DK172673B1 - Immunstimulerende præparat samt anvendelse heraf - Google Patents

Description

i DK 172673 B1

Den foreliggende opfindelse angår forstærkning af værtsforsvarsmekanismer i pattedyr, fx immunstimulering.

Tidligere kendt teknik har vist, at ernæringsmæssig supplerende terapi, som gives til patienter enten gennem munden 5 (enteralt) eller gennem en vene (parenteralt), er effektiv til at modvirke katabolisme og stimulere anabolisme. Denne forbedring i patientens metaboliske tilstand antages at være kritisk for helingsprocessen og nødvendig for patientens overlevelse. Det er imidlertid blevet observeret, at patien-10 ter, som modtager kemisk definerede parenterale og enterale ernæringsmæssige regimener, ofte har kompromitterede værts-forsvarsmekanismer. Denne kompromittering af immunsysternet kan, selv når det metaboliske system er ved at komme sig, medføre forøget morbiditet og mortalitet som følge af sepsis 15 og svigt af flere organer.

I de senere år har opmærksomheden været rettet mod at identificere de biokemikalier eller næringsstoffer, som mangler i alle kommercielt tilgængelige parenterale ernæringsmæssige produkter og alle kommercielt tilgængelige enteriske diæter 20 med defineret indhold. Rudolph og Van Buren har vist, at tilsætning af nukleinsyrer (RBA) til diæter med defineret indhold, som gives til dyr, medførte forbedrede værtsforsvarsmekanismer. Endvidere har Barul og Daly vist, at når arginin gives i mængder, der er større end kroppens behov for 25 proteinsyntese, forstærkes værtsforsvarsmekanismerne. Dette påvises ved forøget blastogenese af lymfocytter som respons på mitogener i dyr og mennesker; reduceret tumorhyppighed og -forekomst; forøget overlevelse hos dyr; og forøget cellemodtagelighed for lymfokiner.

30 Det har også vist sig, at omega-6-fedtsyrer (polyumættede vegetabilske olier, der typisk findes som lipidkilde i ernæringsmæssige produkter) trænger ind i kroppens metaboliske omsætningsveje, hvor de fungerer som precursorer for den familie af prostaglandiner, der er forbundet med inflammation ' 35 og hæmning af værtsforsvarsmekanismer. Omega-3-fedtsyrer (der { t r f DK 172673 B1 2 typisk findes i fiskeolie), som administreres til mennesker eller dyr enten parenteralt eller enteralt, trænger ind i de biosyntetiske omsætningsveje og omdannes fortrinsvis til den familie af prostaglandiner, som har vist sig hverken at være 5 inflammatoriske af natur eller immunsuppressive.

Alexander har beskrevet, at når omega-3-fedtsyrer og supplerende arginin gives til forbrændte marsvin og mennesker, medførte dette forbedrede værtsforsvarsmekanismer, hvilket blev bestemt ved en reduktion af forekomsten af sepsis og den 10 generelle morbiditet.

Når de ovenfor nævnte biokemikalier og næringsstoffer blev administreret alene, gav de en vis grad af forøget immunforstærkning eller formindsket immunsuppression hos dyr og mennesker, som modtog parenteral eller enteral ernæring med 15 defineret indhold. Imidlertid nævner den kendte teknik intet om administration til dyr eller mennesker af kombinationer af disse forbindelser, enten med eller uden forøgede mængder af mikronæringsstoffer til immunforstærkning.

Den foreliggende opfindelse angår immunstimulerende præpara-20 ter og deres anvendelse ved fremgangsmåder, der forstærker værtsforsvarsmekanismer, fx præparater, der forstærker genoprettelsen af en defekt eller hæmmet immunfunktion i mennesker.

Den foreliggende opfindelse angår typisk immunstimulerende 25 præparater, der omfatter en sammensat immunstimulerende mængde bestående af s a) 3-40 g arginin eller en tilsvarende mængde af en arginin- precursor eller orthinin, b) 0,1-4 g RNA eller en tilsvarende mængde af en anden 30 nukleobase-kilde, c) 0,1-20 g omega-3-polyumættede fedtsyrer og DK 172673 B1 3 d) 0,1-20 g omega-6-polyumættede fedtsyrer.

Selv om en del af ornithin og arginin kan administreres i proteinform, er proteiners arginin- og ornithinindhold almindeligvis så lavt, at der kan ses bort fra bidraget fra en 5 eventuelt tilsat proteinkilde til arginin- og ornithinind-holdet i præparatet ifølge opfindelsen.

Den mængde argininbestanddel, der skal tilvejebringes, kan variere inden for vide grænser, bl.a. afhængigt af den ønskede behandling, den patient, der skal behandles, samt dennes 10 behov. Præparater kan fortrinsvis være formuleret til at give en daglig administration af 10-30 g, især 15-22 g arginin (i fri aminosyreform). Ornithin og/eller andre forbindelser, der er forbundet med syntese af polyaminer, kan anvendes i stedet for arginin i et 1:1 molforhold eller kan anvendes i kombi-15 nation med arginin.

Nukleobase-kilder, der er egnede til anvendelse i præparatet ifølge opfindelsen, omfatter eller består af naturlige nukle-obaser, nukleosider, nukleotider, RNA, DNA, ækvivalenter dertil og/eller blandinger, der omfatter én eller flere af 20 disse forbindelser.

Naturlige nukleobaser omfatter purineme adenin og guanin samt pyrimidinerne cytosin, thymin og uracil. Når nukleobase-kilden er i form af frie nukleobaser, er den fortrinsvis uracil.

25 Naturlige nukleosider omfatter ribosenukleosideme adenosin, guanosin, uridin og cytidin samt deoxyribosenukleosiderae deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxythymidin og deoxycytidin.

Naturlige nukleotider omfatter phosphatestere af naturlige nukleosider såsom monophosphateme adenylat (AMP), guanylat 30 (GMP), uridylat (UMP), cytidylat (CMP), deoxythymidylat (dTMP), deoxycytidylat (dCMP) og diphosphater og triphos-phater af naturlige nukleosider såsom ADP og ATP.

DK 172673 B1 4 ! Der foretrækkes en oprenset nukleobase-kilde såsom gær. Der kan imidlertid anvendes andre kilder såsom kød og lignende.

Den mængde nukleobase-kilde, der skal administreres, vil bl.a. afhænge af den ønskede behandlingstype, den patient, 5 der skal behandles, og lignende. Præparaterne ifølge opfindelsen kan fortrinsvis være formuleret til at give en daglig administration af 1-3 g, især 1,25-2,5 g RNA eller en tilsvarende mængde af en anden nukleobase-kilde. Til den foreliggende opfindelses formål anses én vægtenhed nukleobase for S 10 at svare til 2,5-3,0 vægtenheder RNA, DNA, nukleosider eller nukleotider.

Til den foreliggende opfindelses formål kan de omega-3-polyumættede fedtsyrer (PUFA) være i fri syreform eller i en

Li form, der er egnet til fysiologisk tilførsel af omega-3-L 15 PUFA'er, fx i triglyceridform. Eksempler på omega-3-PUFA'er, Γ der er særligt egnede til anvendelse i præparaterne ifølge opfindelsen, omfatter eicosapentaensyre (EPA) og docosahexa-ensyre (DHA). Egnede kilder til sådanne omega-3-PUFA'er er kendte. De omfatter linolie og fiskeolier såsom menhadenolie, 20 lakseolie, makrelolie, tunolie og ansjosolie, især menhaden-olie.

Den mængde omega-3-PUFA, der skal administreres, vil bl.a. afhænge af behandlingstypen, den patient, der skal behandles, og lignende. Præparaterne ifølge opfindelsen kan være for-25 muleret til at give en daglig tilførsel af 0,1-15 g, især 0,15-10,0 g omega-3-fedtsyrer.

i” Til den foreliggende opfindelses formål kan omega-6-PUFA'erne være i fri syreform eller i en form, der er egnet til fysiologisk tilførsel af omega-6-PUFA'er, fx i triglyceridform.

30 Eksempler på omega-6-PUFA'er, der er særligt egnede til anvendelse ifølge opfindelsen, omfatter linoleinsyre og arachidonsyre (ETA), idet linoleinsyre især foretrækkes.

Bksempler på egnede omega-6-PUFA-kilder er kendte på området.

De omfatter vegetabilske olier. Der foretrækkes omega-6-PUFA- i i ·· hm i DK 172673 B1 5 kilder med et højt linoleinsyreindhold såsom farvetidselolie, solsikkeolie, sojaolie, bomuldsfrøolie og majsolie.

Den mængde omega-6-PUFA'er, der skal tilføres, vil bl.a. afhænge af behandlingstypen, den patient, der skal behandles, 5 og lignende.

Præparaterne ifølge opfindelsen giver typisk en daglig tilførsel af 0,15-15 g, især 0,5-10 g omega-6-PUFA’er.

Præparaterne ifølge opfindelsen kan formuleres i en form, der er egnet til parenteral eller enteral administration. De er 10 særligt egnede til enteral anvendelse, fx til oral administration, nasal administration og/eller tilførsel gennem slanger. Sådanne præparater administreres hensigtsmæssigt i form af en vandig væske. De præparater ifølge opfindelsen, der er egnede til enteral applikation, er derfor fortrinsvis 15 i vandig form eller i pulverform, idet pulveret hensigtsmæssigt tilsættes vand før anvendelse. Til tilførsel gennem slanger vil den mængde vand, der skal tilsættes, bl.a. afhænge af patientens væskebehov og tilstand.

Præparatet ifølge opfindelsen kan omfatte vitaminer, minera-20 ler, sporelementer samt yderligere nitrogen-, carbonhydrat-og fedtsyrekilder.

I overensstemmelse med en foretrukken udførelsesform af opfindelsen er præparaterne ifølge opfindelsen i form af en flydende diæt med komplet indhold, således at i det væsent-25 lige alle daglige behov for kalorier, nitrogen, fedtsyre, vitaminer, mineraler og sporelementer er opfyldt ved anvendelse som eneste ernæringsmæssig kilde.

I almindelighed vil den daglige kaloriemængde, en voksen person skal have tilført, ligge i området 750-3500 kcal/dag, 30 især 1000-2000 kcal/dag. Afhængigt af patientens tilstand, fx til anvendelse mod postkirurgisk traume, kan det være ønskeligt indledningsvis (fx fra dag 1 til 5) at administrere en DK 172673 B1 6 hypokalorisk daglig mængde og at øge energitilførslen derefter for at opfylde de normale daglige kaloriebehov. Nitrogenkildens, carbonhydratkildens og lipidkildens bidrag til den samlede daglige kaloriemængde kan variere inden for vide 5 grænser. I foretrukne præparater ifølge opfindelsen tilvejebringer carbonhydratkilden 40-70% af den samlede energitilførsel, og nitrogen- og fedtsyrekilden tegner sig hver især for 15-30% af den samlede energitilførsel i præparatet.

Eksempler på egnede nitrogenkilder omfatter ernæringsmæssigt 10 acceptable proteiner såsom caseinater eller proteinhydrolysa-ter.

Eksempler på egnede carbonhydratkilder omfatter maltodex- j triner.

Eksempler på egnede fedtsyre-energitilførselskilder omfatter j 15 triglyceridkilder.

Foretrukne eksempler på triglyceridkilder, der er egnede til anvendelse i præparatet ifølge opfindelsen, omfatter trigly-ceridolier, som tilvejebringer de ønskede mængder omega-3- og omega-6-fedtsyrer, og som er rige på fedtsyrerester med 20 mellemkædelængde (dvs. rester af C6_12-fedtsyre) og/eller monoumættede fedtsyrerester. Triglyceridkilden tilvejebringer fortrinsvis en balance mellem de forskellige typer umættede I fedtsyrer, især mellem polyumættede omega-3-, polyumættede omega-6- og monoumættede omega-9-fedtsyrer, for at tilveje- 25 bringe de producerede eicosanoider.

I Egnede kilder til sådanne triglycerider er fx fysiske bland- ) inger af LCT (langkædede triglycerider) og MCT (mellemkædede triglycerider) eller strukturerede lipider (triglycerider).

De MCT og LCT, der er egnede til anvendelse i de fysiske 30 blandinger, kan anvendes i ren form eller i form af olier, der er rige på MCT eller LCT. LCT-kilderne er som nævnt ovenfor hensigtsmæssigt rige på essentielle fedtsyrerester.

m i DK 172673 B1 7

Egnede MCT-kilder er fx vegetabilske olier, herunder kerne-olier såsom palxnekerneolie, kokosnøddeolie, balassuolie, cohuneolie, tucumolie og fraktioner deraf. Den foretrukne MCT-vegetabilske olie er kokosnøddeolie.

5 Foretrukne præparater ifølge opfindelsen omfatter trigly-cerlder, der tilvejebringer en daglig tilførsel på fra 1 til 30 g, fortrinsvis 2-20 g, især 8-15 g, mellemkædede fedtsyrer, især af laurinsyre.

Særligt foretrukne præparater ifølge opfindelsen omfatter 10 triglycerider, der tilvejebringer en daglig tilførsel på fra 1 til 30 g, fortrinsvis 5-25 g, især 5-20 g, monoumættede fedtsyrer. Egnede kilder til monoumættede fedtsyrer er omega- 9-monoumættede fedtsyrer, der er rige på oliesyre. Eksempler på sådanne kilder omfatter oliven, canola, farvetidsel (hy-15 brider) og solsikke (hybrider).

Eksempler på vitaminer, der er egnede til inkorporering i præparatet ifølge opfindelsen, omfatter vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, vitamin C, folinsyre, thiamin, riboflavin, vitamin B6, vitamin B12, niacin, biotin og pantothensyre 20 i farmaceutisk acceptabel form.

Eksempler på mineralelementer og sporelementer, der er egnede til inkorporering i præparatet ifølge opfindelsen, omfatter natrium, kalium, calcium, phosphor, magnesium, mangan, kobber, zink, jern, selen, chrom og molybdæn i farmaceutisk 25 acceptabel form.

Især omfatter præparaterne ifølge opfindelsen fortrinsvis β-karoten (vitamin A), vitamin E, vitamin C, thiamin, vitamin Bl2, cholin, selen og zink i farmaceutisk acceptabel form.

Den mængde præparat ifølge opfindelsen, der er egnet til at 30 opfylde de daglige behov hos en patient, der lider af hæmmede værtsforsvarsmekanismer, vil typisk omfatte 3-40 g arginin eller en fysiologisk tilsvarende mængde af en argininprecur- DK 172673 B1 8 sor eller ornithin eller en blanding af sådanne forbindelser sammen med 0,1-4,0 g nukleobase-kilde, 0,1-20 g omega--3-fedtsyrer og 0,1-20 g omega-6-fedtsyrer. En sådan daglig enhedsmængde giver hensigtsmæssigt en energitilførsel på 5 750-3500 kcal/dag.

De immunstimulerende præparater ifølge opfindelsen er egnede til anvendelse i patienter, der lider af hæmmede værtsforsvarsmekanismer, fx i patienter, der lider af hæmmede værts-forsvarsmekanismer som følge af postkirurgisk traume, cancer, 10 kemoterapi/stråleterapi, sepsis, traume, brandsår, immunsuppressiv lægemiddelterapi, fejlernæring, transfusionsinduceret immunsuppression og lignende.

I Det har vist sig, at kroppen under alvorlig stress ikke let kan mobilisere de næringsstoffer, der er nødvendige for at 15 sikre en normal immunfunktion. Administration af præparatet ifølge opfindelsen gør det muligt at bibeholde, genoprette og ! forstærke immunfunktionen, når dette ønskes. Immunsysternet reagerer overraskende hurtigt og gunstigt på administration af præparatet ifølge opfindelsen.

20 Sådanne præparater kan følgelig anvendes til forstærkning af i en hæmmet værtsforsvarsmekanisme, til genoprettelse af en normal immunfunktion hos et menneske med et defekt immunrespons, til forstærkning af udviklingen af immunsysternet i et menneske under udvikling eller til forstærkning af et ! 25 aldrende immunsystem hos et menneske.

Den foreliggende opfindelse angår følgelig også et præparat ifølge opfindelsen til anvendelse ved en fremgangsmåde til opretholdelse eller stimulering af immunsystemet hos en patient, der har behov for en sådan behandling.

30 Opfindelsen angår yderligere anvendelse af a) arginin, en argininprecursor eller ornithin, DK 172673 B1 9 b) en nukleobase-kilde, c) omega-3-polyumættede fedtsyrer og d) omega-6-polyumættede fedtsyrer ved en fremgangsmåde til fremstilling af et diætpræparat til 5 stimulering af immunfunktionen i et menneskes krop.

Præparatet ifølge opfindelsen kan fremstilles på i og for sig kendt måde, fx ved blanding af bestanddelene.

Opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet nærmere under henvisning til nedenstående eksempler.

DK 172673 B1 10 EKSEMPEL 1

Prsparat A (1 kcal/cm3) pr. 1500 cm3

Nitrogenkilde 5 Intakt protein (Na/Ca-caseinater) 65,0 g

Arginin 18,75 g

Carbonhydratki1de

Maltodextriner 197,6 g

Lipidkilde 10 Strukturerede lipider (Captex® 710A) 25,0 g

Menhadenolie (raffineret, ikke-hydro- generet) 16,75 g

Typisk fedtsyreprofil (MCT 8-13 g, fx 11,5 g) (linoleinsyre 2,5-4,5 g) (eicosa-15 pentaensyre -(EPA)- 1,0-2,0 g) (docosa- hexaensyre -(DHA)- 0,25-1,00 g) (mono-umættede fedtsyrer 8-11 g, fx 10 g) (polyumættede fedtsyrer 6-10 g, herunder fx 3,6 g omega-6-PUFA og 3,0 g omega-3-PUFA) 20 RNA-kilde Gær-RNA 1,88 g

Typisk nukleotidprofil (uracil 0,34-0,47 g) (cytosin 0,15-0,28 g) 25 (guanin 0,56-0,77 g) (adenin 0,53-0,649 g) (thymin 0,01-0,09 g) ΤΪ DK 172673 B1 11

Vitamin og mineraler % USRDA1 % NASRDA2

Vitamin A (iu) 10,000 200 200

Vitamin D (iu) 400 100 100

Vitamin E (iu) 90 200 300 5 Vitamin κ {/ig) 100 *** 70-140+

Vitamin C (mg) 120 200 200

Folinsyre tøg) 600 150 150

Thiamin (mg) 3,0 200 200

Riboflavin (mg)q 2,55 150 150 10 Vitamin B6 (mg) 2,2 100 110

Vitamin B12 tøg) 12,0 200 200

Niacin (mg) 30,0 150 150

Cholin (mg) 400 *** 400-900++

Biotin (mg) 0,3 100 0,1-0,2+ 15 Pantothensyre (mg) 10,0 100 4-7+

Natrium (g) (1,1-2,5) 1,6 *** 1,1-3,3+

Kalium (g) (1,9-3,0) 1,9 *** 1,87-5,629+

Chlorid (g) (1,7-3,0) 2,0 *** 1,7-5,1+

Calcium (g) 1,2 120 120 20 Phosphor (g) 1,2 120 120

Magnesium (mg) 400 100 100 lod tøg) 150 100 100

Mangan (mg) 3,0 *** 2,5-5,0+

Kobber (mg) 2,5 125 2,0-3,0+ 25 Zink (mg) 22,5 150 150

Jern (mg) 18,0 100 100

Selen tøg) 150 +** 50-200+

Chrom tøg) 150 +** 50-200+

Molybdæn tøg) 300 *** 150-500+ 30 Vand 75-80 vægtprocent af det samlede præparat

Nitrogenkilde 335 kcal - 22% af den samlede kalorie- mængde

Carbonhydratkilde 790 kcal - 53% af den samlede kaloriemængde 35 Lipidkilde 375 kcal - 25% af den samlede kalorie mængde DK 172673 B1 12 (1) USRDA = United States Recommended Dietary Allowances (2) NASRDA = National Academy of Sciences Recommended Dietary Allowances + Beregnede sikre og tilstrækkelige daglige diætindek- 5 ser af udvalgte vitaminer og mineraler, NAS 1980, 9th

RDA

++ Beregnet område for indtagelse ! *** Ingen USRDA fastlagt EKSEMPEL 2 10 Denne undersøgelse blev foretaget på patienter under intensiv behandling ("intensiv afdeling"; ITA) med længere tids ITA-ophold efter traume, sepsis eller omfattende generel kirurgi.

Materialer 03 metoder

Denne kliniske undersøgelse var randomiseret, dobbeltblind og 15 prospektiv. Den var godkendt af Human Investigations Committee på University of Minnesota. Alle patienter deltog, efter I at der var opnået skriftligt informeret tilsagn.

Kriterierne for deltagelse var: ITA-patienter, mænd eller kvinder, som var 21-80 år gamle og havde gennemgået en kirur-20 gisk begivenhed, på grund af hvilken de var indlagt på ITA.

Disse begivenheder omfattede traume, mere omfattende elektiv i generel kirurgi samt kirurgiske infektioner. Hver patient måtte være minimalt til moderat underernæret; være under moderat metabolisk stress; skulle bedømmes som egnet til I 25 enteral ernæring i 7-10 dage; og skulle bedømmes til at være i stand til at tåle al næringstilførsel ad enteral vej.

4 DK 172673 B1 13

Alle patienter modtog H2 - receptorantagonister som en del af et stress-ulcus-profylakse-regimen. Al anden behandling blev givet i overensstemmelse med kliniske behov.

Der lå ingen specifik udløsende begivenhed til grund for 5 deltagelse i undersøgelsen. Hver patient skulle snarere opfylde ovenstående kriterier. Derfor kunne de være i ITA i et variabelt tidsrum før deltagelse i undersøgelsen. Denne parameter kaldes: dage indtil deltagelse. Under dette tidsrum blev hver patient holdt på parenteral ernæring, der påbe-10 gyndtes inden for 24 timer fra begivenheden og havde det generelle indhold: 1,5-2,0 g/kg/dag aminosyrer, 1,0 g/kg/dag fedt og de resterende kalorier som glucose med 30-35 totale kcal/kg/dag.

Når patienten havde nået et punkt i ITA-forløbet, hvor en-15 teral ernæring blev overvejet, blev der anbragt en fødesonde, og den parenterale ernæring blev standset. Indikationerne for sonde-ernæring var: en tilstrækkeligt fungerende tarm og hensigtsmæssig adgang til denne fungerende tarm. Fødesonden var en nasoenterisk, vægtet fødesonde, der blev anbragt efter 20 maveporten og ind i duodenum under fluoroskopi. Patienten blev derpå randomiseret af forskningsapoteket ved åbning af en forseglet kuvert, læsning af instruktionerne og fordeling af patienten til den relevante gruppe. Blind-ernæringerne blev givet af forskningsapoteket til ITA og givet som en 25 kontinuerlig infusion med en purrøe. Sonde-ernæringen blev påbegyndt med fuld styrke med 25 ml/time og fortsat med stigninger på 25 ml/time hver 12. time, indtil det nødvendige volumen pr. dag var opnået. Dette tidsrum fra påbegyndelse af sonde-ernæring til opnåelse af den fulde dosis kaldes: dage 30 indtil målet. Undersøgelsesdag l var den første dag, patienten i fuldt omfang modtog det beregnede kaloriebehov.

Patienten fortsatte i undersøgelsen, indtil der var givet 7-10 dages fuld terapi.

To ernæringsmæssige komplette diæter blev anvendt i under-35 søgelsen. Præparat A ifølge opfindelsen og som standard DK 172673 B1 14

Osmolite* HN, lactosefri, caseinatbaseret enteral ernæringsindhold, som er kommercielt tilgængelig fra Ross Laboratories.

Den mængde af diæten, der blev givet, blev beregnet ud fra 5 energiforbruget. Energiforbruget blev beregnet som det basale energiforbrug (BEE) under anvendelse af Harris-Benedict-ligningerne; og under anvendelse af 150% BEE som den mængde kalorier, der er nødvendig på dagsbasis.

På undersøgelsesdagene 0, 3 og 7-10 blev følgende parametre 10 bestemt: serumglucose, blodurinstofnitrogen (BUN), kreatinin, leverfunktionstests, blodpladetal, protrombintid, trigly-cerid, albumin og plasmatransferrin. Yderligere blod blev taget til in vitro immunstimuleringsundersøgelser? Con A, HA og tetanus. Urin og afføring blev opsamlet dagligt med hen-15 blik på total nitrogenanalyse. De kemiske bestemmelser blev udført ved standardlaboratoriemetoder. Immunfunktionsundersøgelserne blev udført i Immunobiology Research Laboratories på University of Minnesota. Nitrogenbalance blev beregnet som nitrogen ind - nitrogen ud; hvor nitrogen ud - nitrogen i 20 urinen + nitrogen i afføringen + 1,0. Værdierne blev korrigeret for BUN og vægtændring.

Alle patienter, der gennemførte undersøgelsen, blev underkastet dataanalyse. En fejlslået behandling blev anset for at være til stede hos en patient, som oplever alvorlig into-25 lerance over for diæten, hvilket udelukker administration af den enterale ernæring, eller som har en uønsket reaktion over for diæten.

Fejlslåede behandlinger og patienter, der ikke gennemførte undersøgelsen, blev udelukket fra dataanalysen.

' i i 30 Data for optagelseskarakteristika blev analyseret ved en enkelt variansanalyse. Data over undersøgelsesintervallet bortset fra immunfunktionundersøgelseme blev analyseret ved en dobbelt variansanalyse for diættype og tid (undersøgelses- li

l._ I

DK 172673 B1 15 dag). Immunfunktionsundersøgelserne blev analyseret ved regressionsanalyse. Hvert datapunkt for hver undersøgelse blev beregnet som procentuel ændring fra grundlinjen på dag 0 af undersøgelsen. En regressionslinje blev derefter beregnet 5 for hver patient i hver undersøgelse i både gruppen, der fik kontrol (Osmolite· HN), og gruppen, der fik forsøgspræparat A (som defineret i eksempel 1). Disse regressioner blev derefter behandlet som en population for hver variabel, og en Z-score blev bestemt for både kontrol- og forsøgsgruppen i hver 10 immunfunktionsundersøgelse for at konstatere, om ændringen over tiden var signifikant forskellig fra 0. En Z-score blev derefter beregnet mellem kontrol- og forsøgsgruppen for hver undersøgelse for at konstatere, om de to linjer var signifikant forskellige fra hinanden. I alle tilfælde blev signifi-15 kansen defineret som P < 0,05.

Resul tater

Der var 11/13 patienter, der gennemførte behandlingen, i præparat A-gruppen og 9/9 i Osmolite· HN-gruppen. De to, der ikke fuldførte, var begge patienter, der ikke gennemførte 20 undersøgelsen; én trak sig selv ud på dag 1, og én fik ingen ernæring i over 24 timer. Der var ingen statistiske forskelle mellem grupperne. De kliniske tilstande var også de samme.

Alle patienterne havde sepsis eller sepsis-syndrom (se R.C.

Bone et al., Crit. Care Med. 17, 389-393 (1989) og F.B.

25 Cerra, Surgery 101, 1-14 (1987)) efter traume, sepsis eller omfattende generelle kirurgiske indgreb.

Dataresultaterne stemmer overens med det synspunkt, at diæt-præparatet ikke blot er vigtigt til påvirkning af klassiske ernæringsmæssige resultater såsom nitrogenbalance, men også 30 til påvirkning af andre systemiske og måske eraæringsspeci-fikke virkninger såsom det lymfoproliferative respons in vitro over for Con A, HA og tetanus-antigen.

DK 172673 B1 16

Der var Ingen påviselige forskelle i den administrerede ernæring eller i de ernæringsmæssige resultater af ernæringen. Der var heller ikke nogen forskelle i mortaliteten og længden af opholdet.

5 Resultaterne af in vitro stimulering af perifere blodlymfocytter med Con A, HA og tetanus-antigen er vist i henholdsvis fig. 1, 2 og 3. I alle tre tilfælde var kontroldiæten forbundet med en nedadgående tendens, mens tendensen med diæten ifølge opfindelsen (præparat A) var forbundet med 10 forøget respons-evne.

EKSEMPEL 3 i i !

Dette eksempel viser resultaterne af en prospektiv randomi-seret undersøgelse, der sammenligner virkningerne af en ernæringsmæssig enteral formulering ifølge opfindelsen med en 15 standard enteral diæt (Osmolite® HN) for patienter, der gennemgår en større operation for øvre gastrointestinale maligne sygdomme.

Materialer og metoder

Voksne patienter med gastrointestinale (GI) maligne sygdomme, 20 hvilke patienter skulle gennemgå en større abdominal operation, blev inddelt på grundlag af omfanget af deres vægttab (mindre end 10% sædvanlig kropsvægt i forhold til mere end eller lig med 10% sædvanlig kropsvægt) og de blodtransfusioner, de havde modtaget under deres operation (ingen i forhold 25 til mere end eller lig med 1). Patienterne blev derefter randomiseret til én af to behandlingsgrupper. Gruppe I-pati-enter modtog enteral ernæring med præparat A (defineret ovenfor), mens gruppe Il-patienter modtog Osmolite· HN.

På operationstidspunktet gennemgik alle patienter de pro-30 cedurer, der var indikeret som følge af deres primære lokalisation og stadium af sygdommen. En nålekateter-jejunostomi blev anbragt i den proksimale jejunum. Blod- og væskeerstat- ! DK 172673 B1 17 ning blev fortsat intravenøst som klinisk indikeret for hver patient. Kl. 11.00 om formiddagen den første postoperative dag blev jejunostomi-patienter randomiseret til at modtage enten præparat A eller Oemolite® HN. Formlerne var kodede, og 5 undersøgerne var blindede indtil efter fuldførelse af dataanalysen.

Gastrointestinal symptomatologi blev bedømt og optegnet dagligt.

Alle patienter blev forsynet med en eller anden form for 10 nasogastrisk sondedrænering, idet sonden blev fjernet, når der var klinisk indikation derfor. Bortset fra klare væsker, der blev indtaget oralt, modtog patienterne ingen ernæring de første 7 postoperative dage. Alle patienterne modtog intravenøse (IV) væsker, 5* dextrose og 0,5% normal saltvandsopiøs-15 ning og andre elektrolytter som klinisk indikeret.

Alle patienternes kropsvægt blev bedømt dagligt. Al intravenøs og enteral indtagelse blev målt, og et kalorie/nitrogen-forhold blev beregnet. Urinen blev opsamlet for hver 24 timers periode; urinnitrogenindholdet blev målt ved Kjeldahl-20 teknikken, og kreatinin blev målt med et automatiseret system (Technicon, Tarrytown, NY). Urinnitrogenniveuaer blev beregnet for hver 24 timers periode ved måling af urinkreati-nin-udskillelse og korrektion for ændring i serumurinstof-nitrogenniveauer. Der blev ikke gjort forsøg på at opsamle 25 afføringen. I fravær af diarré blev der ikke udskilt nogen betydende mængde afføring, før den orale indtagelse blev genoptaget efter dag 7.

Immunfunktionsundersøgelser

Blod blev opsamlet kl. 8 om morgenen dagen før operationen og 30 på dag 1 og 7 efter operationen. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) blev isoleret fra hepariniseret veneblod ved Ficoll-Hypaque-densitetsgradientcentrifugering. Celler blev vasket tre gange med Hanks afbalancerede saltopløsning DK 172673 B1 18 (HBSS), resuspenderet i komplet medium og talt. Cellernes levedygtighed blev bestemt ved trypan blue-farveeksklusion.

Frisk isolerede PBMC blev suspenderet i en koncentration på 1 x 106 ml i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium 5 tilsat 10% varmeinaktiveret puljet normal blodtype A-serum, 2 rriM glutamin, 100 enheder/ml penicillin og 100 mg/ml streptomycin. PBMC blev dyrket i en koncentration på 1 x 10e ml i fladbundede mikrotiterplader med/uden 10 mg/ml Con A eller phytohæmagglutinin (Sigma, St. Louis, MO) . Kulturerne blev 10 inkuberet i en fugtig inkubator ved 37eC i 5% C02 i tre dage.

14 timer før høstning blev 1 μϋΐ tritieret thymidin sat til hver brønd, og radioaktiviteten i pellets blev talt i en væskescintillationstæller (Tricar, Model 500, Packard, Sterling, VA) . Data udtrykkes som et stimulationsindeks. Stimula-15 tionsindekset er lig med middeltællinger pr. minut af stimulerede lymfocytter i forhold til middeltællinger pr. minut af ustimulerede lymfocytter. Data er angivet som middel ± standardafvigelse fra middel. Statistisk signifikans blev bestemt ved p < 0,05-niveauet ved Students uparrede t-test.

20 Resultater

Patientkarakteristika og1 metaboliske data

Ved optagelsen i undersøgelsen var patientkarakteristika homogene. 31 patienter blev undersøgt. Gennemsnitsalderen for patienter i præparat A- (I) og Osmolite* HN- (II) -grupperne 25 var henholdsvis 63 og 66 år. Den præoperative diagnose og operative procedurer var ens for de to grupper. Postoperativ total kalorieindtagelse var ens for behandlingsgrupperne.

Immundata

De gennemsnitlige stimulationsindekser over for Concanavalin 30 A (Con A) og lymfocytrespons over for nitrogen-phytohæmagglu-tinin (PHA) er angivet i nedenstående tabeller: i « DK 172673 B1 19

Imntunfunk tion: PHA

Gennemsnitligt stimulationsindeks ± SD * P - 0,01

Gruppe I II

5 Præoperativt 115 ± 119 135 ± 103

Postoperativt dag 1 90 ± 86 84 ± 79

Postoperativt dag 7 188 ± 109 83 ± 61*

Immunfunktion: Con A

Gennemsnitligt stimulationsindeks ± SD 10 * P - 0,06

Gruppe I II

Præoperativt 29 ±31 27 ± 23

Postoperativt dag l 15 ± 22 13 ± 12

Postoperativt dag 7 24 ± 33 10 ± 8* 15 EKSEMPEL 4

Virkning af diætbestanddele på in vivo cellemedieret immun -respons i mus

Materialer og metoder

Dyr 20 Ca. 12 uger gamle, vægtafstemte Balb/c-hunmus (H-2b) (NIH-Jax Labs) blev anvendt som modtagere og syngeniske miltcelle-donorer og C57bl/6-hunmus (H-2d) som allogene miltcelle-donorer. Efter modtagelse af dyrene blev de akklimatiseret i DK 172673 B1 20 et dyreopholdsanlæg i flere uger før påbegyndelse af forskellige forsøgsdiæter. De blev holdt på en cyklus med 12 timers lys og mørke med foder og vand ad libitum. Dyrene blev anbragt med 5 pr. bur, og forsøgsdyrene blev observeret 5 dagligt og kropsvægtene optegnet ugentligt.

Foder Følgende blev anvendt: F Standardlaboratoriefoder ("chow") leveret af Purina med kodenummer 5008 og omfattende 23,5 vægtprocent af 10 en proteinkilde fra sojabønner, fiskebenmel og mælk DF Et proteinfrit foder tilgængeligt fra Purina med kodenummer 5765c, hvor energitilførslen er justeret med carbonhydrat NF Grundfoder, nukleotidfrit foder leveret af Purina med 15 kodenummer 5775 og omfattende 21 vægtprocent casein

som proteinkilde. NF er isokalorisk og med samme nitrogenindhold som præparat F

NFR NF tilsat 0,25% gær-RNA

Ml En blanding af 86,2 vægtprocent af et eksperimentelt 20 ikke-fedtholdigt 90% pulver bestående af 21 dele casein, 15 dele saccharose, 3 dele Solka Floc (en fiber), 2 dele vitaminblanding, 5 dele mineralblanding, 0,15 dele dL-methionin, 0,20 dele cholinchlorid og 43,65 dele dextrin (i det følgende Purina 5758 25 M-T) med 0,57% RNA, 5,75% arginin og 7,5% menhaden- olie M2 En kombination omfattende 86,93 vægtprocent Purina 5785 M-T, 0,57% RNA, 5,62% arginin, 4,99% menhaden-olie og 1,89% farvetidselolie i DK 172673 B1 21 herunder følgende NF- og NFR-baserede fodere tilsat glutamin eller alanln: NF + 2% glutamin NF + 4% glutamin 5 NFR + 2% glutamin NFR + 4% glutamin NF + 4% alanin NF + 8% alanin NFR + 4% alanin 10 Bestanddelene blev blandet i en Kitchen Aid-mixer, og der tilsattes en tilstrækkelig mængde demineraliseret vand til dannelse af en tyk dej, som derefter blev rullet ud på ba-gepapir ved hjælp af en kagerulle. Den udrullede dej blev derefter skåret i små stykker under anvendelse af en pizza-15 skærer.

Alle foderne blev nedfrosset i fryseposer med lynlås, indtil de skulle anvendes efter behov. Fiskeolieholdige foderposer blev skyllet med nitrogengas før opbevaring.

Fodrlngeprograia og PLN-assay (knæhase-lymfeknudeassay) . Alle 20 dyrene blev vejet på dag 0. Derefter blev én gruppe dyr fodret med "chow" (F) under hele forsøgsperioden. Alle de andre dyr blev fodret med proteinfrit (PF) foder i ca. 7 dage, og når de havde mistet ca. 20% af deres kropsvægt, blev alle dyrene inokuleret i den ene bagpotes trædepude med 1 x 25 107 syngeniske Balb/c bestrålede (3000 R) miltceller i et volumen på 50 μΐ. Den kontralaterale trædepude modtog 1 x 107 allogene C57B1/6 bestrålede (3000 R) miltceller i et volumen på 50 μΐ. Musene blev inokuleret under etheranæstesi. Samme dag blev de PF-fodrede dyr randomiseret opdelt i flere grup-30 per, som fik ovennævnte forsøgsdiæter. På den 7. inokula-tionsdag blev dyrene aflivet, og knæhase-lymfeknuderne blev fjernet og vejet på en Mettler-vægt (HL-52). Resultaterne af stimulationsindeks beregnes som følger: DK 172673 B1 22

Vægt af allo-stimuleret PLN

; Stimulationsindeks (S.I.)

Vægt af syn-stimuleret PLN

S ta tistik 5 Statistisk analyse blev udført ved den "tohalede" T-testmetode, hvor resultaterne af forsøgsgrupperne blev sammenlignet med grupperne med NF-grundfoder. Der anvendtes hele tiden et 95% signifikansniveau.

Resultater f 10 Resultaterne af PLN-assayet er opsummeret i følgende tabel: i * Γ i

S

DK 172673 B1 23

PLN-ASSAY

Foder Allo Syn Delta b.I.

(mg) (mg) (mg) F 5,29±,44 1,64±,09 3,ø5i,52* 3,30i,42* .PF-F 4,09±,45 1,47±,40 2,611,39 3,31l,60 5 .PF-HF 3,44±,37 1,001,11 1,701,32 2,07i,20 .PF-NFR 5,07±,79 1,20±,20 3,86l75* 4,501,82* .PF-PF l,37±,lfl 1,00±,05 0,301,16* 1,301,15* .PF-NF+2% Glutamin 3,701,30 1,31±,13 2,441,24 2,91l,20* .PF-NF+4% Glutamin 3,48t,40 1,01,12 1,001,39 2,2i,24 10 .PF-NFR+2% Glutamin 3,701,31 1,68±,16 2,1±,44 2,37i,34 .PF-NFR+4% Glutamin 4,501,30 2,401,27 2,171,55 2,05i,39 .PF-NF+2% Alanin 3,311,32 l,02i,13 1,601,34 2,091,28 .PF-NF+8% Alanin 4,501,44 1,01,17 2,96i,30* 2.93i,33 .PF-NFR+4% Alanin 3,53i,29 1,501,23 l,95l,25 2,35l,25 15 .PF-H1 3,721,31 1,841,24 1,001,51 2,24i,45 .PF-M2 0,031,08 1,201,00 4,77i,03* 4,77i,40* * p < 0,05 sammenlignet med PF NF-gruppe N - 5/gruppe dag 0 - start på PF-foder

20 dag 8 - skift til specielle fodere og injiceret PLN

dag 15 - PLN høstet I denne dyremodel blev der opnået alvorlig proteindepriva-tionsinduceret fejlernæring ved den initiale fodring med PF-foder, hvilket blev påvist ved vægttab og generel morbiditet 25 med pukkelryg og kruset pelsudseende. Den immunologiske konsekvens af denne proteindeprivation ses ved det formindskede in vivo PLN-respons hos værter, der har fået PF-foder, over for alloantigen-eksponering i sammenligning med værter fodret med grundfoder (NF) (p < 0,05%) og værter fodret med 30 "chow". For værter, der blev fodret med NF-grundfoder, hjæl- DK 172673 B1 24 per foderets proteinindhold med til at få kropsvægten og det generelle udseende til at genvinde den normale værdi. Der er nogen stigning i PLN-responset, men signifikant lavere end værter fodret med "chow" eller NFR. Omdannelse til proteinbe-5 rigede fodere hjælper med til, at værternes kropsvægt genvinder niveauerne for "chow"- fodrede dyr.

| Glutamin, alanin og kombinationer af RNA, arginin og fedt stoffer (fiskeolie og farvetidselolie) blev testet i forhold til Ml og M2. Glutamin i koncentrationer på 2% og 4% (w/w) 10 blev testet, og alanin i koncentrationer på 4% og 8% (w/w) blev anvendt til fremstilling af kontroller med samme nitro-I genindhold.

r PLN-responserne for glutamin og alanin i de testede doser var effektive til genoprettelse af den tabte kropsvægt og ge-h 15 nerelle sundhedstilstand, men de var ikke i stand til at forbedre eller genoprette immunfunktionen som indikeret af deres PLN-respons.

Foder Ml (som kun indeholdt fiskeolie som fedtkilde) var ude af stand til at genoprette PLN-respone, men foder M2 (om-20 fattende omega-3- og omega-6-PUPA'er) var signifikant mere effektivt til genoprettelse af immunresponset med et PLN S.I.

På 4,77 ± 0,4, sammenlignet med NF-foder PLN S.I. på 2,07 ± 0,20.

Claims (13)

1. Iiranunstimulerende præparater, _ kendetegnet ved, at de i én enhedsdosis omfatter en sammensat immunstimulerende mængde bestående af 5 a) 3-40 g arginin eller en tilsvarende mængde af en arginin-presursor eller ornithin, b) 0,1-4,0 g RNA eller en tilsvarende mængde af en anden nukleobase-kilde, c) 0,1-20 g omega-3-polyumættede fedtsyrer og 10 d) 0,1-20 g omega-6-polyumættede fedtsyrer.

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bestanddel a) er arginin.

3. Præparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at bestanddel b) er i RNA-form.

4. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det i én enhedsdosis omfatter a) 10-20 g arginin eller en tilsvarende mængde af en argi-ninprecursor eller ornithin, b) 1-3 g RNA eller en tilsvarende mængde af en anden nukleo- 20 base-kilde, c) 0,1-15 g omega-3-polyumættede fedtsyrer og d) 0,15-15 g omega-6-polyumættede fedtsyrer.

5. Præparat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det i én enhedsdosis omfatter i 26 DK 172673 B1 a) 15-22 g arginin eller en tilsvarende mængde af andre forbindelser, der er forbundet med syntese af polyaminer; i b) 1,25-2,5 g RNA eller en tilsvarende mængde af en anden nukleobase-kilde; 5 c) 0,15-10 g omega-3-polyumættede fedtsyrer og i d) 0,5-10 g omega-6-polyumættede fedtsyrer.

6. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det i én enhedsdosis omfatter 1-30 g, især 5-20 g, af monoumættede fedtsyrer. ' 10

7. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det i én enhedsdosis omfatter 5-25 g, især 8-15 g, monoumættede fedtsyrer.

8. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det i én enhedsdosis omfatter 15 1-30 g mellemkædede fedtsyrer.

9. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at det er i parenteral eller enteral administrationsform og i én enhedsdosis tilveje- Π bringer en energitilførsel på 750-3500 kcl/dag.

10. Præparat ifølge krav 9, t - kendetegnet ved, at det i én enhedsdosis tilvejebringer en energitilførsel på 1000-2000 kcal/dag.

11. Præparat ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, at det er i fom af en komplet 25 diæt og således i det væsentlige opfylder alle daglige behov for kalorier, nitrogen, fedtsyrer, vitaminer, mineraler og sporelementer.

12. Præparat ifølge krav il, HH i DK 172673 B1 27 Kendetegnet ved, at det omfatter en carbonhydrat -kilde, der tegner sig for 40-70%, en nitrogenkilde, der tegner sig for 15-30%, og en fedtsyrekilde, der tegner sig for 15-30% af den samlede energitilførsel i præparatet.

13. Anvendelse af a) arginin, en argininprecursor eller ornithin, b) en nukleobase-kilde, c) omega-3-polyumættede fedtsyrer og d) omega-6-polyumættede fedtsyrer. 10 ved en fremgangsmåde til fremstilling af et diætpræparat ifølge krav 1-12 til stimulering af immunfunktionen i et menneskes krop.