DK164176B

DK164176B - Bacillus subtilis dsm 2704 og anvendelse heraf i en fremgangsmaade til fremstilling af alfa-amylase

Info

Publication number: DK164176B
Application number: DK585784A
Authority: DK
Inventors: Arved Lompe
Original assignee: Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg
Priority date: 1983-12-09
Filing date: 1984-12-07
Publication date: 1992-05-18
Also published as: FI86557B; ATE26303T1; FI86557C; JPS60153791A; EP0145798B1; JPH0436676B2; US4610964A; DK585784A; FI844845L; FI844845A0; DE3370652D1; DK585784D0; EP0145798A1; DK164176C

Description

i

DK 164176B

α-amylase er et industrielt betydningsfuldt emzym og anvendes i stort omfang f.eks. i stivelses-, textil-og levnesmiddelindustrien til hydrolyse af stivelse.

Den industrielle fremstilling af α-amylase har derfor 5 en teknisk betydning.

Til fremstilling af α-amylase er det alment kendt, at ved fermentering af forskellige arter af mikroorganismer af slægten Bacillus, derunder Bacillus subtilis og varianter deraf, kan α-amylase udvindes i teknisk 10 og økonomisk forsvarligt udbytte. Særlig fordelagtigt er det herved, når der allerede i fermenteringsmediet foreligger en så høj koncentration af aktivt enzym som muligt. Det skorter derfor ikke på bestræbelser for ved dyrkningsmæssige og fremgangsmådetekniske foranstalt-15 ninger i fermenteringsmediet at opnå en så høj enzym- koncentration som muligt. Således beskrives f.eks. af Voneda et al. i tidsskriftet "Applied and Environmental Microbiology"; årgang 1980, bind 39, side 274 ff og i bogen "Molecular Cloning and Gene Regulation in Bacilli", 20 udgivet af Ganesan, Chang og Hoch i 1982 hos Academic

Press, Inc., New York, en fremgangsmåde til, hvorledes man med en industrielt udnyttet stamme af Basillus subtilis ved hensigtsmæssig overføring af genfragmenter kan forøge udbyttet af α-amylase i fermenteringsmediet 25 fra 130-150 E/ml til 25000 E/ml. Denne forøgelse udgør en ca. 170 fold forbedring af produktiviteten. En sådan produktivitet er dog stadig utilstrækkelig for en industriel fremstilling af a-amylase.

Opfindelsen angår derfor en hidtil ukendt mikroorganis-30 me af arten Bacillus subtilis og en fremgangsmåde til fremstilling af α-amylase under anvendelse af en sådan mikroorganisme, hvorved der opnås en væsentlig højere produktivitet.

2

DK 164176 B

Den hidtil ukendte organisme er Bacillus subtilis DSM 2704 og den anvendes som nævnt i en fremgangsmåde til fremstilling af ct-amylase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved 5 det i krav 2's kendetegnende del anførte.

Den hidtil ukendte mikroorganisme DSM 2704 blev iagttaget ved de i den industrielle fermentering sædvanlige kontrolundersøgelser (udarbejdelse af udstrygninger af prøver af fermenteringsmediet, fermentering af kolonier 10 af sådanne udstrygninger i rystekolber, tilvejebringel se af udstrygninger af prøver af fermenteringsmediet fra rystekolberne) som afvigende kolonier fra kontrol-udstrygningen af en prøve fra rystekolben, renisoleret ved systematisk screening og erkendt som en fra den 15 oprindelige mikroorganisme sig adskillende mutant på grund af de morphologiske og physiologiske forhold.

Den hidtil ukendte mikroorganisme med den interne betegnelse A4 er deponeret i henhold til Budapesttrakta-ten i den tyske samling af mikroorganismer under depone-20 ringsnummeret DSM 2704.

De morphologiske og stofskiftephysiologiske egenskaber for mikroorganismen DSM 2704 blev undersøgt og til be stemmelse sammenlignet med de i "Bergey's Manual of determinative bacteriology" 8. oplag, 1974, genoptrykt 25 1975, Baltimore, opførte egenskaber. I enkeltheder blev følgende egenskaber fastlagt.

Katalasedannelse positiv

Anaerob vækst i næringsagar negativ

Gasdannelse ud fra glucose negativ 30 Gasdannelse ud fra xylose negativ

Gasdannelse ud fra mannitol negativ 3

DK 164176 B

Gasdannelse ud fra arabinose negativ

Gasdannelse ud fra trehalose negativ pH i glucose 6,1 pH i xylose 6,7 5 pH i mannitol 6,1 pH i arabinose 6,75 pH i trehalose 6,8

Bedømmelse af propionat negativ

Bedømmelse af citrat positiv 10 Vækst ved 65 °C negativ Vækst i næringsbouillon med 5 % NacL positiv Vækst i næringsbouillon med 7 % NaCl positiv Vækst i næringsbouillon med 10 % NaCl positiv

Voges-Proskauer-reaktion positiv 15 pH i V.P. bouillon 5,45 Vækst i 0,001 % lysozym negativ Vækst i 0,02 % Na-azid negativ

Hydrolyse af stivelse positiv

Hydrolyse af hippurat negativ 20 Omsætning af tyrosin negativ

Omsætning af casein positiv

Nitratreduktion positiv

Evne til at gøre gelatine flydende >1 cm 0 Æggeblommereaktion negativ 25 De morphologiske kendetegn for den encellede organisme svarer til det, der er kendt fra Bacillus subtilis; ligeledes er kolonimorphologien i vidtgående grad identisk med de kendte stammer af Bacillus subtilis. I direkte sammenligning med udgangskulturen er stammen A4 30 påfaldende ved at have stærkt rynkede kolonier med ujæv ne overflader, som ved gennemlysning synes at være mørkbrunlige med kornet struktur.

Under anvendelse af den i ovennævnte "Bergey's Manual of determinative bacteriology11 angivne bestemmelsesta- 4

DK 164176 B

bel viste den hidtil ukendte stamme ifølge opfindelsen mest lighed med Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn.

Den hidtil ukendte stamme må derfor betegnes som hørende til arten Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn.

5 Den hidtil ukendte mikroorganisme DSM 2704 er i produk tivitet af a-amylase alle kendte mikroorganismer af samme slægt og art langt overlegen. Koncentrationen af a-amylase i fermenteringsmediet ligger konstant over 250000 E/ml og når til dels over 300000 E/ml. Særlig 10 fordelagtigt ved den nye mikroorganisme er det specielt, at den danner mindre protease end de kendte mikroorganismer af arten Bacillus subtilis. Således lå koncentrationen af protease i fermenteringsmediet i intet tilfælde højere end 10 NU/100000 amylaseenheder. Typisk 15 ligger koncentrationen af protease under 8 NU/100000 amylaseenheder.

Fermenteringen af den hidtil ukendte mikroorganisme Bacillus subtilis DSM 2704 ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af α-amylase kan udføres 20 såvel i flydende næringmedier submers som på faste næ ringsmedier, hvorved fremstillingen i flydende kultur i almindelighed er fordelagtigere. Fermenteringen sker efter i dag almene sædvanlige fremgangsmåder. Fremstilling af de anvendelige næringsmedier sker ligeledes 25 på kendt måde. Næringsmedierne indeholder assimilerbare carbonkilder, nitrogenkilder og andre for væksten af mikroorganismen gunstige eller nødvendige nærings- og hjælpestoffer. Som carbonkilder har forskellige sukkerstoffer og sukkerholdige stoffer vist sig egnede, idet 30 sukker kan foreligge i forskellige polymerisationsstrin; som eksempel skal nævnes stivelse, dextriner, rørsukker, mælkesukker, maltose, fructose og glucose. Som nitrogen-kilder kan anvendes såvel uorganiske som organiske kvælstofforbindelser både alene og i kombination. Som eksem- 5

DK 164176 B

pel skal nævnes proteinholdige stoffer, som f.eks. pepton og soja, kød og casein, gelatine, gærproteinstof og gærekstrakt, affald fra kødindustrien eller anvendelse af dyrekroppe samt ammoniumsalte. Desuden kan til-5 sætning af uorganiske salte, især af alkalimetal- og jordalkalimetalsalte og phosphater være en fordel, samt tilsætningen af sporstoffer, som f.eks. Fe, Mg, Mn, Co og Ni.

Fermenteringen kan udføres ved pH-værdier mellem 5 og 10 9, fortrinsvis mellem 6 og 8, og en temperatur mellem 25 og 50 °C, fortrinsvis 33 og 45 °C. Fermenteringsvarigheden kan udgøre mellem 30 og 90 timer, fortrinsvis mellem 50 og 70 timer.

I det følgende gives eksempler på fermenteringens udfø-15 relse til nærmere beskrivelse af opfindelsen.

Bestemmelsen af a-amylaseaktiviteten sker efter en af FUWA (1954) i tidsskriftet "Journal of Biochemistry (Tokyo)", årgang 1954, bind 41, side 583 ff beskrevet metode. Som enzymsubstrat blev anvendt højrenset amylose 20 (Sigma Chemicals Co., bestillingsnr. A 0512). Alle andre reagenser var af standardkvalitet "pro analysi".

Amyloseopløsning 0,2 %i 200 mg amylose sættes til 4 ml 1 N NaOH og henstår natten over i køleskab. Efter fortynding til 80 ml neutraliseres 25 med 1 N eddikesyre, og der fyldes op til 100 ml. Denne opløsning må friskfremstilles dagligt.

Reagens A

Opløsning med 0,2 % iod og 2 % kaliumiodid. Denne opløsning fremstilles dagligt ud fra en fem gange koncentre- 6

DK 164176 B

ret stamopløsning ved fortynding med vand.

Arbejdsmåde: 500 ^uliter 0,5 M acetatpuffer og 500yuliter enzymholdig opløsning, eventuelt fortyndet med calciumacetatopløs-5 ning, blandes med 100 ^uliter amyloseopløsning (0,2 %) og inkuberes 30 minutter i vandbad ved 37 °C.

Reaktionen standses ved tilsætning af 2000 ^uliter 1 N eddikesyre, blandingen fortyndes 1:50 med reagens A, og extinktionen ved 700 nm og en lysvej på 10 mm måles.

10 En amylaseenhed (E) svarer til en 10 %'s reduktion af iodstivelsesfarvekompleks. I området 1 til ca. 5 enheder er justeringskurven lineær.

Bestemmelsen af proteaseaktiviteten sker ved anvendelse af den følgende metode: 15 Caseinopløsning: 0,2 £ casein ifølge Hammarsten (Merck, Art.-Nr. 2242) 1 puffer 1 opløses ved opvarmning til 40 °C i 45 minutter.

Puffer 1: 10,3 g borsyre, 46,18 g dinatriumhydrogenphosphat x 20 7 h^O, 60,7 g trinatriumcitrat x 2 h^O fortyndes til 2 liter med destilleret vand; pH = 8,0.

Puffer 2: 120 g natriumacetat x 3 H2O og 160 ml eddikesyre fortyndes til 2 liter med destilleret vand; pH = 4,0.

7

DK 164176 B

Arbejdsmåde:

Parallelt med prøven måles en denatureret blindværdi ved opvarmning. 50 ml caseinopløsning (fortempereret til 40 °C) + 1 ml enzymopløsning eller blindværdi (en-5 zymopløsning fortyndet således, at aktiviteten ligger mellem 0,07 og 0,11 NE/ml), inkuberes 35 minutter ved 40 °C; reaktion ved tilsætning af 25 ml puffer 2 stopper.

Efter 15 minutters opholdstid filtreres opløsningen (Blauband, Schleicher & Schiill Nr. 5893).

10 I filtratet bestemmes nitrogen efter Kjeldahl; protein- indholdet beregnes efter formlen protein = nitrogen x 6,25.

1 proteaseenhed (NE) er defineret som den aktivitet, der under betingelserne ved forsøget hydrolyserer 40 % 15 af caseinet.

Eksempel 1

Til fremstilling af 1 liter næringsopløsning blev 90 g lactose, 30 g sojamel, 10 g proteasepepton oxoid nr. L46 blandet, fyldt i Erlenmeyerkolber i en mængde på 50 ml, 20 steriliseret og podet med Bacillus subtilis A 4. Efter 70 timers forløb blev der centrifugeret kraftigt på en rundrystemaskine, og i den overliggende væske blev aktiviteten bestemt. Den androg i gennemsnit 300000 E/ml; proteaseaktivitet 21 NE/ml.

25 Eksempel 2

Til fremstilling af en 1 liter næringsopløsning blev 90 g maltodextrin, 30 g soja, 10 g gelatine og 2,5 g diammoniumphosphat blandet, fyldt i Erlenmeyer-Schikanen- 8

DK 164176 B

kolber i en mængde på 50 ml, steriliseret og dyrket som i eksempel 1. Udbyttet androg i gennemsnit 280000 E/ml; proteaseaktivitet 22 NE/ml.

Eksempel 3 5 Det i eksempel 1 nævnte medium blev fermenteret i en 2 liters fermentator med 650 ml nyttevolumen med en lufttilsætning på 1,3 v/vm og en omrøringsomdrejningstal på 900 Udbyttet androg efter 70 timers forløb 300000 E/ml; proteaseaktivitet 24 NE/ml.

10 Oparbejdning af det ifølge opfindelsen fremstillede fermenteringsmedium og udvinding af a-amylase sker på i og for sig kendt måde.

Claims

9 DK 164176 B Patentkrav :

1. Bacillus subtilis DSM 2704.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af a-amylase ved fermentering af en mikroorganisme af arten Bacillus subtilis i et næringsmedium indeholdende assimilerbare carbon-· 5 og nitrogenkilder og eventuelt adskillelse af a-amylasen fra fermenteringsmediet, kendetegnet ved, at man fermenterer mikroorganismen ifølge krav 1.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man fermenterer ved et pH på 5,0 til 9,0, for- 10 trinsvis ved et pH på 6,0 til 8,0.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, k ende-tegnet ved, at man fermenterer ved 25 til 50 °C, fortrinsvis ved 33 til 45 °C. 1 Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 2 til 15 4, kendetegnet ved, at man fermenterer i 30 til 90 timer, fortrinsvis 50 til 70 timer.