DK162997B - Fremgangsmaade til fremstilling af 5,6,7,8-tetrahydrofolinsyre - Google Patents

Description

i

DK 162997 B

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af 5,6,7,8-tetrahydrofolinsyre (herefter kort omtalt som tetrahydro-folinsyre) ved reduktion af fol i nsyre eller di hydrofoil nsyre i vandig basisk opløsning.

5

Tetrahydrofolinsyre er et co-enzym, der er repræsenteret ved strukturformlen (I) anført nedenfor. Det er en nyttig forbindelse, der spiller en vigtig rolle i biosyntetiske reaktioner. I f.eks. enzym-5 10 reaktioner tjener N,N -formylderivater, i hvilke tetrahydrofolin- 5 10 10 syre er forenet med myresyre, som formyl donorer, N ,N -methylende-rivatet, i hvilket tetrahydrofolinsyre er forenet med formaldehyd, tjener som en hydroxymethyl donor ved omdannelse af glycin til serin, og N -methylderivatet, der er den reducerede form af methyl enderiva-tet, tjener til omdannelse af homocystein til methionin.

15 H

"Ύϊ Y 8 Y H CH2CH2COOH

H H9 10 \_/ COOH

20 Ϊ

Traditionelt kendes der et antal af fremgangsmåder til fremstilling af tetrahydrofolinsyre. Én af dem omfatter opløsning af folinsyre i en vandig opløsning af natriumhydroxid, reduktion af denne med 25 natriumhydrosulfit til dannelse af di hydrofoilnsyre og yderligere reduktion med natriumborhydrid eller lignende til dannelse af tetrahydrofolinsyre [Helv. Chim. Acta, 1980, 63(8), 2554], og en anden omfatter reduktion af folinsyre i eddikesyre ved hjælp af NaCNBH3 [Anal. Biochem., 1980, 103(2), 255]. Disse fremgangsmåder er 30 imidlertid ikke egnede til fremstilling af tetrahydrofolinsyre i industriel målestok, fordi de besidder de ulemper, at de kræver et dyrt reduktionsmiddel i store mængder og involverer vanskelige procedurer.

35 På den anden side kendes der også fremgangsmåder til fremstilling af tetrahydrofolinsyre ved hydrogenering af folinsyre i nærvær af en ædelmetal katalysator. For eksempel beskrives der i beskrivelsen til U.S. patent nr. 2.717.250 (1955) og nr. 2.790.802 (1957) en fremgangsmåde, der omfatter suspendering af folinsyre i iseddikesyre og 2

DK 162997 B

reducering af denne i nærvær af en pi at i noxid katalysator. Ved denne fremgangsmåde udgør mængden af anvendt katalysator imidlertid så meget som 10 til 100 vægtprocent baseret på folinsyren, og en stor mængde iseddikesyre anvendes som reaktionsopløsningsmiddel. Desuden 5 kræver den en besværlig procedure til isolering af produktet. Ydermere er produktudbyttet så lavt som ca. 48%. Følgelig kan denne fremgangsmåde ikke anses for økonomisk fordelagtig.

Endvidere findes der et tilfælde, i hvilket fol i nsyre blev opløst i 10 en stor mængde, dvs. ca. 19 mol per mol folinsyre, vandig natrium-hydroxidopløsning (nærmere bestemt blev 36 mg folinsyre opløst i 15 ml 0,IN NaOH), og dets hydrogenering blev udført under disse stærkt alkaliske forhold i nærvær af en platinoxidkatalysator, der blev anvendt i en mængde på så meget som 70 vægtprocent baseret på 15 folinsyren [J. Am. Chem. Soc., 69, 250 (1947)]. I dette tilfælde stoppede hydrogeneringen imidlertid på dihydrofolinsyretrinet til trods for den store mængde anvendt katalysator, således at kun di hydrofoil nsyre blev opnået i et lavt udbytte, og intet tetrahy-drofolinsyre blev fremstillet.

20

Tetrahydrofolinsyre er en ustabil forbindelse. Hed tiden nedbrydes tetrahydrofolinsyre ved indvirkning af oxygen, varme, lys og lignende til dannelse af dihydrofoilnsyre, folinsyre, p-aminobenzoesyre og andre forbindelser. Når tetrahydrofolinsyre har undergået en 25 udpræget grad af forringelse, inhiberer det undertiden enzymreaktioner. Følgelig udføres fremgangsmåden til isolering af tetrahydrofolinsyre fra den reaktionsopløsning, der er opnået ved katalytisk hydrogenering af folinsyre, i en atmosfære af en inert gas (f.eks. i et indelukke, der skylles med nitrogengas for at erstatte 30 luften, som forekommer heri) for at forhindre tetrahydrofolinsyren i at blive nedbrudt ved oxidation.

Hvor den således opnåede tetrahydrofolinsyre foreligger i pulverform, forsegles den hermetisk i ampuller, der fyldes med en inert 35 gas, såsom argongas eller lignende. Hvor den foreligger i form af en opløsning, opløses den i en vandig opløsning, der indeholder 1 mol/liter mercaptoethanol, til frembringelse af en typisk koncentration af størrelsesordenen 0,5 g/3 ml og forsegles i ampuller, der fyldes med en inert gas på samme måde som for pulverprodukter. Disse 3

DK 162997 B

ampuller er i nedkølet tilstand faste.

Som beskrevet ovenfor har den traditionelt kendte fremgangsmåde til fremstilling af tetrahydrofoli nsyre ikke være tilfredsstillende med 5 hensyn til at fremstille den i industriel målestok, fordi hydroge- nolysen og lignende kan forårsage dannelse af biprodukter under hydrogeneringen, og reaktionsblandingen kan indeholde tilbagebleven ureageret fol insyre eller dihydroforbindelse, hvilket medfører et lavt udbytte af det ønskede produkt.

10

Ydermere har de traditionelle metoder til stabilisering og opbevaring af tetrahydrofoli nsyre om end til en vis grad være effektive, så dog ikke helt tilfredsstillende. Specielt afhænger stabiliteten af en tetrahydrofol insyreopløsning især af temperaturen, selv om en 15 stabilisator, såsom mercaptoethanol eller lignende, er inkluderet.

Det vil sige, den undergår forringelse selv ved relativt lave temperaturer omkring 0°C og navnlig markant forringelse i kvalitet ved stuetemperatur og i området deromkring, hvilket indicerer, at stabilisatoren ikke fungerer behørigt. Selv om lagerstabiliteten af 20 et pulver er bedre end den af en opløsning, har også dettes forringelse i kvalitet med tiden været uundgåelig, fordi det er vanskeligt at erstatte luften, der forekommer i beholderen, med en inert gas i tilfælde, hvor den uanvendte del af den tetrahydrofolinsyre, der udtages af ampullen, lagres igen, eller 25 tetrahydrofolinsyre fremstillet af brugeren lagres i en beholder til opnåelse af kontrolleret forbrug. Det vil følgelig være ønskeligt at forbedre lagerstabiliteten af tetrahydrofolinsyre.

Fra beskrivelsen til DK patentskrift nr. 144.944 kendes en frem-30 gangsmåde til fremstilling af d,l-5-methyltetrahydrofolinsyre eller salte heraf ved reduktion af folinsyre til tetrahydrofolinsyre med NaBH^ i vandig opløsning med en pH-værdi på 7-8, methylering af tetrahydrofolinsyren til 5-methyltetrahydrofolinsyre med formaldehyd og natriumborhydrid i vandig opløsning samt adskillelse og oprens-35 ning af natrium-5-methyltetrahydrofolat.

Ved fremgangsmåden til fremstilling af 5,6,7,8-tetrahydrofolinsyre ifølge den foreliggende opfindelse benyttes der hydrogen som reduktionsmiddel, hvilket er meget billigere end NaBH^. Endvidere er 4

DK 162997 B

reduktionsreaktionen under anvendelse af NaBH^ kun egnet til produktion i forholdsvis lille skala, medens den foreliggende reduktion under anvendelse af hydrogen let kan benyttes til produktion i stor skala.

5

Formålet med den foreliggende opfindelse er således at tilvejebringe en økonomisk fordelagtig og simplificeret fremgangsmåde til fremstilling af tetrahydrofolinsyre. Et andet formål er at isolere tetrahydrofolinsyren i form af et produkt med forøget lagerstabi- 10 litet.

Ifølge den foreliggende opfindelse opnås disse formål ved en fremgangsmåde af den i krav l's indledning angivne art, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at folinsyre eller 15 di hydrofoilnsyre opløses eller suspenderes i en vandig opløsning, der indeholder en uorganisk base, og den resulterende folinsyre-eller di hydrofoilnsyre-indeholdende opløsning eller suspension bringes i kontakt med hydrogen i nærvær af en katalytisk mængde af et ædelmetal, medens pH holdes i området på fra 5 til 9, hvorefter 20 5,6,7,8-tetrahydrofolinsyren isoleres.

Tetrahydrofoli nsyren kan anvendes i form af den reaktionsopløsning, der opnås ved fraskillelse af katalysatoren fra reaktionsblandingen, eller i form af et pulver, der isoleres fra reaktionsblandingen. I 25 di sse tilfælde er det ønskeligt at tilvejebringe en simpel metode til stabil lagring af tetrahydrofolinsyre i lange tidsperioder.

Dette ønske kan opfyldes ved at fryse en vandig opløsning indeholdende tetrahydrofolinsyre og en uorganisk base og forsegle den frosne opløsning i en atmosfære af en inert gas til beskyttelse af 30 den mod luft eller ved at forsegle et pulver af tetrahydrofolinsyre sammen med et deoxidati onsmiddel i en atmosfære af en inert gas, således at det beskyttes mod luft. Ifølge begge disse fremgangsmåder kan tetrahydrofolinsyre opbevares stabilt.

35 Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes folinsyre eller dihydrofolinsyre som udgangsmateriale.

Den uorganiske base, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, kan være en hvilken som helst uorganisk 5

DK 162997 B

base, der muliggør opløsning af folinsyre eller dihydrofolinsyre, og som ikke udøver nogen uheldig virkning på hydrogeneringsreaktionen. Specifikke eksempler på sådanne uorganiske baser omfatter natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriumcarbonat, kaliumcarbonat, natriumhy-5 drogencarbonat, kaliumhydrogencarbonat og ammoniumhydroxid. Blandt disse foretrækkes ammoniumhydroxid.

Mængden af anvendt uorganisk base bør almindeligvis ligge i området fra 0,5 til 1,5 ækvivalenter for hver carboxyl gruppeækvivalent af 10 udgangsfoli nsyren eller -dihydrofolinsyren og kan hensigtsmæssigt bestemmes alt efter typen af anvendt uorganisk base og pH i reaktionsblandingen. Mængden af anvendt uorganisk base bør dog fortrinsvis være en omtrent ækvivalent mængde, dvs. befinde sig i området fra 0,8 til 1 ækvivalent for hver carboxyl gruppeækvivalent af udgangsfo-15 linsyren eller -dihydrofolinsyren. Reaktionen bør udføres på en sådan måde, at reaktionsblandingens pH holdes i området fra 5 til 9 og fortrinsvis i området fra 6 til 8.

Hvis pH i reaktionsblandingen er mindre end 5, nedsættes opløselig-20 heden af udgangsmaterialet, og derfor vil der være en stor del uomsat materiale tilbage. Hvis pH i reaktionsblandingen er større end 9, nedsættes aktiviteten af katalysatoren. Derved vil mængden af absorberet hydrogen blive meget mindre end den teoretiske værdi, således at reaktionen vil stoppe halvvejs, og der vil være en stor 25 mængde uomsat materiale tilbage.

På det indledende reaktionstrin behøver den folinsyre, der anvendes som udgangsmateriale, ikke at være fuldstændig opløst men kan være tilstede i en sådan tilstand, at mindst ca. halvdelen af den er 30 opløst, og resten er suspenderet. I et sådant tilfælde bør den uorganiske base tilsættes kumulativt med reaktionens fremadskriden.

På denne måde opnås produktet til slut i form af en vandig opløsning.

35 Under udførelse af fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse kan alle de tilnærmelsesvise ækvivalente mængder af uorganisk base tilsættes reaktionssystemet ved reaktionens begyndelse. Det er imidlertid at foretrække at sætte en del af den uorganiske base til reaktionssystemet ved reaktionens begyndelse og tilsætte resten 6

DK 162997 B

dråbe for dråbe, medens hydrogeneringsreaktionen skrider frem. Denne metode gør det ikke kun muligt at styre reaktionen på den rette måde og opretholde aktiviteten af katalysatoren, men gør det også muligt at minimere dannelsen af biprodukter ved hydrogenolyse af tetrahy-5 drofolinsyre.

En ædelmetal katalysator anvendes ved fremgangsmåden ifølge nærværende opfindelse, og foretrukne eksempler herpå er platin og rhodium. Almindeligvis anvendes disse katalysatorer båret på aktivt kul, 10 siliciumoxid, aluminiumoxid og lignende. De kan også anvendes i form af oxider såsom platinoxid.

Udtrykt som ædelmetal bør mængden af anvendt katalysator ligge i området fra 0,15 til 3,0 vægtprocent baseret på den folinsyre, der 15 er anvendt som udgangsmateriale, eller i området fra 0,15 til 2,0 vægtprocent baseret på den dihydrofolinsyre, der er anvendt som udgangsmateriale. Hvor en 5% piatin/aktiveret kul katalysator anvendes, er det f.eks. almindeligvis passende at anvende katalysatoren i en mængde på fra 3 til 20 vægt%, baseret på fol i nsyren. Hvor 20 fol i nsyren anvendes som udgangsmateriale, vil reaktionen, hvis mængden af anvendt 5% piatin/aktiveret kul katalysator er mindre end 3 vægt%, stoppe halvvejs og efterlade uomsat materiale og mellemprodukter. Hvis mængden af anvendt 5% Pd/kul-katalysator er større end 20 vægtprocent, vil reaktionen være fuldendt efter et 25 kort tidsrum, men der vil være en uønsket tendens, der medfører dannelse af biprodukter ved hydrogenolyse. Generelt behøver en frisk katalysator ikke at blive anvendt i så store mængder. Det foretrukne område er almindeligvis fra 5 til 15 vægtprocent. Den katalysator, der er blevet anvendt ved reaktionen, fraskilles ved filtrering 30 eller med andre midler, vaskes med vand og genanvendes i efterfølgende reaktioner. Da aktiviteten af katalysatoren reduceres mere eller mindre, bør en frisk katalysator tilsættes efter behov.

Det hydrogentryk, der anvendes ved hydrogeneringen, kan være atmos-35 færetryk. Reaktionen kan dog udføres ved tryk over atmosfæretryk, hvis det er nødvendigt.

Den reaktionstemperatur, ved hvilken hydrogeneringen udføres, kan passende være 0°C eller derover. Når reaktionen udføres ved 7

DK 162997 B

atmosfæretrykket, er det ønskeligt at anvende en temperatur i området fra 0 til 80°C. Det særligt foretrukne område er fra 20 til 50°C.

5 Da hastigheden for hydrogeneringsreaktionen for en stor del afhænger af omrøringshastigheden af reaktionsblandingen, er det at foretrække at omrøre reaktionsblandingen kraftigt, således at den bringes i grundig kontakt med hydrogen.

10 Fremgangsmåden til isolering af tetrahydrofolinsyre fra reaktionsblandingen udføres almindeligvis i en atmosfære af inert gas for at forhindre, at tetrahydrofolinsyren forringes ved oxidation. Specielt separeres katalysatoren fra reaktionsblandingen ved filtrering eller andre midler i en boks, der skylles med nitrogen til erstatning af 15 luften heri. Derefter neutraliseres den resulterende opløsning med saltsyre under tilstedeværelse af en stabilisator, såsom L-ascorbin-syre, mercaptoethanol eller lignende, til udfældning af tetrahydro-folinsyren. Det foretrækkes at neutralisere opløsningen, indtil dens pH kommer i nærheden af 3,5.

20

Efter afkøling underkastes den neutraliserede opløsning en separationsmetode, såsom filtrering eller lignende. Den tetrahydrofolinsyre, der er frasepareret ved filtrering, vaskes med afluftet koldt vand til fjernelse af eventuelle salte og tørres derefter.

25

For at tørre tetrahydrofolinsyren ved lave temperaturer på kort tid, foretrækkes det at vaske den med et lavtkogende og vandblandbart opløsningsmiddel (såsom acetone, methanol eller lignende) forud for tørring.

30

Tetrahydrofolinsyre, der er opnået på denne måde, foreligger i form af hvide til askegrå krystaller og har almindeligvis en renhed på ikke mindre end 80% (bestemt ved HLC-analyse). Uden nogen yderligere oprensning udviser den en aktivitet, der er tilstrækkelig til 35 anvendelse som coenzym ved enzymreaktioner.

Ydermere kan et tetrahydrofolinsyreprodukt, der har langtidslagerstabilitet, opnås ved at fremstille tetrahydrofolinsyre i form af en opløsning, forsegle den i en beholder, der er fyldt med en inert

DK 162997 B

s gas, og lagre den i frossen tilstand. Opløsningen kan være den reaktionsopløsning, der er opnået ved fraseparering af katalysatoren fra den reaktionsblanding, der har været underkastet den ovenfor beskrevne hydrogenering, eller en vandig opløsning, der er opnået 5 ved at isolere tetrahydrofolinsyren i pulverform, som det er beskrevet ovenfor, og opløse pulveret i en vandig opløsning af alkali (som f.eks. ammoniumhydroxid, natriumhydroxid eller lignende) for på den måde at få en typisk koncentration på fra 5 til 10 vægtprocent. Det er blevet konstateret, at der ikke observeres nogen ugunstig påvirk-10 ning, når den frosne opløsning optøs og anvendes, f.eks. i en enzymreaktion til syntese af L-serin.

Hvor tetrahydrofolinsyren opbevares på pulverform, kan dette almindeligvis gennemføres ved at forsegle pulveret sammen med et deoxida-15 tionsmiddel i en beholder, der er fyldt med en inert gas, og opbevare den ved lav temperatur. Deoxidationsmidl et kan være ethvert velkendt oxygenabsorberende stof, der er emballeret i et porøst materiale, f.eks. det, der er kommercielt erhverveligt fra Mitsubishi Gas Chemistry Co., Ltd. under handelsnavnet "AGELESS". Mængden 20 af anvendt deoxidationsmiddel kan tilpasses mængden af opbevaret tetrahydrofoli nsyre og opbevaringsperioden. Når et sådant deoxidationsmiddel er tilstede i en forseglet beholder, vil det indre af beholderen blive trykreduceret som resultat af deoxidationen. Følgelig bør beholderen ved forsegling af pulveret sammen 25 med deoxi dati onsmi dl et fortrinsvis fyldes med en inert gas for på den måde at opretholde en svag overtrykstilstand heri. Den forseglede beholder bør opbevares ved en temperatur på under 0°C.

Ved den foreliggende fremgangsmåde er produktionsomkostningerne 30 meget lave, fordi der anvendes en vandig opløsning af en billig uorganisk base som opløsningsmiddel, og reaktionen fuldføres på relativt kort tid, fordi udgangsmaterialet hydrogeneres i en sådan tilstand, hvor det er fuldstændigt opløst i den vandige opløsning af den uorganiske base eller for størstedelen opløst heri med resten 35 suspenderet heri. Derfor er en meget lille mængde katalysator tilstrækkelig til opnåelse af formålet ifølge den foreliggende opfindelse. Ydermere simplificeres efterbehandlingen af reaktionsblandingen. Dette kan specielt opnås ved at filtrere reaktions blandingen til fraskil!el se af katalysatoren herfra, hælde filtratet 9

DK 162997 B

i en sur opløsning, der indeholder en stabilisator som f.eks. L-ascorbinsyre eller lignende, og derved neutralisere filtratet til udfældning af det ønskede produkt. Det således dannede udfældningsprodukt kan frasepareres ved filtrering, vaskes og derefter tørres 5 under reduceret tryk. Således opnås der i godt udbytte et præparat af tetrahydrofolinsyre med høj kvalitet, som tilfredsstillende kan anvendes i reaktioner, som f.eks. biosyntese af L-serin og lignende, uden at der kræves nogen yderligere oprensning.

10 Ydermere kan der opnås tetrahydrofolinsyreprodukter, der har langtidslagerstabilitet, ved at fremstille reaktionsproduktet i form af en opløsning (dvs. reaktionsopløsningen opnået ved fraseparering af katalysatoren fra førnævnte reaktionsblanding, der har været underkastet hydrogenering, eller en vandig opløsning, der er dannet ved 15 at isolere reaktionsproduktet i pulverform og opløse det i en vandig opløsning af et alkali, som f.eks. ammoniumhydroxid, natriumhydroxid eller lignende), fryse og bringe opløsningen på fast form og afskærme den fra luft; eller ved at isolere reaktantproduktet i pulverform, og forsegle pulveret sammen med et deoxidationsmiddel i en 20 inert gas til afskærmning af det fra luft.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse illustreres mere specifikt af følgende eksempler. Folinsyren, der anvendes i disse eksempler, havde en renhed på 91,3%, og dens mol antal udtrykkes som 25 ren fol insyre.

Eksempel 1 I en 1-1 iters rundbundet kolbe, der var forsynet med en omrører, 30 blev der fyldt 15,012 g (3,105 x 10~2 mol) folinsyre og 10,8 ml (5,40 x 10 mol) 0,5N vandig opløsning af ammoniumhydroxid. Indholdet blev omrørt, indtil størstedelen af folinsyren var opløst.

Den resulterende opløsning udviste et pH på 6,6.

35 Derefter blev der sat en suspension af 2,025 g 3% piatin/aktiveret kul katalysator (indeholdende ædelmetal i en mængde på 0,44 vægtprocent baseret på folinsyre) i 160 ml destilleret vand til kolben.

Efter at det indre af systemet var skyllet med nitrogen, blev hydrogeneringen udført ved atmosfæretryk i 360 minutter og 10

DK 162997 B

omgivelsestemperatur, d.v.s. 20-30°C, hvorunder indholdet i kolben blev kraftigt omrørt på sædvanlig måde. Ved afslutningen af reaktionen var mængden af absorberet hydrogen 100,4% af den teoretiske værdi.

5

Efter fuldendelse af reaktionen blev der tilsat 18,6 ml 0,5 N vandig opløsning af ammoniumhydroxid under en strøm af nitrogengas til opløsning af uopløst stof, som var tilstede i meget små mængder. Fra dette trin og fremefter blev separering og tørring af reaktions-10 produktet til stadighed udført i en atmosfære af nitrogen.

Specielt blev reaktionsblandingen filtreret med et sugefilter til fraseparering af katalysatoren, der blev vasket med 30 ml destilleret vand. Derefter blev filtratet og vaskevandet hældt i en opløs-15 ning af 3,3 g L-ascorbinsyre i 117,4 ml 0,5N saltsyre. Den resulterende blanding blev justeret til pH 3,5. Det således dannede præci-pitat blev frasepareret ved sugefiltrering og vasket med 30 ml destilleret vand ved 5°C og derefter med 200 ml acetone ved 5°C. Den resulterende våde kage blev anbragt i en tørrer, der indeholdt et 20 tørremiddel, og holdt ved et reduceret tryk på 5 mm Hg, tørret ved 25 - 30°C i 8 timer under opnåelse af 10,714 g tetrahydrofolinsyre (77,5% udbytte).

Den således opnåede tetrahydrofolinsyre havde en renhed på 85,0%, 25 der blev analyseret ved højhastighedsvæskekromatografi. Når dette produkt blev anvendt i enzymreaktioner uden yderligere oprensning ved konventionelle metoder som f.eks. søjlekromatografi eller lignende, udviste det en aktivitet, der var ækvivalent med den af kommercielt opnåelige reagenskvalitetprodukter.

30

Eksempel 2 I en 300-ml rundbundet kolbe, der var forsynet med en omrører, blev fyldt 4,310 g (8,91 x 10"3 mol) folinsyre og 32,2 ml (16,1 x 10"3 35 mol) 0,5N vandig opløsning af ammoniumhydroxid. Indholdet blev omrørt, indtil størstedelen af fol i nsyren var opløst. Den resulterende opløsning udviste et pH på 6,6.

Derefter blev der tilsat en suspension af 0,0687 g platinoxid 11

DK 162997 B

(indeholdende ædelmetal i en mængde på 1,5 vægtprocent baseret på fol insyren) i 50 ml destilleret vand til kolben, og hydrogeneringen blev udført på samme måde som beskrevet i eksempel 1 under opnåelse af 2,973 g af tetrahydrofolinsyre (74,9% udbytte).

5

Eksempel 3 I en 300-ml rundbundet kolbe, der var forsynet med en omrører, blev fyldt 2,2963 g (4,75 x 10'^ mol) folinsyre og 16,5 ml (8,25 x 10 ^ 10 mol) 0,5N vandig opløsning af ammoniumhydroxid. Indholdet blev omrørt, indtil størstedelen af fol i nsyren var opløst. Den resulterende opløsning udviste et pH på 6,5.

Derefter blev der tilsat en suspension af 0,230 g 5% rhodium/ 15 aktiveret kul katalysator (indeholdende ædelmetal i en mængde på 0,55 vægtprocent baseret på folinsyre) i 25 ml destilleret vand til kolben, og hydrogeneringen blev udført på samme måde som beskrevet i eksempel 1 under opnåelse af 1,593 g tetrahydrofolinsyre (75,3% udbytte).

20

Eksempel 4 I en 300-ml rundbundet kolbe, der var forsynet med en omrører, blev fyldt 4,384 g (9,07 x 10"^ mol) folinsyre og 35,7 ml (17,85 x 10"^ 25 mol) 0,5N vandig opløsning af ammoniumhydroxid. Indholdet blev omrørt, indtil størstedelen af fol i nsyren var opløst. Den resulterende opløsning udviste et pH på 7,3.

Derefter blev der tilsat en suspension af 0,399 g 5% platin/aktive-30 ret kul katalysator i 50 ml destilleret vand til kolben, og hydrogeneringen blev udført i 515 minutter på samme måde, som beskrevet i eksempel 1. Ved slutningen af reaktionen var mængden af absorberet hydrogen 101,8% af den teoretiske værdi.

35 Efter at katalysatoren var frasepareret ved filtrering, blev filtratet hældt i en opløsning, der bestod af 34 ml 0,5N saltsyre og 1,026 g L-ascorbinsyre. Den resulterende blanding blev neutraliseret, hvorefter dens pH blev justeret til 3,5.

12

DK 162997 B

Reaktionsproduktet blev frasepareret og tørret på samme måde, som beskrevet i eksempel 1 under opnåelse af 2,926 g tetrahydrofolinsyre (72,4% udbytte).

5 Eksempel 5 I en 300-ml rundbundet kolbe, der var forsynet med en omrører, blev fyldt 2,179 g 7,8-dihydrofolinsyre og 17,5 ml 0,5N vandig opløsning af ammoniumhydroxid. Indholdet blev omrørt, indtil størstedelen af 10 dihydrofolinsyren var opløst. Den resulterende opløsning udviste et pH på 6,7.

Derefter blev der tilsat 0,112 g 5% piatin/aktiveret kul katalysator (indeholdende ædelmetal i en mængde på 0,26 vægtprocent baseret på 15 dihydrofolinsyren) til kolben, og hydrogeneringen blev udført på samme måde, som beskrevet i eksempel 1 under opnåelse af 1,439 g tetrahydrofolinsyre (65,7% udbytte).

Eksempel 6 20 10.0 ml (0,5 ækvivalent) 0,5N ammoniumhydroxid blev sat til 2,417 g _3 (5,0 x 10 mol) folinsyre, og den resulterende opløsning blev justeret til pH 6,3. Derefter blev der tilsat 0,202 g 5% platin/ aktiveret kul katalysator og 25 ml destilleret vand for at sætte 25 hydrogeneringen i gang.

Fra det tidspunkt, hvor hydrogenabsorptionshastigheden begyndte at falde, blev 9,8 ml 0,5N vandig opløsning af ammoniumhydroxid langsomt lidt efter lidt sat til reaktionsblandingen under reaktionens 30 fremadskriden. Slutteligt udviste reaktionsblandingen et pH på 6,8.

Derefter blev reaktionsblandingen oparbejdet på samme måde som beskrevet i eksempel 1 under opnåelse af 1,785 g tetrahydrofolinsyre (80,2% udbytte).

35

Eksempel 7 10.0 g Tetrahydrofolinsyrepulver (88,8% renhed), der indeholdt 1,0% L-ascorbinsyre som stabilisator, blev sammen med en deoxida- 13

DK 162997 B

tionspakning (kommercielt opnåelig fra Mitsubishi Gas Chemistry Co.,

Ltd. under handelsnavnet "AGELESS"), der har en oxygenabsorptionskapacitet på 50 cc, fyldt på 100 nil's brune prøverør fremstillet af glas. Disse rør blev skyllet med Ng-gas for at erstatte luften heri 5 og derefter forseglet. (Denne prøve vil herefter blive omtalt som prøve A).

På den anden side blev en kontrol prøve forseglet i et prøverør under de samme forhold med undtagelse af, at der ikke var placeret noget 10 deoxidationsmiddel heri (prøve B). Begge prøver blev opbevaret i et termostatstyret rum, der blev holdt ved -20°C, og deres ændring i renhed med tiden blev undersøgt ved højhastighedsvæskekromatografi.

De opnåede resultater er vist i tabel 1, og de viser tydeligt effekten af deoxidationsmidlet.

15

Tabel 1 Ændring af tetrahvdrofolinsvre (pulver) med tiden _Antal dage_ 20 0 10 20 40

Prøve A (med deoxidationsmiddel) 88,8 88,3 88,3 88,0 B (kontrolprøve) 88,8 88,0 74,5 70,6 25 Eksempel 8 100 g Folinsyre (91,3% renhed) blev opløst i en ækvivalent mængde af fortyndet vandig ammoniak til dannelse af en opløsning, der havde en koncentration på 10,0 vægtprocent, til hvilken der blev sat 8,14 g 30 3% piatin/aktiveret kul katalysator (med et vandindhold på 50%).

Efter at systemet var skyllet med nitrogen og derefter med hydrogen, blev hydrogeneringen udført i det neutrale område ved stuetemperatur og ved atmosfæretryk i overensstemmelse med traditionel fremgangsmåde.

35

Efter fuldendelse af reaktionen blev systemet skyllet med nitrogen for at erstatte det tilstedeværende hydrogen heri og derefter placeret i en nitrogenboks, hvor 21,4 g L-ascorbinsyre blev sat til reaktionsblandingen og opløst heri ved omrøring. Derefter blev 14

DK 162997 B

katalysatoren frasepareret ved sugefiltrering og vasket med 100 ml afluftet vand til opnåelse af en vandig opløsning af tetrahydrofo-1 i nsyreammon i umsaltet.

5 150 ml Af ovenstående vandige opløsning af tetrahydrofolinsyreammo- niumsaltet, der indeholdt 1,74% L-ascorbinsyre (og havde en tetra-hydrofolinsyrekoncentration på 7,13%), blev fyldt i 250 ml brune rør fremstillet af glas. Disse rør blev skyllet med nitrogengas for at erstatte luften heri og derefter forseglet.

10 Rørene blev opbevaret i termostatstyrede rum, der blev holdt ved -20°C, 0-5°C henholdsvis 25°C, og deres ændringer af tetrahydrofo-linsyrekoncentration som funktion af tiden blev undersøgt ved højhastighedsvæskekromatografi. De derved opnåede resultater er 15 anført i tabel 2, og de viser klart, at kvaliteten af vandig tetra-hydrofolinsyreopløsning stabiliseres ved frysning og opbevaring ved lave temperaturer.

Tabel 2 20 Ændring af tetrahydrofolinsyrekoncentrationen i en opløsning _som funktion af tiden_

Opbevaringstemperatur (°C1 _Antal dage_ 25 0_20_40_60 -20 (frossen) 7,13 7,04 6,97 6,93 0-5 7,13 4,77 3,91 2,50 25 7,13 1,95 1,55 1,07 30 35

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af 5,6,7,8-tetrahydrofolinsyre ved reduktion af folinsyre eller di hydrofoil nsyre i vandig basisk 5 opløsning, kendetegnet ved, at folinsyre eller dihydrofo-linsyre opløses eller suspenderes i en vandig opløsning, der indeholder en uorganisk base, og den resulterende folinsyre- eller dihydrofolinsyreholdige opløsning eller suspension bringes i kontakt med hydrogen i nærvær af en katalytisk mængde af et ædelmetal, 10 medens pH holdes i området på fra 5 til 9, hvorefter 5,6,7,8-tetrahydrofoli nsyren isoleres.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pH-området fra 5 til 9 opretholdes ved at tilsætte den uorganiske 15 base kumulativt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den uorganiske base udvælges fra gruppen, der består af ammoniumhydroxid, natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriumcarbonat, kaliumcarbo- 20 nat, natriumhydrogencarbonat og kaliumhydrogencarbonat.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den uorganiske base er ammoniumhydroxid.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den uorganiske base anvendes i en mængde på fra 0,8 til 1 ækvivalent for hver carboxylgruppeækvivalent i udgangsfolinsyren eller -dihydro-folinsyren.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ædelmetallet er platin, rhodium eller platinoxid, der er båret på en bærer.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 35 ædelmetallet anvendes i en mængde på fra 0,15 til 3,0 vægtprocent baseret på vægten af fol i nsyren eller i en mængde på fra 0,15 til 2,0 vægtprocent baseret på vægten af di hydrofoil nsyren.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at den DK 162997 B katalytiske hydrogenering udføres ved en temperatur på fra 0 til 80°C.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den 5 katalytiske hydrogenering udføres ved atmosfæretryk.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 5.6.7.8- tetrahydrofolinsyren isoleres i form af et produkt, som kan opbevares stabilt ved lave temperaturer, idet reaktionsblandingen 10 filtreres til fraseparering af ædelmetallet herfra, hvorefter den resulterende vandige opløsning, der indeholder 5,6,7,8-tetrahydrofo-linsyre og uorganisk base, fryses og bringes på fast form, og den frosne opløsning forsegles i en atmosfære af en inert gas.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 5.6.7.8- tetrahydrofolinsyren isoleres i form af et pulver, og at pulveret forsegles sammen med et deoxidationsmiddel i en atmosfære af en inert gas. 20 25 30 35