DK160831B

DK160831B - Antimikrobielt virksom og antitumorvirksom forbindelse fr-900447, fremstilling heraf, mikroorganisme til brug ved fremstillingen samt farmaceutisk praeparat indeholdende forbindelsen

Info

Publication number: DK160831B
Application number: DK427584A
Authority: DK
Inventors: Yasuhiro Hori; Motohiro Hino; Hiroshi Terano; Masashi Hashimoto; Masanobu Kohsaka
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co
Priority date: 1983-09-07
Filing date: 1984-09-06
Publication date: 1991-04-22
Also published as: JPS63146784A; CA1238874A; EP0139439A2; DK427584D0; US4605559A; GB8324006D0; DE3480486D1; ES8603269A1; JPH04633B2; DK160831C; EP0139439B1; ATE48017T1; DK427584A; JPS6087794A; ES535726A0; EP0139439A3; JPS6332437B2

Description

DK 160831 B

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt forbindelse kaldet FR-900447 og farmaceutisk tolerable salte deraf, hvilke forbindelser har antimikrobiel virkning og antitumorvirkning, en fremgangsmåde til fremstilling deraf og farmaceutiske præparater indeholdende sådanne 5 forbindelser samt en biologisk ren kultur af en mikroorganisme til brug ved fremgangsmåden.

Forbindelsen FR-900447 har i sin frie form de i krav 1 angivne karakteristika.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at mikroorga-10 nismen Streptomyces rubropurpureus nr. 6362 (FERM BP-584) eller en mutant deraf med væsentlig samme egenskaber dyrkes i et vandigt næringsmedium under aerobe betingelser, hvorefter FR-900447 isoleres fra den resulterende dyrkningsvæske.

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, 15 at det som aktiv bestanddel indeholder forbindelsen FR-900447 eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf og et ikke-toxisk, farmaceutisk tolerabelt bærestof.

Kulturen ifølge opfindelsen er en biologisk ren kultur af mikroorganismen Streptomyces rubropurpureus nr. 6362 (FERM BP-584).

20 Karakteristika for den til fremstilling af FR-900447 anvendte mikroorganisme og fremstilling deraf forklares nærmere nedenfor.

MIKROORGANISME

Den mikroorganisme, der kan anvendes til fremstilling af FR-900447, er stammen Streptomyces rubropurpureus nr. 6362, som er blevet iso-25 leret fra en jordprøve optaget i byen Kawachinagano i Japan.

En lyofiliseret prøve af den isolerede mikroorganisme er blevet deponeret hos en international deponeringsmyndighed ifølge Budapest-traktaten, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Yatabe-cho higashi No' 1-1-3, Tsukuba-gun, 30 Ibaraki-ken, Japan, under nr. FERM BP-584 den 26. august 1983.

DK 160831 B

2

Det er klart, at fremstillingen af den hidtil ukendte forbindelse FR-900447 ikke er begrænset til anvendelsen af den her beskrevne bestemte organisme. Opfindelsen omfatter også anvendelsen af mutanter med væsentlig samme egenskaber, herunder naturlige mutanter samt kun-5 stigt frembragte mutanter, som kan produceres ud fra den beskrevne mikroorganisme på sædvanlig måde, fx ved røntgenbestråling, ultraviolet bestråling, behandling med N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguani-din, 2-aminopurin, etc.

Streptomyces rubropurpureus nr. 6362 har nedenstående morfologiske, 10 kulturelle, biologiske og fysiologiske træk.

Til det taxonomiske studium er der især anvendt de af Shirling og Gottlieb [jfr. International Journal of Systematic Bacteriology 16, 1966, s. 313-340] beskrevne metoder.

1. Morfologiske egenskaber 15 Morfologiske iagttagelser blev udført med lys- og elektronmikroskoper på kulturer, der havde vokset ved 30°C i 14 dage på en gær-malteks-traktagar, havremelsagar eller uorganiske salte-stivelsesagar. De modne sporer optrådte i kæder på ca. 10 sporers længde, der dannede spiraler. Sporerne var cylindriske eller ovale og havde en størrelse 20 på 0,5-0,7 x 0,7-0,9 pm ifølge elektronmikroskopisk iagttagelse. Sporeoverfladen var glat.

2. Kulturmæssige karakteristika

Kulturmæssige karakteristika blev observeret på ti typer medier beskrevet af Shirling og Gottlieb (jfr. ovenfor) og Waksman [jfr. The 25 Actinomycetes, bind 2, 1961].

Inkuberingen blev foretaget ved 30°C i 14 dage. De i denne undersøgelse anvendte farvenavne er baseret på Color Standard (Nihon Shikisai Co., Ltd.). Kolonier hørte til den grå farveserie, når de voksede på havremelsagar, gær-maltekstraktagar og uorganiske salte-

DK 160831B

3 stivelsesagar. Der blev ikke produceret opløseligt pigment i gærmal tekstraktagar en og de andre. Resultaterne er anført i tabel 1.

TABEL 1

Kulturmæssige karakteristika for stamme nr. 6362, Streptomyces liba-5 ni, subsp. libani IFO 13452 og Streptomyces pulcher IFO 13462

Havremelsagar

Nr. 6362 IFO 13452 IFO 13462 G moderat moderat ringe 10 A bleg rødligbrun bleg rødlig brunolivengrå R farveløs bleggul farveløs S intet intet intet Gær-maltekstraktagar 15 G kraftig kraftig kraftig A bleg rødligbrun grålighvid til blegbrun grå R bleg gulligbrun mørk gulorange gulliggrå S intet intet intet 20 Uorganiske salte-stivelsesagar G kraftig kraftig moderat A grålig-gulbrun bleg rødligbrun mørk olivengrå R grålig-rødpurpur bleggul farveløs S intet intet intet 25 ________

Glycerol-asparaginagar G kraftig kraftig moderat A bleg gulorange grålig hvid til gråliggul olivengrå til lysegrå 30 R rødlig orange bleg gulorange bleggul S intet bleg gulorange intet

DK 160831B

4

Tabel fortsat

Nr. 6362 IFO 13452 IFO 13462 S accharo se-nitratagar 5 G kraftig kraftig ringe A bleg lyserød hvid grålighvid til grålighvid R mørkebrun gullighvid bleggul S svagt brunt intet intet 10 _ Næringsagar G moderat moderat moderat A bleg rødligbrun grålighvid grålighvid R bleg gulorange bleggul bleg lyserød 15 S blegt gulorange intet intet

Kartoffel-dextroseagar G moderat moderat moderat A lysegrå, ringe grålighvid ingen 20 R dyb purpurrød bleg gulligbrun bleggul S intet intet intet

Tyrosinagar G kraftig moderat kraftig 25 A bleg kanel- grålighvid grålighvid lyserød R mørkerød bleg gulbrun bleg gul orange S intet intet intet 30

DK 160831 B

5

Tabel fortsat

Nr. 6362 IFO 13452 IFO 13462

Pepton-gærekstrakt-j ernagar 5 G moderat ringe moderat A ingen ingen grålighvid R bleggul bleggul bleg gul orange S intet intet intet 10 _

Forkortelser: G - vækst, A = farve på luftmassen, R — farve på bagsiden, S - opløseligt pigment.

Helcelle-analysen blev udført ved de af Becker et al. [jfr. Applied Microbiology 22, 1964, s. 421-423] og Yamaguchi [jfr. Journal of 15 Bacteriology 89, 1964, s. 444-453] angivne metoder. Analyse af hel-celle-hydrolysater fra stamme nr. 6362 viste, at den indeholdt LL-di-aminopimelinsyre. Cellevæggen i denne stamme antages derfor at være af type I.

3. Biologiske og fysiologiske egenskaber.

20 Fysiologiske egenskaber ved stamme nr. 6362 er angivet i tabel 2. Temperaturområde og maksimal temperatur for vækst blev bestemt på gær-maltekstraktagar under anvendelse af en temperaturgradientinku-bator (Toyo Kagaku Sangyo Co., Ltd.). Temperaturområdet for vækst var mellem 14 og 42°C med et optimum ved 32°C. Stivelseshydrolyse, mela-25 minproduktion, H2S-produktion, mælkepeptonisering og mælkekoagulation var negativ.

DK 160831 B

6 TABEL 2

Fysiologiske egenskaber ved stamme nr. 6362, Streptomyces libanl subsp. libani IFO 13452 og Streptomyces pulcher IFO 13462 5 Nr. 6362 IFO 13452 IFO 13462

Temperaturområde for

vækst 14-42°C 13-36°C 14-43°C

Optimal temperatur 32°C 26-30°C 32-34°C

Nitratreduktion positiv negativ negativ 10 Stivelseshydrolyse negativ positiv positiv Mælkekoagulation negativ negativ negativ Mælkepeptonisering negativ negativ negativ

Melaninproduktion negativ negativ negativ

Gelatinesmeltning negativ negativ negativ 15 H2S-produktion negativ negativ negativ

Ureasereaktion positiv negativ negativ

NaCl-Tolerance (%) 10% < 10% < 7% O 10%

Udnyttelsen af carbonkilder blev undersøgt efter de af Pridham og 20 Gottlieb [jfr. Journal of Bacteriology 56, 1948, s. 107-114] angivne metoder. Resultaterne blev bestemt efter 14 dages inkubering ved 30°G. Næsten alle carbonkilder blev udnyttet undtagen chitin og cellulose. Sammenfattet carbonudnyttelse for denne stamme er angivet i tabel 3.

DK 160831 B

7 TABEL 3

Carbonkildeudnyttelse for stamme nr. 6362, Streptomyces libani subsp. libani IFO 13452 og Streptomyces pulcher IFO 13462 5 Nr. 6362 IFO 13452 IFO 13462 D-Glucose + + +

Saccharose + +

Glycerol + + + D-Xylose + ± + 10 D-Fructose + + +

Lactose + + +

Maltose + + +

Rhamnose + - +

Raffinose + + 15 D-Galactose + + + L-Arabinose + + + D-Mannose + + + D-Trehalose + + +

Inositol ++- 20 Mannitol + + +

Inulin + ±

Cellulose -

Salicin + + +

Chitin ...

25 Natriumcitrat + - +

Natriumsuccinat + + +

Natriumacetat + - ±

Symboler: + = udnyttelse, ± = tvivlsom udnyttelse, - - ingen udnyt-30 telse.

Mikroskopiske undersøgelser og analyse af cellevægsammensætningen i stamme nr. 6362 viser, at denne stamme hører til slægten Streptomyces . Der blev derfor udført sammenligning af denne stamme med den publicerede beskrivelse [jfr. International Journal of Systematic 35 Bacteriology 18, 1968, s. 16-189 og s. 279-392 og 19, 1969, s.

DK 160831 B

8 391-512, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, 1974] med forskellige Streptomyces-arter. Stamme nr. 6362 bedømmes til at ligne Streptomyces libani subsp. libani Baldacci Grein og Streptomyces pulcher Routien. Disse to arter adskiller sig fra stamme 5 nr. 6362 på nedenstående punkter:

Streptomyces libani subsp. libani IFO 13452

Farven på luftmassen i S. libani subsp. libani er forskellig på glucose -asparaginagar, næringsagar og tyrosinagar. Bagsidefarven på S. libani subsp. libani er forskellig på uorganiske salte-stivelses-10 agar, saccharose-nitratagar og tyrosinagar. Stivelseshydrolysen er positiv. Nitratreduktion og ureasereaktion er negativ. S. libani subsp. libani kan ikke assimilere rhamnose, natriumcitrat og natriumacetat .

Streptomyces pulcher IFO 13462 15 Farven på luftmassen i S. pulcher er forskellig på 8 medier. Farven på bagsiden af S. pulcher er forskellig på uorganiske salte-stivelsesagar, saccharose-nitratagar og tyrosinagar. Stivelseshydrolysen er positiv. Nitratreduktion, ureasereaktion og 10%'s NaCl-tolerance er negativ. S. pulcher kan ikke assimilere saccharose, rhamnose, inosi-20 tol og inulin.

Som resultat af ovenstående sammenligning kan det konkluderes, at stamme nr. 6362 kan anses for at være en ny art, og stammen er blevet kaldt Streptomyces rubropurpureus sp. nov. med reference til farven på det vegetative mycelium på uorganiske salte-stivelsesagar og 25 saccharose-nitratagar.

FREMSTILLING AF ER-900447

Den hidtil ukendte forbindelse FR-900447 kan fremstilles ved at dyrke Streptomyces rubropurpureus nr. 6362 (FERM BP-584) eller en mutant deraf med væsentlig samme egenskaber i et vandigt næringsmedium under 30 aerobe betingelser.

DK 160831 B

9

Generelt kan dyrkningen foregå i et næringsmedium indeholdende assi-milerbare kilder til carbon og nitrogen under aerobe betingelser (fx ved rystekultur eller neddyppet kultur, etc.).

De foretrukne carbonkilder i næringsmediet er carbonhydrater såsom 5 glucose, fructose, glycerol og stivelse. Andre anvendelige kilder er lactose, arabinose, xylose, dextrin, melasse, etc.

De foretrukne nitrogenkilder er gærekstrakt, pepton, glutenmel, bomuldsfrømel, sojabønnemel, majsstøbevand, tørret gær, etc., samt uorganiske og organiske nitrogenforbindelser såsom ammoniumsalte (fx 10 ammoniumnitrat, ammoniumsulfat, ammoniumphosphat, etc.), urinstof, aminosyre, etc.

Selv om carbon- og nitrogenkilderne fordelagtigt anvendes i kombination, behøver de ikke at blive anvendt i deres rene form, idet mindre rene stoffer, som indeholder spor af vækstfaktorer og betydelige 15 mængder mineralnæringsstoffer, også kan anvendes. Om ønsket kan der til mediet sættes mineralsalte såsom calciumcarbonat, natrium- eller kaliumphosphat, natrium- eller kaliumiodid, magnesiumsalt, cobalt-chlorid, etc. Om nødvendigt kan der, især når kulturmediet skummer betydeligt, tilsættes et skumdæmpende middel såsom flydende paraffin, 20 en højere alkohol, en planteolie, en mineralolie eller siliconer.

Som betingelser for fremstilling af store mængder foretrækkes ned-dyppede aerobe kulturbetingelser til fremstilling af FR-900447. Til produktion af små mængder anvendes en rystekultur eller en overfladekultur i en kolbe eller flaske. Når væksten foretages i store 25 tanke, foretrækkes det endvidere at anvende den vegetative form af organismen til podning i produktionstankene for at undgå vækstforsinkelse ved fremstillingen af FR-900447. Det er derfor ønskeligt først at fremstille et vegetativt inokulum af organismen ved at pode en relativt lille mængde kulturmedium med sporer eller mycelier af 30 organismen og dyrke dette podede medium og derefter aseptisk overføre det dyrkede vegetative inokulum til store tanke. Som medium, hvori det vegetative inokulum fremstilles, kan der anvendes i det væsent-

DK 160831 B

10 lige samme medium, som anvendes til hovedproduktionen af FR-900447, eller et medium, der er noget anderledes.

Agitation og beluftning af kulturblandingen kan udføres på en række måder. Agitation kan tilvejebringes med en propeller eller lignende 5 mekanisk agitationsudstyr, ved en roterende bevægelse eller rystning af fermentationsbeholderen, med forskelligt pumpeudstyr eller ved at lede steril luft gennem mediet. Beluftning kan udføres ved at lede steril luft gennem fermentationsblandingen.

Fermentationen udføres sædvanligvis ved en temperatur på mellem 20 og 10 40°C, fortrinsvis ved ca. 30°C, i et tidsrum på mellem 50 og 100 timer, der kan varieres efter fermentationsbetingelserne og mængden af fermentationen.

Det således producerede FR-900447 kan isoleres fra kulturmediet med sædvanlige midler, der normalt anvendes til isolering af andre fer-15 mentationsprodukter, fx antibiotika.

Generelt findes størstedelen af det producerede FR-900447 i kulturfiltratet, hvorfor FR-900447 kan isoleres fra det filtrat, der fås ved filtrering eller centrifugering af dyrkningsvæsken, ved en sædvanlig metode såsom koncentrering under reduceret tryk, lyofilise-20 ring, ekstraktion med et normalt opløsningsmiddel, pH-ændring, behandling med en sædvanlig harpiks (fx en anion- eller katioribytter-harpiks eller en ikke-ionisk adsorptionsharpiks), behandling med en sædvanlig adsorbent (fx aktivkul, kiselsyre, silicagel, cellulose eller aluminiumoxid), krystallisation, omkrystallisation, etc.

25 Det i fri form vundne FR-900447 kan endvidere omdannes til syreadditionssalte eller basesalte deraf ved behandling med en uorganisk eller organisk syre, fx saltsyre, svovlsyre, eddikesyre, p-toluensul-fonsyre, etc., eller med en uorganisk eller organisk base såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid, ethanolamin, etc.

30 Når FR-900447 er fremstillet ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåder, har det følgende fysiske og kemiske egenskaber:

DK 160831 B

11 1) Elementaranalyse (%): C 59,05; H 6,72; N 5,57 2) Molekylvægt: 928 [SIMS: m/z 929 (M+ + 1)] 3) Smeltepunkt: 85°C (sønderdeling) 4) Specifik drejning: [a]^D = +291,4° (c = 0,675 i vand) 5 5) UV-Absorptionsspektrum: AVand = 276 nm (E1* - 390), max lem ,„ 340 nm (skulder) (Ej = 80) .vand+HCl 0_0 ,„1% /r>r..

λ - 272 nm (E . - 400), max lem . ’ 330 nm (skulder) (EJ - 81) ,vand+Na0H 0/„ ,„1% 10 λ = 243 nm (E , - 275), max lem 278 nm (skulder) (E^ - 350), 410 nm (E1? - 31) lem ΚΒΐ 6) IR-Absorptionsspektrum (KBr): υ ^ — 3400, 2950, 1650, 1560, 1465, 1435, 1395 (skulder), 1375, 1280, 15 1150, 1075, 1040 (skulder), 960, 895, 855 og 840 cm'1 7) NMR-Absorptionsspektrum (pyridin-d^): S (ppm) = 10,62 (IH, t, J=6Hz), 8,38 (IH, s), 8,14 (IH, s), 6,90 (IH, s), 6,895 (IH, d, J=5Hz), 6,43 (IH, s), 5,79 (IH, m), 5,80 (IH, d, J-lOHz), 5,37 (IH, d, J-5Hz), 4,48 (IH, q, J=6Hz), 4,15 (IH, m), 20 3,9 (2H, m), 3,85 (IH, s), 3,63 (IH, t, J=10Hz), 3,47 (IH, m), 3,34 (IH, m), 3,12 (IH, m), 3,08 (2H, m), 3,07 (3H, s), 2,9 (IH, m), 2,82 (2H, m), 2,76 (6H, s), 2,74 (IH, m), 2,50 (6H, s), 2,19 (3H, s), 1,71 (3H, d, J=6Hz), 1,63 (2H, m), 1,62 (3H, d, J-6Hz), 1,47 (3H, d, J=5,4Hz), 1,20 (3H, s) 25 8) Opløselighed:

Opløseligt i vand

Tungt opløseligt i acetone og methanol Uopløseligt i chloroform, n-hexan og diethylether

DK 160831 B

12 9) Farvereaktion:

Positiv: Hver reaktion med kaliumpermanganat, ioddamp og cerisulfat

Negativ: Ehrlich's reaktion, reaktion med Dragendorff-rea- 5 gens og Molish's reaktion 10) Stoffets natur: Amfotert 11) Krystallernes farve: Gule nåle 13 12) C-NMR-Spektrum (pyridin-d5) : 8 (ppm) = 14,2, 17,3, 17,5, 19,4, 22,9, 31,1, 32,2, 33,5, 35,4, 36,1, 36,8, 10 40,2, 52,1, 55,6, 58,4, 64,6, 64,8, 68,3, 68,5, 70,5, 70,8, 72,2, 76,6, 78,1, 98,5, 107,1, 108,5, 121,6, 124,6, 124,9, 127,6, 131,0, 131,9, 132,4, 133,7, 137,0, 138,8, 155,1, 156,4, 162,5, 166,4, 174,7, 179,8, 187,3 13) Tyndtlagschromatografi (silicagellag) 15 Opløsningsmiddel Rf-Værdi a) En blanding af isopropylalkohol, vand og 28% ammoniakvand (70:30:1) 0,5 b) En blanding af n-butanol, eddikesyre og vand (4:1:2) 0,3 20 FR-900447 har antitumorvirkning og antimikrobiel virkning. FR-900447 og farmaceutisk tolerable salte deraf kan derfor anvendes som antitumormiddel eller antimikrobielt middel til behandling af infektionssygdomme eller tumorer hos mennesker og dyr.

Som eksempel på påvisning af sådanne farmakologiske virkninger af 25 FR-900447 er nogle farmakologiske testdata angivet nedenfor.

Test 1 (antitumorvirkning)

Antitumorvirkningen af FR-900447 blev bestemt på mus ved et eksperimentelt tumorsystem.

DK 160831 B

13

Melanotisk melanoma Bl6 blev implanteret intraperitonealt i voksne hunmus af stammen C^yBL/6 med en inokulumstørrelse på 0,9 x 10^ celler/mus. 24 timer efter implantation af tumorcellerne blev graduerede doser af FR-900447 administreret intraperitonealt til musene.

5 Behandlinger blev givet to gange daglig 1, 2 og 3 dage efter tumorimplantationen .

Kontroldyr fik kun intraperitoneale doser af fysiologisk saltopløsning.

Injektionsvolumenet var 0,2 ml i alle forsøg. Til hver forsøgsgruppe 10 blev anvendt 5 mus.

Antitumorvirkningen blev bestemt ved middeloverlevelsestiden for en gruppe mus og også udtrykt som T/C værdien i procent (middeloverlevelsestiden for den behandlede gruppe/middeloverlevelsestiden for kontrolgruppen x 100). Toxiciteten blev målt ved vægttab mellem 0 og 15 4 dage efter tumorimplantationen.

Resultaterne er anført i nedenstående tabel IV. FR-900447 var ret aktivt mod det melanotiske melanoma B16. Doser på mellem 6,0 og 200 mg/kg resulterende i signifikant forlængelse af musenes levetid.

Tabel IV

20 _ Vægtæn- Middelover-

Dosis dring (g) levelsestid mg/kg/dag dag 0 - dag 4 (dage) T/C % 25 FR-900447 200 -0,8 22,4 149 100 +1,0 25,2 168 50 +1,1 26,8 184 25 +0,4 25,2 168 12,5 +1,0 25,2 169 30 6,0 +1,7 19,8 132

Kontrol +1,5 15,0 100

DK 160831 B

14 C^^BL/6-Mus, hun, 7 uger.

Tumorsted: i.p. (0,9 x 10^ celler/mus).

MedikamenterIngsvej: i.p. [behandling to gange daglig den 1., 2. og 3. dag].

5 Fem mus i hver gruppe.

Test 2 (antimikrobiel virkning)

Antimikrobiel virkning af FR-900447 blev bestemt ved en seriefortyndingsmetode i bouillonmedier. Værdierne for den minimale inhiberende koncentration (MIC-værdier) blev udtrykt i mg/ml efter inkubation 10 natten over ved 37 °C.

Resultaterne er anført i nedenstående tabel V

Tabel V

Mikroorganismer MIC (mg/ml) 15 - __

Staphylococcus aureus 209 P 1

Bacillus subtilis 0,25

Akut toxicitet (LD^q) af FR-900447 i ddY-mus efter intraperitoneal 20 injektion var ca. 1 g/kg.

FR-900447 ifølge opfindelsen i blanding med farmaceutisk tolerable bærestoffer kan administreres til pattedyr, herunder mennesker, i form af et farmaceutisk præparat såsom kapsler, tabletter, granuler, pulvere, buccaltabletter, sugetabletter og opløsninger.

25 De farmaceutisk tolerable bærestoffer kan omfatte forskellige organiske og uorganiske bærestoffer, der normalt anvendes til farmaceutiske formål, fx excipienser (fx saccharose, stivelse, mannitol, sorbitol, lactose, glucose, cellulose, talkum, calciumphosphat, calciumcarbo-nat, etc.), bindemidler (cellulose, methylcellulose, hydroxypropyl-

DK 160831 B

15 cellulose, polypropylpyrrolidon, gelatine, gummi arabicum, polyethy-lenglycol, saccharose, stivelse, etc.), desintegranter (fx stivelse, carboxymethylcellulose, calciumsaltet af carboxymethylcellulose, hydroxypropyl- stivelse, natriumglycol-stivelse, natriumhydrogen-5 carbonat, calciumphosphat, calciumcitrat, etc.), smøremidler (fx magnesiumstearat, aerosil, talkum, natriumlaurylsulfat, etc.), aromastoffer (fx citronsyre, mentol, ammoniumsaltet af glycyrrhizin, glycin, orange pulvere, etc.), konserveringsmidler (natriumbenzoat, natriumbisulfit, methylparaben, propylparaben, etc.), stabilisatorer 10 (citronsyre, natriumcitrat, eddikesyre, etc.), suspenderingsmidler (fx methylcellulose, polyvinylpyrrolidon, aluminiumstearat, etc.), dispergeringsmidler [polysorbat 80, emalgen 408 (overfladeaktivt middel), emasol (overfladeaktivt middel), etc.], vandige fortyndingsmidler (fx vand), voksbaser (fx kakaosmør, polyethylenglycol, witep-15 sol, hvid vaseline, etc.).

Dosis af den omhandlede forbindelse kan varieres alt afhængig af forskellige faktorer såsom sygdommens art, patientens vægt og/eller alder og administrationsvejen.

Den optimale dosis af FR-900447 ligger normalt i området på mellem 20 1 mg og 1 g/kg/dag, fortrinsvis på 10-500 mg/kg/dag.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempel.

EKSEMPEL

160 ml af et podemedium indeholdende 1% majsstivelse, 1% glycerol, 0,5% glucose, 1% bomuldsfrømel, 0,5% gærekstrakt, 0,5% majsstøbevand 25 og 0,2 Ca(X>3 (pH 6,5) hældes ud i hver af tre 500 ml Erlenmeyer-kolber og steriliseres ved 120°C i 30 minutter. Et øjefuld af en skråkultur af Streptomyces rubropurpureus nr. 6362 podes i hvert medium og dyrkes på et roterende rystebord med 7,5 cm's vandring og med 200 rpm i 3 dage. Den resulterende kultur podes i samme poderne-30 dium (80 1) i en 200 liters fermenteringsbeholder, som er steriliseret ved 120°C i 30 minutter, og dyrkes ved 30°C i 2 dage under beluftning med 80 1/minut og agitation med 265 rpm. 35 liter af

Claims

10 Kolonnen vaskes med 150 1 vand og derefter med 150 1 25%'s acetone og elueres med 150 1 50%'s acetone. Den aktive fraktion koncentreres i vakuum til et volumen på 20 1 og indstilles på pH-værdi 10 med 25%'s ammoniakvand. Til opløsningen sættes 40 1 n-butanol, og der omrøres i 10 minutter. Denne ekstraktionsprocedure gentages to gange, og eks-15 trakteme sammenhældes. Derefter koncentreres ekstrakterne i vakuum til et volumen på 500 ml. Det vundne olieagtige stof blandes med 2 1 silicagel og hældes på en chromatografikolonne med 5 1 silicagel. Kolonnen elueres med 18 1 methanol. De aktive fraktioner koncentreres i vakuum til tørhed. 20 Den rå prøve opløses i 100 ml 60%'s methanol indeholdende 10 millimol ammoniumacetat og underkastes chromatografi på en kolonne med 750 ml -coated silicagel, NS-gel (varemærke, Nihon Seimitsu Kagaku Co., Ltd.) fremkaldt med 5 1 60%'s methanol indeholdende 10 millimol ammoniumcitrat. De eluerede aktive fraktioner koncentreres i vakuum 25 til et volumen på 1 1 og hældes gennem en kolonne med 300 ml Diaion® HP-20. Efter vask med vand elueres kolonnen med 1 1 50%'s acetone. Den aktive fraktion inddampes til tørhed under reduceret tryk, hvorved der fås 5,7 g renset aktivt stof, som fri base. Af varmt methanol fås 4 g gule krystaller af FR-900447. 30 PATENTKRAV

1. Elementaranalyse (%): C 59,05; H 6,72; N 5,57

1. Forbindelse FR-900447 og farmaceutisk tolerable salte deraf med følgende karakteristika i sin frie form: DK 160831 B

2. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen FR-900447 ifølge 10 krav 1, kendetegnet ved, at mikroorganismen Streptomyces rubropur-pureus nr. 6362 (FERM BP-584) eller en mutant deraf med væsentlig samme egenskaber dyrkes i et vandigt næringsmedium under aerobe betingelser, hvorefter FR-900447 isoleres fra den resulterende dyrk-15 ningsvæske.

2. Molekylvægt: 928 [SIMS: m/z 929 (M+ + 1)]

3. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det som aktiv bestanddel indeholder forbindelsen FR-900447 eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf ifølge krav 1 og et ikke-toxisk, farmaceutisk tolerabelt bærestof.

3. Smeltepunkt: 85°C (sønderdeling)

4. Specifik drejning: [a]23p - +291,4° (c - 0,675 i vand) 5 5) UV-absorptionsspektrum: Avand - 276 nm (E1* - 390), max lem .„ 340 nm (skulder) (E - 80) . vand+HCl /E,1% λ - 272 nm (E . =* 400), max lem . 330 nm (skulder) (E = 8i) .vand+NaOH /T,1% ,7c\ 10 λ - 243 nm (E . = 275), max lem ,„ 278 nm (skulder) (E = 350), 410 nm (E1*^ = 31) KBr

6. IR-Absorptionsspektrum (KBr): υ = 3400, 2950, 1650, 1560, 1465, 1435, 1395 (skulder), 1375, 1280, 15 1150, 1075, 1040 (skulder), 960, 895, 855 og 840 cm-1

7. NMR-Absorptionsspektrum (pyridin-d^): 5 (ppm) = 10,62 (IH, t, J=6Hz), 8,38 (IH, s), 8,14 (IH, s), 6,90 (IH, s), 6,895 (IH, d, J=5Hz), 6,43 (IH, s), 5,79 (IH, m), 5,80 (IH, d, J-lOHz), 5,37 (IH, d, J=5Hz), 4,48 (IH, q, J=6Hz), 4,15 (IH, m), 20 3,9 (2H, m), 3,85 (IH, s), 3,63 (IH, t, J=10Hz), 3,47 (IH, m), 3,34 (IH, m), 3,12 (IH, m), 3,08 (2H, m), 3,07 (3H, s), 2,9 (IH, m), 2,82 (2H, m), 2,76 (6H, s), 2,74 (IH, m), 2,50 (6H, s), 2,19 (3H, s), 1,71 (3H, d, J=6Hz), 1,63 (2H, m), 1,62 (3H, d, J=6Hz), 1,47 (3H, d, J=5,4Hz), 1,20 (3H, s) 25 8) Opløseligt i vand, tungt opløseligt i acetone og methanol og uopløseligt i chloroform, n-hexan og diethylether

9. Positiv farvereaktion med kaliumpermanganat, ioddamp og cerisul- DK 160831 B. fat og negativ ved Ehrlich's reaktion, reaktion med Dragendorff-reagens og Molish's reaktion 10) ^C-NMR-Spektrum (pyridin-d^): S (ppm) = 14,2, 17,3, 17,5, 19,4, 22,9, 31,1, 32,2, 33,5, 35,4, 36,1, 36,8, 5 40,2, 52,1, 55,6, 58,4, 64,6, 64,8, 68,3, 68,5, 70,5, 70,8, 72,2, 76,6, 78,1, 98,5, 107,1, 108,5, 121,6, 124,6, 124,9, 127,6, 131,0, 131,9, 132,4, 133,7, 137,0, 138,8, 155,1, 156,4, 162,5, 166,4, 174,7, 179,8, 187,3.

4. Biologisk ren kultur af mikroorganismen Streptomyces rabropurpu- reus nr. 6362 (FERM BP-584) til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 2.