DK160446B - Fotometrisk fremgangsmaade til koncentrationsbestemmelse ved reaktioner, der forloeber under dannelse eller forbrug af lysspredningscentre - Google Patents

Description

i

DK 160446 B

o

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af en reaktionspartner ved hjælp af en lysspredningsmåling.

Fænomenet med lysspredning ved partikler, der 5 befinder sig i et homogent medium, benyttes til koncentrationsbestemmelse ved både måling af intensiteten af spredt lys (nephelometri) og ved måling af intensitetstabet af lysstrålen, der går gennem mediet, (turbi-dimetri).

10 Mange kemiske reaktioner fører i flere trin til molekylaggregater eller makromolekyler, der med hensyn til deres lysspredningsopførsel adskiller sig meget stærkt fra udgangsstofferne, og hvis koncentration kan bestemmes ved hjælp af denne egenskab.

15 For eksempel går mange ioner ved overskridelse af opløselighedsproduktet sammen til krystaller, der først viser sig som uklarhed og til slut bliver så store, at de sedimenteres fra den flydende fase.

Et andet eksempel er den immunkemiske reaktion 20 mellem et opløseligt antigen og et bivalent antistof, der kan føre til store og stærkt lysspredende molekylaggregater .

Det tidsmæssige forløb af sådanne reaktioner svarer meget hyppigt til det almene kinetiske forløb af 25 på hinanden følgende reaktioner af 1. orden, dvs. koncentrationskurven for dannelsen af slutproduktet udviser et vendepunkt, og den maksimale reaktionshastighed optræder således først i løbet af reaktionen.

Med en immunkemisk reaktion som eksempel er 30 dette forløb vist for to antigenkoncentrationer i fig.

1 på tegningen.

Ud fra signal/tid-kurverne i fig. 1 kan der på forskellig måde fås et koncentrationsafhængigt målesignal (tabel I).

35

O

DK 160446 B

2

Tabel I.

Tidsmæssige randbetingelser ved tilvejebringelse af koncentrationsafhængige målesignaler (S “ signal, t = tid).

Navn Princip 5 1) Endepunkts- Målesignalet bestemmes på et så metode sent tidspunkt, at det erfarings- j mæssigt ikke mere forandres, men j at der endnu ikke finder nogen i

udfældning sted. I

10 2) Kinetisk Det egentlige målesignal er dif- metode ferensen mellem to signaler, der | "fixed-time"- bestemmes på to forskellige, men -kinetik forud givne tidspunkter.

3) Kinetisk metode Den maksimale reaktionshastighed, 15 "rate determina- dvs. den maksimale ændring af tion" "peak rate signalet pr. tidsenhed, måles: method" a) ved måling af &S ved til strækkelig korte intervaller af Lt og bestemmelse af den stør-20 s te kvotient AS/&t, b) ved elektronisk differentiering dS/dt og bestemmelse af maksimummet, c) ved konstruktion af tangen- 25 ten til signal/tid-kurven og be stemmelse af den maksimale stigning.

Et stort antal analytter kan i dag kvantificeres ifølge de i tabel I anførte metoder ved direkte eller 30 indirekte måling af spredt lys.

Hvis man betragter afhængigheden af et egnet målesignal (tabel I) af koncentrationen af én reaktionspartner, f.eks. antigenet, medens den anden reaktions-partner anvendes med konstant koncentration, kan man 35 f.eks. ved iramunkemiske reaktioner observere den i fig.

2 viste sammenhæng. Den overraskende kendsgerning, at

O

DK 160446 B

3 det samme målesignal både kan tilbageføres til en lav og en høj koncentration af analytten, fører til en dobbelttydighed af signal/koncentration-relationen, der er kendt af fagmanden som antigenoverskudsfænomenet eller 5 Heidelberg-kurven.

Denne dobbelttydighed kan principielt observeres overalt, hvor komplekser med forskellig støkiometri er mulige, alt efter overskuddet af den ene eller anden reaktionspartner, og disse komplekser ikke adskil-10 ler sig med hensyn til signalegenskaber, f.eks. lys spredning, f.eks.

MonxCoMonx+m og Monx+mCoMonx hvori Mon = monomer

CoMon = Co-monomer 15 Ag2 Ak og AgAk2 hvori Ag = antigen

Ak - homologt antistof

Lee2 GP og Lee GP2 hvori Lee = lectin GP = glycoprotein 20 (AgxClx+1)- og ^Ågx+lC1x*+ hvori A9 = sølvion

Cl = chloridion

Hvis man gennemfører sådanne reaktioner med det formål at bestemme koncentration, definerer og op-25 timerer man metoden til en bestemt overskudssituation.

I praksis fører dette til vanskeligheder, hvor analytten kan foreligge i et meget stort koncentrationsområde, og koncentrationsoverskuddet af en reaktionsdeltager ikke kan sikres.

30 Denne situation spiller især en rolle ved im munkemisk bestemmelse af immunoglobuliner, hvis koncentration kan variere med en faktor 1000. Testbetingelserne og den økonomisk optimale antistofkoncentration til bestemmelse af den normale og subnormale koncen-35 tration tillader ikke indbefatning af ;en koncentration, der er forhøjet med en faktor 1000.

4

O

DK 160446B

Det i det følgende anførte vedrører derfor kun immunkemiske reaktioner, selv om fremgangsmåden principielt er anvendelig på alle reaktioner, der har de ovenfor diskuterede egenskaber og udviser en analog 5 kinetisk opførsel.

Med hensyn til immunkemiske reaktioner er der blevet foreslået et stort antal fremgangsmåder og udførelsesformer til at erkende, på hvilken del af Hei-delbergkurven man befinder sig med en given analyse- 10 blanding.

I det følgende nævnes nogle eksempler: 1. Den ældste og sikreste metode til erkendelse af et antigenoverskud er gennemførelse af en dobbeltbestemmelse med to forskellige prøvefortyndinger. Når 15 der foreligger et antigenoverskud, får man et højere signal ved den største fortynding og finder tilsyne- . ladende et højere proteinindhold end i den koncentrerede prøve (H.E. Schultze og G. Schwick, Prot. Eiol. Fluids 5, 15-25 (1958)).

20 Ifølge forbedrede udførelsesformer for denne fremgangsmåde sker der en yderligere tilsætning af antistoffer til prøveblandingen, efter at reaktionen har nået en vis ligevægt. Når der foreligger et antigenoverskud, optræder der en signalforøgelse (T.O. Tiffany et 25 al., Clin. Chem. 20^, 1055-1061 (1974)). Ligeledes kan et antigenoverskud erkendes ved efterdosering af antigenmateriale med kendt koncentration (J.C. Sternberg,

Clin. Chem. 23, 1456-1464 (1977)).

2. I det specielle tilfælde, hvor der er tale 30 om "continuous flow"-teknik observeres det, at der foreligger et antigenoverskud, ved at der optræder en dobbelttop (R.F. Ritchie, Protides Biol. Fluids 21, 569 (1974)).

3. Ved betragtning af reaktionskinetikken ef-35 ter grafisk afbildning af reaktionsforløbet kan man ved turbidimetrisk måling skelne mellem antistofoverskud og

DK 160446B

5 "mildt" antigenoverskud (I. Deverill, Protides Biol.

Fluids 2£, 697 (1979); P.J.J. van Munster et al., Clin.

Chim. Acta 76, 377-388 (1977)).

4. Ved bestemmelse af varigheden af reaktionen, 5 indtil der optræder den maksimale reaktionshastighed, ved nephelometrisk måling kan der beregnes en størrelse, der tillader diskriminering mellem antigen- og antistofoverskud (DE-A 2.724.722 C2).

De under punkt 2 og 4 nævnte metoder adskiller 10 sig fordelagtigt fra de andre metoder ved, at ikke alle prøver skal undersøges for, om der foreligger et antigenoverskud, men at der under målingen fås information om, hvorvidt der skal gennemføres en prøvning for antigenoverskud .

15 Metode 2 er bundet til en bestemt teknik og er ikke alment anvendelig til nephelometriske eller turbi-dimetriske proteinbestemmelser.

Ifølge DE-A 2.724.722 C2 gås der som kendt teknik ud fra, at der eksisterer en funktion af den maksimale reak-20 tionshastighed, der ved hjælp af en tærskelværdi af denne funktion gør det muligt at skelne mellem antigenoverskud og antistofoverskud (krav l). I spalte 12, linie 8-21, i dette patentskrift anføres det, at der som diskriminatorfunktion kan anvendes den tid (T), der forløber fra reaktionens start 25 og indtil der optræder en maksimalværdi (H) af reaktionshastigheden. Det her anførte begrænses imidlertid stærkt i spalte 21, linie 55-68, hvor det anføres, at der ikke eksisterer nogen enkelt tidsværdi, ved hvilken antistofoverskudskurvedelen ligger på den ene side af denne værdi, og antigen-30 overskuds-kurvedelen ligger på den anden side. Ifølge patentskriftet løses problemet ved koordinattransformation og indføring af nye variable. Endvidere er metoden karakteriseret ved, at man, når der konstateres en antigenoverskudstilstand, gentager målingen efter tilsvarende fortynding af 35 prøven til opnåelse af en antistofoverskudstilstand. Denne yderligere måling på en prøve, der findes at være i antigen-

DK 160446 B

6 overskuds-tilstand, er materiale- og tidskrævende.

Det har derfor været formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde, der gør det muligt at bestemme en prøves indhold af et an- j 5 tigen eller antistof uden yderligere måling, også når j denne befinder sig i den foreliggende prøveblandings antigenoverskudstilstand .

Det har nu overraskende vist sig, at der ved måling af tiden, der forløber fra reaktionens„start og 10 indtil der optræder en maksimalværdi af reaktionshastigheden, ved en kinetisk metode, dvs. ved bestemmelse af den maksimale reaktionshastighed som funktion af koncentrationen, kan måles kvantitativt på begge sider af Heidelbergkurven. Det er ikke mere nødvendigt at skel-15 ne mellem antistofoverskud og antigenoverskud.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af koncentrationen af en reaktant i en reaktion, der forløber under dannelse eller forbrug af lysspredningscentre i retning af en o-20 vergang fra Rayleigh- til Mie-spredning, hvorved den maksimale reaktionshastighed (V ax) og tidsrummet fra reaktionens begyndelse og indtil der optræder den maksimale reaktionshastighed (tmax) bestemmes, man til éntydig bestemmelse af koncentrationen empirisk bestemmer den funk-25 tionelle sammenhæng mellem koncentration, Vmax og tmax ved hjælp af et standardpræparat, og Vmax og tmax måles på prøven, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der blandt to mulige koncentrationer udvælges den rigtige koncentration ved hjælp af den 2. reaktionsparameter, altså Vmax eller 30 ^max*

Relationen mellem koncentration og V og t * max ^ max kan f.eks. foreligge i en tabel, en matriks eller en eller flere matematiske funktioner.

Det er kendt, at reaktionshastigheden og sig-35 nalintensiteten af antigen-antistofreaktioner kan påvirkes inden for et vidt område alt efter reaktions-

O

DK 160446 B

7 mediets ionstyrke, ionart og polymertilsætning. Den følgende redegørelse er derfor ikke begrænset til de i eksemplerne anførte betingelser, men gælder for udfældningsreaktioner, der kan påvirkes på den ovennævnte måde.

5 Hvis man bestemmer den maksimale reaktionshas tighed (V ) i afhængighed af koncentrationen, får man den i fig. 2 viste sammenhæng. Hvis man samtidig med Vmax t,esteiraner det tidsrum, der forløber fra begyndelsen af reaktionen og indtil nås (t„,_), fås den i fig.

10 3 viste sammenhæng. Hver af de to signal-koncentrations kurver udviser antigenoverskuds-fænomenet. Bestemte signaler kan tilordnes to koncentrationer.

Ved projicering af de to funktioner i én afbildning (fig. 4) ser man, at der ikke eksisterer et værdi- 15 par (Vm!iv, t aw) , der kan tilordnes to forskellige max max koncentrationer.

Den maksimale reaktionshastighed (Vmax) og tidsrummet til opnåelse af den maksimale reaktionshastighed (t x) er åbenbart af hinanden uafhængige variable 20 af koncentrationen, og Heidelberg-kurven er en tredimensional kurve (fig. 5), der ved passende reaktionsstyring ikke udviser nogen dobbelttydighed med hensyn til koncentrationen.

Målemetoder, hvorved der kun arbejdes med en 25 todimensional projektion af denne kurve, f.eks. måling af V som funktion af koncentrationen (fig. 6), ud-viser altid en dobbelttydighed med hensyn til koncentrationen .

Ved den praktiske vurdering af de fundne sam-30 menhænge skal der tages hensyn til, at koncentrationen i nærheden af en signal-koncentrationskurves minimum eller maksimum kun kan bestemmes med mindre præcision, da relativt ringe signaldifferenser svarer til en stor koncentrationsdifferens. Ved den her omhandlede metode til 35 bestemmelse af to uafhængige målesignaler forbedres præcisionen især, når minimummet af funktionen kone. =

8 DK 160446 B

O

f(tmax) ligger så langt fra maksimummet af funktionen kone. = f(V ) som muligt.

Arbejdsmåden og reaktionsbetingelserne ved den her omhandlede fremgangsmåde vises i de følgende eksemp-5 ler.

Eksempel 1

Bestemmelse af maksimumsområdet af en kalibreringskurve for IgG.

t0 Fotometer: DU-8 med tilsatsdel til nephelometriske målin ger (Beckman Instruments).

Reaktionsmediumr 0f02 mol/liter kaliumphosphatpuffer, pH-værdi 7,3, med 40 g/liter polyethy-lenglycol 6000 (Serva), Heidelberg, 15 Vesttyskland, og 64 g/liter natriumbro- mid.

Prøvefortyndingsmedium: fysiologisk natriumchloridopløsning .

Antiserum: LN-antiserum mod humant IgG/kappa-kæde (fra 20 kaniner) (Behringwerke AG, OSAS 14), fortyn det 1:31 med reaktionsmedium.

Standard: T-protein-standard-serum (humant), (Behringwerke AG, OSKT 06).

Prøveblanding: til 20/Uliter prøve-/standardfortynding AE ' sættes 500yUliter antiserumfortynding, og der måles straks i fotometeret under anvendelse af kinetik-II-programmet i maksimalt 3 minutter ved en bølgelængde på 334 nm.

30 35

O

DK 160446 B

9 a) Turbidimetrisk måling.

Tid fra reaktionens

Koncentration af Maksimal reaktions- begyndelse og indtil standardfortynding, hastighed (vmax i der optræder maksimum 5 mg/dl IgG_ mE/min.)_ (t i sek.)_ 110,4 425 38 92 466 30 78.9 542 24 73.6 569 20 10 69 583 18 64.9 576 16 61,3 567 16 55.2 548 14 22.1 219 20 15 11,0 75 30 b) Nephelometrisk måling. Tid fra reaktionens

Koncentration af Maksimal reaktions- begyndelse og indtil standardfortynding, hastighed (Vmax i der optræder maksimum mg/dl IgG mE/min.) (t i sek.) —*--------- * ' ' 1 — * 1 -—max........ 1 1 20 110,4 1410 36 92 1490 30 78.9 1710 22 73.6 1730 22 69 1780 20 25 64,9 1800 20 61.3 1810 20 55.2 1720 18 22,1 706 24 11,0 325 42 30

Eksempel 1 viser, at der både ved turbidimetrisk og ved nephelometrisk måling éntydigt kan bestemmes koncentrationer i og på begge sider a£ Heidelberg-kurvens maksimum. Til bestemmelse af en ukendt prøvekoncentra-35 tion interpoleres der efter måling af V og t mel-lem standardens tabellerede værdier. Måleområdet fast-

DK 160446 B

10 o lægges ved passende fortynding af prøverne - i eksempel 1 ved en 1:51-fortynding af prøven på 560 til 5600 mg/dl IgG - og kan vælges således, at delområdet med den ringere præcision ikke falder inden for det klinisk 5 relevante område for bestemmelse af de tilsvarende parametre .

Eksempel 2.

Optagelse af en kalibreringskurve for IgM 10 (turbidimetrisk).

Fotometer: DU-8 (Beckman Instruments).

Reaktionsmedium: 0,15M natriumchlorid-phosphatpuffer, pH-værdi 7,2, med 39 g/liter PEG 6000 (Serva) og 8 g/liter NaCl.

15 Prøvefortyndingsmedium: fysiologisk natriumchloridop løsning.

Antiserum: LN-antiserum mod humant IgM^u-kæde (fra kaniner) (Behringwerke AG, OSAT 14), fortyndet 1:11 med reaktionsmedium.

20 Standard: T-protein-standard-serum (humant) (Behring werke AG, OSKT 06).

Prøveblanding: til 200^,uliter prøve-/standardfortynding sættes 500^uliter antiserumfortynding, og der måles derefter straks i fotometeret 25 under anvendelse af kinetik-II-programmet i maksimalt 3 minutter ved en bølgelængde på 312 nm.

30 35

11 DK 160446 B

o

Tid fra reak-

Konc. af stan- Kone. af prøve Maks. reakti- tionsbegyndelse dardfortynding, fortyndet 1:21, onshastighed til maksimum m9/dl IgM mg/dl IgM (V i mE/min.) (t i sek.) -----i-max--- —max- — 5 110 2310 371 34 74 1540 508 28 55 1155 591 18 44 924 639 14 10 37 770 639 12 31 660 620 12 28 578 611 10 24 513 598 10 22 462 556 10 15 20 420 508 10 18 385 488 10 17 355 467 10 16 330 460 10 15 308 419 10 20 14 290 405 10 13 272 378 10 12 257 368 10 11 231 330 10 5,5 116 158 10 25 2,8 58 69 10 1,4 29 27 12

Det fremgår af eksempel 2, at der ved den valgte prøvefortynding kan måles en koncentration mellem 30 og 30 600 mg/dl IgM med en bedre præcision end mellem 600 og 900 mg/dl. Ved en normalområde mellem 70 og 300 mg/dl IgM i serum ligger værdier over 600 mg/dl imidlertid altid nær en mistanke om monoklonal gammopati og kræver uafhængigt af værdiens præcision yderligere undersøgel-35 ser.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fotometrisk bestemmelse af koncentrationen af en reaktant i en reaktion, der forløber under dannelse eller forbrug af lysspredningscentre i retning af 5 en overgang fra Rayleigh- til Mie-spredning, hvorved den maksimale reaktionshastighed (Vmax) og tiden fra reaktionens begyndelse og indtil den maksimale reaktionshastighed optræder (tmax) bestemmes, man til éntydig bestemmelse af koncentrationen empirisk bestemmer den funktionelle sammenhæng 10 mellem koncentration, Vmax og t^y ved hjælp af et standardpræparat, og Vmax og tfflay måles på prøven, kendetegnet ved, at der blandt to mulige koncentrationer udvælges den rigtige koncentration ved hjælp af den 2. reaktionsparameter, altså vmax ©ller tmax*

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendete g- n e t ved, at reaktionen er en immunkemisk reaktion.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den fotometriske bestemmelse udføres ved hjælp af en måling af gennemfaldende lys (turbidimetrisk 20 metode).

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den fotometriske bestemmelse udføres med stråling med en bølgelængde på 240 til 700 nm, dog fortrinsvis 300-380 nm. 25

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den fotometriske bestemmelse udføres ved hjælp af en måling af spredt lys (nephelornetrisk metode). 30 35