DK163030B

DK163030B - Laegemidler, der er emballeret med henblik paa administration ved injektion

Info

Publication number: DK163030B
Application number: DK554585A
Authority: DK
Inventors: Pierre Casellas; Bernard Bourrie; Pierre Gros
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1984-11-29
Filing date: 1985-11-29
Publication date: 1992-01-13
Also published as: AU5047385A; EP0186551B1; FR2573656B1; IE852992L; ZA859120B; US4749566A; DK554585A; AU588008B2; DK554585D0; NZ214357A; EP0186551A1; IL77168A0; IE58776B1; ATE49708T1; JPH062679B2; CA1254139A; DE3575521D1; DK163030C; FR2573656A1; JPS61197528A

Description

i

DK 163030 B

Den foreliggende opfindelse angår lægemidler, der er emballeret med henblik på administration ved injektion.

I fransk offentliggørelsesskrift nr. 2.437.213 og dets ti 1 -5 lægsoffentliggørelsesskrift nr. 2.466.252 samt i de franske offentliggørelsesskrifter nr. 2.504.010 og nr. 2.516.794 har ansøgerne beskrevet fremstilling af anti cancerprodukter, kaldet konjugater, og som er fremkommet ved kobling ved hjælp af en covalent binding af A-kæden af ricin med antistoffer eller 10 antistoffragmenter rettet mod et antigen, der er båret af cellen, der skal ødelægges. Produkter af denne type betegnes i den foreliggende ansøgning med det generiske navn immunotok-s i ner.

15 Udtrykket immunotoksin betegner et cytotoksisk konjugat mellem et toksin og et antistof, der er specifikt for cellerne, som skal ødelægges af det pågældende toksin. De ovenfor omtalte immunotoksiner opnås ved kobling af ricins A-kæde, som er et særligt toksin, og et antistof eller antistoffragment, der er 20 specifikt for et antigen båret af de til ødelæggelse bestemte celler.

I de franske offenti iggørelsesskri fter nr. 2.516.794, nr. 2.521.010, nr. 2.536.997, nr. 2.522.968 og nr. 2.523.445 har 25 ansøgerne også påvist evnen hos visse stoffer (ammoniumsalte, monovalente carboxyljonoforer, methylamin, chloroquin og enzymkon jugater, der er i stand til at frigøre ammoniak) til at forstærke den cytotoksiske virkning af immunotoksiner. 1 2 3 4 5 6

De terapeutiske virkninger af aktiverede eller ikke-aktiverede 2 immunotoksiner kan imidlertid kun manifestere sig helt, hvis 3 immunotoksinet er i stand til sammen med sin antistofdel at 4 blive lokaliseret in vivo i den aktive form på målcellen, der 5 skal ødelægges (en absolut uomgængelig betingelse for al eks- 6 pression af immunotoksiners aktivitet). Immunotoksinets evne til at blive lokaliseret på målet afhænger først og fremmest af immunotoksinets evne til at forblive i blodstrømmen og de

DK 163030 B

2 ekstracellulære væsker i den aktive form i tilstrækkeligt høje koncentrationer til at give en høj grad af besættelse af de tilsvarende antigensteder.

5 Ansøgerne har udført et stort antal undersøgelser, som har gjort det muligt at fastlægge plasmaelimineringsteknikken af immunotoksiner efter intravenøs injektion i forskellige dyremodeller. Det har vist sig, at efter injektion falder plasma-niveuaet af biologisk aktivt immunotoksin meget hurtigt og 10 meget væsentligt. I et typisk tilfælde med kaniner i en model under anvendelse af et immunotoksin opbygget ved kobling af A-kæden af ricin ved hjælp af en binding, der indeholder en disulfidbro, med et monoklonalt antistof rettet mod antigenet T65 i humane T-lymfocyter, viser det sig således, at 97% af 15 immunotoksinet, der findes i blodstrømmen på tidspunktet 0 efter injektion, forsvinder på 30 minutter, og 99,9% forsvinder på 17 timer. De fremkomne resultater er analoge, hvis leddet, der forbinder antistoffet med A-kæden af ricin, indeholder en thioetherbinding i stedet for en disulfidbinding.

20 Denne hurtige forsvinden af immunotoksinet forringer naturligvis ekspressionen af dets fuldstændige cytotoksiske evne, idet immunotoksinet forhindres i varigt at mætte en stor del af mål antigenerne båret af cellerne, som skal ødelægges. En sammenligning af plasmaelimineringskinetikken af immunotoksiner 25 med den af de tilsvarende ukonjugerede antistoffer viser endvidere omvendt, at antistofferne - således som det er velkendt - forbliver i plasmaet i høj koncentration i forholdsvis lange tidsrum. Selv i de bedst rensede immunotoksinpræparater er der altid en vis restmængde af ukonjugerede antistoffer. På grund 30 af virkningen af de forskellige hastigheder af elimineringen af immunotoksiner og antistoffer bliver de ukonjugerede antistoffer, som til at begynde med er i minoritet, gradvis majoritetskomponenten efter nogle få timer, således at disse antistoffer ved konkurrence gradvis bliver kraftige antagonister 35 for fikseringen af immunotoksinerne til deres mål.

Disse undersøgelser viser klart værdien af at forøge varigheden af immunotoksiner i plasma i deres aktive form, således at

DK 163030 B

3 både varigheden og graden af besættelse af målantigenerne derfor forbedres.

Lægemidlerne ifølge den foreliggende opfindelse er ejendomme-5 lige ved, at de omfatter en forening af mindst et immunotok-sin, der er opnået fra et naturligt, halvsyntetisk eller syntetisk toksin, en toksisk underenhed eller et fragment af en toksisk underenhed omfattende polysaccharidgrupper indeholdende mannoserester, især i den terminale stilling, uanset det 10 indgående antistof og uanset den valgte type binding til forening af antistoffet med toksinet, den toksiske underenhed eller det toksiske fragment, samt mindst en polyosid- eller po-lysaccharid-kulhydratpolymer, der har en gennemsnitlig molekylvægt på mere end 1000 omfattende fra 20 til 100% mannose-15 rester, uanset typen af binding, som forbinder disse mannoserester med hinanden eller med andre sukkerarter.

Den omhandlede medicinske forbindelse gør det muligt at hindre immunotoksiners hurtige eliminering fra plasmaet efter injek-20 tion uden skadeligt at påvirke immunotoksinernes karakteristiske naturlige egenskaber.

Ifølge opfindelsen har det overraskende vist sig, at mannaner udgør en særligt værdifuld stoftype til forøgelse af plasma-25 koncentrationerne af immunotoksiner. Udtrykket "mannan" anvendes her til at betegne enhver polyosid- eller polysaccharid-kulhydratpolymer, som har en gennemsnitsmolekylvægt større end 1000, og som indeholder en stor mængde mannoserester, nærmere betegnet fra 20 til 100% mannoserester, uanset typen af osi-30 disk binding, som forbinder disse mannoserester til hinanden eller til andre sukkerarter. Specielt, og som et ikke-begræn-sende eksempel, er det muligt inden for den foreliggende opfindelse at anvende naturlige mannaner isoleret fra gær (f.eks. Saccharomyces cerevisiae), d.v.s. kulhydratfraktionen 35 af en peptidoglycan, der hører til cellevæggen af disse gærarter. Proteinmannankomplekset er en blanding af makromoleky-ler, hvori polysaccharidkomponenten repræsenterer fra 50 til

DK 163030 B

4 90¾ af komplekset. Mannanfunktionen er selv en polymer af D-mannose. Den består af et skelet af mannoserester koblet i al 6 stilling, hvortil der slutter sig sidekæder af forskellige længder indeholdende al -+ 3- og al -»· 2-bindinger.

5

Mannan anvendt i doser, hvori det ikke viser nogen toksicitet for dyret, hverken i sig selv eller i forbindelse med immuno-toksinet, gør det overraskende muligt at forøge plasmakoncentrationen af immunotoksiner med en meget stor faktor (af stør-10 relsesordenen 100) og på en holdbar måde, således at deres lokalisering på målet forbedres tydeligt, og man undgår fikseringshæmningsfænomener, som skyldes tilstedeværelse af frie antistoffer i præparaterne, som tidligere nævnt.

15 Det bemærkelsesværdige fravær af toksicitet af mannaner gør dem til foretrukne stoffer til farmaceutisk brug i forbindelse med immunotoksiner. Forbindelse af immunotoksinet med mannanet forøger ikke væsentligt den naturlige toksicitet af immunotok-sinet, og denne forbindelse generer heller ikke de specifikke 20 cytotoksicitetsegensakaber, der er karakteristiske for immuno-toksinerne, i nærværelse eller fravær af de allerede beskrevne forstærkende midler.

Forsøg med in vivo lokalisering af det radiomærkede immuno-25 toksin injiceret i dyr uden noget specifikt mål har endvidere vist, at konjugatet fortrinsvis bliver lokaliseret i leveren i de første få minutter efter injektion. Det samme gælder for A-kæden, der følger samme mønster, når den injiceres i ukoblet form. Dette antyder kraftigt, at immunotoksinet bliver fikse-30 ret i leveren via A-kæden af ricin indeholdt i immunotoksinet. Det er kendt, at A-kæden i ricin er et glycoprotein, hvis polyosidiske grupper omfatter mannoserester og N-acetylglucos-aminrester, idet mannoseresterne er i endestilling (Agri.Biol. Chem. (1978) 42, 501). Receptorer, der er i stand til at gen-35 kende glycoproteiner indeholdende disse endestillede mannoserester, har også vist sig at eksistere i leveren.

DK 163030 B

5

Det har således vist sig, at glycoproteinerne genkendt af disse receptorer - hvor sidstnævnte i det væsentlige findes på Kupffer-cel 1 erne - hurtigt elimineres af blodstrømmen ved fiksering til disse celler, som »etaboliserer dem. Dette er vel-5 dokumenteret, især i tilfældet med β-glucuronidase og i tilfældet med ri bonuklease B (Arch.Biochem.Biophys. (1978) 188, 418, Advances in Enzymology, redigeret af A.Meister, New York (1974), Pediat.Res. (1977) 11, 816).

10 I sin helhed viser dette, at den hurtige eliminering af immu-notoksiner kan forklares ved, at mannoseresterne i A-kæden i ricin genkendes af de hepatiske celler, især Kupffer-cellerne. Egenskaberne af mannaner til at hæmme den hurtige plasmaeliminering af immunotoksiner indeholdende A-kæden af ricin forkla-15 res også let af den omstændighed, at de administrerede mannaner besætter receptorcellerne i glycoproteinerne og derfor modvirker genkendelsen hos disse receptorer af de polyosidiske enheder båret af A-kæden i ricin eller af ethvert konjugat indeholdende sidstnævnte.

20

Mannaners evne til at hæmme den hurtige plasmaeliminering af immunotoksiner indeholdende A-ksden af ricin gælder også af de ovennævnte grunde for den ukoblede A-kæde af ricin eller ethvert naturligt, halvsyntetisk eller syntetisk hybridmolekyle, 25 der indeholder A-kæden af ricin, og især for immunotoksiner indeholdende A-kæden af ricin, uanset hvilken type binding, der er valgt til at forbinde antistoffet med A-kæden af ricin.

Af de samme grunde er denne evne hos mannaner mere generelt anvendelig for ethvert immunotoksin, uanset hvilket toksin, 30 der er anvendt til at fremstille det, forudsat at dette toksin eller toksiske underenheder omfatter polysaccharidgrupper indeholdende mannoserester, især i endestilling, uanset det indgående antistof og uanset bindingstypen, der er valgt til at forbinde antistoffet med toksinet eller den toksiske underen-35 hed.

Opfindelsen forklares nærmere med henvisning til tegningen, hvor

DK 163030 B

6 fig. 1 viser plasmaelimineringskurverne for immunotoksinet IT-T101, det ukoblede antistof T101 og den ukoblede A-kæde i ricin som funktion af tiden efter injektion, 5 fig. 2 viser virkningen af mannan på immunotoksi net IT-TlOl's plasmaelimineringskinetik som funktion af tiden af injektion, fig. 3 viser virkningen af mannan på plasmaelimineringen af ricins A-kæde som funktion af tiden efter injektion, 10 fig. 4 viser virkningen af polysacchari der på IT-TlOl’s elimineringskinetik som funktion af tiden efter injektion, fig. 5 viser den procentiske hepatiske fiksering af ricins 15 A-kæde i nærværelse eller fravær af mannan som funktion af tiden, og fig. 6 viser procenten af overlevende dyr som funktion af den tid, der er forløbet efter behandlingen.

20

De følgende eksempler giver en bedre forståelse af opfindelsen .

EKSEMPEL 1.

25 -----------

Formålet med dette eksempel er at vise ændringerne i elimineringskinetikken af immunotoksiner (samt deres indgående komponenter) i nærværelse eller fravær af mannan.

30 A. Der blev anvendt følgende metoder: a) Måling af elimineringsteknikken af immunotoksinet IT-T101.

35 Konjugatet kaldet IT-T101 fås ved reaktion af et antistof rettet mod humane T-celler (antistof T101 rettet mod antigenet T65), substitueret med en aktiveret disulfidgruppe, v

DK 163030 B

med A-kæden i ricin. Fremstillingen og de cytotoksiske egenskaber af dette konjugat er beskrevet i fransk offentliggørelsesskrift nr. 2.516.794, tilhørende de foreliggende ansøgere. Konjugatet IT-T101 administreres til ka-5 niner ved en enkelt injektion i ørevenen. Den injicerede mængde svarer til 1,25 mg immunotoksin pr. kg legemsvægt, d.v.s. 0,415 mg/kg udtrykt som A-kæde og 0,835 mg/kg udtrykt som antistof. Blodprøver udtages med mellemrum på heparin. Plas-maen analyseres ved hjælp af en radioimmunbestemmelse, der i 10 det følgende er betegnet med forkortelsen RIM-1.

Denne teknik har den fordel at bestemme immunotoksin.et uden at modificere det. Denne bestemmelse udføres i mikrotitrerings-plader (f.eks. "NUNC-TSP screening system", Poly Labo Block, IB Frankrig), hvis låg er forsynet med hyperabsorberende spidser der dypper ned i fordybningerne i pladen. Disse spidser udgør den faste fase. Fåreantistoffer rettet mod A-kæden i ricin (i det følgende betegnet med forkortelsen Acl), renset ved affinitetskromatografi, adsorberes på de faste faser. For at gøre 20 dette bliver 200 /il af en opløsning af Acl indeholdende 10 /ig/ml i en stødpude, som er 20 mM med hensyn til phosphat, pH 7, og 150 mM med hensyn til NaCl, fordelt i fordybningerne. Spidserne bringes i kontakt, først med opløsningen af Acl i 24 timer ved 4°C og derefter med kalvefosterserum i 3 timer ved 20°C, for at 25 mætte alle fikseringsstederne. Den mættede immunoabsorbent bringes så i 3 timer ved 20°C i kontakt med plasmaprøverne i forskellige fortyndinger eller med opløsninger af immunotoksin IT-T101 af kendte koncentrationer for at fastlægge kalibreringskurven. Vask udføres med en stødpude, som er 20 mM med hensyn 30 til phosphat, pH 7, og 150 mM med hensyn til NaCl, og immuno-absorbenten bringes så i 2 timer ved 20°C i kontakt med gede-antistoffer rettet mod muse-IgG, der er blevet renset ved affinitetskromatografi og radiomærket (i det følgende betegnet med forkortelsen Ac2). Ac2 radiomærkes med jod 125 i nærværelse af 35 chloramin T ved fremgangsmåden ifølge Greenwood & Hunter (Bio- chem.J. (1963) 89, 114). Den specifikke aktivitet af det radio-

DK 163030B

s c mærkede Ac2 er 5 - 10 yCi/mg. 10 cpn (tællinger pr. minut) radionnærket Ac2 indføres i et rumfang på 200ml i en stødpude, son er 20 mM med hensyn til phosphat, pH 7, og 150 mM med hensyn til NaCl, og indeholder 0,1% okseserumalbumin. Efter vask i en stødpude, som er 20 mM 5 med hensyn til phosphat, pH 7, og 150 mM med hensyn til NaCl, tages spidserne af, og mængden af bundet Ac2 måles ved tælling af radioaktiviteten. Immunotoksinkonc entr at ionen i prøverne, der skal bestemmes, måles ved sammenligning med kalibreringskurven, fastlagt med IT-T101, indført i forskellige kendte kon-10 centrationer.

I kraft af dens genkendelsesprincip gør denne prøve det muligt at måle de intakte immunotoksinmolekyler.

15 Sammenligning af koncentrationerne opnået ved denne bestemmelse méd dem, der måles ved prøven for in vitro cy to toksisk aktivitet på målcellerne, giver endvidere identiske værdier og sikrer derved, at immunotoksinet bestemt ved REM-l-prøven svarer til molekyler, som har bevaret deres egenskab af cytotoksicitet.

20 b) Måling af elimineringskinetikken af antistoffet rettet mod humane T-celler (eller antistof T101) .

Dette antistof blev fremstillet og renset på den måde, der er 25 vist i fransk offentliggørelsesskrift nr. 2.516.794. Antistoffet T101 injiceres intravenøst i kaniner i en dosis på 0,835 mg/kg. Plasmaprøverne udtages som før. Antistofkoncentrationen i prøverne måles ved radioimmunbestemmelse (RIM-2). Denne bestemmelse udføres under samme betingelser som RIM-l-prøven, med undtagelse 30 af at her er Acl-opløsningen en opløsning, som indeholder 10 mg/ml gedeantistoffer rettet mod muse-IgG, renset ved affinitetskromatografi. Antistoffet Ac2 er identisk med det i RIM-l-prøven. Koncentrationen af antistof T101 i prøverne, som skal bestemmes, måles ved sammenligning med kalibreringskurven, der er fastlagt 35 med antistoffet T101 indført i forskellige kendte koncentrationer.

c) Måling af elimineringskinetikken af A-kæden i ricin.

A-kæden af ricin blev fremstillet og renset på den måde, der er 9

DK 163030B

vist i fransk offentliggørelsesskrift nr. 2.437.213 og dets tillægsoffentliggørelsesskrift nr. 2.466.252. A-kæden injiceres intravenøst i kaniner i en dosis på 0,415 mgAg. Plasmaprøveme udtages som før. Koncentrationen af A-kæde i prøverne måles ved r adio immunbes temmel-5 se (RIM-3). Denne bestemmelse udføres under samme betingelser som RIM-l-prøven, idet antistofferne Acl, der er absorberet på den faste fase, også er fåreantistoffer rettet mod A-kæden i ricin, renset ved affinitetskromatografi, og antistofferne Ac2 er de samme radiomærkede antistoffer som beskrevet i RIM-1.

10 Koncentrationen af A-kæde af ricin i prøverne, som skal bestemmes, måles ved sammenligning med en kalibreringskurve, der er fastlagt med A-kæden af ricin indført i forskellige kendte koncentrationer.

Værdierne af koncentrationerne af immunotoksin, antistof og A-15 kæde af ricin i plasmaen, der er målt ved disse tre prøver, er reproducerbare, pålidelige og kvantitative. Påvisningstærskelen for disse tre produkter er 1 ng/ml. En undersøgelse af reproducerbarheden inden for en bestemmelse og mellem bestemmelser giver variationskoefficienter under 10% for koncen-20 trationsværdier i intervallet fra 1 til 200 ng/ml.

B. Resultater:

Resultaterne af de udførte forsøg er vist i form af kurver, som på abscissen viser tiden udtrykt i timer og på en logaritmisk skala på ordinaten koncentrationen af det målte produkt, udtrykt 25 som en procent af den teoretiske plasmakoncentration, ved tidspunktet 0. Denne værdi, kaldet "den relative plasmakoncentra-tion" (RPC), beregnes ved anvendelse af følgende udtryk:

koncentration målt fcil tiden T

RPC = - x 100.

mængde inj iceret/plasmarumfang 1

Plasmarumfanget anses for at være lig med 36 ml/kg legemsvægt

DK 163030 B

10 af dyret.

a) I fravær af mannan; Plasmaelimineringskinetik af immuno-toksin IT-T101, antistoffet T101 og A-kæden i ricin.

Figur 1 viser plasmaelimineringskurven af ΓΓ-Τ101, som har to 5 faser (kurve 1). I den første fase forsvinder produktet hurtigt (ca. 97% på 30 minutter). I den anden fase er faldet langsommere. Den første elimineringsfase iagttaget med IT-T101 forekommer ikke ved elimineringskinetikken af antistoffet T101, hvor der kun noteres én langsom eliminerings fase (kurve 2).

10 På den anden side er plasmaelimineringskinetikken af den ukob-lede A-kæde meget sammenlignelig med den af IT-T101: 1 time efter injektion er der kun 0,7% af den administrerede dosis tilbage i plasmaen (kurve 3).

b) I nærværelse af mannan: Plasmaelimineringskinetik af immuno- 15 toksin IT-T101 og A-kæden i ricin.

Mannanet blev administreret efter følgende skema: 20% af den endelige dosis af polysaccharidet injiceres intravenøst 10 minutter før injektionen af IT-T101 eller A-kæde.

På tidspunktet 0 injiceres 40% af den endelige dosis af poly-20 saccharidet intravenøst sammen med IT-T101 eller A-kæde (0,415 mg A-kæde/kg). Derpå injiceres 20% af den endelige dosis af poly-saccharid intravenøst på tidspunkterne henholdsvis 1,5 time og 5 timer.

Figur 2 viser plasmaelimineringskurven som funktion af tiden af 25 IT-T101 injiceret intravenøst sammen med mannan i en samlet do sis på 0,416 g/kg (kurve 2). I nærværelse af mannan er den første eliminerings fase - som er ansvarlig for forsvinden af den største del af produktet - praktisk taget undertrykt, hvilket

DK 163030 B

11 fører til en større stigning i mængden af aktivt immunotoksin i plasmaen. 15 timer efter injektion er koncentrationen af IT-T101 100 gange større, når immunotoksinet er blevet forbundet med mannan, end når mannan er fraværende (kurve 1).

5 Denne virkning af haamning af elimineringen af immuno toksinet fra plasmaen afhænger af dosen af mannan. Lavere doser af mannan (166 mg/kg og 16,6 mg/kg) giver svagere virkninger (kurverne 3 og 4) .

Egenskaberne af mannan iagttages også med den ukoblede A-kæde 10 som vist på figur 3. Dette bekræfter, at den hurtige forsvinden af immunotoksinet faktisk kan tilskrives bestanddelen A-kæden, især på grund af dens endestillede mannoserest.

Alligevel ses det, at den første eliminerings fase af A-kæden ikke er helt undertrykt, i modsætning til hvad der sker med 15 immunotoksinet. Dette bekræfter den helt overraskende virkning, som iagttages, når mannan og immunotoksin administreres samtidig.

EKSEMPEL 2.

For at vise den mulige specificitet af virkningen af mannan blev plasmaelimineringskinetikken af immunotoksinet IT-T101 målt i 20 nærværelse af andre polysaccharider, der ikke har mannoserester i endestilling. Det drejer sig om dextranerne T10, T40 og T500 (glucosepolymerer med molekylvægt på henholdsvis ca. 10.000, 40.000 og 500.000), administreret i en samlet dosis på 416 mg/kg, galactan (galactosepolymer), administreret i en samlet dosis på 25 166 mg/kg, og asialofetuin (kraftigt glycosyleret glycoprotein med endestillet galactose), administreret i en samlet dosis på 166 mg/kg.

Kurverne illustreret på figur 4 viser, at disse polysaccharider praktisk taget ikke har nogen virkning på plasmaeliminerings-30 kinetikken af immunotoksinet IT-T101.

12

DK 163030B

EKSEMPEL 3.

Dette eksempel viser den hepatiske indfangning af A-kæden af ricin efter intravenøs injektion og hasinningen af denne indfangning med ® mannan.

A-kæden, der er radiomærket med jod 125, injiceres intravenøst i Charles River France CDl-mus i fravær eller nærværelse af mannan i en dosis på 1 g/kg. På forskellige tidspunkter 10 under forsøget anæstetiseres to dyr. Dyrenes bughuler åbnes, cava-venen overskæres, og leveren vaskes med 10 ml fysiologisk saltopløsning ved injektion i portalvenen. Leveren fjernes helt, og radioaktiviteten bestemmes. Resultaterne er vist son en procent af antallet af cpm (tællinger pr. minut) fikseret 15 til leveren i forhold til det samlede antal cpm injiceret (fig. 5). I fravær af mannan indfanges A-kæden af ricin meget hurtigt og effektivt af leveren, således som vist ved den radioaktive top. Omvendt, i nærværelse af mannan er denne radioaktive top praktisk taget undertrykt. Dette resultat bekræfter, at A-kæden 20 af ricin fanges af leveren, og at opretholdelse af immunotoksinet ligesom A-kæden i høje plasmakoncentrationer i nærværelse af mannan faktisk skyldes hæmningen af denne hepatiske indfangning.

EKSEMPEL 4.

25 ___________

Dette eksempel viser fraværet af en antagonistisk virkning af mannan over for den selektive cytotoksicitet af immunotoksinet IT-T101 in vitro.

30

Ved disse forsøg blev cytotoksiciteten bedømt ved at måle inkorporeringen af 14C-leucin af målcellerne (CEM-celler) efter inku-bering i 24 timer ved 37°C i nærværelse af kendte koncentrationer af det undersøgte immunotoksin eller af cytotoksiske stoffer til 35

DK 163030 B

13 sammenligning i fravær eller nærværelse af mannan i en koncentration på 10 mg/ml. Den anvendte teknik er den tidligere beskrevne (J.Biol.Chem. 1984, 259 (15) 9359).

En kontrol blev udført på forhånd for at vise, at mannan ikke 5 er cytotoksisk for cellerne i de anvendte koncentrationer. Resultaterne af disse forsøg er vist i tabel I. Den cyto-toksiske virkning måles med værdien af den molære koncentration (ICjjq) udtrykt som A-kæde, der forårsager en 50%'s hæmning af inkorporeringen af sporstoffet.

10 Immunotoksinet, alene eller i sin form aktiveret med ammonium-chlorid, bevarer fuldt ud sin aktivitet. På samme måde bliver den naturlige toksicitet af A-kæden ikke modificeret. I nærværelse af mannan bliver de karakteristiske cytotoksiske egenskaber af immunotoksinet således ikke påvirket.

15 TABEL I.

ICj.q udtrykt som molaritet af A-kæde Afprøvede stoffer Uden mannan Med mannan (10 mg/ml)

Immunotoksin IT-T101 + ·,,

NH4C1 3,0 10 AJ M 2,8 10 M

IT-T101 1,0 10"9 M 1,2 1θ“9 M

20 A-kæde 8,0 10~7 M 7,0 10~7 M

EKSEMPEL 5.

Toksicitet af immunotoksinet IT-T101 injiceret i mus sammen med mannan.

DK 163030 B

14

Det var vigtigt at efterprøve den samlede toksikologiske virkning af forbindelsen af immunotoksin og mannan på det hele dyr. Dette blev gjort ved at bestemme den 50% dødelige dosis af antimelanoma-immunotoksinet (IT-HM) administreret intravenøst 5 til Charles River France CDl-mus i fravær af mannan eller med samtidig intravenøs administration af 10 mg mannan pr. mus. Fremstillingen og de cytotoksiske egenskaber af dette antimela-noma-konjugat (IT-HM) er beskrevet i fransk offentliggørélses-skrift nr. 2.504.010.

10 De fundne værdier er vist i tabel II.

TABEL II.

Afprøvet produkt LD50 IT-HM alene 460 mikrogram/mus IT-HM + 10 mg mannan/mus 115 mikrogram/mus 15 Disse resultater viser en svag stigning i toksicitet af immuno- toksinet, når det administreres samtidig med mannan. Denne stigning i toksicitet med en faktor på kun 4 begrænser ikke in vivo anvendelsen af mannan, når henses til de meget betydelige virkninger med hensyn til vedligeholdelse af plasmakoncentrationen 20 af immunotoksiner in vivo, således som vist ovenfor.

EKSEMPEL 6.

Formålet med dette eksempel er at demonstrere virkningen af mannan på aktiviteten af et immunotoksin ved et in vivo forsøg.

Forsøget blev udført på BL 1.1-mus (negative Thy 1.2 celler) 25 [International Journal of Cancer 24, 168-177 (1979)]. Det anvendte immunotoksin er konjugatet, hvori antistoffet rettet mod

DK 163030 B

15

Thy 1.2 (antistof AT15E) er forbundet ved hjælp af en disulfidbinding med A-kæden i ricin, og som fremstilles ved fremgangsmåden, der er beskrevet i ansøgernes tidligere kendte ansøgninger.

5 Der blev anvendt følgende protokol: På dag 0 får grupper på 10 BL 1.1-mus 5 x 10^ T2-celler (positive Thy 1.2 celler af murin lymphoma) ved intravenøs injektion, og de fordeles tilfældigt før behandling.

Behandlingen udføres intravenøst på dag 1: 10 En gruppe modtager 10 ;ug/mus af konjugatet antistof AT15E/A-kæde af ricin alene.

En anden gruppe modtager samme mængde af samme konjugat blandet med 10 mg mannan.

Desuden modtager 4 kontrolgrupper henholdsvis:

Kulturmediet RPMI (medium anvendt til dyrkning af T2-cellerne), 15 mannan alene (10 mg/mus), A-kæden af ricin (10 yug) og mannan (10 mg), A-kæden af ricin (10 /ig) , antistoffet AT15E (30 /ig) og mannan (10 mg).

Dyrene iagttages i 50 dage, og dødeligheden noteres.

20 Figur 6 viser procenten af dyr, der overlever som funktion af tiden, der er forløbet siden behandlingen.

DK 163030 B

16

Kurven 1 angår de dyr, der modtog immunotoksinet, og kurven 2 angår de dyr, der modtog forbindelsen af immunotoksin og mannan.

Som det vil ses, gav forbindelsen immunotoksin/mannan en overlevelsesprocent på 90% 50 dage efter behandlingen, hvorimod ad-5 ministration af immunotoksinet alene gav en overlevelsesprocent af dyrene på kun 30% efter 50 dage.

Endvidere blev der gjort følgende iagttagelser på dag 50 for kontrolgrupperne (ikke vist på figur 6): 0% overlevelse for dyrene behandlet med KPMI og med A-kæde + 10 mannan, 10% overlevelse for dyrene, der modtog mannan alene, 20% overlevelse for dyrene behandlet med A-kæde af ricin + antistof + mannan.

Disse resultater viser effektiviteten af forbindelsen immunotok-15 sin/mannan sammenlignet med immunotoksinet anvendt alene og sammenlignet med kontrolstofferne.

Forbindelsen bestående af et immunotoksin og mannan kan derfor anvendes som et lægemiddel i humanterapien. Forbindelsen kan anvendes til behandling af cancer- eller ikke-cancersygdomme, 20 hvori målcellerne vil blive genkendt af antistoffet anvendt til fremstilling af immunotoksinet.

Med det formål at eliminere alle målcellerne må behandlingen udføres med en tilstrækkelig dosis immunotoksin i forbindelse med en mængde mannan, der kan variere fra 10 mg til 1 g/kg for hver 25 administration af immunotoksin. De optimale udførelsesformer for administration af bestanddelene af forbindelsen og også varigheden af behandlingen må bestemmes i hvert tilfælde, afhængende af individet og karakteren af den sygdom, der skal behand les.

Claims

3. Lægemidler ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 30 ved, at de er emballeret med henblik på administration ved hjælp af intravenøs injektion. 1 Lægemidler ifølge krav 1, 2 eller 3, kendeteg net ved, at immunotoksinet og den mannoseholdige polymer er 35 emballeret separat.