DK171087B1 - Apparat til bestemmelse af funktionen af celler - Google Patents

Description

i DK 171087 B1

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt apparat til bestemmelse af funktionsegenskaberne ved celler ved måling af en svag reaktion hos celler, der befinder sig i en cellesuspension, når cellesuspensionen udsættes for en forskydningsspænding. Nærmere betegnet an-5 går den foreliggende opfindelse et apparat, hvori for eksempel en blod-pladesuspension underkastes en forskydningsspænding og den svage aggregation af blodpladerne, forandringen i blodpladernes former og blodpladernes frigørelsesreaktion etc. som følge af den påførte forskydningsspænding kontinuerligt måles med høj følsomhed. Apparatet ifølge den 10 foreliggende opfindelse kan herved anvendes i forbindelse med diagnosen og kontrol af behandlingen af medfødte sygdomme, såsom thrombasthenia og von Willebrands sygdom, og akvisitte sygdomme, såsom myocardial infarkt, thrombosis og arteriosclerosis, der får blodplader til at fungere abnormt. Ydermere kan apparatet ifølge den foreliggende opfindelse også 15 anvendes i forbindelse med udviklingen af medicin, som er beregnet til at behandle blodpladeabnormiteter.

Forskellige apparater, som bestemmer funktionsegenskaberne ved celler under anvendelse af en cellesuspension, er blevet udviklet. Særligt er det af Born og O'Brien (Born, G.V.R..: Nature, side 194, 927, 20 (1962), og O'Brien, J.R.: Clin. Path., side 15, 446 (1962)) konstruerede apparat og det af Salzman (Salzman, E.W.: J. Lab. Clin. Med., side 62, 724 (1963)) konstruerede apparat kendt som apparater, der kan bestemme funktionsegenskaberne ved blodplader, og disse apparater anvendes i vid udstrækning til kliniske undersøgelser.

25 Førstnævnte apparat (i det følgende benævnt det første konventio nelle apparat) anvendes til undersøgelse af aggregationsegenskaberne ved blodplader. Dette apparat omfatter en enhed, hvori indgår en cylindrisk glasbeholder med en diameter på ca. 5 mm til måling af en blodpladesus-pensions gennemsigtighed og en registreringsindretning, som omdanner den 30 målte transmittans til et tilsvarende elektrisk signal og registrerer aggregationskurven med en pen. I dette apparat opbevares den fra blod ved hjælp af en centrifugal separator separerede blodpladesuspension i en mængde på 0,2-0,3 ml i en cylindrisk glasbeholder, og et aggregeringsmiddel, såsom adenosindiphosphat, collagen, epinephrin, ristocetin 35 eller thrombin tilsættes. Når blodpladesuspensionen omrøres ved hjælp af en i beholderen i forvejen anbragt magnetisk omrører, flokkul erer blodpladerne og den målte transmittans af blodpladesuspensionen forøges.

DK 171087 B1 2

Variationen i denne transmittans kan kontinuerligt registreres som aggregationskurven for blodpladerne.

Det sidstnævnte apparat (i det følgende benævnt det andet konventionelle apparat) anvendes til undersøgelse af blodpladernes adhæsions-5 egenskaber. Dette apparat udnytter egenskaben hos blodplader til at ad-hærere til en glasoverflade. I dette apparat ledes blod gennem et rør, fyldt med glasperler, og ændringen mellem antallet af blodplader før gennemledningen og efter gennemledningen måles. Apparatet omfatter et rør med en indre diameter på ca. 2 mm og en længde på ca. 15 cm og fyldt 10 med glasperler med en diameter på 0,3-0,4 mm, og et tomt rør til optagelse af en blodprøve. De respektive ender af de to rør er indbyrdes forbundet via en trevejshane med en nål til at tappe blod med. Plastsprøjter er forbundet med de respektive uforbundne ender af de to rør. Ydermere er et sugeapparat forbundet med de to sprøjter, og blod optages 15 deri med konstant hastighed.

En akademisk publikation beskriver den kontinuerligt registrerede variation i egenskaber ved blodplader, fremkaldt når en blodpladesuspen- 2 sion underkastes en forskydningsspænding på ca. 1 dyn/cm (Klose, H.J., Rieger, H. og Schid-Schonbein, H.: Thrombosis Res., Vol. 7, side 261-272 20 (1975)). Et forsøgsapparatur (i det følgende benævnt det tredje konven tionelle apparat) er omhandlet i denne rapport. Apparatet omfatter et konkavt bad, der kan transmittere lys, og en rotor med en konisk overflade, som vender mod badets indvendige bundoverflade i en vinkel på 3°, og som har en diameter på 5 cm. På den udvendige side af badets over-25 flade er der tilvejebragt to optiske fibre, idet en stråle projiceres ind i blodpladesuspensionen mellem rotoren og den indvendige bundoverflade af badet i blodpladesuspensionens strømretning via den ene af de optiske fibre, og den transmitterede stråle detekteres fra den indvendige side af badet via den anden af de optiske fibre. En stabiliseret 30 hal ogeniampelyskiIde er forbundet til enden af den optiske fiber, der anvendes til at projicere strålen, og en fotodetektor, forbundet med en registreringsindretning, er forbundet med enden af den optiske fiber, som anvendes til detektion af den transmitterede stråle.

Ydermere er der beskrevet et apparat, som er forbedret i forhold 35 til det tredje konventionelle apparat (i det følgende benævnt det fjerde konventionelle apparat) (Rieger, H., Baier, H., Schroder, H., Wurzinger, L., Schid-Schonbein, H. og Blasberg, P.: Thrombosis Res., Vol. 17, side DK 171087 B1 3 589 (1980)). Dette fjerde konventionelle apparat har en opbygning, som svarer til en rotationsviskositetsmåler af dobbeltcylinder typen, hvilken måler omfatter en indvendig cylinder med en lyskilde og en udvendig cylinder, der roterbart er anbragt omkring den indvendige cylinder.

5 Skønt en rotationsviskositetsmåler af dobbeltcylinder typen generelt lider af den mangel, at en sekundær strøm har tendens til at forekomme som følge af en Taylor hvirvel, overvindes denne mangel i det fjerde konventionelle apparat ved at rotere den udvendige cylinder.

Ydermere er der beskrevet et apparat svarende til det tredje kon-10 ventionelle apparat (i det følgende benævnt det femte konventionelle apparat) (Frojmovic, M.M.: Biorheology, side 12, 193 (1975)). I dette apparat er længden af den optiske vej i blodpladesuspensionen reduceret indtil ca. 1 mm ved at anbringe en lyskilde og en fotodetektor vinkelret på blodpladesuspensionens strømretning.

15 I det første konventionelle apparat, hvori blodpladernes funk tionsegenskaber bestemmes ud fra aggregeringskurven, opnået ved at sætte aggregeringsmidler til blodpladesuspensionen, er det et problem, at påvirkningen af blodpladerne ikke er fysiologisk. Når dette apparat for eksempel anvendes ved en klinisk undersøgelse, er koncentrationen af 20 adenosindiphosphat i blodpladesuspensionen reguleret fra 2 /xM til 10 μM, men det er ganske ukendt, om adenosindiphosphat i sådan en høj koncentration forårsager aggregering af blodplader i en organisme eller ikke. Ydermere findes ristocetin, som er et af aggregeringsmidlerne, ikke i nogen organisme. Ydermere og til trods for den kendsgerning, at det af 25 mange forskere er beskrevet, at blodplader aktiveres ved indvirkning af blodstrømmen, udgøres den faktor, som repræsenterer blodets strømningstilstand, kun af omrørerens rotationshastighed, som generelt ikke er ensartet, og som ikke kan bestemmes nøjagtigt. Da længden af den optiske vej i blodpladesuspensionen ydermere kun er ca. 5 mm, kan den variation 30 i omfanget af den transmitterede stråle, der skyldes en svag aggregation af blodpladerne som reaktion på en lille påvirkning i en organisme, ikke påvises. Da det første konventionelle apparat således lider af ovennævnte ulemper, identificerer de med apparatet opnåede resultater mange gange ikke kliniske symptomer til trods for den omfattende anvendelse af 35 apparatet ved kliniske undersøgelser.

I det andet konventionelle apparat, hvori blodpladernes adhæsionsegenskaber i forbindelse med adhærering til en glasoverflade udnyttes, DK 171087 B1 4 eksisterer der, da adhæsionen til en glasoverflade er et ikke-fysiolo-gisk fænomen, problemer af samme art som problemerne ved det"første konventionelle apparat. Da prøven strømmer mellem glasperler i dette apparat, er strømningstilstanden, som stærkt indvirker på blodpladernes ad-5 hæsionsegenskaber, ydermere helt forskellig fra strømningstilstanden i en organisme. Derfor repræsenterer de med apparatet opnåede resultater ofte ikke præcist blodpladernes sande egenskaber.

Det tredje, fjerde og femte konventionelle apparat har på den anden side det fælles træk, at en blodpladesuspensions strømningstilstand 10 kan angives ved forskydningsspændingen, som er en generisk faktor. Da blodpladernes reaktioner spiller en vigtig rolle i sygdomme, såsom myo- . cardial infarkt, thrombosis og arteriosclerosis, har der været ofret mange kræfter på forskning og diskussioner i en række år, således som det fremgår af mange videnskabelige og akademiske rapporter og dokumen-15 ter, under anvendelse af disse apparater og andre apparater, der kan specificere en blodpladesuspensions strømningstilstand. Til trods for denne kendsgerning har det tredje, fjerde og femte konventionelle apparat endnu ikke været udnyttet til kliniske undersøgelser i sammenligning med det første og det andet konventionelle apparat. Begrundelsen herfor 20 er, at det tredje, fjerde og femte konventionelle apparat lider af den ulempe, at aggregationsmekanismen og blodpladernes reaktionsegenskaber som følge af forskydningsspændingen ikke er blevet belyst, og korrelationen mellem blodpladernes aggregation og reaktion og sygdomme er ikke blevet klarlagt.

25 Det tredje konventionelle apparat tilsigter for det første, at blodpladeaggregationen måles under betingelser med lav forskydningsspæn- 2 ding, såsom ca. 1 dyn/cm , og anvender en rotor med en konisk overflade, som vender mod badets indvendige bundoverflade i en vinkel på 3°. Derfor er den ensartede forskydningsspænding, som kan påføres blodpiadesuspen-30 sionen med en viskositet på ca. 1 centipoise ved anvendelse af dette ap-parat, højst ca. 5 dyn/cm . Når blodpladesuspensionen underkastes en højere forskydningsspænding end ovennævnte værdi, bliver suspensionens strømningstilstand turbulent, og den anvendte forskydningsspænding bliver uensartet. Da lyset i dette apparat udsendes fra en halogenlampe 35 lyskilde med en bred bølgelængdefordeling og projiceres ind i blodpladesuspensionen uden anvendelse af et optisk filter eller et spektroskop, har den detekterede transmittance af strålerne tendens til at blive på- DK 171087 B1 5 virket af strålernes absorption som følge af protein i blodet og/eller spredning af strålerne som følge af lipid i blodet. Ydermere varierer forbindelsen mellem partiklernes størrelse og spredningen af lys på en kompliceret måde, alt efter lysets bølgelængde i et dispersionssystem 5 med store partikler, såsom en bl odpiadesuspension. Når lys med en sådan bølgelængdefordeling derfor direkte projiceres ind i blodpladesuspensio-nen, kan en svag blodpladeaggregation som følge af forskydningsspændingen ikke detekteres. Det fjerde konventionelle apparat forbedrer mangelen ved det tredje konventionelle apparat ved en reduktion af 10 længden af den optiske vej under anvendelse af en opbygning af dobbelte cylindre. Da længden af den optiske vej i dette apparat imidlertid er næsten den samme som eller mindre end den optiske vej i det første konventionelle apparat, kan en stor aggregation af blodplader måles, mens en svag blodpladeaggregation, der skyldes en meget lille fysio-15 logisk påvirkning, ikke kan måles.

Længden af den optiske vej i det femte konventionelle apparat, er meget lille, dvs. ca. 1 mm. Derfor er dette apparat helt uegnet til måling af en svag bl odpiadevariation.

Det er således formålet med opfindelsen at tilvejebringe et appa-20 rat, hvori en svag reaktion hos celler i en cellesuspension kontinuerligt kan måles, når cellesuspensionen underkastes en forskydningsspænding, især et apparat, hvormed der kontinuerligt kan måles en svag reaktion hos blodplader i en blodpladesuspension, når blodpladesuspensionen underkastes en forskydningsspænding, hvorved apparatet kan anvendes i 25 forbindelse med diagnose og overvågning af sygdomme, som forårsager variationer i blodpladernes funktionsegenskaber, og i forbindelse med udviklingen af medicin, beregnet til behandling af blodpladeabnormi-teter.

Ifølge opfindelsen er der tilvejebragt et apparat til bestemmelse 30 af funktionsegenskaberne af celler, som befinder sig i en cellesuspensionsprøve, hvilket apparat omfatter a) et kammer til at rumme en prøve, hvilket kammer cylindrisk er afgrænset af en indvendig bundoverflade og en indvendig sideoverflade, b) en rotor, anbragt i nævnte kammer og forsynet med en konisk 35 overflade, der spidser i retning mod den indvendige bundoverflade af nævnte kammer, hvilken konisk overflade vender imod den indvendige bundoverflade i en vinkel, som ikke overstiger 2°, DK 171087 B1 6 c) en stråletransmissionsvej tilvejebragt på den indvendige sideoverflade af nævnte kammer, hvilken vej sørger for transmissionen af en stråle gennem prøven, som befinder sig mellem den indvendige bundoverflade af nævnte kammer og den koniske overflade af rotoren, 5 d) en detektionsvej for en transmitteret stråle, tilvejebragt på den indvendige sideoverflade af nævnte kammer modsat stråletransmissionsvejen, hvilken detektionsvej sørger for modtagelsen af en stråle, som transmitteres gennem prøven, der befinder sig mellem nævnte kammers indvendige bundoverflade og rotorens koniske overflade. Den koniske 10 overflade af rotoren vender mod den indvendige bundoverflade af kammeret i en vinkel, som ikke overstiger 2°. Længden af den optiske vej i prøven mellem stråletransmissionsvejen og detektionsvejen for den transmittere-' de stråle er ikke mindre end 1 cm, e) et drivorgan forbundet til rotoren og indrettet til at dreje 15 rotoren, f) en styreenhed til styring af drivorganet, g) en lyskildeenhed, som er operativt forbundet med stråletransmissionsvejen og som er indrettet til at forsyne stråletransmissionsvejen med stråler, 20 h) en fotodetektorenhed, som er operativt forbundet med detek tionsvejen for transmitterede stråle, og som er indrettet til at detektere transmittansen fra detektionsvejen for transmitterede stråler, og i) en registreringsindretning, som er forbundet med fotodek-25 torenheden, og som er indrettet til at registrere et signal sendt fra fotodetektorenheden.

Apparatet kan yderligere omfatte drivorganer, forbundet med rotoren til rotation deraf, en styreenhed til styring af drivorganerne, en lyskilde, som operativt er forbundet med stråletransmissionsvejen, såle-30 des at den forsynes med stråler, en fotodetektor, som operativt er forbundet med detektionsvejen for transmitterede stråler til detektion af de transmitterede stråler derfra, og en registreringsindretning forbundet med fotodetektoren til registrering af et signal udsendt fra fotodetektoren.

35 Det til at rumme prøven indrettede kammer kan være afgrænset af et cylindrisk bad, opbygget af en lysledende sidevæg og en bundvæg.

Funktionsegenskaberne af celler, som befinder sig i en prøve af en DK 171087 B1 7 cellesuspension, bestemmes ved, at man anbringer en prøve i et kammer, indrettet til at rumme en prøve, hvilket kammer er cylindrisk afgrænset af en indvendig bundoverflade og en indvendig sideoverflade, underkaster prøven, der befinder sig mellem den indvendige bundoverflade af nævnte 5 kammer og en konisk overflade af en rotor, anbragt i nævnte kammer, en forskydningsspænding ved rotation af rotoren, projicerer en stråle fra den indvendige sideoverflade til prøven, der befinder sig mellem den koniske overflade og den indvendige bundoverflade, på en sådan måde, at der for den projicerede stråle i prøven opretholdes en optisk vejlængde, 10 der ikke er mindre end 1 cm, detekterer den gennem prøven fra den indvendige sideoverflade transmitterede stråle, og bestemmer aggregationsgraden af cellerne, der befinder sig i prøven, hvilken aggregation er fremkaldt af den anvendte forskydningsspænding, idet variationen i den detekterede stråle, transmitteret fra den indvendige sideoverflade må-15 les. Den koniske overflade af rotoren spidser imod den indvendige bundoverflade i det til at rumme prøven indrettede kammer og vender imod den indvendige bundoverflade i en vinkel, som ikke overstiger 2°.

De egenskaber ved cellerne, som bestemmes i apparatet ifølge opfindelsen, er de direkte eller indirekte ved påtrykning af forskydnings-20 spænding fremkaldte reaktioner og mere konkret aggregationsegenskaber ved cellerne, frigørelse af stoffer fra cellerne og variationer i cellernes former, etc.

I apparatet ifølge den foreliggende opfindelse frembringes en forskydningsspænding i prøven mellem den roterende rotor og den indvendige 25 bundoverflade af det til at rumme prøven indrettede kammer. Mellemrummet mellem rotoren og den indvendige overflade af nævnte kammer må være indstillet således, at forskydningsspændingen, fremkaldt mellem den udvendige sideoverflade af rotoren og den indvendige sideoverflade af nævnte kammer, ikke overstiger forskydningsspændingen, der frembringes mellem 30 den koniske overflade af rotoren og den indvendige bundoverflade af det til at rumme prøven indrettede kammer. Hvis den indvendige diameter af det til at rumme prøven indrettede kammer er meget stor, bliver mængden af den prøve, der skal rummes i kammeret, også stor, og således er en meget stor indvendig diameter ikke at foretrække. Den indvendige diame-35 ter af det til at rumme prøven indrettede kammer, indrettes fortrinsvis således, at mellemrummet mellem den udvendige sideoverflade af rotoren og den indvendige sideoverflade af nævnte kammer, kan være 0,2-2,0 mm.

DK 171087 B1 8

Det til at rumme prøven indrettede kammer er fortrinsvis afgrænset af et cylindrisk bad, som har en lysledende sidevæg, og som ér opbygget således, at det kan skilles fra en holder, der holder badet. Da badet kan adskilles fra holderen, er det let at håndtere badet eller at an-5 bringe prøven i eller fjerne prøven fra badet. Badets bundvæg er fortrinsvis ikke-lysledende, da mere præcise data kan opnås med en sådan konstruktion. Når det cylindriske bad anvendes, indstilles afstanden mellem rotorens udvendige sideoverflade og badets indvendige sideoverflade også fortrinsvis til 0,2-2,0 mm. De dele af badets sidevægge, som 10 står i forbindelse med stråletransmissionsvejen og detektionsvejen for den transmitterede stråle, må i det mindste være lysledende. Når for eksempel den transmitterede stråle er i spektrets synlige område, er det foretrukne materiale til sidevæggen et plastmateriale, såsom en prisbil-, lig akrylpolymer eller polystyren, og når den transmitterede stråle er i 15 spektrets ultraviolette eller infrarøde område, foretrækkes kvartsglas som materiale.

I apparatet ifølge den foreliggende opfindelse overstiger radius for rotoren, der underkaster cellesuspensionen, en forskydningsspænding, fortrinsvis ikke 3 cm, idet en foretrukken radius ligger i intervallet 20 fra 0,7-2,0 cm. Den indvendige bundoverflade af det til at rumme prøven indrettede kammer udstrækker sig vinkelret på rotorens rotationsakse. Vinklen mellem rotorens koniske overflade og den indvendige bundoverflade i det til at rumme prøven indrettede kammer, er ikke større end 2° og ligger fortrinsvis i intervallet 0,3-1,50.

25 I apparatet anvendes fortrinsvis optiske fibre i henholdsvis strå-, letransmissionsvejen og detektionsvejen for den transmitterede stråle.

Som materiale for de optiske fibre anvendes fortrinsvis et prisbilligt plastmateriale, når stråling er i spektrets synlige område, og kvartsglas, når strålen er i spektrets ultraviolette eller infrarøde område.

30 Lyskilden, der operativt er forbundet med stråletransmissionsve jen, er udvalgt i overensstemmelse med de celleegenskaber, som skal må les. En halogenlampe eller wolframlampe, hvortil er føjet et interferensfilter, eller en emitter, som kan udsende en stråle med stærkt monokromatiske egenskaber, såsom en laser, foretrækkes som lyskilde. To el-35 ler flere forskellige lyskilder kan anvendes samtidig, og strålerne, udsendt fra disse kilder, kan transmitteres af den optiske fiber i strå-letransmissionsvejen.

DK 171087 B1 9 I apparatet ifølge den foreliggende opfindelse anvendes fortrinsvis en detektor, som udnytter en fotoelektromotorisk kraft, såsom en fotodiode som fotodetektor. I tilfælde af, at strålen, der skal detekte-res, er en svag stråle, såsom en fluorescensstråle, anvendes fortrinsvis 5 en fotomultiplikator som fotodetektor. Når to eller flere forskellige arter af stråler udsendes, eller når to eller flere arter af floure-scensstråler detekteres, foretrækkes det kun at transmittere den eller de til detektion beregnede stråler som har ønskede bølgelængder ved anvendelse af optiske filtre, såsom inteferensfiltre og at transmittere de 10 respektive udvalgte stråler til fotodetektoren via en optisk fiber.

Ifølge den foreliggende opfindelse er længden af den optiske vej defineret som den korteste afstand mellem stråletransmissionsvejen og detektionsvejen for den transmitterede stråle i cellesuspensionen i det til at rumme prøven indrettede kammer. Længden af den optiske vej må ik-15 ke være mindre end 1 cm. Længden af den optiske vej ligger fortrinsvis i intervallet 1-4 cm, og mere foretrukkent i intervallet 2-3 cm. Placeringen af stråletransmissionsvejen og detektionsvejen for den transmitterede stråle er fortrinsvis indrettet således, at en hypotetisk linie mellem vejene ikke fører gennem rotationscentret for rotoren, og således 20 at længden af den optiske vej er så lang som muligt.

I apparatet ifølge den foreliggende opfindelse er afstanden mellem den indvendige bundoverflade i det til at rumme prøven indrettede kammer og den koniske overflade af rotoren ønskværdigt indstillelig. For eksempel er spidsdelen af den koniske overflade på rotoren fremstillet af et 25 magnetisk materiale, en sensor i en forskydningsmåler baseret på et jævnstrømsprincip, er anbragt i en bundvæg i det til at rumme prøven indrettede kammer, og afstanden detekteres med sensoren. Ydermere kan et søjleformet, magnetisk materiale, for eksempel fremstillet af rustfrit stål, tilvejebringes på spidsdelen af rotorens koniske overflade for at 30 gøre det lettere at måle afstanden.

I et tilfælde, hvor forandringen af blodpladernes former eller forandringen af koncentrationen af calciumioner i blodpladerne bestemmes med apparatet ifølge den foreliggende opfindelse, tilvejebringes ønskværdigt en transmissionsvej for spredt stråling på den indvendige side-35 overflade af det til at rumme prøven indrettede kammer. Forandringen i koncentrationen af calciumioner i blodpladerne bestemmes ved måling af fluorescensen fra prøven, som beskrevet nedenfor. Ved bestemmelsen af DK 171087 B1 10 forandringen i blodpladernes former underkastes prøven ønskværdigt en forskydningsspænding, som ikke overstiger 10 dyn/cm , eller en blodpla-deaggregationsinhibitor, såsom prostaglandin, sættes til prøven.

1 apparatet ifølge den foreliggende opfindelse omfatter drivorga-5 nerne til rotation af rotoren ønskværdigt en jævnstrømsmotor med en indkodningsindretning. Prøven kan underkastes en tilstrækkeligt høj og ens-artet forskydningsspænding på indtil 200 dyn/cm ved anvendelse af sådanne drivorganer. Funktionen af drivorganerne kontrolleres ved hjælp af en kontrolenhed. Når et program kan lagres i kontrolenhedens hukommelse, 10 kan rotoren ikke blot fungere ved en konstant rotationshastighed, men også på en sådan måde, at selve suspensionsprøven underkastes forskeil i- 2 ge forskydningsspændinger i det brede interval fra 0 dyn/cm til 200 o dyn/cm ved en enkelt måling, og på en sådan måde, at reaktionen af cellerne i prøven bestemmes i det brede interval ved en enkelt måling.

15 Med apparatet ifølge den foreliggende opfindelse kan abnormiteter ne hos glycoproteinet på blodpladernes cellemembran og plasmaproteinet, som binder sig til glycoproteinet, der står i tæt forbindelse med blodpladernes funktion, let undersøges ved bestemmelse af aggregationen af 2 blodplader i det lave forskydningsspændingsinterval 10-40 dyn/cm , og 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 det høje forskydningsspændingsinterval, som ikke ligger under 80 2 2 3 dyn/cm . Da cellerne underkastes en forskydningsspænding, som er en fysiologisk og svag påvirkning, og en svag forandring i cellerne, som 4 reaktion på påvirkningen kan måles med høj følsomhed i apparatet ifølge 5 den foreliggende opfindelse, kan med hensyn til blodpladernes funktion 6 følgende fænomener opdages.

7

Skønt der findes mange rapporter vedrørende forskning i forbindel-, 8 se med blodpladernes funktion, er de fleste funktionsmekanismer endnu 9 ikke forstået. Forbindelsen mellem forskydningsspændinger, som en prøve 10 af en blodpladesuspension underkastes og aggregationen af blodpladerne 11 på grund af den påførte forskydningsspænding undersøges i forskydnings- 12 2 13 spændingsintervallet fra 0-200 dyn/cm under anvendelse af apparatet ifølge den foreliggende opfindelse. Som et resultat er det blevet klart, 14 at aggregationen af blodplader er tæt forbundet med glycoproteinet (i 15 det følgende benævnt "GP") på blodpladernes cellemembran og plas- 16 maproteinet, som forbinder sig med glycoproteinet, og at mekanismen for den aggregation, der fremkaldes i intervallet fra 10-40 dyn/cm er forskellig fra mekanismen af den aggregation, der fremkaldes i et interval, 2 DK 171087 Bl 11 som ikke ligger under 80 dyn/cm . For nærværende kendes mere end 10 typer GP og det er beskrevet, at disse GP'er er nært forbundet'med blodpladernes funktioner, såsom aggregation og adhæsionsegenskaber. Specielt er det beskrevet, at blandt disse GP'er er GPIb forbundet med blodpla-5 dernes adhæsionsegenskaber, og komplekset af GPIIb og GPIIIa (i det følgende benævnt "GPIIb/IIIa") er forbundet med blodpladernes aggregationsegenskaber. Med hensyn til plasmaproteinet er hhv. von Willebrands faktoren tæt forbundet med blodpladernes adhæsionsegenskaber, og fibrinogen tæt forbundet med blodpladernes aggragationsegenskaber.

10 Forbindelsen mellem glycoproteinet på blodpladernes cellemembran og blodpladernes aggregation som følge af påført forskydningsspænding analyseres først. Som et resultat heraf er følgende kendsgerninger klarlagt. Som det nærmere fremgår af eksempel 2 nedenfor fremmes aggregatio-nen af blodplader i forskydningsspændingsintervallet fra 10-40 dyn/cm , 15 når en blodpladesuspension behandles med monoklonalt antistof mod GPIIb/IIIa, og aggregationen undertrykkes fuldstændigt i et interval, som ikke ligger under 80 dyn/cm . Når en blodpladesuspension behandles med monoklonalt antistof mod GPIIb/IIIa undertrykkes blodpladeaggrega- tionen fuldstændigt i forskydningsspændingsintervallet fra 10-40 2 20 dyn/cm , og undertrykkes fuldstændigt i et interval, som ikke ligger un-2 der 80 dyn/cm . I en prøve taget fra en patient med Bernard-Soulier syndromet, i hvilken GPIb mangler, aggregerer blodpladerne ydermere nor-malt i forskydningsspændingsintervallet fra 10-40 dyn/cm , men blodpladerne aggregerer slet ikke i et interval, som ikke ligger under 80 2 25 dyn/cm . I en prøve taget fra en patient med thrombasthenia, i hvilken GPIIb/IIIa mangler, aggregerer blodpladerne overhovedet ikke i forskyd- 2 ningsspændingsintervallet 10-40 dyn/cm , men blodpladerne aggregerer i 2 ringe grad i et interval, som ikke ligger under 80 dyn/cm .

Forbindelsen mellem plasmaproteinet og blodpladernes aggregation 30 som følge af den påførte forskydningsspænding analyseres dernæst. Som et resultat heraf, hvilket også fremgår detaljeret af eksempel 2, undertrykkes aggregationen af blodplader overhovedet ikke i intervallet fra 2 10-40 dyn/cm , men undertrykkes fuldstændigt i et interval, som ikke 2 ligger under 80 dyn/cm , når en blodpladesuspension behandles med mono-35 klonalt antistof, der virker imod forbundne dele af GPIIb/IIIa i von Willebrands faktor. I en prøve taget fra en patient med von Willebrands sygdom, dvs. en patient, hos hvem von Willebrands faktor mangler, aggre- DK 171087 B1 12 gerer blodpladerne normalt i forskydningsspændingsintervallet fra 10-40 dyn/cm^, men aggregerer slet ikke i et interval, der ikke ligger under

O

80 dyn/cm . I en prøve taget fra en patient, der lider af afibrinogenemia, dvs. en patient, hos hvem fibrinogen mangler, aggregerer bl odpi a- 2 5 derne overhovedet ikke i forskydningsspændingsintervallet 10-40 dyn/cm , men aggregerer normalt i et interval, som ikke ligger under 80 dyn/cm .

Som et resultat af denne undersøgelse ved brug af apparatet ifølge den foreliggende opfindelse er det således klart, at to mekanismer forekommer ved aggregationen af blodplader som følge af påføring af forskyd-10 ningsspænding.

Aggregationen af blodplader fremkaldt i intervallet med lav for- skydningsspænding fra 10-40 dyn/cm er forbundet med kombinationen af fibrinogen, som er et plasmaprotein, og GPIIb/IIIa, som findes på blod- plademembranen, og skyldes således den gensidige indvirkning deraf.

15 Aggregat ionen af blodplader fremkaldt i et interval med høj forskyd- 2 ningsspænding, som ikke ligger under 80 dyn/cm , er forbundet med kombinationen af von Willebrands faktorer, som er plasmaproteiner med GPIb og GPIIb/IIIa. Disse vigtige opdagelser tilvejebringer en simpel og nøjagtig metode til bestemmelse af aggregationsegenskaber og adhæsionsegen-20 skaber hos blodplader, hvilke egenskaber er to vigtige blodpladefunktio-ner. Ved måling af aggregationen af blodplader fremkaldt ved, at underkaste en prøve forskydningsspænding kan således hhv. aggregationsegen- 2 skaberne af blodpladerne bestemmes i intervallet fra 10-40 dyn/cm , og adhæsionsegenskaberne af blodpladerne bestemmes i et interval, som ikke 2 25 ligger under 80 dyn/cm .

Ovennævnte aggregation af blodplader kan akkurat og kontinuerligt bestemmes ved anvendelse af apparatet ifølge den foreliggende opfindel- . se. En svag reaktion på stimulering af celler kan også bestemmes med apparatet ifølge den foreliggende opfindelse. En prøve af en cellesus-30 pension (en blodpladesuspension) rummes i det dertil indrettede kammer, rotoren drejes og prøven, der befinder sig mellem rotorens koniske overflade og det til at rumme prøven indrettede kammers indvendige bundoverflade, underkastes en forskydningsspænding. En stråle transmitteres ind i prøven, der befinder sig mellem den koniske overflade og den ind-35 vendige bundoverflade fra stråletransmissionsvejen, den transmitterede stråle detekteres fra detektionsvejen for den transmitterede stråle, og den transmitterede stråle detekteres og registreres kontinuerligt. Den DK 171087 Bl 13 svage reaktion af cellerne overfor den ensartet påførte forskydningsspænding ved laminarstrømningstilstand, især aggregationen af blodplader, bestemmes kontinuerligt ved at måle ændringer i den transmitterede stråle, dvs. ændringer i transmittansen.

5 Den svage reaktion af cellerne kan bestemmes med høj følsomhed, som er ca. 1000 gange bedre end følsomheden ved de konventionelle apparater, og især abnormiteter forbundet med glycoprotein og plasmaprotein, som er tæt forbundet med funktionerne af blodpladerne, kan let og nøjagtigt bestemmes. I overensstemmelse hermed kan apparatet og 10 fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes til diagnose og kontrol af behandling af sygdomme, som bevirker, at blodplader fungerer abnormt, og kan også anvendes til udvikling af medicin, der er beregnet på behandling af blodpladeabnormiteter.

Opfindelsen belyses i det følgende nærmere i forbindelse med teg-15 ningen, hvor fig. 1 er et perspektivisk billede af et apparat til bestemmelse af celleegenskaber i overensstemmelse med en udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse, fig. 2 er et forstørret partielt, lodret snitbillede af apparatet 20 vist i fig. 1, fig. 3 er et planbillede af apparatet vist i fig. 2 i en tilstand, hvor rotoren er fjernet, fig. 4 er et skematisk billede af det indre af en lyskildeenhed i apparatet vist i fig. 1, 25 fig. 5 er et skematisk billede af det indre af en fotodetektoren hed i apparatet vist i fig. 1, fig. 6 er en kurve, der viser transmittanser målt i eksempel 1 under anvendelse af apparatet vist i fig. 1, fig. 7A og 7B er kurver, der viser transmittanser målt i eksempel 30 2 under anvendelse af apparatet vist i fig. 1,

Fig. 8A og 8B er kurver, der viser yderligere transmittanser målt i eksempel 2 under anvendelse af apparatet vist i fig. 1, fig. 9A og 9B er kurver, der viser yderligere transmittanser målt i eksempel 2 under anvendelse af apparatet vist i fig. 1, 35 fig. 10A og 10B er kurver, der viser yderligere transmittanser målt i eksempel 2 under anvendelse af apparatet vist i fig. 1, fig. 11-14 er kurver, der viser yderligere transmittanser målt i DK 171087 B1 14 eksempel 2 under anvendelse af apparatet vist i fig. 1, fig. 15 er en kurve, der viser i eksempel 4 opnåede aggregations-procentmålinger på blodplader foretaget ved en konventionel beregningsmetode, og 5 fig. 16 er en kurve, der viser i eksempel 4 opnåede aggregations- procentmålinger på blodplader foretaget ved en beregningsmetode ifølge den foreliggende opfindelse.

Nogle foretrukne udførelsesformer ifølge den foreliggende opfindelse vil i det følgende blive beskrevet nærmere under henvisning til 10 tegningen.

Fig. 1-5 illustrerer et apparat til bestemmelse af funktionelle egenskaber hos celler i overensstemmelse med en udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse. Dette apparat er specielt udformet til bestemmelse af egenskaberne af blodplader i en prøve af en blodpladesus-15 pension.

Ifølge denne udførelsesform er et til at rumme en prøve indrettet kammer 101, som rummer en prøve af en blodpladesuspension som en prøve af en cellesuspension, cylindrisk afgrænset af et cylindrisk bad 1 med en indvendig bundoverflade 36a og en indvendig sideoverflade 35a. Bad 1 20 er opbygget af en lystransmitterende sidevæg 35 af en tilstrækkeligt poleret, transparent, farveløs acrylharpiks og en ikke-lystransmitterende bundvæg 36, som har en overflade, der er i kontakt med blodpladesuspen-sionen, og som er tilstrækkeligt poleret og er opbygget af en acrylharpiks. Udsparet del 38 er udformet på bagsiden af bundvæggen 36, og en 25 sensor 33 i en forskydningsmåler baseret på et hvirvelsstrømsprincip er anbragt i den udsparede del.

En rotor 2 med en konisk overflade 2a med en form, der spidser i retning mod den indvendige bundoverflade 36a, er anbragt i det til at rumme prøven udformede kammer 101. Rotoren 2 er konstrueret af en ikke-30 lystransmitterende acrylharpiks og dens koniske overflade 2a er tilstrækkeligt poleret. Den koniske overflade 2a vender mod den indvendige bundoverflade 36a i en vinkel, som ikke overstiger 2°. Et søjleformet, rustfrit stålorgan 31 er udformet af et magnetisk materiale og er tilvejebragt i rotoren 2 i bundspidsen deraf, og den konisk formede overflade 35 af organet er tilstrækkeligt poleret. Et aksel hul 34 er udformet i en øvre del af rotoren 2, og en drivaksel 4a fra en jævnstrømsmotor 4 af den kerneløse type med en indkodningsindretning er anbragt i aksel hul- DK 171087 B1 15 let. Motoren 4 er fastgjort til en fastgørelsesplade 41, og fastgørelsespladen er forbundet med en højdejusterbar opspændingsindrétning 9, der er monteret på en basisplade 42. Den højdejusterbare opspændingsindretning 9 har en grovindstillingsknap 10 og finindstillingsknap 11. Et 5 gab mellem rotoren 2 og bundvæggen 36 i badet 1 indstilles ved hjælp af knapperne 10 og 11. Gabets størrelse måles via sensoren 33. Sensoren 33 detekterer positionen af det søjleformerede, rustfrie stålorgan 31, det detekterede signal sendes til en display-indretning 27, der er tilvejebragt på basispladen 42, via ledning 39, som er forbundet med sensoren 10 og display-indretningen, og angivelsen af gabets størrelse eller højden af rotoren vises på display-indretningen. Bundoverfladen af det søjleformede, rustfrie stålorgan 31 kan være en delvis eller fuldstændig flad overflade for at lette detekteringen af positionen af organet med sensoren 33. Motoren 4 køres i overensstemmelse med et program lagret i hu-15 kommeisen af en kontrolenhed 5 for motorens drift.

Badet 1 holdes i en udsparet del af en holder 3 konstrueret af rustfrit stål og badet er fastgjort med fastgørelsestap 30 tilvejebragt i den øvre del af holderen. En strålestransmissionsvej 28 er udformet i holderen 3 gennem sidevæggen af holderen i en position, der ligger en 20 smule over den indvendige bund af den udsparede del af holderen. En de-tektionsvej 29 for transmitterede stråler er udformet i holderen 3 gennem sidevæggen af holderen i en position overfor stråletransmissionsvejens 28 position. Vejen mellem stråletransmissionsvejen 28 og detek-tionsvejen 29 for transmitterede stråler er anbragt forskudt fra roto-25 rens 2 rotationscenter. En transmissionsvej 40 for spredte stråler er tilvejebragt i holderens 3 sidevæg mellem stråletransmissionsvejen 28 og detektionsvejen 29 for transmitterede stråler. Transmissionsvejen 40 for spredte stråler er udformet som en spalte, der udstrækker sig i en perifer retning omkring sidevæggen af holderen 3. Stråletransmissionsvejen 30 28 er forsynet med en optisk fiber 14, og detektionsvejen 29 for transmitterede stråler er forsynet med en optisk fiber 15. Hver optisk fiber er af enkeltkernetypen, hvor kernen består af kvartsglas, og hvortil et forbindelsesstik af FC-typen er forbundet. Disse optiske fibre 14 og 15 er fastgjort til støtteorganer 32 og 26 via forbi ndelsesadaptorer af FC-35 typen (ikke vist) forbundet til de respektive støtteorganer. En optisk fiber 16 til transmission af spredte stråler er anbragt i transmissionsvejen 40 for spredte stråler. Kernen af denne optiske fiber 16 består DK 171087 B1 16 også af kvartsglas, og et forbindelsesstik af FC-typen er forbundet til den optiske fiber. Den optiske fiber 16 er fastjort til et lédeorgan 25 via en forbi ndelsesadaptor af FC-typen (ikke vist), og ledeorganet er understøttet af et stativ 24, som er monteret på basispladen 42.

5 Holderen 3 er fastgjort på et leje 43, og lejet er monteret på et rotationsbord 12, som omfatter et øvre bord 12a og et nedre bord 12b, som kan dreje og indstille periferi retningen af det øvre bord ved drejning af en indstillingsknap 13 fastgjort til det nedre bord. Ved denne indstilling justeres positionen af holderen 3 i periferi retningen deraf, 10 og positionen af den optiske fiber 16 i transmissionsvejen 40 for spredte stråler indstilles i periferi retningen inden i spalteudstrækningen af vejen i periferi retningen. Derved kan vinklen for transmission af en spredt stråle i periferi retningen hensigtsmæssigt indstilles.

En flerkernet optisk fiber 44, i hvis endedel er anbragt et for-15 bindelsesstik af FC-typen, som indeholder 12 optiske kvartsfibre i en enkelt ferrule, er forbundet til støtteorganet 32, hvortil forbindelses-adaptoren af FC-typen til fastgørelse af den optiske fiber 14 er forbun det. Den flerkernede optiske fiber 44 deles i 2 flerkernede optiske fibre 18 og 19, som hver især indeholder 6 fibre. En endedel af hver af 20 disse flerkernede optiske fibre 18 og 19 rummes også i en enkelt ferrule, og er forbundet til en forbi ndelsesadaptor af FC-typen, hvilken adaptor er forbundet til en lyskildeenhed 6 via et forbindelsesstik af FC-typen.

En He-Ne-gaslaserkilde 51 og en excitationslyskilde 52 i form af 25 en kviksølv-xenonlampe er anbragt i lyskildeenheden 6. He-Ne-gaslaser-ki1 den 51 anvendes til bestemmelse af blodpladeaggregationen. Laserkilden frembringer en gaslaserstråle, hvis bølgelængde er 632,8 nm, og den har en endefladeeffekt på 1,6 mW, når en optisk kvartsfiber forbundet dermed har en kerne med en diameter på 125 pi og en længde på 2 m. Exci-30 tationslyskilden 52 anvendes til bestemmelse af variationen i koncentrationen af calciumioner i blodpladernes cytoplasma, og den har en effekt på 100 W og er forbundet med et UV-lystransmitterende filter 53 som interferensfilter.

En ende af en optisk fiber 20, som er forsynet med forbi ndelses-35 stik af FC-typen i begge ender, er forbundet med støtteorganet 26, hvortil er fastgjort en forbi ndelsesadaptor af FC-typen til fastgørelse af den optiske fiber 15. Et stik i den anden ende af den optiske fiber 20 DK 171087 B1 17 er forbundet med en på en fotodetektorenhed 7 tilvejebragt forbindelses-adaptor af FC-typen. En flerkernet optisk fiber 23, hvis endédel er forsynet med et forbindelsesstik af FC-typen, som er fyldt med 12 optiske kvartsfibre i en enkelt ferrule, er forbundet til den via ledeorganet 25 5 og stativet 24 fastgjorte optiske fiber 16, via en forbindelsesadaptor af FC-typen forbundet til ledeorganet. Den flerkernede optiske fiber 23 deles i flerkernede optiske fibre 21 og 22, som hver indeholder 6 fibre.

En endedel af hver af disse flerkernede optiske fibre 21 og 22 er også omsluttet af en enkelt ferrule, og er via et forbindelsesstik af FC-ty-10 pen forbundet til en forbindelsesadaptor af FC-typen, der er tilvejebragt på fotodektorenheden 7.

En fotodiode 61, to fotomultiplikatorrør 62a og 62b og et elektro-. nisk kredsløb 63 til modtagelse af signaler fra disse elementer og analyse af data, er samlet i fotodetektorenheden 7. Et interferensfilter 15 64, hvis centrale bølgelængde er 633 nm, er knyttet til forbindelses-adaptoren af FC-typen, hvortil den optiske fiber 20 er forbundet, og filteret er forbundet med fotodioden 61. Et interferensfilter 65a, hvis centrale bølgelængde er 410 nm, er tilvejebragt foran fotomultiplikator-røret 62a, og et interferensfilter 65b, hvis centrale bølelængde er 480 20 nm, er tilvejebragt foran fotomultiplikatorrøret 62b. Disse fotomultiplikatorer 62a og 62b er via de respektive interferensfiltre 65a og 65b forbundet med forbindelsesadaptorer af FC-typen, hvortil hhv. den optiske fiber 21 og 22 er forbundet.

En registreringsindretning 8 til modtagelse af signaler sendt fra 25 fotodetektorenheden 7 er forbundet med fotodetektorenheden, og registreringsindretningen registrerer ved hjælp af to penne kontinuerligt data for variationen i turbiditeten af blodpladesuspensionen som følge af bl odpiadeaggregationen, og data for variationen af koncentrationen af calciumioner i blodpladerne.

30 I denne udførelsesform har holderen 3 et hul 37 i centerdelen af dens bundvæg, fordi sensoren 33 er indbygget i badet 1. Imidlertid behøver holderen 3 ikke at have et sådant hul. Ligeledes kan et til at rumme prøven indrettet kammer være afgrænset uden et cylindrisk bad, dvs. af holderen selv.

35 Målingen af omfanget af den ved påtrykning af en forskydningsspæn ding fremkaldte blodpladeaggregation vil i det følgende blive beskrevet nærmere. Det er nødvendigt at tage hensyn til et bestemt indeks ved ge- DK 171087 B1 18 neralisering af en opnået aggregationskurve for blodplader for kvantitativt at vurdere blodpladernes aggregationstilstand. I det første konventionelle apparat diskuteret ovenfor, hvilket apparat finder udbredt anvendelse til kliniske undersøgelser, er aggregationsforholdet (ARc) 5 for blodplader defineret som følger.

ARc (%) = (It - IpRp)/(Ippp - IpRp) x 100 (1) I denne ligning angiver "It" målet for en transmitteret stråle, 10 når blodpladerne aggregerer, "Ippp" målet for en transmitteret stråle i blodpladefattigt plasma (i det følgende benævnt "PPP"), og "IpRp" målet for en transmitteret stråle i blodpladerigt plasma (i det følgende benævnt "PRP") før blodpladerne aggregerer. Dette indeks varierer stærkt i overensstemmelse med den optiske vejlængde i cellerne, plasmaets turbi-15 ditet og antallet af blodplader før aggregation. Da det ydermere ikke er proportionalt med variationen i antallet af uaggregerede blodplader, er det ikke egnet til at bestemme blodpladernes aggregation. Disse problemer løses med apparatet ifølge den foreliggende opfindelse, da apparatet kan detektere aggregateonen af blodplader med høj følsomhed, og forskel -20 len mellem målet for den transmitterede stråle i "PPP" og målet for den transmitterede stråle i "PRP" derfor bliver meget stor.

I apparatet ifølge den foreliggende opfindelse har det vist sig, at forholdet mellem antallet af blodplader og transmitterede stråler adlyder Lambert Beer's lov, og at variationen i transmitterede stråler 25 primært fremkaldes af variationen i antallet fra uaggregerede blodpla der. I overensstemmelse hermed opstilles følgende ligning, som definerer et indeks, der er i stand til at vise et nøjagtigt aggregationsforhold (ARi) for blodplader.

30 log (It/Ippp) ARi (%)................. x 100 (2) lOQ (Ippp/IpRp)

Ved at anvende ovenstående indeks bliver det muligt, at angive 35 aggregationsforholdet for blodplader som variationen i antallet af uaggregerede blodplader, og kvantitativt at bestemme aggregationen af blodplader uanset den optiske vejlængde i cellerne, plasmaets turbiditet DK 171087 B1 19 og antallet af blodplader før aggregation.

Eksempel 1 Målingerne udføres under anvendelse af apparatet vist i fig. 1, 5 hvilket apparat har følgende dimensioner.

Rotorens 2 radius er 1,5 cm, det søjleformede rustfrie stålorgans 31 radius er 2,5 mm, og vinklen mellem rotorens koniske overflade 2a og et plan vinkelret på rotorens rotationsakse er 1,0°. Badets 1 indvendige diameter er 3,1 cm, badets ydre diameter er 3,4 cm og dybden af badet, 10 hvori blodpiadesuspensionen indføres, er 1,3 cm. Tykkelsen af bundvæggen 36 af badet 1 er 2 mm, og tykkelse af bunddelen ved hullets 38 plads er 0,5 mm. Den indvendige diameter af holderen 3 er 3,41 cm, og den udvendige diameter af holderen er 5,5 cm. Stråletransmissionsvejen 28 og de-tektionsvejen 29 for transmitterede stråler er anbragt således, at af-15 standen mellem en lineær vej, der forbinder centrene af vejen 28 og 29 og centrum for den cylindske udsparede del af holderen 3 kan være 0,8 cm. Spalten for transmissionsvejen 40 for spredte stråler er udformet således, at vinklen mellem linier, der forbinder centrum af den udsparede del af holderen 3 og endeoverfladerne af spalten i periferi retningen 20 kan være 120°. Kernediameteren af de optiske fibre 14, 15, 16 og 20 er 1 mm, og deres diameter med overtræk er 1,035 mm. Kernediameteren af de optiske fibre 18, 19, 21, 22, 23 og 44 er 0,200 mm, og deres diameter med overtræk er 0,230 mm. Højden den højdejusterbare opspændingsindretning 9 er 15,5 cm, og diameteren af rotationsbordet 12 er 9 cm. Længden 25 af basispladen 42 er 20 cm og dens bredde er 25 cm.

Apparatets virkemåde og anvendelsesmuligheder vil i det følgende blive belyst nærmere.

Blod tappes fra en vene i albuen hos en rask voksen person og overføres til en plastbeholder via en siliconebehandlet 20 gauge nål, 30 hvilken beholder indeholder en vandig 3,8% natriumcitratopløsning således, at forholdet mellem natriumcitratopløsning og blod bliver 1/9. Dette blod separeres ved centrifugering under anvendelse af en centrifugalkraft på 100 G i 15 minutter til opnåelse af "PRP", og den resterende suspension af røde blodlegemer separeres så ved centrifugering under an-35 vendel se af en centrifugalkraft på 1500 G i 10 minutter til opnåelse af "PPP". "PRP", som er passende kontrolleret ved hensyn til antallet af blodplader, fremstilles under anvendelse af det opnåede "PRP" og "PPP".

DK 171087 B1 20 0,3 ml af dette for antallet af blodplader kontrollerede "PRP" rummes i delen af badet 1 nær bundvæggen 36, rotoren 2 bevæges nedad mod bundvæggen ved at dreje på grovindstillingsknappen 10 og finindstillingsknappen 11 på den højdejusterbare opspændingsindretning 9, og gabet mellem det 5 søjleformede, rustfrie stålorgan 31 og centrum af bundvæggen 36 indstilles til 40 /im ved detektion af afstanden med sensoren 33 og ved udlæsning af afstanden på display-indretningen 27. Derpå drejes rotoren 2 og "RPR"-prøven underkastes en forskydningsspænding i intervallet fra 0-200 2 dyn/cm i 5 minutter, hvorunder en stråle med bølgelængden 633 nm konti-10 nuerligt projiceres ind i prøven fra den optiske fiber 14, og den gennem prøven transmitterede stråle udtages via den optiske fiber 15 og detek-teres med fotodetektorenhed 7. Eftersom blodpladerne aggrerer forøges transmittansen og dens variation registreres ved hjælp af registreringsindretningen 8.

15 Fig. 6 viser aggregationskurver for blodplader fra 5 sunde voksne, 2 2 når der anvendes forskydningsspændinger pa 18 dyn/cm , 36 dyn/cm , 72 2 2 dyn/cm og 108 dyn/cm . Af fig. 6 fremgår det, at blodpladernes aggrega- 2 tion i almindelighed fremmes ved forskydningsspændinger på 18 dyn/cm og 2 2 108 dyn/cm i sammenligning med forskydningsspændinger pa 36 dyn/cm og 20 72 dyn/cm2.

Eksempel 2

Det samme apparat som i eksempel 1 anvendes. Følgende prøver måles med hensyn til aggregationen af blodplader ved forskydningsspændinger på 25 18 dyn/cm og 108 dyn/cm på samme måde som i eksempel 1.

Fig. 7A og 7B viser resultatet af prøve nr. 1 af en normal blod-pladesuspension. Fig. 8A og 8B viser resultatet af prøve nr. 2 af en blodpladesuspension, hvis glycoprotein GPIb, der er nært forbundet med blodpladernes adhæsionsegenskaber, som udvises af blodpladernes celle-30 membran, er behandlet med monoklonalt antistof. Fig. 9A og 9B viser resultatet af prøve nr. 3 af en blodpladesuspension, hvis GPIIb/IIIa, som er tæt forbundet med blodpladernes aggregationsegenskaber, som udvises · af blodpladernes cellemembran, behandles med monoklonalt antistof. Fig.

10A og 10B viser resultatet af prøve nr. 4 af en blodpladesuspension, 35 hvis von Willebrands faktor, der er forbundet med blodpladernes adhæsionsegenskaber, er behandlet med monoklonalt antistof. Fig. 11 viser resultatet af prøve nr. 5 af en blodpladesuspension, som er tappet fra DK 171087 B1 21 en patient med Bernard-Souliers syndrom, hvor GPIb mangler. Fig. 12 viser resultatet af prøve nr. 6 af en blodpladesuspension, der"er tappet fra en patient med thrombasthenia, hos hvem GPIIb/IIIa mangler. Fig. 13 viser resultatet af prøve nr. 7 af en blodpladesuspension, som er tappet 5 fra en patient med von Willebrands sygdom, hvor von Willebrands faktor mangler. Fig. 14 viser resultatet af prøve nr. 8 af en blodpladesuspension tappet fra en patient med afibrinogenemia, hvor fibrinogen mangler.

1 sammenligning med prøve nr. 1 som vist i fig. 7A og 7B, fremmes aggregationen af blodplader ved en lav forskydningsspænding på 18 2 10 dyn/cm og undertrykkes fuldstændigt ved en høj forskydningsspænding på 2 108 dyn/cm i prøve nr. 2 som vist i fig. 8A og 8B. I prøve nr. 3 som vist i fig. 9A og 9B undertrykkes aggregationen af blodplader fuldstæn- digt ved en lav forskydningsspænding på 18 dyn/cm , og en svag blodpla- 2 deaggregation udvises ved en høj forskydningsspænding på 108 dyn/cm . I 15 prøve nr. 4 som vist i fig. 10A og 10B, undertrykkes aggregationen af blodplader ikke ved en lav forskydningsspænding på 18 dyn/cm , men undertrykkes næsten fuldstændigt ved en høj forskydningsspænding på 108 2 dyn/cm . I prøve nr. 5 som vist i fig 11, aggregerer blodpladerne nor- malt ved en lav forskydningsspændning på 18 dyn/cm , men blodpladerne 20 aggregerer overhovedet ikke ved en høj forskydningsspænding på 108 2 dyn/cm . I prøve nr. 6 som vist i fig. 12, aggregerer blodpladerne over- hovedet ikke ved en lav forskydningsspænding på 18 dyn/cm , men aggrege- rer en smule ved en høj forskydningsspænding på 108 dyn/cm . I prøve nr.

7 som vist i fig. 13 aggregerer blodpladerne normalt ved en lav forskyd- 2 25 ningsspænding på 18 dyn/cm , men aggregerer overhovedet ikke ved en høj 2 forskydningsspænding på 108 dyn/cm . I prøve nr. 8 som vist i fig. 14, aggregerer blodpladerne overhovedet ikke ved en lav forskydningsspænding 2 på 18 dyn/cm , men aggregerer normalt ved en høj forskydningsspænding på 108 dyn/cm^.

30 Som det fremgår af ovenstående resultater undersøges abnormiteter forårsaget af GPIb, GPIIb/IIIa, fibrinogen og von Willebrands faktor, som er tæt forbundet med blodpladernes funktioner og egenskaber, let ved afprøvning af blodpladernes aggregation i lave og høje forskydningsspændingsintervaller.

35 DK 171087 B1 22

Eksempel 3 I apparatet i eksempel 1 forbindes et instrumenteringssystem omfattende en fotostyrkemåler, en GP-IB interface-enhed og en mikrodatamat til fotodioden 61. Aggregeringen af pladerne bestemmes og udtrykkes ved 5 det nye indeks vist i ligning (2).

Først indsættes et rør fremstillet af vinylchlorid og med en udvendig diameter på 1,35 mm i halspulsåren hos en kanin med en vægt på ca. 3 kg. Blodet tappedes fra kaninen i en plastbeholder indeholdende en vandig 3,8% natriumcitratopløsning til opnåelse af et citratopløs-10 ning/blodforhold på 1/9. Derpå fremstilles "PPP" og "PRP" på samme måde som i eksempel 1, og blodpladesuspensioner til prøve A, hvori antallet 4 af blodplader er 42 x 10 /ν'], prøve B, hvori antallet af blodplader er 4 4 21 x 10 //il og prøve C, hvori antallet af blodplader er 14 x 10 /μΐ, fremstilles ved at fortynde "PRP" med "PPP". Til at begynde med under-15 kastes disse prøver en forskydningsspænding på 3 dyn/cm i 15 minutter således, at der ikke fremkaldes aggregation af blodpladerne, og trans- mittansen gennem "PRP" før aggregationen af blodpladerne bestemmes.

2

Derpå forøges forskydningsspændingen til 18 dyn/cm i 15 minutter, og aggregationsværdierne for blodpladerne opnås. Transmittansen bestemmes, 20 aggregationskurven for blodpladerne, hvilken kurve repræsenterer aggregationsprocenten, beregnes under anvendelse af mikrodatamaten, og den maksimale aggregationsprocent beregnes også. Fig. 15 viser kurverne i overensstemmelse med en konventionel beregningsmetode, dvs. opnået ud fra den førnævnte ligning (1). Fig. 16 viser kurverne ifølge den nye 25 fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse, dvs. opnået ud fra ligning (2).

Umiddelbart efter ovennævnte bestemmelse fikseres de respektive blodplader yderligere med formalin, antallet af uaggregerede blodplader tælles med en automatisk blodpladetæller, og variationsforholdet mellem 30 antallet af blodplader før og efter aggregation beregnes. Som et resultat opnås, at det beregnede forhold for prøve A er 65%, det beregnede forhold for prøve B er 76% og det beregnede forhold for prøve C er 80%. Disse værdier stemmer godt overens med aggregationsprocenterne for de respektive prøver opnået fra kurverne vist i fig. 16.

35 Ved den konventionelle bestemmelsesmetode fremgår det på den anden side tydeligt af fig. 15, at aggregationsprocenterne ved målingens afslutning opnået fra aggregationskurverne er betydeligt lavere end vær- DK 171087 B1 23 dierne opnået med den automatiske blodpladetæller. Når aggregationsprocenten ydermere repræsenteres ved den konventionelle metode,'kan den illusoriske slutning drages, at jo mindre antallet er af blodplader, der eksisterer før aggregation, jo mere aktivt fremmes aggregationen af 5 blodplader.

Som ovenfor beskrevet kan aggregationsforholdet beregnet ud fra ligning (2) akkurat og kvantitativt angive aggregationen af blodplader.

Claims (18)

1. Apparat til bestemmelse funktionsegenskaberne ved celler, som befinder sig i en prøve af en cellesuspension, KENDETEGNET ved, at det omfatter 5 a) et til at rumme en prøve indrettet kammer (101), som er cylin drisk afgrænset af en indvendig bundoverflade (36a) og en indvendig sideoverflade (35a), b) en rotor (2) anbragt i det til at rumme en prøve indrettede kammer (101) og forsynet med en konisk overflade (2a), som spidser i 10 retning mod den indvendige bundoverflade (36a) i det til at rumme en prøve indrettede kammer (101), hvilken konisk overflade (2a) vender imod den indvendige bundoverflade (36a) i en vinkel, som ikke overstiger 2°, c) en stråletransmissionsvej (28) tilvejebragt på den indvendige sideoverflade (35a) af det til at rumme en prøve indrettede kammer (101) 15 til transmission af en stråle gennem nævnte prøve, som befinder sig mellem den indvendige bundoverflade (36a) af det til at rumme en prøve indrettede kammer (101) og den koniske overflade (2a) af rotoren (2), d) en detektionsvej (29) for en transmitteret stråle tilvejebragt på den indvendige overflade (35a) af det til at rumme en prøve indret- 20 tede kammer (101) modsat stråletransmissionsvejen (28) til modtagelse af en stråle, der transmitteres gennem prøven, som befinder mellem den indvendige bundoverflade (36a) af det til at rumme en prøve indrettede kammer (101) og den koniske overflade (2a) af rotoren (2), hvori en optisk vej er afgrænset gennem prøven mellem stråletransmissionsvejen (28) og 25 detektionsvejen (29) for den transmitterede stråle på en sådan måde, at længden af den optiske vej ikke er mindre end 1 cm, e) et drivorgan (4) forbundet til rotoren (2) og indrettet til at dreje rotoren (2), f) en styreenhed (5) til styring af drivorganet (4), 30 g) en lyskildeenhed (6), som er operativt forbundet med stråle transmissionsvejen (28) og som er indrettet til at forsyne stråletransmissionsvejen (28) med stråler, h) en fotodetektorenhed (7), som er operativt forbundet med detektionsvejen (29) for transmitterede stråle, og som er indrettet til at 35 detektere transmittansen fra detektionsvejen (29) for transmitterede stråler, og DK 171087 B1 25 i) en registreringsindretning (8), som er forbundet med fotodek-torenheden (7), og som er indrettet til at registrere et signal sendt fra fotodetektorenheden (7).

2. Apparat ifølge ethvert af kravene 1, KENDETEGNET ved, at det yderligere omfatter en transmissionsvej (40) for spredte stråler, hvilken transmissionsvej (40) er tilvejebragt på den indvendige sideoverflade (35a) af det til at rumme en prøve indrettede kammer (101).

3. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-2, KENDETEGNET ved, at det . til at rumme en prøve indrettede kammer (101) er afgrænset af et cylindrisk bad (1), som er opbygget af en lystransmittende sidevæg (35) og en bundvæg (36).

4. Apparat ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at bundvæggen (36) er ikke-lystransmitterende.

5. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-4, KENDETEGNET ved, at afstanden mellem den indvendige bundoverflade (36a) i det til at rumme en 20 prøve indrettede kammer (101) og den koniske overflade (2a) af rotoren (2) er justerbar.

6. Apparat ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at i det mindste spidsdelen af den koniske overflade (2a) af rotoren (2) er konstrueret af et 25 magnetisk materiale, at en sensor (33) i en forskydningsmåler baseret på et hvirvelstrømsprincip er tilvejebragt i bundvæggen (36) af det til at rumme en prøve indrettede kammer (101), og at afstanden detekteres med sensoren (33).

7. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-6, KENDETEGNET ved, at vinklen mellem den koniske overflade (2a) og den indvendige bundoverflade (36a) ligger i intervallet fra 0,3-1,5°. 1 2 Apparat ifølge ethvert af kravene 1-7, KENDETEGNET ved, at den 2 35 optiske vejlængde ligger i intervallet fra 1-4 cm. DK 171087 B1 26

9. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-8, KENDETEGNET ved, at strålen indføres i stråletransmissionsvejen (28) via en optisk fiber (14).

10. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-9, KENDETEGNET ved, at den transmitterede stråle modtages af detektionsvejen (29) for transmitterede stråler via en optisk fiber (15).

11. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-10, KENDETEGNET ved, at 10 drivorganet (4) omfatter en jævnsstrømsmotor med indkoder.

12. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-11, KENDETEGNET ved, at styreenheden (5) er programmeret til ændring af drivorganets (4) rotationshastighed. 15

13. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-12, KENDETEGNET ved, at et interferensfilter (53) er tilknyttet lyskildeenheden (6).

14. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-13, KENDETEGNET ved, at 20 lyskildeenheden (6) omfatter en lyskilde (51), som udsender et monochro-matisk lys.

15. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-14, KENDETEGNET ved, at fotodetektorenheden (7) indeholder et fotoelektromotorisk element (61), 25 som anvender fotoelektromotorisk kraft.

16. Apparat ifølge krav 15, KENDETEGNET ved, at det fotoelektromotoriske element er en fotodiode (61).

17. Apparat ifølge ethvert af kravene 1-16, KENDETEGNET ved, at fotodetektorenheden (7) indeholder et fotomultiplikatorrør (62a, 62b). 1 Apparat ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at transmissionsvejen (40) for spredte stråler er udformet som en spalte, der udstrækker sig 35 på den indvendige sideoverflade (35a) af det til at rumme en prøve indrettede kammer (101) i en periferiretning omkring den indvendige sideoverflade (35a). DK 171087 Bl 27

19. Apparat ifølge krav 18, KENDETEGNET ved, at en optisk fiber (16) er tilvejebragt i transmissionsvejen (40) for de spredte stråler til modtagelse og transmission af spredte stråler udsendt fra prøven.

20. Apparat ifølge krav 19, KENDETEGNET ved, at placeringen af den optiske fiber (16) i transmissionsvejen (40) for spredte stråler kan indstilles ved at dreje det til at rumme en prøve indrettede kammer (101) i en periferiretning med hensyn til den indvendige sideoverflade (35a). 10 15 1