DK173040B1

DK173040B1 - Peptider relateret til HIV, antigener omfattende peptiderne, antistoffermod disse peptider, vacciner og antisera til aktiv

Info

Publication number: DK173040B1
Application number: DK198702452A
Authority: DK
Inventors: Allan L Goldstein; Su Sun Wang
Original assignee: Viral Technologies Inc
Priority date: 1986-05-19
Filing date: 1987-05-14
Publication date: 1999-11-29
Also published as: ATE100469T1; EP0246829A3; AU606595B2; GB8711567D0; IL82471A; ZA873215B; JPH0925300A; KR910002690B1; EP0246829B1; JPS6327498A; JPH089636B2; DE3788822T2; DK245287A; MX167236B; KR870011154A; PH26239A; IE60274B1; ES2061495T3; GB2190679A; GB2190679B

Description

i DK 173040 B1 ' Opfindelsen angår peptider eller peptidanaloger med evne til at frembringe antistoffer, der kan genkende human immundefektvirus (HIV); et immunogenisk anti-. gen omfattende et sådant peptid; vacciner og antisera 5 til anvendelse ved forhindring eller behandling af erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) eller AlDS-relateret kompleks (ARC); antistoffer, herunder monoklonale og anti-idiotypiske sådanne, der er specifikke for peptiderne og fremgangsmåde til fremstilling af antistoffer-10 ne; fremgangsmåde til ved fastfasesyntese at fremstille visse af peptiderne; samt diagnostiske sæt til påvisning af Hiv I væskeprøver fra mennesker og fremgangsmåder til analyse for HIV i sådanne prøver.

Erhvervet Immundefektsyndrom (AIDS) er en sygdom 15 som er karakteriseret ved en nedgang i hjælper T-celler (T4) og T4/Tø lymfocytforholdet, en vækst i forekomsten af opportunistiske infektioner og en fremadskridende ødelæggelse af immunsystemet. Man har identificeret årsagen til AIDS som et humant T-lymfotropisk retrovirus, 20 nu benævnt HIV. På mange måder er de kliniske symptomer på aids uadskillige fra symptomer, der ofte ses hos børn med sjældne primære Immundefektsygdomme (PID) associeret med aplasi eller hypoplasi i thymus og en forøget risiko for opportunistiske infektioner deriblandt 25 pneumocystis carinii lungebetændelse.

Den mulige medvirkning af thymuskirtlen, som spiller en nøglerolle ved udviklingen og funktionen af det lymfoi-de system, er med hensyn til AIDS blevet antydet med påvisning af forhøjede niveauer af et Τα^-lignede pep-30 tid i blodet hos personer med AIDS eller personer der hører til risikogruppen med hensyn til AIDS. Se Naylor, P.H. et al, NYAS Monograph on AIDS, 437, 88 (1965);

Hirsh, E.M. et al. New Eng.J. Med., 308, 45 (1983); 2 DK 173040 B1

Biggar, R.j. et al, New. Eng. J. Med., 309, 49 (1983);

Kreiss, j.k. et al. Annal Int. Med, 100, 178 (1984);

Kessler, C.M. et al, Brit, J. Hematology, 5Θ, 325 . (1984).

5 Τα1 var det første thymushormon der blev oprenset til homogenitet og adskilt fra den delvis rensede thy-muin fraktion 5 (TF 5). Se Goldstein, A.L. et al.,

Proc, Natl, Acad, Sci., USA, 74, 725 (1977) og U.S. patent nr. 4,002,740; 4,010,148; 4,148,788 og andre.

10 Det er et surt polypeptid (pi 4,2) med en molekylvægt på 3108, det besidder mange af de biologiske aktiviteter fra thymosin fraktion 5 (TF 5) og det er en potent immunmodulator in vivo og in vitro, τα^ virker først og fremmest på hjælper T-celler, og man har fundet at ^ det hos dyr og mennesker forstærker ekspressionen af T-celle markører, og at det stimulerer produktionen af en række lymfokiner, deriblandt interleukin-2 (IL-2) og y-interferon, at det genopretter immunfunktionen og immunitet mod tumorer. I øjeblikket er Taj den første bio-20 logiske respons modifikator (BRM) som man har vist kan genoprette funktionen af hjælper T-celler og som kan give en forbedret overlevelse hos patienter med lungekræft efter radioterapi, Schulof, R.S., et al., J.

Biol. Resp. Mod. 4, 147 (1985). U.S. patentskrift 25 4,521,407, Pelham, et al. beskriver at en speciel ekstrakt fra kalvebrissel kan stimulere det cellulære immunsystem hos en person med AIDS.

På grund af de kliniske ligheder mellem AIDS og PID sygdomme hos børn ventede man, at niveauet for Tc^ 30 skulle være lavere hos patienter med AIDS eller AIDS-relateret kompleks (ARC). Man kan måle Taj ved radioim-munassay som beskrevet i U.S. patentskrift nr.

4,264,571 og 4,339,427. Det er overraskende at man ved i 3 DK 173040 B1 . undersøgelse af blod fra patienter med AIDS og ARC har fundet tydelige forhøjede niveauer for Ta^. For eksempel havde 44 ud af 72 personer med Kaposi's sarcom (60%) og 12 ud af 22 personer med pneumocystis carinii 5 lungebetændelse (54%) niveauer for Ta^ der var to standard afvigelser højere end gennemsnittet for normale personer. Yderligere studier bekræftede disse fund for et landsdækkende udvalg af patienter med AIDS, deriblandt homoseksuelle og biseksuelle, narkomaner, hai-10 tianere og homoseksuelle med lymfeadenopati.

Man har foreslået 3 mulige alternativer til at forklare de forhøjede niveauer af Tc^: 1) en defekt i hjælper T-celler fører til forhøjede niveauer af dete biologisk aktive peptid, dvs. til slut 15 en organisk fejl; 2) en invasion af virus i epithelcellerne i thymus fører til mangel på kontrol over hormonproduktionen og/eller hormonomsætningen; eller 3) tilstedeværelsen af et biologisk inaktivt, men immu-20 no logisk krydsreaktivt protein relateret til Hiv.

Som beskrevet af Naylor. P.H., et al., AIDS (Alan R.

Liss, New York) (1985) (s.265) har en yderligere kemisk og immunokemisk karakterisering af det Tdj lignede peptid i blodet hos homoseksuelle med høj AIDS risiko på-25 peget, at dette peptid med abnormt forhøjet niveau kan være et krydsreagerende molekyle, og at i virkligheden niveauet for autentisk Tc^ i virkeligheden ofte er faldet i betydelig grad.

For at identificere substanser, der er Immunak-30 tivt med Τα-j^ har vi under anvendelse af EDB-analyse grundigt eftersøgt homologe peptider, vi benyttede mere end 3,500 proteinsekvenser fra sekvensbanken i National Biological Research Foundation i Washington, D.C. og kataloget over tilgængelige HIV og andre retrovirale 4 DK 173040 B1 isolater fra Dr. Robert Gallo's laboratorium ved National Cancer Institute (NCI). Selvom vi ikke fandt signifikante homologier med andre thymushormoner eller lymfokiner opdagede vi uventet, at Tc^ og gag (kore) 5 proteinerne (pl7) fra HIV opviser en 44-50% homologl i en region på 18 aminosyrer (positionerne n-28 på ταχ og 92-109 på pl7 gag proteinet) i deres primære sekvenser.

I øjeblikket foregår i det væsentlige enhver 10 form for forskning med hensyn til udvikling af vacciner mod sydomme forårsaget af HIV genet og dets produkter (dvs. proteiner og/eller glycoproteiner) med fokus på indhylningsgenet,env. Se f.eks. Fischinger, P.J. et al., "Current Status and Strategies for vaccines 15 against Diseases Induced by Human T-Cell Lymphotropic Retroviruses (HTLV-I, -ΙΙ,-III)" Cancer Research, 45 4694s-4699s (sep. 1985); L. Davis, "AIDS Vaccine Research: Promising Protein", Science News, 129, 10, s.151 (8. marts 1986). Dette er antagelig baseret på 20 den solide viden, at indhylningsproteinerne (dvs. det ydre over-træk) sandsynligvis tilvejebringer den eller de antigene positioner som "genkendes" af kroppens immunsystem under dannelse af antistoffer.

Imidlertid vil som for eksempel påpeget af 25 Fischinger, et al., p.g.a. den udbredte heterogenitet og p.g.a. de antigene variationer man har iagttaget mellem forskellige Hiv isolater i env-genet og tilsvarende env-proteiner, udvikling af vacciner med disse immunogener være en meget besværlig proces og måske væ-30 re forgæves.

Derimod er gag koreproteinerne i HIV, skønt de tilsyneladende ikke er "udsat" for immunforsvaret, i meget højere grad bevaret og i meget mindre grad udsat for mutationer og genetisk drift.

i 5 DK 173040 B1

Opfindelsen er baseret på den ganske overraskende opdagelse, at de antigene determinanter, der er fælles for gag-proteiner fra Hiv, er tilgængelige for destruktion med antistoffer rettet mod specifikke epitoper, 5 nemlig de epitoper som man har fundet med en høj grad af homology med thymosin c^.

Robert C. Gallo, et al. beskriver i US patentskrift nr. 4.520.113 en diagnostisk prøve til serologisk bestemmelse af antistoffer for Hiv i serum fra pa-10 tienter med AIDS og ARC symtomer. Denne diagnostiske fremgangsmåde, som I øjeblikket er i bred anvendelse, har forskellige ulemper, der kan føre til falske resultater. Især har en diagnostisk test, som bestemmer tilstedeværelse af antistoffer for HIV følgende ulemper, 15 som kan medføre falsk-negative eller falsk-positive resultater. visse patienter, som blev udsat for AIDS-virus, kan have et defekt immunforsvar og ikke producere antistoffer. Andre patienter kan fornylig have været udsat men endnu ikke have produceret påvise-20 lige mængder antistof (antistoffer for AIDS tager ofte op til 8 uger at blive produceret i påviselige mængder) . visse patienter med antistoffer i deres serum har måske ingen virus tilbage i deres system. Således vil man opnå et "falsk-positivt" resultat i det sidstnævnte 25 tilfælde og "falsk-negativt" resultater i de to første tilfælde.

En diagnostisk test, som bestemmer tilstedeværelse af virus direkte og selektivt ville derfor klart være af overordenlig vigtighed til tidlig bestemmelse og 30 diagnose hos patienter, der er udsat for at få AIDS eller tilhører høj risiko grupperne.

Det er et formål for opfindelsen at tilvejebringe en sikker vaccine, der er i stand til at inducere dan 6 DK 173040 B1 nelsen af antistoffer, som er effektive ved neutralisering af HIV eller andre lignede retrovira associerede med erhvervet immundefektsyndrom (AIDS).

Et beslægtet formål er tilvejebringelse af en me-5 tode til at immunisere personer, der er under fare for at udvikle AIDS eller som har været udsat for Hiv, idet man til personen indgiver et immunogent antigent materiale, som vil medføre dannelsen af specifikke neutra-! liserende antistoffer der er i stand til at blokere re- 10 plikationen af Hiv.

Det er et særligt formål med opfindelsen at til-I vejebringe en sådan sikker vaccine og aktiv immunise rings fremgangsmåde, der som immunogent antigent materiale benytter hidtil ukendte peptider, som har fælles 15 epitoper med HIV-proteiner eller benytter peptidet fra pi7 gag proteinet fra HIV, og som har homologt med ami-nosyresekvensen ved positioner 11-28 i thymosin c^, eller fragmenter, analoger eller polymerer af et sådant peptid.

20 Et andet formål med opfindelsen er at tilveje bringe antisera der er i stand til at blokere replika-tionen af HIV under anvendelse af anti-Tc^serum, igG-berigede præparationer deraf eller antisera til andre peptider eller analoger deraf, der har fælles 25 epitoper med gag proteinet fra HIV eller antisera til 711 korepeptidfragmenterne afledt af gag regionen i selve HIV.

Et andet og beslægtet formål med opfindelsen er at tilvejebringe korepeptidfragmenter afledt af gag re-30 gionen i HIV.

Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe nye immunogener, idet man binder et hvilket som helst af de nye peptider til et immunogent bærerma-3 teriale.

7 DK 173040 B1

Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe nye antistoffer, der er specifikke for sådanne peptider, fragmenter og/eller epitoper, til anvendelse - ved behandling og forhindring af AIDS og/eller AIDS-5 relateret kompleks (ARC) og passiv immunisering mod AIDS ved anvendelse af sådanne nye antistoffer eller antisera, der indeholder sådanne antistoffer eller anti-Tc^ antisera, eller IgG-berigede præparationer deraf.

10 Et yderligere formål med opfindelsen er at tilve jebringe en diagnostisk fremgangsmåde og et sæt, hvorved man kan foretage en direkte serologisk bestemmelse af tilstedeværelse eller fravær af Hiv.

Peptiderne ifølge opfindelsen, med evne til at 15 frembringe antistoffer, der kan genkende human immunde-fektvirus, er ejendommelige ved det i kravene 1-3's kendetegnende dele anførte.

Foretrukne opfinderiske peptider er ejendommelige ved det i kravene 4-7’s kendetegnende dele anførte.

20 Endvidere er antigenerne ifølge opfindelsen ejen dommelige ved det i kravene 8-13's kendetegnende dele anførte; og antistofferne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved det i kravene 15, 16 (monoklonale sådanne) og 18 (anti-idiotypiske sådanne)'s kendetegnende 25 dele anførte.

På tegningen vises i:

Figur 1 et søjlediagram der afbilder evnen af antisera for thymosin til at forhindre replikation af Hiv i H9 celler baseret på data fra tabel 2; 30 Figur 2 en afbildning af et kompetitivt radioimmunassay mellem HIV og Rouscher murin leukæmiretrovirus (RLV);

Figur 3 et søjlediagram, der viser krydsreaktiviteten bestemt ved RIA for antisera til thymosin , til HIV

8 DK 173040 B1 og forskellige animale retrovirus ekstrakter;

Figur 4 en afbildning af et typisk antistofrespons hos kaniner ved vaccination med en af de nye gag proteiner ifølge opfindelsen.

5 Gruppen af retrovira som man for tiden ved inklu- i derer humane T-celle lymfotropiske specier og adskil lige beslægtede animale specier f.eks. fra katte, kvæg, kaniner etc., er karakteristiske ved at indeholde en-j keltstreng RNA indesluttet i en beskyttende indre pro-

10 teinovertrækning (koreprotein), og den indesluttede RNA

streng er selv omsluttet af et ydre proteinhylster I (indhylningsprotein). RNA genomet inkluderer et "gag" gen der koder for koreproteinet (gag) og et "env"gen I der koder for indhylningsproteinet (env)(eller glyco- 15 proteinet). Da indhylningsproteinet tilsyneladende er ^ ansvarligt for den mekanisme, hvorved viruset bindes til overfladen af værtscellen og er "synligt" som det yderste lag af viruset, venter man almindeligt, at de antigene determinanter eller epitoper i viruset der 20 mest sandsynligt genkendes af cellens immunsystem og som kan angribes af antistoffer, vil findes på indhylningsproteinet. Imidlertid opviser env genet fra HIV desværre en betydeligt heterogenitet og antigene variationer, og man har Indtil nu ikke opdaget nogen virk-25 ningsfuld vaccine rettet mod env proteinet, skønt der - foregår en omfattende forskning på dette område.

7 I modsætning til heterogenieteten og de antigene variationer hos env genet fra HIV, vil gag genet og dermed gag (kore)proteinet være meget mere bevaret. I 30 overensstemmelse hermed kan man vente, at et antistof, der er specifikt for koreproteinet, vil være effektivt over for et meget bredere spektrum af vira, der forårsager AIDS.

Ϊ ϊϊ 9 DK 173040 B1

Vi har nu ifølge opfindelsen tilvejebragt antistoffer, der er specifikke til koreproteinet fra HIV, associeret med erhvervet immundefektsyndrom (AIDS). Vi vil betegne alle de forskellige, men relaterede grupper 5 af retrovira, der er ansvarlige for AIDS og AIDS relateret kompleks (ARC), både i beskrivelsen og i kravene, som Hiv.

Det blev oprindeligt opdaget som følge af observationen af forhøjet niveauer for thymosin (TajJ hos 10 AIDS patienter, at der er en høj grad (ca. 50%) af homolog! over for en 18-aminosyresekvens fra thymosin 02 og Hiv. Thymosin besidder følgende aminosyresekvens:

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-A9p-Thr-Ser-Ser-Glu-15 Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-

Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Aen-COOH

Gag genet fra HIV koder for 4 gag proteiner, der indeholder 512 aminosyrer, gag pi7, gag p24, gag p7 og 20 gag p9, der henholdsvis har en molekylvægt på 17.000, 24.000, 7.000 og 9.000. Sammenligning mellem den primære sekvens i thymosin og pi7 gag proteinet viser en 44-50% homologi i regionen med 18 aminosyrer mellem positionerne 11-28 på thymosin og positionerne 92-109 25 på gag proteinet som vist nedenfor: 10 DK 173040 B1

Thymosin α1 ARV-2 gag protein HIV aacr protein ,_L__£_ _r 11 He92' 9Τ' ile | i 5 Thr Asp Glu ' Thr _Val__n« H Lys 95 Lys 9Γ LyT" I —Asp—___96 Asp_ 96 Asp --u ___Thr j 17 Lys 98 Lys 98 Lys I l18 Glu_99 Glu_99 Glu

Lys Ala Ala ; i--hil______Leu ; 15 1^- ciu 102 Asp i Val Lys Lys j—-_Llf_______ Ile 2ή Glu 105 Glu 105 Glu

Ul-Plu,_106 Glu _ 106 Glu 20 Ala Glu Glu 5 ,-_CIn__ Gin tøL-jjf«__109 Asn_109 Asn

C00H 512 ~COOH 5ir~~C00H

25

Som følge af denne usædvanlige høje grad af homo-logi lod man antistoffer for thymosin αΑ (AbTc^) undersøge, for at bestemme deres evne til at neutralisere HIV, idet man målte deres evne til at inhibere replika-30 tionen af Hiv i den permissive H9 celleline. Til bestemmelse af tilstedeværelsen af neutraliserende antistof for Hiv i serum fra kaniner immuniseret med thymosin c^, benyttede man HIV replikationssystemet i H9

H

11 DK 173040 B1 celler som beskrevet af P.S. Sarin, et al., Biochem.

Pharmacol., 34, 4075 (1985).

Kort fortalt følger man infektionen af H9 celler-. ne ved at måle aktiviteten af revers transkriptase (RT) 5 i kulturmediet og ved at benytte et indirekte immun-fluorescensassay til expressionen af pl5 og p24 fra HIV. Man foretager immunfluorescensassays på celler fikseret i methanol:acetone (1:1) og med monoklonale antistoffer til HIV pl5 og p24. De HIV inficerede cel-10 ler med og uden antistofbehandling fikseres på toxo-plasmoseglas. Efter fiksering med methanol:acetone (1:1) 30 minutter ved stuetemperatur opbevarer man glassene i forseglede plastposer ved -20 °C Indtil anvendelse. Man sætter monoklonale antistoffer til par af 15 brønde, inkuberer ved stuetemperatur i et fugtigt kammer i en time og vasker med PBS med indhold af 0,25%

Triton® X-100 i 2 timer. Derefter udsætter man cellerne for fluorescein (FITC), konjugeret gede antiserum til muse IgG (Capeli Laps) i en time og vasker med PBS puf-20 fer med indhold af 0,25% Triton® X-100 natten over. Man fikserer glassene med 50% glycerol og Iagttager cellefluorescens under et Zeiss fluorescensmikroskop.

Analyser af lo forskellige præparationer af heterologe antisera til ΤαΑ fremstillet i kaniner fastslog 25 tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer til HIV (Tabel l). Man fremstillede antisera til Tax som beskrevet i US patentskrift nr. 4.264.571 i forbindelse med et radioimmunassay for thymosin aj_. Kort fortalt kobler man syntetisk Ταχ via glutaraldehyd til 30 "keyhole limpet" hæmocyanin (KLH) (1:1 vægtforhold) til opnåelse af en slutkoncentration for Tc^ på 100 yg/ml.

Man blander konjugatet (1 ml og 1 ml) med Freunds komplette adjuvans og indgiver det til hvide New Zealand 12 DK 173040 B1 kaniner intradermalt adskillige steder. Man giver kaninerne forstærkende injektioner (100 yg Ta^ i Freunds komplette adjuvans) hver uge i 6 uger (2-4 måneder).

. Efter 1 måneds pause modtager dyrene forstærkende in-5 jektioner hver måned indtil man opnår maksimalt resultat. I alle tilfælde er RT betydeligt inhiberet (53 +/-3%), men adskillige af de anvendte rå antisera viste ved en fortynding på 1:20 en vis cytotoxicitet mod H9 celler og/eller inhiberede ikke expressionen af 10 pl5 og p24. Derfor udvalgte man 4 præparationer Ta^ antisera og fremstillede for hver af disse en immunoglobulin (IgG)-beriget præparation til at bekræfte at den antivirale aktivitet medieres af IgG. De

IgG-berigede præparationer fremstilles ved ammoniumsul-15 fatudfældning (40%). Efter centrifugering opløser man præcipitatet i PBS og dialyserer i 24 timer imod PBS.

Hver præparation filtreres derefter gennem et 0,8 miliporefilter. Man kan i stedet for eller sammen med ammoniumsulfatudfældningen indkoncentrere antisera ved 20 andre konventionelle fremgangsmåder såsom f.eks. staph-A rensning, HPLC rensning etc.

Som vist i tabel 2 er de koncentrerede IgG præparationer af antisera for Tc^ meget effektive ved neutralisering af HIV; de inhiberer expressionen af de vi-25 rale proteiner pl5 og p24 og aktiviteten af RT og de er ikke cytotoxiske over for H9 celler. Antisera fra kaniner immuniseret mod Ταχ er lige så effektive ved neutralisering af HIV som sera fra patienter med ARC og AIDS, som også udviser neutraliserende aktivitet.

30 således er ikke blot antisera eller IgG-berigede præparationer rettet mod den fælles epitop i Ταχ og gag proteinet fra Hiv meget effektive in vitro til at neutralisere dette virus, men de er også ganske fordelag 13 DK 173040 B1 tige sammenlignet med de anti-neutraliserende antistoffer der findes i visse sera opnået fra patienter med AIDS.

DK 173040 B1 14

Tabel 1

Neutralisering af Hiv med fuldstændigt antiserum for Thymosin 5 Serum , h9’ Celler τ ..

Nr. Eitsgerlnent_ fortyndmc 10° celler/ml p!5*' p?4 rt 1. H9 celler (Ingen virus) . [ j 2. HIV - 0.96 100 100 100 3· nr. 2 + serun fra AIDS patientel· 1:100 1.4 25 33 13 ! Experiments 10 4 .nr.2+normal kaniner serum 1:20 1.21 100 100 100 j 5.nr.2*antiserum for Ta^ 1:20 0.33 100 33 43 i (preparation 1 ) 6-nr.2+*neiserum for To^ 1:20 0.33 50 33 42 (prq-araticn 2) 7.nr.2+entlserum fer Taj^ 1:20 0.33 50 66 60 (prånaration 3) 15 8.nr.2+antlserum fer To^ 1:20 0.19 25 33 45 ! (preparation 4) 9.nr.2->antiserum for Toj, 1:20 0.14 25 > 33 59 (preparation 5) 10 nrZ+arvtiserum for Ta1 1:20 0.29 100 133 62 (procuration $) ll-nr^+anciserumfor To^ 1:20 0.71 125 166 72 (preparation 7) 20 12.nr.2+«ntiserum for Toj 1:20 0.14 125 100 58 (preparation 8) 13 ujr.2+antiserue fer 1"°| 1:20 0.16 50 33 50 (præparation 9) 14 ,nr.2+antiserum for Ta^ 1:20 0.31 50 66 42 (preneration 10 ) 25 Tekst til Tabel 1.

HIV infektion af H9 celler: Man behandler H9 celler med polybren (2 pg/ml) i 30 minutter ved 37 °c , vasker frit for polybren og inficerer med 2 x 108 Hiv viruspartikler pr. 4 x 105 H9 celler. Til assays for 30 neutraliserende antistof varmeinaktiver man sera ved 56 °C i 30 minutter og filtrerer gennem et 0,45 ym filter. Man blander antistof i de relevante fortyndinger med HIV (500 viruspartikler/celle) i 24-brønd fladbun- 35 aa m 15 DK 173040 B1 dede plader (2 ml). Man inkuberer pladerne ved 4 °C i en time og ved 20 eC i 15 minutter. Man sætter H9 celler til brøndene til en slutkoncentration på 5 x 105 celler/ml. Man inkuberer kulturerne ved 37 eC og 5% C02 5 i 96 timer. Derefter tæller man synlige celler under tilstedeværelse af trypanblåt. Cellesuspensionen centrifugeres ved 500 g i 10 minutter. Man benytter super-natanten til assays for revers transkriptase og anbringer cellerne på toxoplasmoseglas, fixerer med metha-10 nol:acetone (1:1) og analyserer med monoklonale antistoffer til HIV, pl5 og p24 som beskrevet af P.S. Sarin et al., Biochem.Pharm. 34, 4075 (1985).

DK 173040 B1 16

Tabel 2

Neutralisering af HIV inhibering af viral replication med delvis renset IgG antiserum for thymosin αΊ

Serum " ,H9 celler % kontrol 3 Nr. Eksperiment_fortynding_10° celler/ml RT pl5 p24 1. H9 celler - 1.56 - " “ i (inaen virus) 2. H9+Hiv* - 0.26 100 100 100 3. nr.2+ normal 1:20 0.32 100 100 100 10 4. nr.2+ antiserum til Τα. 1:20 1.00 31 18 21 (piaparation i“) 1:50 °·98 38 26 38 5. nr.2 + Antiserum til Τα. 1:20 1.48 46 21 15 (..^»rations»') 1:50 77 58 43 ^ 6PT;2 + Antiserum til Τα. 1:20 1.26 36 '15 18 (praparition 7«) 1:50 ^32 62 33 25 7 nr. 2 + Antiserum til Τα. 1:20 1.18 42 18 18 (prsparation i»**) ^50 ^02 - 57 33 28 20 * Til H9 celler: Man behandler H9 cellex med po- lybren (2 yg/ml)i 30 minutter ved 37 eC, vasker fri for polybren og inficerer med 2 x 10® HIV viruspartikler pr 4 x ΙΟ5 H9 celler. Man analyserer kulturerne 4 dage efter infektionen. Man udfører assays for neutraliserende 25 antistof som beskrevet i tabel 1.

xx Man fremstiller IgG-berigede sera ved ammoniumsul fatud fældning. Præparationer af anti-Tc^ afprøvet for aktivitet før rensning.

Til illustration er data fra Tabel 2 for H9 cel-30 ler afbildet i figur 1. Man kan let se af figur l, at anti-Τα^ antistoffer er meget effektive til neutralisering af HIV. Ydermere kan man fra disse data konkluderer, at denne epitope region (positionerne 92-109 fra 17 DK 173040 B1 gag proteinet) fra vlrusgenomet er kritisk med hensyn til replikation af Hiv.

I overensstemmelse hermed er det omhandlede antiserum ejendommeligt ved, at det omfatter en terapeutisk 5 effektiv mængde af et antistof ifølge opfindelsen og en farmaceiutisk acceptabel bærer; og vaccinerne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de omfatter en terapeutisk effektiv mængde af et peptid ifølge opfindelsen eller en terapeutisk effektiv mængde af et anti-10 idiotypisk antistof ifølge opfindelsen; samt i begge tilfælde er farmaceutisk acceptabel bærer.

De omhandlede peptider, peptidanaloger og fragmenter deraf er selv hidtil ukendte substanser og antistofferne til peptiderne med formlerne (I) og (II) er 15 også hidtil ukendte substanser såvel som antisera og vacciner, der indeholder disse antistoffer eller peptider.

Peptidfragmenter ved C-terminus af thymosin αχ og analoger deraf, som repræsenteres ved den følgende for-20 mel (T): A()-Ile-Xi-X2-Lys-Asp-X3-Lys-Glu-XA-X5-X6-

X7-X8-Glu-Glu-X9-X10-Asn-COOH

25 eller et salt, ester, ether eller amid deraf, hvori A0 er NH2 eller en aminosyresekvens på fra 1 til ca. 6 aminosyrer; og Χχ - X10 uafhængigt af hinanden repræsenter en hvil-30 ken som helst af en naturligt forekommende aminosyre; og peptidfragmenterne fra den antigene region fra i det mindste ca. position 92 til ca. position 109 i gag koreproteinet, som repræsenteres i krav 3, nemlig ved den følgende formel (II): 5 18 DK 173040 B1

A-Ile-Y1-Y2-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu- (II) Y3-Lys-Ile-Glu^Glu-Glu-Gln-Asn-B

' hvori Y2 er Asp eller Glu, ; Y2 er Val eller Ile, Y3 er Glu eller Asp, A er NH2 eller en aminosyresekvens på optil ca.

10 10 aminosyrer, og B er COOH eller en aminosyresekvens på optil ca.

I 10 aminosyrer, kan X'erne (Xj^ - X3q) være en hvilken ! som helst af de naturlige forekomne aminosyrer nemlig; alanin (Ala), arginin (Arg), asparagin (Asn), aspara-15 ginsyre (Asp), cystein (Cys), glutamin (Gin), glutamin-syre (Glu), glycin (Gly), histidin (His), isoleucin (Ile), leucin (Leu), lysin (Lys), methionin (Met), phe-nylalanin (Phe), prolin (Pro), serin (Ser), threonin (Thr), tryptophan (Trp), tyrosin (Tyr) og valin (Val).

20 Tilsvarende, når A0 betegner en eller flere aminosyrer, ! kan den omfatte en hvilken som helst af disse aminosy rer i en vilkårlig kombination, eller A0 kan være en aminosyresekvens, der er nabostillet til Ile på den N-terminale ende af thymosin α1# dvs. Glu, Ser-Glu, 25 Ser-Ser-Glu, Thr-Ser-Ser-Glu, Asp-Thr-Ser-Ser-Glu, val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu, osv.

Når Xj^ er Thr, X2 er Thr, X3 er Leu, X4 er Lys,

Xg er Lys, x6 er Glu, X7 er Val, X8 er val, x9 er Ala og X10 er Glu, svarer peptidet med formel (i) til " 30 C11_28 terminalen i thymosin og har formlen: i 19 DK 173040 B1 A0-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-

Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-GIn-Asn-COOH

5 I formel (T) er det især interessant, at xg er

Glu eller Asp, det første svarer til Glu ved position 102 i ARV-2 og det sidste svarer til Asp ved position 102 i Hiv.

Da anti-Taj antiserum er effektivt med hensyn til 10 neutralisering af Hiv, er det sandsynligt, at aminosy-rerne Xx - X10, især - X5 og X7 - X10i er mindre kritiske med hensyn til antistofgenkendelse.

På den anden side, i peptidet med formel (T), hvori er Asp, X2 er Val, X3 er Thr, X4 er Ala, X5 er 15 Leu, Xg er Glu, X7 er Lys, X0 er Ile, Xg er Glu og X10 er Gin, vil det resulterende peptid med formel: A0-Ile-Asp-Val-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu-

Glu-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Cln-Asn-COOH

20 svare identisk til ARV-2 gag proteinet ved positionerne 92-109, dvs. 100% homologi, og skulle tilvejebringe endnu mere effektive antistoffer for Hiv.

25 Tilsvarende, når Χχ er Glu, X2 er Ile, X3 er Thr, X4 er Ala, X5 er Leu, Xg er Asp, X? er Lys, X8 er Ile,

Xg er Glu og X10 er Gin, vil det resulterende peptid med formlen: A -Ile-Glu-Ile-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu-30 °

Asp-Lys -1le-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn-COOH

20 DK 173040 B1 korrespondere identisk til Hiv gag proteinet ved positionerne 92-109 og skulle også tilvejebringe et særlig effektivt antistof til HIV.

Ydermere, selvom det synes, at antigenet for ko-5 reproteinet fra Hiv ved positionerne 92-109 er kritisk med hensyn til den virale replikationsproces, er det alligevel fordelagtigt at udvide længden af polypeptid-kæden i begge ender eller i den ene ende af aminosyre-sekvensen til at inkludere en tilfældig aminosyresek-10 vens på 1-10 aminosyrer, foretrukket 1-8 aminosyrer, og især foretrukkent 1-6 aminosyrer til tilvejebringelse af polypeptider med 18-40 aminosyrer, foretrukket 18-36 aminosyrer, og især foretrukket 18-30 aminosyrer. Det er især foretrukket i stedet for tilfældige aminosyre-15 sekvenser til den ene eller begge sider af peptider med formel (II) at føje aminosyresekvenser (naturligvis tilbundet med peptidbindinger - det samme gælder ovenfor) der svarer til sekvensen, der findes i HIV.

Dette afspejles i det I krav 4 definerede fore-20 trukne peptid ifølge opfindelsen.

Man kan fremstille peptiderne ifølge opfindelsen ved konventionele fremgangsmåder til syntese af peptider; mere detaljeret ved anvendelse af processer som beskrevet i Schroder og Lubke, The Peptides, bind 1, 25 (1966), Academic Press, New York, USA eller Izumiya er al., Synthesis of Peptides, (1975), Maruzen Publishing Co., Ltd., f.eks. en azid proces, en chlorid proces, en syreanhydrid proces, en blandet anhydrid proces, en DCC proces, en aktiv ester proces (en p-nitrophenylester 30 proces, en N-hydroxysuccinimidester proces, en cyano-methylester proces,etc.) en proces under anvendelse af et Woodward reagens K, en carbodiimidazol proces, en oxidation-reduktions proces, en DCC/additiv (HONB, ! 21 DK 173040 B1 HOBt, HOSu) proces, etc. Fastfasesyntese og væskefasesyntese kan begge benyttes til de ovennævnte processer.

Man fremstiller peptiderne ifølge opfindelsen 5 ifølge de ovennævnte fremgangsmåder til syntese af almindelige polypetider, som regel enten ved en såkaldt trinvis proces, hvorved man til den terminale aminosyre tilkondenserer yderligere aminosyrer én efter én i rækkefølge ved sammenkobling af fragmenter opdelt 10 i mange grupper til den terminale aminosyre. Mere detaljeret (i henseende til fastfasesyntese ejendommeligt ved det i krav 20's kendetegnende del angivne) binder man den C-terminale aminosyre til en uopløselig bærer via carboxylgruppen. Typen af uopløselig bærer er ikke 15 særlig begrænset så længe den kan bindes til en reaktiv carboxylgruppe og er inert over for reagenser og reaktionsbetingelser anvendt i de trinvise kondensations-afbeskyttelsesreaktioner. Eksempler på sådanne uopløselige bærere inkluderer halogenmethylharpikser såsom 20 chlormethylharpiks, især chlormethylpolystyrendivinyl-benzenpolymer, brommethylharpiks etc., hydroxymethyl-harpikser, phenolharpikser, tert-alkyloxycarbonyl-hydraziderede harpikser, tværbundne poly-N-arylylpyrro-lidinharpiks, etc. Hvis det f.eks. drejer sig om poly-25 peptider, hvori den C-terminale aminosyre har en funktionel amidgruppe som i asparagin, (Asn), NH2-<jH-C00H, 30 CH2-C0NH2 er det fordelagtigt at benytte en benzhydrylamlnharpiks i 22 DK 173040 B1 som bærer, så den funktionelle amidgruppe direkte kan dannes på harpiksbæreren. Ved en særligt foretrukket udførelsesform udfører man fastfasesyntesen til frem- . stilling af peptider, hvori der i den C-terminale ami-I 5 nosyrer indgår en funktionel amidgruppe, under anven delse af methylbenzhydrylaminharpiksbærer, som mere detaljeret beskrevet i den samtidigt løbende US patentansøgning af Su-Sun Wang, SN. nr. 849,839 indleveret 8. j april 1986.

10 Når beskyttelsen på aminogruppen er fjernet, til binder man i rækkefølge aminosyrer, hvor aminogruppen s er beskyttet, i overensstemmelse med ønskede aminosyre- sekvenser ved kondensering af dens reaktive aminogruppe ; og af den reaktive carboxylgruppe, hvorved man opnår en 15 trin-for-trln syntese. Når den fuldstændige sekvens er syntetiseret, spalter man peptidet fra den uopløselige - bærer til dannelse af proteinet idet man f.eks. benyt ter HF, HBr, eller et andet spaltende middel.

I beskrivelsen ovenfor og i det følgende har for-20 korteiserne der benytter standardnomenklatur, følgende mening:

Boc, t-butyloxycarbonyl, Bzl, benzyl; DCC, dicyc-lohexylcarbodiimid; Cbz, benzyloxycarbonyl; TFA, tri-I fluoreddikesyre, og Clz, 2-chlorbenzyloxycarbonyl.

25 Selvom der gives specielle eksempler på beskyt tende grupper nedenfor, hører til under fagmanden at benytte tilsvarende konventionelle beskyttende grupper.

Fagmanden vil uden videre kunne indse, at man foretruk-kent vil udvælge visse almindelige betingelser uafhæn-^ 30 gigt af, hvilket bestemt peptid der skal syntetiseres.

For eksempel er det almindeligt anerkendt, at a-amino gruppen 1 hver aminosyre, der benyttes i peptidsyntesen, skal beskyttes under sammenkoblingsreaktionen til

Hl m

Ka ri * ri Π 23 DK 173040 B1 at forhindre sidereaktioner, der involverer den reaktive a-aminogruppe. Tilsvarende for aminosyrer, der indeholder reaktive sidekæde funktionelle grupper (f.eks. sulfhydryl, ε-amino, hydroxyl, carboxyl), skal sådanne 5 funktionelle grupper også beskyttes, både under den første tilkobling af aminosyren, der indeholder sidekæ-degruppen og under tilkoblingen af de følgende aminosyrer. Passende beskyttende grupper er kendt. (Se f.eks.

Protective Groups in Organic Chemistry, M.McOmie, 10 Editor, Plenum Press, N.Y., 1973).

Når man udvælger en bestemt beskyttende gruppe, må man iagttage følgende: en α-amino beskyttende gruppe skal: (1) være stabil og gøre α-aminogruppen inert ved de reaktionsbetingelser, man anvender ved sammenkob-15 lingsreaktionen og (2) være let at fjerne efter sammenkoblingsreaktionen under betingelser, hvor man ikke fjerner beskyttelsen på sidekædegrupperne eller ændrer strukturen af peptidfragmentet. En gruppe til beskyttelse af sidekæder må: (1) være stabil og gøre den 20 funktionelle sidekædegruppe inert under de betingelser, der benyttes ved sammenkoblingsreaktionen, (2) være stabil under de betingelser, der benyttes under fjernelse af den beskyttende gruppe på α-aminogruppen og (3) være let fjernelig, når den ønskede aminosyresek-25 vens er fuldstændig under reaktionsbetingelser der ikke vil ændre strukturen af peptidkæden eller føre til ra-cemisering af overhovedet nogen af dens chirale centre.

Passende beskyttende grupper for α-aminogruppen er t-butyloxycarbonyl (BOC), benzyloxycarbonyl (Cbz), biphe-30 nylisopropyloxycarbonyl, t-amyloxycarboxyl, isobornyl-oxycarbonyl, 1,l-dimethyl-2,5-dimethoxybenzyloxycarbo- nyl, o-nitrophenylsulfenyl, 2-cyano-t-butyloxycarbo-nyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl og lignende, især t-butyloxycarbonyl (Boc).

24 DK 173040 B1

Som eksempler på carboxylbeskyttende grupper kan man nævne ester-dannende grupper, der fører til dannelse af alkylestere (f.eks. methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, etc. estere), benzylestere, p-nitrobenzyl-5 estere, p-methoxybenzylestere, p-chlorbenzylestere, benzhydrylester, etc. og hydraziddannende grupper såsom sådanne, der er i stand til at danne carbobenzoxyhy-drazid, t-butyloxycarbonylhydrazid, tritylhydrazid, etc.

10 Som ekspemler på grupper til beskyttelse af gua- nidinogruppen i arginin kan man nævne nitro, tosyl (Tos), p-methoxybenzensulfonyl, carbobenzoxy, isobor-nyloxycarbonyl, admantyloxycarbonyl, etc. Man kan også beskytte guanidinogruppen, når den danner et salt med 15 en syre (f.eks. benzensulfonsyre, toluensulfonsyre, saltsyre, svovlsyre, etc.).

Man kan f.eks. beskytte hydroxylgruppen i threo-nin ved hjælp af kendt esterificering eller etherifice-ring. Som eksempler på grupper, der er egnet til en så-20 dan esterificering, kan man nævne lavere alkanoylgrup-per (f.eks.. acetyl), aroylgrupper (f.eks. benzoyl), og grupper afledt af carboxsylsyrer såsom benzyloxycarbo-nyl, ethyloxycarbonyl, etc. Som grupper egnede til en sådan etherificering kan man nævne benzyl, tetrahydro-25 pyranyl, t-butyl etc. Hydroxylgruppen i threonin behøver imidlertid ikke nødvendigvis at beskyttes. Man kan beskytte methionin som et sulfoxid. Andre foretrukne sidekæde beskyttende grupper til specielle aminosyrer inkluderer; for tyrosin: benzyl, o-brombenzyloxycarb-30 onyl (BrZ), 2-6-dichlorbenzyl, isopropyl, cyclohexyl, cyclopentyl og acetyl; for histidin: benzyl, benzyloxy-carbonyl, p-toluensulfonyl, trityl og 2,4-dinitrophe-nyl; for tryptophan: formyl.

i i i 25 DK 173040 B1

Med hensyn til typiske fremgangsmåder til den første kobling af den C-terminale aminosyre til den faste harpiksbærer kan følgende retningslinier angives.

For benzhydrylamin- eller methylbenzhydrylaminharpiks 5 binder man en Na-Boc-aminosyre eller en tilsvarende beskyttet C-terminal aminosyre til (methyl)benzhy-drylaminharpiksen ved hjælp af en N,N'-dicyclohexyl-carboxiimid (DCC)/l-hydroxybenzotriazol (HBT) medieret sammenkobling med en reaktionstid på ca. 2-24 timer, 10 foretrukkent ca. 12 timer og en temperatur på mellem ca. 10-50 ° C foretrukkent 25 eC , i et opløsningsmiddel såsom dichlormethan eller DMF, foretrukkent di-chlormethan. Hvis man benytter en chlormethylpolysty-rendivinylbenzen type harpiks: man foretager sammenbin-15 dingen til harpiks ved hjælp af en reaktion af den Na-beskyttede aminosyre, især Boc-aminosyren som cæsium, tetramethylammonium, triethylammonium,4,5-diazabi- cyclo[5.4.0]undec-5-en, eller tilsvarende salt i ethanol, acetonitril, N,N.-dimethyl-formamid (DMF), og 20 lignende, især cæsiumsaltet i DMF med chlormethylhar-piks ved en forhøjet temperatur, f.eks. mellem ca.

40-60 °C, foretrukken ca. 50 *C i ca. 12-48 timer, foretrukkent ca. 24 timer.

Fjernelsen af en Na-beskyttende grupper kan udfø-25 res under tilstedeværelse af f.eks. en opløsning af trifluoreddikesyre i methylchlorid, hydrogenchlorid i dioxan, hydrogenchlorid i eddikesyre, eller en anden stærkt sur opløsning foretrukkent 50% trifluoreddikesyre i dichlormethan ved omtrent stuetemperatur. Sammen-30 koblingen af beskyttede aminosyre i rækkefølge kan udføres ved kendt teknik i et automatisk synteseapparat for polypeptider. Enhver beskyttet aminosyrer indføres foretrukkent i et molært overskud på omtrent 2,5 eller 26 DK 173040 B1 mere og sammenmkoblingen kan udføres i dichlormethan/ DMF-blandinger, DMF og lignende især i methylenchlorid ved omtrent stuetemperatur. Andre opløsningsmidler som er kendt som nyttige ved peptiddannende kondensations-5 reaktioner er f.eks. dimethylsulfoxid, pyridin, chloroform, dioxan, tetrahydrofuran, ethylacetat, N-methyl-i pyrrolidon, etc., såvel som passende blandinger deraf.

Man kan udvælge reaktionstemperaturen for kondensation/koblingsreaktionen i det område, man ved 10 er passende for peptidedannende kondensationsreaktioner. Temperaturen ligger normalt inden for området ca.

-40-60 eC og foretrukkent ca. -20-0 "C . Det sammenkoblende middel er normalt DCC i dichlormethan, men kan være N,N'-diisopropylcarbodiimid eller et andet carbo-15 diimid enten alene eller under tilstedeværelse af HBT, N-hydroxysuccinimid, ethyl-2-hydroxyimino-2-cyanoace-tat, eller N-hydroxyimider eller oximer. Man kan alternativt benytte aktive estere af beskyttede aminosyrer (f.eks. p-nitrophenyl, pentafluorphenyl eller lignende) 20 eller symmetriske anhydrider.

Reaktionerne med spaltning, fjenelse af beskyt-5 telse, kløvning og fremstilling af derivater af poly- peptiderne udføres passende ved temperaturer mellem ca.

-10-50 °C mest foretrukkent ca. 20-25 °C . Den udvalg- - 25 te temperatur for en bestemt reaktion vil naturligvis være afhængig af substrat, reagenser, opløsningsmidler j og så videre, og vil kunne bestemmes af fagmanden. Man kan derefter rense det fuldstændigt af beskyttede poly-; peptid ved en række af chromatografiske trin, hvor man ^ 30 benytter en hvilken som helst eller alle af følgende typer: ionbytning på en svag basis harpisk på acetatform; gelpermeeringschromatografi, f.eks på Sephadex ^ G-25; hydrophobisk adsorptionschromatografi på ikke- si sxm 27 DK 173040 B1 derivatiseret polystyren-divinylbenzen (f.eks.

Amberlite XAD); silicagel adsorptionschromatografi; ionbytterchromatografi f.eks og Sephadex G-25, eller modstrømsfordeling; væskechromatografi med højt udbytte 5 (HPLC) Især revers fase HPLC på octyl- eller octade-cylsilyl-silica bundet fase pakket i søjler.

Selv om de syntetiske peptider ifølge opfindelsen kan fremstilles ved de ovenfor beskrevne kemiske fremgangsmåder, især den ovenfor beskrevne fastfasepeptid-10 syntese, med stort udbytte, kan man også ifølge opfindelsen fremstille de nye gag proteinfragmenter eller analoger deraf ved genteknologiske fremgangsmåder ifølge kendt teknik, idet man benytter passende enzymer og mikroorganismer (f.eks. bakterier, såsom E.coli) kan 15 man inkorporere DNA sekvensen, der koder for det ønskede polypeptid, i genomet i mikroorganismen og derved få mikroorganismen til at exprimere det relevante peptid.

Når et bestemt peptid er fremstillet og renset, kan det benyttes som hapten til fremstilling af en an-20 tigent immunogen og fra antigenet kan man nemt, stabilt og med godt udbytte fremstille antistoffer med specifik krydsreaktivitet for gag koreproteinet fra Hiv, med evne til at neutralisere Hiv. De specifikke antistoffer kan derfor benyttes som antisera til inhibering af re-25 plikation af HIV. Antistofferne kan benyttes til immunreaktiv rensning af proteiner fra Hiv, idet man binder disse antistoffer til bærere til anvendelse i f.eks. affinitetchromatografi og benytter de bundne antistoffer i affinitetschromatografien. De specifikke anti-30 stoffer kan også benyttes som specifikke antistoffer ved forskellige Immunologiske målinger af HIV. Som følge heraf er antistofferne ifølge opfindelsen nyttige til direkte og høj specifik diagnosticering af tilstedeværelsen af HIV i serum fra blod.

28 DK 173040 B1

Polypeptider, der udviser antigen opførelse som pl7 gag proteinet, og antistoffer frembragt for dem kan benyttes i sådanne diagnostiske fremgangsmåder til at bestemme tilstedeværelse af henholdsvis antistoffer til 5 HIV eller selve HIV. Disse polypeptider og deres antistoffer kan indpakkes i diagnostiske sæt, enten alene eller sammen med nogle eller alle af de andre Hiv, antigener og antistoffer. Disse omhandlede fremgangsmåder er ejendommelige ved det i de kendetegnende dele for 10 kravene 21-2 3 og 29-32 anførte, og de omhandlede sæt, der er ejendommelige ved det i kravene 24-28's kendetegnende dele anførte, tillader en hurtig og bekvem identificering af AIDS smittebærere og kan benyttes til forudsigelse af forløbet af ARC og AIDS. Nedenfor gives 15 en kort beskrivelse af et typisk radioimmunassay og ELISA bestemmelse af Hiv.

Radioimmunassay til bestemmelse af HIV:

Antistoffer ifølge opfindelsen fremstillet som ovenfor fæstes til en fast fase f.eks. indersiden af et rea-20 gensglas. Man sætter en prøve af patientens serum til glasset sammen med en kendt mængde omhandlede polypeptider, fremstillet som ovenfor, som er mærket med en radioaktiv isotop såsom radioaktivt iod. Et hvilket som helst HIV (med associerede gag proteiner) til stede i 25 patientens serum vil konkurrere med de mærkede polypeptider, der udviser den antigene virkning som pl7 gag proteinerne fra Hiv med hensyn til binding til de bundne antistoffer. Man fjerner overskud af væske, vasker reagensglasset og måler mængden af radioaktivet. Det 30 positive resultat dvs. indhold af HIV i patientens serum fås, hvis man ved tællingen finder en lav mængde radioaktivitet tilbage i glasset. I stedet for fastfase RIA som beskrevet ovenfor kan det i visse tilfælde være 29 DK 173040 B1 mere bekvemt at udføre væskefase RIA. Ved væskefase RIA fæster man ikke antistofferne der genkender HIV, til en fastfase, men de reagerer I væskefasen med patientens serum i konkurrence med det mærkede antigene materiale.

5 Man kan derefter bestemme antistof-antigen vekselvirk ningskomplekset ved en hviken som helst passende metode. p.eks kan man benytte et andet antistof, der kan reagere med det første antistof (såsom et anti-antistof fremstillet mod det første antistof, men i et andet 10 dyr) bundet til en uopløselig partikel til at fjerne komplekset fra væskefasen.

ELISA til bestemmelse af Hiv: man overtrækker en mikrotiterplade med antistoffer ifølge opfindelsen, og dertil sætter man en prøve af patientens serum. Efter 15 en inkubationsperiode tilladende vekselvirkning af et hvilket som helst pl7 gag protein fra HIV, der findes i serumet, med de bundne antistoffer, vasker man pladen.

Man tilsætter en præparation af antistoffer imod HIV, som kan være det samme antistof som på pladen (dvs. en 20 såkaldt "sandwich"), bundet til et enzym, ved inkube-ring tillader man, at en antistof-antigen reaktion finder sted, hvorefter man igen vasker pladen. Derefter sætter man enzymsubstrat til mikrotiterpladen og inkuberer sålænge, at enzymet kan virke på substratet, 25 hvorefter man til slut måler absorbansen. En stor ændring i absorbans er tegn på et positivt resultat.

De ovenfor beskrevne detaljer for radioimmunas-says og ELISA demonstrerer, at omhandlede peptider, med 30 evne til at frembringe antigener, der kan genkende HIV, tillader bestemmelse af HIV og af antistoffer for HIV ved standardfremgangsmåder, der allerede rutinemæssigt benyttes I medicinske laboratorier og forskningslabora- : torier.

30 DK 173040 B1

Peptiderne ifølge opfindelsen kan benyttes som mærkede antigener i radioimmunassay (RIA) eller enzym-immunassay (EIA), især enzymassocierede immunsorbentas- say (ELISA) idet man deri Indfører radioaktive stoffer 5 såsom 12®i, 131l, 3H(tritum), 14C etc.; diverse enzymreagenser såsom peroxidase (POX), chymotrypsinogen, procarboxypeptidase, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, amylase, phosphorylase, D-Nase, P-Nase, β-ga-lactosidase, glucose-6-phosphat-dehydrogenase, j 10 ornithin-decarboxylase, etc. Indførelsen af de ovenfor nævnte radioaktive forbindelser kan udføres ved kendt j teknik. F.eks. kan man indføre radioaktivt iod 125I ved en oxidativ ioderingsfremgangsmåde under anvendelse af chloramin T (W.M. Hunter og F.C. Greenwood, Nature, 15 194,495 (1962), Biochem, J., 89 144 (1966), eller ved anvendelse af Bolten-Hunter reagenset (125 i-ioderet p-1 hydroxyphenyl propionsyre N-hydroxy-succinimidester) som beskrevet i Biochem.J., 133, 529 (1973). Se eksempel 2 i US patentskrift nr. 4.264.571, etc.

20 Mere detaljeret kan man udføre denne fremgangsmå de i et passende opløsningsmiddel f.eks. 0,2M phosphat- pufferopløsning (pH 7,4) under tilstedeværelse af chloramin T ved omtrent stuetemperatur i løbet af ca.

10-30 sekunder. Peptidet, radioaktivt iod 125 og chlor-a 25 amin T benyttes i forholdet ca. 1 mCi radioaktivt iod pr. nmol tyrosin i peptidet og lo-ioo nmol chloramin τ Ξ pr. nmol tyrosin i peptidet, når man indfører et atom radioaktivt iod pr. molekyle tyrosin og ca. 2 mCI af ^ det radioaktive iod pr. nmol tyrosin, der findes i pep- 30 tidet og 10-100 nmol chloramin T pr. nmol tyrosin, der indeholdes i peptidet, når man indfører 2 atomer radioaktivt iod pr. molekyle tyrosin. De således fremstillede peptider mærkede med radioaktivt iod kan isoleres 31 DK 173040 B1 fra reaktionsblandingen og renses ved konventionel separationsteknik såsom ekstraktion, distribution, søjle-chromatografi, dialyse, etc. De således tilvejebragte peptider kan om ønsket opbevare efter frysetørring.

5 Hvad angår peptiderne ifølge krav 4 med formel {II)—1 hvori A1 er Tyr-Cys-Val-His-Gln-Arg eller Tyr-Ser-Val-His-Gln-Arg, kan man direkte indføre 125I i det N-terminale Tyr, såsom ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 3B i US patentskrift nr. 4.339.427.

10 Indførelsen af enzymreagenser kan udføres ved kendt teknik såsom konventionelle koblingsreaktioner f.eks. fremgangsmåden ifølge B.F. Erlanger, et al.

(Acta Edocrinol. Suppl. 168, 206 (1972)), fremgangsmåden ifølge M.H. Karol et al. method.,(Proc. Natl.Acd.

15 Sci. USA., 57.713 (1967)),etc. Mere detaljeret lader man et peptid og et enzym reagere i en pufferopløsning med en pH-værdi på 4-6, f.eks. lmM acetatpuffer (pH 4,4) under tilstedeværelse af et oxiderende middel som

NaI04 ve(j C3t stuetemperatur i 2-5 timer, hvorefter man reducerer med NaBH4 eller lignende. Man kan benytte enzymet i en mængde på 1-3 mol pr. mol af peptidet. Det foretrækkes, at det oxiderende middel anvendes i en mængde på ca. 100-300 mol pr. mol af peptidet, og at det reducerende middel benyttes i en mængde på ca. 1-2 2·* mol pr. mol af det oxiderende middel. Det således tilvejebragte enzymmærkede peptid kan isoleres, renses og opbevares på lignende måde som beskrevet ved peptidet mærket med radioaktivt iod.

Man ved, at polypeptider, dvs. peptider der inde-holder mindre end ca. 50 aminosyrer, ikke i almindelighed direkte vil føre til produktion af et tilsvarende antistof. Af denne grund plejer man at koble eller konjugere polypeptidantiget som hapten til en haptenbæ- 32 DK 173040 B1 rer, herefter omtalt som et "immunogent bærermateriale" hvorved man kan elicitere produktion af specifikke antistoffer i tilstrækkelig høje mængder, så de kan udvindes. Imidlertid er det også kendt, at visse polypep-5 tidantigener, deriblandt visse Hiv env peptider er me-I get stærkt immunogene og direkte kan få immunsystemet til at producere specifikke antistoffer. (Desværre har indtil nu ingen sådanne anti-env antistoffer været i ' stand til at neutralisere Hiv, antageligt fordi de spe- 10 cielle antigener I env proteinet ikke er nødvendige til S virusreplikation.). Selvom det ifølge opfindelsen i al mindelighed foretrækkes at benytte omhandlede peptider (deriblandt fragmenter og analoger) som haptener, koblet til et immungent bærermateriale, kan man også 15 ifølge opfindelsen, især når det drejer sig om peptider med i det mindste ca. 26 aminosyrer, direkte benytte peptider som vacciner eller som immunogene antigener ved fremstille af specifikke antistoffer, såvel som naturligvis i de diagnostiske sæt ifølge opfindelsen. Man 20 kan yderligere ifølge opfindelsen benytte hvilke som helst af de omhandlede peptider som polymereres, såsom dimer, trimer eller oligomer, dvs. gentagne sekvenser, der indeholder aminosyrerne fra det syntetiske peptid.

Man kan således polymerisere de syntetiske peptider og 25 opbygge en kæde på 2 eller flere gentagelsesenheder, så de gentagne sekvenser virker både som "bærer" og som center for immunologisk aktivitet.

Herefter beskrives fremgangsmåder til fremstilling af immunogene antigener under anvendelse af pepti-30 der ifølge opfindelsen som haptener mere detaljeret.

De nævnte antigener fremstilles, idet man benytter peptiderne ifølge opfindelsen som haptener og lader peptiderne reagere med et passende immunogent bærerma- i §3 £9 33 DK 173040 B1 teriale under tilstedeværelse af et hapten-bærer bindende middel, i dette tilfælde kan man i høj grad benytte naturlige og syntetiske proteiner med høj molekylvægt, som normalt anvendes ved fremstilling af anti-5 gener som bærere, der skal bindes til haptener. Derudover kan man ligeså godt benytte mindre peptider eller molekyler såsom tufsin (et tetrapeptid), analoge til tufsln og muramyldipeptider og deres analoge som "immunogent bærermateiale".

10 I denne forbindelse skal betegnelsen "immunogent bærermateriale" inkludere sådanne materialer som uafhæ-gigt kan fremkalde en immunogen respons hos en dyrevært og som kovalent kan bindes til polypeptidet, enten direkte via dannelsen af peptidbindinger eller esterbin-15 dinger mellem frie carboxyl- , amino-,eller hydroxy-grupper i polypeptidet og tilsvarende grupper i det immunogene bærermaterialer, eller alternativt ved tilbinding via en konventionel bifunktionel sammenbindende gruppe. Eksempler på sådanne bærere inkluderer albumi-20 ner fra dyreserum, såsom serumalbumin fra heste, kvæg, kaniner, mennesker, får etc.; globuliner fra dyreserum såsom serumglobulin fra heste, kvæg, kaniner, mennesker, får etc.; thyroglobuliner fra dyr såsom thyroglo-bulin fra heste, kvæg, kaniner, mennesker får etc.; hæ-25 moglobuliner fra dyr, såsom hæmoglobuliner fra heste, kvæg, kaniner, mennesker, og får etc. ; hæmocyaniner fra dyr, såsom "keyhole limpet" hæmocyanin (KLH) etc; proteiner extraheret fra ascaris (ascaris extrakter såsom beskrevet i Japansk patentansøgning (OPI) nr.

30 16.414/81., J.Immun.,111, 260-268 (1973), ibid., 122.

302-308 (1979), ibid., 98, 893-900 (1967) og Am. J.

Physiol., 199, 575-578 (1960), eller rensede produkter deraf); polylysin, polyglutaminsyre, lysin-glutamin- 34 DK 173040 B1 syre, copolymer, coplymere med indhold af lysin eller ornithin etc. Man har fornylig fremstillet vacciner under anvendelse af diphtheritoxoid eller tetanustoxoid som immunogent bærermateriale (se Lepow.M.L., et at., 5 j. of Infectious Diseases, Vol. 150, No. 3, side 402-406 (1984), og Coen Beuvery, E., et al., infection and Immunity 40, side 39-45 (April 1983), og man kan også i denne forbindelse benytte disse toxoide materialer. Andre passende bærere beskrives i f.eks. US pa-10 tentskrift 4.575.495, Inkluderende vacciner, organiske polymere etc.

Som hapten-bærer bindende midler kan man i stor udstrækning benytte sådanne, der konventionelt anvendes ved fremstilling af antigener. Eksempler på disse mid-15 ler inkluderer diazoniumforbindelser til tværbindingsdannelse i tyrosin, histidin, tryptophan etc., f.eks. bisdiazotiseret benzidin (BDB), etc.; alifatiske dialdehyder til dannelse af tværbinding med aminogrupper f.eks. C2-C7 alkanaler såsom glyoxal, malonedialdehyd, 20 glutaraldehyd, succinaldehyd, adipaldehyd, etc.; dima-leimid forbindelser til dannelse af tværbindinger mellem thiolgrupper f.eks. Ν,Ν'-o-phenylendimaleimid, Ν,Ν'-m-phenylendimaleimid, etc.; maleimidocarboxyl-N-hydroxysuccinimidestere til dannelse af tværbindinger 25 mellem en aminogruppe og en thiolgruppe, f.eks. m-ma-leimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester,4-(maleimido-methyl)-cyclohexan-l-carboxyl-N'-hydroxysuccinimidester, etc.,; midler benyttede i konventionelle reaktioner til dannelse af peptidbindinger, hvori man danner amidbin-30 dinger ud fra en aminogruppe og en carboxylgruppe, f.eks. dehydrerende og kondenserende midler såsom car-bodiimider f.eks. N,N-dicyclohexylcarbodimid,N-ethyl-N'-dimethylaminocarbodiimid,l-ethyl-3-diisopropylamino- i 35 DK 173040 B1 carbodiimid, l-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)-carbodiimid, etc. Som nævnte hapten-bærer bindende midler kan man også benytte de diazoniumarylcarboxylsyrer, såsom p-diazoniumphenyleddikesyre etc. sammen med kon-5 ventionelle midler til dannelse af peptidbindinger såsom de dehydrerende og kondenserende midler beskrevet ovenfor.

Den kovalente sammenbinding af thymosin α^_, peptidfragmenter deraf eller analoge dertil, til det immu-10 nogene bærermateriale kan udføres ved kendt teknik. Det er'således til direkte kovalent sammenbinding muligt at benytte et carbodiimid, mest foretrukkent dicyclohex-ylcarbodiimid eller l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid som koblende midler. I en sådan direkte 15 sammenbinding er det fordelagtigt at benytte et svagt surt reaktionsmedium, dvs. et medium med en pH værdi på ca. 3-6,5, mest foretrukkent ca. 4-6,5.

Den sammenkoblende reaktion til fremstilling af antigener, hvor man som haptener benytter peptider med 20 formel (I) eller formel (II) som er neutrale eller alkaliske, kan udføres på tilsvarende måde, men i en vandig opløsning eller sædvanlig pufferopløsning med en pH værdi på 7-10 foretrukkent pH 8-9, ved temperaturer på ca. 0-40 eC foretrukkent omkring stuetemperatur.

25 Reaktionen er almindeligvis løbet til ende efter ca.

1-24 timer foretrukkent 3-5 timer. Repræsentative pufferopløsninger, som kan benyttes i denne fremgangsmåde inkluderer: 0,2M natriumhydroxid-O,2M borsyre-0,2M kaliumchlorid 30 pufferopløsning; 0,2M natriumcarbonat-0,2M borsyre-0,2M kaliumchlorid pufferopløsning; 0,05M natriumtetraborat-0,2M borsyre-0,05M natriumchlo- 36 DK 173040 B1 rid pufferopløsning; 0,1M dihydrogenkaliumphosphat-0,05M natriumtetraborat pufferopløsning.

Man kan i det foregående selv på en passende måde 5 bestemme forholdet mellem hapten, hapten-bærer bindende middel og bærer, men det foretrækkes at benytte bæreren i en mængde på ca. 1-6 gange, foretrukkent 1-5 gange vægten af hapten og hapten-bærer bindende middel i en mængde på ca. 5-10 gange molmængden af haptenen. Ved 10 den ovennævnte reaktion bindes bæreren til haptenen via j hapten-bærer bindende middel til opnåelse af et ønsket antigen på form af et kompleks mellem peptid og bærer.

Når reaktionen er løbet til ende, kan man let i isolere og rense det således opået antigen ved dialyse, 15 gelfiltrering, fraktioneret udfældelse etc.

Det således opnåede antigen binder i gennemsnit 5-60 mol af det tilsvarende peptidet pr. mol protein og tillader, at man derefter kan fremstille et antistof, der er højt specifikt for antigenet. Især foretrækkes 20 antigener til hvilken peptidet bindes i en mængde på 5-20 mol, foretrukkent 8-15 mol i gennemsnit, da de er mere specifikke og tillader, at man tilvejebringer antistoffer med høj aktivitet og følsomhed.

Man fremstiller et antistof under anvendelse af 25 antigenet, idet man indgiver dette antigen foretrukkent under anvendelse af en adjuvant til pattedyr, hvorved det ønskede antigen fremstilles in vivo, og at man derefter udvinder antistoffet. Man kan opnå forbedre udbytte, hvis man gentager injektionerne over en tidspe-30 riode.

Selvom der ikke findes nogen egentlig afgrænsning af de dyr, der kan benyttes ved fremstillingen af antistoffer, foretrækker man almindeligvis at benytte kani- 37 DK 173040 B1 ner eller marsvin, men heste, geder, svin, rotter, køer, får, etc. kan også anvendes. Ved produktionen af antistoffer fortynder man en bestemt mængde af antigenet tilvejebragt som beskrevet ovenfor med en fysiolo-5 gisk saltopløsning til en passende koncentration og blander den dannede fortyndede opløsning med Freunds komplette adjuvans til opnåelse af en suspension. Denne suspension indgives til pattedyr. F.eks. indgiver man den ovennævnte suspension intracutant (0,1-5 mg/gang 10 afhængigt af indholdet af antigen) til kaniner.

Derefter indgiver man suspensionen hver anden uge over en periode pr. 2-10 måneder, foretrukket 4-6 måneder, til opnåelse af immunisering. Man udvinder antistoffet ved at indsamle blod fra de immuniserede dyr 1-2 uger 15 efter sidste indgivelse, man centrifugerer blodet og isolerer serum. Ifølge denne fremgangsmåde kan man opnå et antistof som selektivt danner kompleks med den antigene determinant fra AIDS-virus, især med pl7 gag koreproteinet ved positionerne 92-109, og man kan benytte 20 det som antiserum til immunisering af patienter i risikogruppen for AIDS (homoseksuelle, Haitianere, intravenøse stofmisbrugere osv.) er udsat for AIDS-virus eller lider af symptomer på AIDS eller ARC. Man kan også benytte antistofferne til analyse for Hiv retrovira, der 25 kan forårsage AIDS, idet man benytter RIA, ELISA etc.

F.eks. kan antistofferne ifølge opfindelse, når de benyttes i et serologisk assay, mærkes med en radioaktiv isotop til anvendelse i RIA eller med enzymer eller en fluorecerende substans ifølge kendt teknik til anven-30 delse i ELISA, fluorescens immunassay (FIA) etc.

Endelig kan antistofferne ifølge opfindelsen desolubl-liseres, idet man lader dem reagere med er konventionelt desolubiliserende middel.

38 DK 173040 B1

Opfindelsen tilvejebringer således som nævnt peptider, inkluderende fragmenter eller analoger deraf, som tilvejebringer en kraftig vaccine til neutralise-. ring af HIV. Vacciner ifølge opfindelsen kan således 5 benyttes til at immunisere patienter med risiko for AIDS, udsat for HIV eller til at behandle patienter med AIDS relateret kompleks eller med AIDS i udbrud.

Når vaccinen ifølge opfindelsen skal anvendes, kan den mest bekvemt Indføres i patienten ved injek-| 10 tion, intramuskulært, parenteralt, oralt eller subcu- i tant. Hvilken som helst sædvanlig væskeformig eller fast bærer kan anvendes, når den er forligelig med patienten og ikke har bivirkninger overfor ham eller virker nedbrydende for vaccinen. Man kan benytte phosphat-15 pufferet saltvand (PBS) ved en fysiologisk pH værdi, f.eks. pH 6,8-7,2 foretrukkent pH 7, som bærer alene eller med en passende adjuvans. Koncentrationen af im-munogent antigen kan variere fra ca.50-200, f.eks 100 yg pr. injektion, i et rumfang af opløsningsmiddel der 20 almindeligvis er ca. 0,25-1, f.eks. 0,5 ml. yderligere injektioner kan være nødvendige efter den første injektion, og de kan gives i intervaller på ca. 2-14 dage, f.eks. ca. 7 dage.

Som alternativ til den ovenfor beskrevne aktive 25 immunisering, hvori man til en vært indgiver immunogent antigent thymosin eller beslægtede peptider med formel (I) og (II), er det også muligt direkte til værten at indgive anti HIV antistoffer ifølge opfindelsen, sædvanligvis dyrket i en anden organismetype end vær-30 ten, selvom antistoffer dyrket i et andet individ af samme art som værten også kan anvendes. Når det drejer sig om sådanne passivt Immuniserende antisera, benytter man almindeligvis de samme indgivelsesmåder, de samme “8 r§i 39 DK 173040 B1 bærerer, og de samme eller højere doser som beskrevet ved den aktive immuniseringsfremgangsmåde. Man kan f.eks. indgive så meget som 1,5 g murint monoklonalt antistof uden særlig giftighed, hvis antistoffet indgives 5 langsomt f.eks. i løbet af 6 timer ved intravenøs infusion.

Et yderligere alternativ udførelsesform af den opfinderiske vaccine er som nævnt baseret på en anti-idiotypisk antistof fremkaldt mod et monoklonalt anti-10 stof mod et hvilket som helst af de omhandlede peptider. Anti-immunoglobin sera fremkaldt mod et monoklonalt antistof defineres som et anti-idiotypisk serum, den genkender den variable region i det fremkaldende antistof og rettes mod sammenkoblingsstedet. Dette 15 anti-idiotypiske antistof, som er rette mod kombinationsstedet, kan i virkeligheden indgå i stedet for det originale antigen. Derfor er det muligt at benytte denne mekanisme til at immunisere og fremkalder antistoffer mod de omhandlede peptider, eller fragmenter og 20 analoger deraf, som er lige så effektive eller mere effektiv end immunisering ved klassiske fremgangsmåder.

Til måling af specificiteten af antistofferne for thymosin peptidet overfor Hiv virale proteiner udførte man et sammenlignende radioimmunassay i lighed 25 med, hvad der beskrives i ovennævnte US patentskrift 4.264.571, og i US patentskrift 4.339.427. Man fandt, at HIV proteiner men ikke Rouscher murine leukæmi re-trovirale (RLV) proteiner kan udkonkurrere Ta^ i det kompetitive RIA. Resultaterne vises i fig. 2. HIV udvi-30 ser en lineær dosis-respons kurve mod Taj anti-serum, hvorimod RLV isolater ikke er krydsreaktive over for Ta^ antiserum. Disse resultater demonstrerer, at der er store mængder immunreaktivt Tc^ lignende materiale til 40 DK 173040 B1 stede i HIV isolatet, men ikke i et RLV isolat, og derved bekræftes at de homologe sekvenser i HIV og Ta^ ikke findes i RLV.

Til yderligere demonstration af specificiteten af 5 antistofferne for de nye antistoffer ifølge opfindelsen til HIV bestemte man krydsreaktionen for andre retrovi-ra med Tc^ ved kompetitivt RIA. Resultaterne vises i fig. 3. Hverken leukæmi retrovirus fra katte (FeLV), sarcoma retrovirus fra aber (SSV), leukæmi retrovirus 10 fra gibbonaber (GALV) eller leukæmi retrovirus fra mus (RVL) viste nogen kendelig krydsreaktivitet.

Eksempel 1 15 Eksemplet illustrerer fastfase peptidsyntese til fremstilling af et af de nye peptider ifølge opfindelsen nemlig [Ser]87 analogen af triacontapeptidet, der svarer til positionerne 86-115 i pl7 gag koreproteinet fra HTLV-III/LAV med formlen 20 Tyr-Ser-Val-His-Glo-Arg-Ile-Asp-Val-

Lys-Asp-Thr-Lys/'Glu-Ala-Leu-Glu-Lyé-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn-Lys-Ser-Lys-Lys-Lys-Ala.

25 Man anbringer Boc-Ala-OCH2-CgH4-harpiks (2 g, 1,0 mmol) (1.cyklus) i en peptidsyntesebeholder (150 ml) og behandler med 20 rumfang af de følgende opløsningsmidler og/eller reagenser, i følgende orden for hver cyklus 2-30: 30 (l) Forvask med 40% trifluoreddikesyre (TFA); (2) Omrøring 28 minutter med 40% trifluoreddikesyre (TFA); (3) Vask 3 gange med dichlormethan, CH2C12; 41 DK 173040 B1 (4) Forvask med 10% triethylamin (TEA); (5) Omrøring 5 minutter med 10% TEA; (6) Vask 3 gange med CH2Cl2; (7) Omrøring med Boc-Lys(ClZ)-OH (1,25 g, 3 mmol) 5 (2. cyklus) og dicyclohexylcarbodiimid (0,618 g, 3 mmol) i 120 minutter; (8) Vask 3 gange, hver gang med CH2Cl2/ 50% iso-propanol og CH2Cl2. Afslutning af sammenkoblingsreaktionen prøves ved ninhydrinreaktion.

10 Hvis sammenkoblingen er ukomplet, må trin (7) og (8) gentages.

Når sammenkoblingen er færdig, udfører man den næste og de følgende syntesecycler 3-30 ved at følge trin (l)-trin (8) og benytte hver af de beskyttede 15 (Boc)aminosyre i trin (7) i rækkefølge som følger: 42 DK 173040 B1

Cyfclus 3: Boc-Lys(ClZ)-OH(l.25 g); cyklus 4: Boc-Lys(ClZ)-OH(l. 25 g); cyklus 5: Boc-Ser(Bzl)-OH (0.89 g); 5 cyklus 6: Boc-Lys(C12)-0H (1.25 g); cyklus 7: Boc-Asn-OH (0.70 g) +l-hydroxjbenztxiazid (HBT) (0.92 g); cyklus 8: Boc-Gln-OH (0.74 g)+HBT (0.92 g); cyklus 9: Boc-Glu\OBzl)-OH (1.01 g): 10 cyklus 10: Boc-Glu(OBzl)-OH (1.01 g); cvklus il: Boc-Glu(0Bz1)-OH (1.01 g); cyklus 12: Boc-Ile-OH (0.72 g); cyklus 13; Boc-Lys(ClZ)-OH (1.25 g); cyklus 14; Boc-Glu(OBzl)-OH (1.01 g); 15 cyklus 15: Boc-Leu-OH (0.75 g) i cyklus 16; Boc-Ala-OH (0.57 g) ;

Cyklus 17: Boc-Glu(OBzl)-OH (1.01 g);

Cyklus 18: Boc-Lys(ClZ)-OH (1.25 g);

Cyklus 19: Boc-Thr(Bzl)-OH (0.93 g); 20 Cyklus 20: Boc-Asp(0Bz1)-OH (0.97 g); cyklus 21: Boc-Lws(ClZ)-OH (1.25 g);

Cyklus 22: Bop-Val-OH (0.65 g); cyklus 23: Boc-Asp(OBzl)-OH (0.97 g);

Cyklus 24: Boc-Ile-OH (0.72 g); 25 cvklus 25: Boc-Arg(Tos)-OH (1.29 g); cyklus· 26: Boc-Gln-OH (0.74 g)+HBT (0.92 g); cvklus 27: Boc-His(Tos)-OH (1.23 g); cyklus 28: Boc-Val-OH ft.65 g); cyklus 29: Boc-SerCBzl)-OH (0.89 g); 30 cyklus 30: Boc-Tyr(BrZ)-OH (1.49 g).

Denne fremgangsmåde tilvejebringer 6,18 g af kombinationen 30 aminosyrer-harpiks, på tørstofbasis.

En del af den beskyttede peptidharpiks (3,5 g) behandles med ca. 15 ml vandfri HF ved 0 eC under til- | 43 DK 173040 B1 stedeværelse af 5 ml anlsol 1 45 minutter. Overskud af syre fordampes bort og det dannede kløvede og afbeskyttede råpeptid vaskes kort med vandfri ether, og ekstra-heres med 150 ml 2% ammoniumacetat. Man indkoncentrer 5 denne peptidopløsning til ca. 40 ml og chromatograferer den indkoncentrede peptidopløsning på en Sephadex® G-10 søjle (2,6 x90 cm) med en 0,1 M eddikesyre som elue-ringsmiddel, og kontrol ved 280 nm.

De vigtigste peptidfraktioner samles og indkon-10 centreres til 50 ml. Efter frysetørring opnår man 1,09 g af idet væsentlige rent peptidprodukt ifølge høj-tryks-væskechromatografi (HPLC).

Eksempel 2 15

Radlolmmunassay

Man fremstiller en lageropløsning af syntetisk thymosin med koncentrationer egnet til brug i assays (mellem 0,5-37,5 ng pr. 100 μΐ) i RIA puffer og fryser 20 ved -10 eC. RIA puffer (RIAB) er phosphatpufret saltvand (pH - 7,4, 0,01 M natriumphosphat og 0,15 M NaCl), til hvilket man sætter 0,05% (vægt/rumfang) NaN3, 0,01 mM EDTA og 0,5% serumalbumin fra kvæg (50 g pr.l). Man fremstiller 9 standarder, der indeholder 0,5 til 37,5 25 ng pr. 100 yl syntetisk thymosin αχ udfra lageropløsningen og fryser ved 4 eC til anvendelse efter behov.

Prøver med ukendt indhold kræver 5-20 μΐ serum pr. assay og man tilsætter saltvand til opnåelse af en 100 μΐ prøve. Alle prøverør fortyndes med riab til et slutrum-30 fang på 400 μΐ. Man sætter en 50 yl prøve af lageranti-serum (1/200 fortynding) til hvert rør. Fortyndingen giver 20-25% binding af tracer og en slutfortynding på 1/2000. Man undersøger for ikke specifik binding ved at 44 DK 173040 B1 behandle rør, der indeholder alle forsøgsreagenserne undtagen specifik anti-thymosin antiserum. Rørerne rystes og inkuberes i 24 timer ved 4 "C . Man adskiller frit og bundet tracermateriale ved tilsætning af KYNAR 5 (gede antikanin IgG bundet til en polymer). Efter ryst-; ning og inkubering i 15 minutter ved stuetemperatur ud- I centrifugerer man immunprecipitatet ved 1500 g i 15 mi nutter ved 4 eC . Man bortsuger supernatanten og bortkaster den og måler radioaktiviteten i immunprecipita-10 terne i et automatisk gamma spectrometer (Beckman Gamma 4000). Man korrigerer minuttælletallet for standarder ! og ukendte prøver for ikke specifik baggrund, sædvan- ! ligvis 5% af den totale radioaktivitet, og dividerer i tallet med det korrigerede minuttælletal for prøverør 15 uden konkurrende antigen (BO). Data analyseres på et ; Beckman system DP 5500 hvor man afbilleder logaritmen af dosis (x-akse) mod målte tællinger og beregner data ved hjælp af 4 parametere logistisk fremgangsmåde, hvori dosis-respons kurven beskrives ved: 20 Y - (A - P) 1 - (x/c/ B +ΊΪ hvori Y = respons, x = koncentration, A = respons når x 25-0 (Bo), B - en hældningsfaktor, c - dosis der svarer til responset halvvejs mellem A og B, og D = dosis for uendelig koncentration.

& mm DK 173040 B1 45

Eksempel 3

Enzymassocieret lmmunsorbentassay - ELISA Man opdeler en lageropløsning af syntetisk Tax 5 fremstillet i phosphatpufferet saltvand ved koncentrationer passende for assayet, dvs. 6 dosisniveauer mellem 100-3200 pg/ml, i portioner, lagrer ved -20 eC og optøer til fremstilling af standardkurven. Pufferen til ELISA er phosphatpufferet saltvand, 8,0 g NaCl, 0,2 g 10 KH2P04, 1,15 g Ha2HP04 og 0,2 g KCl, til hvilket man tilsætter 0,75 ml Tween® 20 og 0,2 g NaNj i 1 liter destilleret vand pH 7,4. Standardopløsninger af syntetisk Tc^ (500 μΐ) eller ukendte prøver (250 μΐ) sættes til 12 gange 75 mm prøverør. Derefter tilsætter man 250 μΐ 15 puffer til de ukendte prøver og 500 μΐ af en 1:2500 fortynding af lagerantiserum til alle rør. Man ryster rørene, forsegler med parafilm og inkuberer natten over ved 4 °C . Man overtrækker brønde i en Costar fladbundet mikrotiterplade med syntetisk Ta^ idet man tilsæt-20 ter 100 μΐ/brønd af en 50 ng pr. ml ταΑ opløsning 1 Bulbeccos phosphatpufferet saltmedium (10 x, GIBCO,

Grand Island, NY) og inkuberer natten over ved 37 DC .

Man vasker pladerne med PBS/Tween® og blokerer med 200 μΐ hesteserum pr. brønd. Man tilsætter 100 yl af hver 25 af antistof-antigen opløsningerne til brøndene og inkuberer natten over ved 4 eC . Pladerne vaskes, og man sætter 100 μΐ af 1/1000 fortynding af biotinmærket anti-kanin-antistof i PBS-Tween® til hver brønd og inkuberer en time ved 37 *C . Man vasker pladerne, til-30 sætter 100 yl avidin alkalisk phosphatase (1:3000 fortynding i PBS-Tween®) og inkuberer pladerne yderligere en time. Til hver brønd sætter man 100 μΐ phosphatsub-strat (2 småpiller/10 ml diethanolaminpuffer) Man inku- 46 DK 173040 B1 berer pladerne 1 30 minutter og bestemmer OD. værdier for serumprøver fås derefter, idet man foretager en tilpasning for standarderne ved hjælp af mindste kvadraters metode.

5 Eksempel 4

Monoklonale antistoffer (sammenligning)

Man kan foretage en produktion af monoklonale antistoffer til thymosin peptider som følger, idet man i 10 eksempelvis benytter Ta^. Man sammensmelter milt fra mus, der producerer anti-Τα^, med SP20/myelomaceller, idet man benytter polyethylenglycol. Man fremstiller hybridcloner under anvendelse af hypoxanthin-aminopterin-thymidin (HAT) udvælgesesmedie og identifi-15 cerer derefter kloner, der producerer antistoffer til Ta^, ved hjælp af RIA og ELISA som beskrevet i eksemplerne 2 og 3. Man opretholder de monoklonale hybridoma i vævskultur og indfører dem i den peritoneale hulhed hos syngenetiske mus til ascitesproduktion af anti-20 thymosin ¢^.

Immunisering til opnåelse af anti-thymosin antistoffer foregår som følger: Man injicerer mus (Balb/c) med Ta^ konjugerete med muse IgG. Sammenkob-blingen foregår ved sammenblanding af 3,5 mg/ml synte-25 tisk Tdj og 7,0 mg pr. ml muse IgG (Miles Laboratory,

Elkhart, in) samt 40 yl gluteraldehyd i 3½ time, hvorefter man natten over dialyserer mod saltvand. Konju-gatet blandes den første dag med et lige så stort rumfang af Freunds komplette adjuvant, og man injicerer 30 100 yg/0,1 ml i.p. i 8 mus. Man giver forstærkende injektioner på uge 2 og uge 4 med 10 yg konjugeret Tc^ og ukomplet Freunds. Man tapper blod fra musene fra en halevene den 5 uge og undersøger serum ved hjælp af ELISA

ϋ . - a ! 47 DK 173040 B1 for anti-thymosin c^. Kort fortalt anbringer man 5 ng Τσ·^ 1 hver brønd på en mikrotiterplade og tilsætter forskellige fortyndinger af museserum, hvorefter man inkuberer i en time. Efter vask tilsætter man anti-mus 5 IgG koblet til alkalisk phosphatase, inkuberer i en time, vasker og tilsætter substrat. 4 dage før fjernelsen af milten til fusionen får musene en forstærkende injektion med 20 pg i.p. eller i.v. af et thymosin-lgG konjugat.

10 Fusionen foretages på følgende måde: fusionscel lerne (8-azaguanin-resistente SP20 myelomaceller) bringes i log-fase ved daglig bearbejdning i 5 dage for fusionen. Man udtager milten fra musene, vasker med RPMI og udsuspenderer til samme rumfang som myelomacellerne 15 (10® pr. ml). Cellerne blandes og udcentrifugeres ved 600 g. Man fjerner supernatanten og tilsætter forsigtigt i løbet af 1 minut 1 ml 50% polyethylenglycol ved 37 "c. Man sammenblander cellerne endnu et minut, tilsætter langsom 8 ml varm DMEM og udcentrifugerer cel-20 lerne. Cellerne udsuspenderes nu ved en koncentration på 2 x 106/ ml og man sætter 0,1 ml til hver brønd i en mikrotiterplade. Man udskifter mediet efter behov (RPMI med 20% serum fra kalvefostre). Efter 14 dages forløb benytter man HT medium og undersøger de relevante brøn-25 de for antistof under anvendelse af ELISA og RIA.

De positive brønde underkastes derefter begrænsende fortynding med præpareret HT medium, indtil man kan fastslå at de er monoklonale. De prøves igen, både ifølge RIA og ELISA, og opretholdes både i vævskultur 30 og i ascites hos synergeniske mus primet med 0,5 ml pristan 1-3 uger, før de modtager hybriden. Ved indsamling af ascites kan man opnå en tilstrækkelig mængde materiale, fra hvilket man kan indkoncentrere det mono- 48 DK 173040 B1 klonale antistof.

Eksempel 5 5 Produktion af gag polypeptld ved genteknologi under anvendelse af E.coli.

Man kan enten eksprimere hele pi7 gag kodesekvensen (til fremstilling af hele gag proteinet fra HIV) som strækker sig fra methioninkodonet til glutaminkodo-10 net eller en hvilken som helst afkortet kodende sekvens, der strækker sig over det mindste nucleotiderne, I der koder for aminosyrene fra positionerne 92, isoleu- cinkodonet, til position 109, af asparaginkodonet, under kontrol af hybriden tryp/lac promoter operator i * 15 E.coli. Man kan derefter inducere polypeptidet ved IPTG, der inducerer lac operon.

Man kan indføre et passende sæt transkriptions og translationssignaler ved at introducere et Ncol sted ved startkodonet (f.eks. methioeninkodonet) og derefter 20 tilsætte en speciel repressionsvektor såsom PMFZOlTet, som inkluderer den hybride tryp/lac promotor, lac operatoren og en kraftig ribosombindingssekvens anbragt, så methionin i det nabostillede Ncol sted er optimalt placeret til translation af det transkriberede mRNA, og 25 så hele den kodede sekvens effektivt vil blive tranla-teret i E.coli.

Man producerer hybride B gal-GAG fusionspolypep-tider under anvendelse af passende fragmenter genererede ved hjælp af restriktionendonuclease, af DNA indsat 30 i genet for galactosidase tæt ved enten NH2 terminus eller COOH terminus, man identificerer rammen ved hjælp af gal enzymaktivitet i kolonierne. Disse proteiner kan renses ved affinitetschromatografi, idet man benytter i 49 DK 173040 B1 affiniteten for B galactosidase for substratanaloge.

Eksempel 6 5 Eksemplet demonstrer effektiviteten af de nye gag polypeptider ifølge opfindelsen til at frembringe produktion af serum antistoffer i kaniner.

Man kobler det syntetiske gag triacontapeptid fra eksempel 1 med "Keyhole Limpet" hæmocyanin (KLH) ved 10 hjælp af glutaraldehyd under anvendelse af følgende fremgangsmåde. Ækvivalente mængder (tør vægt) af hvert protein,triacontapeptid og hæmocyanin opløses i 0,25 M NaP04 , pH 7,0 puffer med en koncentration på 2 mg pr. ml. Man blander lige store rumfang af proteinopløsnin-15 gerne og tilsætter et rumfang glutaraldehyd (25% vandig opløsning) der svarer til 1% af rumfanget af proteinblandingen. Man lader reaktionen foregå i 3 timer under omrøring ved stuetemperatur, fortynder med sterilt saltvand til en slutkoncentration af triacontapeptid på 20 100 yg pr. ml, hvorefter man opdeler opløsningen af sammenkoblet polypeptider i portioner og lagrer ved -20 eC .

Blandingen af produkter, der er resultat af de krydsbindende reaktioner udført ved stuetemperatur, 25 skal ikke fraktioneres eller renses på nogen måde. Man fortynder KLH konjugatet med normalt sterilt saltvand og lagrer i kulden til anvendelse ved immuniseringer.

Man immuniserer kaniner, idet man indgiver 100 yg polypeptid (som KLH konjugat) i emulsion med Freunds 30 komplette adjuvans på 15-20 intradermale steder på ryggen af hver kanin, idet man følger fremgangsmåden fra Vaitukaitis et al., J. Clin. Endoch. 33,988 (1971). Der foretages derefter ugentlige forstærkende indsprøjtnin- 50 DK 173040 B1 ger med 10 yg polypeptid pr. dyr i Freunds ukomplette adjuvans på mange intradermale steder. Man opnåede mængder af antistof mod peptidet, som kunne måles ved . ELISA som beskrevet ovenfor i eksempel 3 efter en hvi-5 leperiode på kun tre uger, en følgende forstærkende indsprøjtning med 100 yg polypeptid og aftapning af blod fra hver kanin 7 dage efter hver forstærkende ind-sprøjning.

Man fortynder serum fra hver kanin 1:10 med PBS

; 10 og foretager ELISA assay som beskrevet I eksempel 3.

. Resultaterne for den kanin med det højeste indhold af antistof vises I fig. 4, hvor uge 1 repræsenterer værdien før aftapning af blod. Den højeste koncentration af antistof findes i uge 4.

kfl

H

ϋ i i

Claims

51 DK 173040 B1

1. Peptid med evne til at frembringe antistoffer, der kan genkende human immundefektvirus, kendetegnet ved, at det har formlen:

2. Peptid med evne til at frembringe antistoffer, der kan genkende human immundefektvirus, kendetegnet ved, at det har formlen (I): 10 Ile-Y1-Y2-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala- Leu-Y-j-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn hvori

3. Peptid eller peptidanalog med evne til at frembringe antistoffer, der kan genkende human immun- 20 defektvirus, kendetegnet ved, at peptidet har formlen (II) eller en repeterenhed deraf: A-Ile-Yj^-Yj-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala- (II) Leu-Y^-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn-B 25 hvori Y^ er Asp eller Glu, Y2 er Val eller Ile, og Y3 er Glu eller Asp, 30. er H eller en aminosyresekvens på 1-10 aminosyrer, der i det væsentlige korresponderer til en opstrøms aminosyresekvens fra pi7 gag proteinet, og B er OH eller en aminosyresekvens på 1-10 aminosy-35 rer, der i det væsentlige korresponderer til en nedstrøms aminosyresekvens fra pl7 gag proteinet. 52 DK 173040 B1

4. Peptid ifølge krav 3,kendetegnet ved, at det har formlen (II)-1: A1-Ile-Y1-Y2-Lys-Asp-Thr-Lys-Glu-Ala- (II)-1

5. Peptid ifølge krav 4, kendetegnet ved, at Υ^^ er Asp, Y2 er Val og Y3 er Glu.

5 Leu-Y^Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn-B1 hvori Yj, Y2 og Y3 er som defineret i krav 3, A1 er valgt fra H, Arg, Gin-Arg, His-Gln-Arg, Val-His-Gln-Arg, Ser-Val-His-Gln-Arg, Cys-Val-His-Gln-Arg, Tyr-Ser-

5 Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu- Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn.

6. Peptid ifølge krav 4, kendetegnet ved, at Y^ er Glu, Y2 er Ile og Y3 er Asp.

7. Peptid ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det er et triacontapeptidfragment af HIV-l ved positionerne 86-115 fra pl7 gag koreproteinet, eller er 20 (Ser)87 analogen deraf med formlen: Tyr-Aj-Val-His-Gln-Arg-Ile-Asp-Val-Lys- Asp-Thr- Lys-Glu-Ala-Leu-A2-Lys-Ile-Glu-Glu-Glu-Gln-Asn- Lys-Ser-Lys-Lys-Lys-Ala, 25 hvori Α^^ er Cys eller Ser, og A2 er Asp eller Glu.

8. Immunogenisk antigen, kendetegnet ved, at det omfatter et peptid ifølge et hvilket som helst af de forrige krav kovalent bundet til et immu-nogent bæremateriale.

9. Antigen ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det immunogene bæremateriale er valgt fra albuminer, globuliner, thyroglobuliner, hæmoglobuliner, hæ-! mocyaniner, ascaris proteinekstrakt, polylysin, poly- glutaminsyre, copolymerer af lysin og glutaminsyre, co- 35 polymerer af lysin og ornithin, difteritoxoid eller tetanustoxoid. i i 53 DK 173040 B1

10. Antigen ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det immunogene bæremateriale er Keyhole limpet hæmocyanin.

10 Val-His-Gln-Arg eller Tyr-Cys-Val-His-Gln-Arg, og B* er valgt fra OH, Lys, Lys-Ser, Lys-Ser-Lys, Lys-Ser-Lys-Lys, Lys-Ser-Lys-Lys-Lys eller Lys-Ser-Lys-Lys-Lys-Ala.

11. Antigen ifølge et hvilket som helst af kravene 5 8 til 10, kendetegnet ved, at peptidet er mærket med henblik på serologisk påvisning af et for nævnte antigen specifikt antistof.

12. Antigen ifølge krav 11, kendetegnet ved, at mærkningen er med en radioaktiv isotop.

13. Antigen ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den radioaktive isotop er 125I, 2H eller 14C.

14. Vaccine til anvendelse ved forhindring eller behandling af erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) eller

15. Antistof, kendetegnet ved, at det 20 er specifikt for et peptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7.

15 AIDS-relateret kompleks (ARC) »kendetegnet ved, at den omfatter en terapeutisk effektiv mængde af et peptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7 og en farmaceutisk acceptabel bærer.

15 Y^ er Asp eller Glu, Y2 er Val eller Ile, og Y3 er Glu eller Asp.

16. Monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det omfatter et antistof ifølge krav 15, der er fremstillet ved fusion af en udødelig cellelinie til en 25 immunoglobulinproducerende plasmacelle, der producerer dette specifikke antistof.

17. Antiserum til anvendelse ved forhindring eller behandling af erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) eller AIDS-relateret kompleks (ARC) »kendetegnet 30 ved, at det omfatter en terapeutisk effektiv mængde af et antistof ifølge krav 15 eller 16 og en farmaceutisk acceptabel bærer.

18. Anti-idiotypisk antistof, kendetegnet ved, at det er frembragt mod et antistof ifølge 35 krav 16. 54 DK 173040 B1

19. Vaccine til anvendelse ved forhindring eller behandling af erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) eller AIDS-relateret kompleks (ARC) »kendetegnet ved, at den omfatter en terapeutisk effektiv mængde af 5 et anti-idiotypisk antistof ifølge krav 18 og en farmaceutisk acceptabel bærer.

20. Fremgangsmåde til ved fastfasesyntese af fremstille et peptid ifølge krav 7, i hvilket A1 er Ser, og A2 er Glu, kendetegnet ved, at man 10 (a) midlertidigt kemisk beskytter den reaktive amino-gruppe i C-terminal alanin; (b) kemisk binder det beskyttede alanin via dettes carboxylsyregruppe til en harpiksbærer; I (c) kemisk afbeskytter den reaktive aminogruppe i det 15 harpiksbundne beskyttede alanin; (d) kemisk via en peptidbinding tilkobler lysin, den næste aminosyre i aminosyresekvensen for dette peptid, ved i nærvær af et koblingsmiddel at bringe den har- \ piksbundne aminosyre fra trin (c) i kontakt med lysin, 20 hvis reaktive aminogrupper er beskyttet kemisk; (e) kemisk afbeskytter den reaktive a-aminogruppe i det tilkoblede lysin fra trin (d); (f) fortsætter syntesen, idet man gentager trin (d) og (e) med følgende aminosyrer, i hvilke α-aminogruppen og 25 en vilkårlig anden reaktiv gruppe ud over den a-stille-de carboxylsyregruppe er beskyttet kemisk, i nævnte rækkefølge, indtil hele sekvensen for det beskyttede triacontapeptid er opbygget på harpiksen: lysin, lysin, serin, lysin, asparagin, glutamin, glutamat, glutamat, 30 glutamat, isoleucin, lysin, glutamat, leucin, alanin, glutamat, lysin, threonin, aspartat, lysin, valin, aspartat, isoleucin, arginin, glutamin, histidin, valin, serin og tyrosin; og (g) spalter det beskyttede triacontapeptid fra harpiks-35 bæreren og afbeskytter de beskyttede reaktive grupper. fl n 55 DK 173040 B1

21. Fremgangsmåde til fremstilling af et antistof ifølge krav 15 til ikke-terapeutiske og ikke-kirurgiske formål, kendetegnet ved, at man til et pattedyr indgiver et peptid ifølge et hvilket som helst af 5 kravene 1 til 7, enten alene eller som et hapten koblet til et immunogenisk bæremateriale, til dannelse af antistoffet, og at man udvinder antistoffet fra serum fra pattedyret .

22. Fremgangsmåde til påvisning af HIV i krops-10 væsker fra mennesker, kendetegnet ved, at man bringer en prøve af kropsvæsken i kontakt med et antistof ifølge krav 15 eller med et monoklonalt antistof ifølge krav 16 og måler dannelsen af antigen-antistof -komplekser ved hjælp af radioimmunassays, enzym-15 associerede immunsorbentassays eller indirekte immun-fluorescensassays.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 22, k ende-tegnet ved, at man måler dannelsen af et antigenantistof -kompleks ved et radioimmunassay under anven- 20 delse af I som radioaktivt mærket isotop.

24. Diagnostisk prøvesæt til påvisning af HIV i kropsvæsker fra mennesker, kendetegnet ved, at det omfatter en rumopdelt lukket beholder indeholdende mangebrøndsplader, der er overtrukket med anti- 25 stof ifølge krav 15, samt ELISA materiale til enzymatisk påvisning inkluderende normalt dyreantiserum og enzym, mærket anti-antistof-antiserum og en farveæn-drende indikator.

25. Diagnostisk sæt til serologisk påvisning af 30 Hiv i væskeprøver fra mennesker ved radioimmunassay, omfattende en beholder, et dække og i beholderen mærket antigenisk materiale og antistoffer mod HIV og midler til påvisning af antistof-antigen-reaktionskomplekser, kendetegnet ved, at det antigeniske materi-35 ale er et peptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7, og antistoffet mod HIV er valgt fra antistof- 56 DK 173040 B1 fer til peptidet med formel (I) ifølge krav 2 og antistoffer til peptidet med formel (II) ifølge krav 3.

26. Diagnostisk sæt ifølge krav 25, k ende-tegnet ved, at midlerne til påvisning omfatter et 5 antistof, der er reaktivt over for de nævnte antistoffer mod HIV.

27. Diagnostisk sæt til serologisk påvisning af HIV i væskeprøver fra mennesker ved Western Blot eller immunblotmetoder, omfattende en beholder, et dække og 10. beholderen et nitrocelluloseark, en skive polyacryl-amidgel og natriumdodecylsulfat, samt yderligere et eller flere overfladeaktive midler, pH-modifikatorer og bovint serumalbumin, midler til påvisning af dannelse af et antistof-antigen-reaktionskompleks og en kilde 15 for antistof til krydsreaktion med de antigeniske determinanter fra pi 7 koreproteinet i væskeprøven, kendetegnet ved, at antistoffet er valgt fra antistoffer ifølge krav 15.

28. Diagnostisk sæt ifølge krav 27, kende-20 tegnet ved, at midlerne til påvisning inkluderer fortyndet normalt antiserum fra et første dyr og et radioaktivt mærket antistof, der er krydsreaktivt med dette normale antiserum.

29. Fremgangsmåde til analyse for HIV eller vira-25 le HIV proteiner i en prøve, hvilken fremgangsmåde omfatter at blande prøven med en kendt mængde mærket peptid og et antistof, der selektivt vil kompleksdanne med dette virus eller de virale proteiner, at skille det dannede antistof-antigen-kompleks fra ikke kompleks- 30 deltagende mærket peptid, at måle graden af binding for ' det mærkede peptid i komplekset og at bestemme den til stedeværende mængde af virus eller virale proteiner i prøven ved at sammenligne graden af binding med en standardkurve opnået ved at blande kendte mængder HIV 35 og virale proteiner med fastlagte mængder af det mærkede peptid og antistoffet og bestemme graden af bin- i 57 DK 173040 B1 ding for hver kendt mængde af HIV og virale proteiner, kendetegnet ved, at peptidet er et sådant ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7, og antistoffet er et antistof ifølge krav 15.

30. Fremgangsmåde ifølge krav 29, kende tegnet ved, at man benytter et radioimmunassay og et radioaktivt mærket peptid.

31. Fremgangsmåde ifølge krav 30, kendetegnet ved, at det radioaktivt mærkede peptid er 10 triacontapeptidet ifølge krav 7.

32. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 29 til 31, kendetegnet ved, at man skiller antistof-antigen-komplekset fra opløsningen ved hjælp af en dobbelt-antistofmetode under anvendelse af 15 et andet antistof, der er immunologisk reaktivt mod serum fra den dyrevært, i hvilken det for HIV specifikke antistof blev frembragt.