NO820836L - Fremgangsmaate for immunoanalyse under anvendelse av monoklone antistoffer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår metoder for immuni-ana-lyser under anvendelse av monoklone antistoffer. Spesifikke antisera er vidt anvendt for påvisning og kvantifisering av et målantigen når det er tilstede i en komplett blanding av molekyler, og mange kvantitative metoder avhenger av utfelling resulterende fra dannelsen av uoppløselig antigen/ antistoffkomplekser. I de tidlige trinn av antigen/antistoff samvirkning er de uoppløselige komplekser av relativt liten størrelse og holdes i suspensjon. Flere teknikker for spesifikk proteinbestemmelse avhenger av lyssprednings- eller

absorpsjonsegenskaper av slike komplekser. En slik automati-sert metode er basert på forskjellsturbidimetriske målinger resulterende fra de forøkede (tilsynelatende) absorpsjonsegenskaper av slike komplekser," holdt i suspensjon når et polyklonalt antistoff samvirker med et multivalent antigen.

I 1975 rapporterte Kohler og Milstein (Nature, 256, si-der 495 - 497) en metode for fremstilling av monoklonale antistoffer rettet mot en enkelt angitenisk determinant. Blant fordelene med monoklonale antistoffer er (1) deres unike spesifisitet og (2) deres evne til å tillate utvikling av evig-varende reproduserbare standardreagenser. Da imidlertid monoklonale antistoffer er spesifikke overfor en enkelt determinant, eller samvirkning med antigen, kan de bare danne

oppløselige lineære komplekser heller enn tverrbundne komplekser som kan være uoppløselige (utfelling). Derfor har individuelle monoklonale antistoffer hittil ikke synes å være anvendbare på teknikker som er avhengig av dannelsen av uopp-løselige immunkomplekser.

Et mål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en metode ved hjelp av hvilken monoklonale antistoffer kan omsettes med proteiner for å danne uoppløselige antigen/antistoff komplekser som vil muliggjøre anvendelse av monoklonale antistoffer i teknikker som krever dannelse av de ovenfor angitte uoppløselige komplekser.

Et særlig mål er å tilveiebringe en metode ved hjelp av hvilken monoklonale antis loffer kan anvendes for å bestemme den totale immunoglobulinpopulasjon eller valgte immunoglobu-linunder-populasjon tilstede i. komplekse blandinger, dvs. serum eller andre kroppsvæsker.

Ifølge oppfinnelsen omfatter en metode for bestemmelse. av mengden av et bestemt protein i en prøve, omsetning av prøven med en kombinasjon av"to monoklonale antistoffpreparater som er spesifikke overfor to distinkte antigenseter (determinanter) på makromolekylet av det protein som under-søkes, og bestemmelse av et kvantitativt mål for den opprin-nelige proteinkonsentrasjon fra de dannede resulterende antigen/antistoffkomplekser.

I en særlig utførelsesform for den ovenfor angitte metode er to monoklonale antistoffer valgt.til å være spesifikt rettet mot relativt vidt adskilte antigene determinanter tilstede på et gitt makromolekyl, hvorved bindingen av det ene monoklonale antistoff- til dets spesifikke antigene determinant ikke samvirker rommelig med bindingen av det annet monoklonale antistoff til den antigene determinant overfor hvilken angitte annet antistoff har spesifisitet.

I en ytterligere utførelsesform omfatter makromolekylet et immunoglobulin, og de monoklonale antistoffer er valgt slik at de er spesifikke overfor antigene determinanter uttrykt ved de lette og tunge kjeder av immunoglobulin.

I en annen utførelsesform omfatter metoden omsetning av en prøve innbefattende første og andre immunoglobulinpopula-sjoner med en kombinasjon av første og andre monoklonale antistoff preparater , hvor begge er spesifikke overfor antigene determinanter angitt på de tunge kjeder av begge immunoglobuliner, bestemmelse av det totale immunoglobulinnivå i prø-ven fra det resulterende kompleks, omsetning av prøven med en kombinasjon av første monoklonale antistoff og et tredje mo-.'noklonalt antistoff som er spesifikt overfor en antigen determinant uttrykt ved bare én av angitte immunoglobulinpolu-lasjoner, og bestemmelse av mengden av angitte ene immunoglobulinpopulasjon fra det resulterende kompleks.

Oppfinnelsen belyses nærmere i de efterfølgende eksempler under henvisning til de medfølgende tegninger. Fig. 1 representerer et IgG molekyl, som indikerer regi-onene overfor hvilke testantistoffene ble rettet; Fig. 2 er en kurve for turbiditeten mot tiden for flere antigen/antistoffreaksjoner; og Fig. 3 er en kurve for forandringen i turbiditet erholdt fra antigen/antistoffreaksjoner med varierende anti-stoffkonsentrasjoner. Fig. 1 representerer et makromolekyl av immunoglobulin G (IgG) med to "tunge" polypeptidkjeder H og to "lette" polypeptidkjeder L, hvor kjedene H og L er bundet ved disul-fidbindinger. Molekylet er symmetrisk og har to antigenbin- dende fragmenter Fab, som hvert innbefatter en lett kjede L og en del av den tunge kjede H. Et krystalliserbart fragment Fc av begge tunge kjeder H omfatter C y2 og Cy 3 regioner med lik lengde. Fragmentet Fc kan separeres fra resten av molekylet ved enzymvirkning, og dette fragment Fc kan un-derkastes ytterligere enzymvirkning under dannelse av et

réstfragment pFc<1>hvis utstrekning er den samme som Cy 3 regionen. Hver kjede i Fab fragmentet har en variabel region V og en konstant region C.

Normalt humant IgG innbefatter sub-populasjoner av IgG kappa og IgG lambda, hvor kappa og lambda karakteristikkene er definert ved strukturene med de konstante regioner C i molekylene.

I de beskrevne eksempler ble antistoffene bragt frem under anvendelse av polyklonalt humant IgG som immunogen, og antistoffproduktene ble valgt på basis av deres evne til å agglutinere røde saueblodceller sehsitisert med humant IgG. Spesifisiteten av de klonede antistoffprodukter var ytterligere definert ved sin evne til å agglutinere røde saueblodceller sensitisert med kappa lettkjede, lambdalettkjede, Fc fragmenter eller pFc• fragmenter. Ved disse metoder ble monoklonale antistoffer valgt med spesifisiteter som indikert i det følgende:

Prøve II ble også funnet å agglutinere celler sensibi-lisert med pFc' fragmenter, og denne prøve var således rettet mot en antigen determinant i Cy3 regionen av IgG molekylet. I fravær av agglutinasjon av pFc<1>sensibiliserte celler av prøve III og IV ble disse prøver antatt å være spesifikke overfor antigene determinanter i Cy2 regionen av IgG-molekylet, eller å være tilpassede determinanter avhengig av den strukturelle integritet av Fc fragmentet i molekylet.

Antigenet med hvilket de foregående antistoffer ble omsatt var et IgG kappa paraprotein.

Preparater av antistoffprøvene I - IV ble omsatt med antigenet, separat og i kombinasjoner av antistoff. Reaksjonene ble utført ved 25°C i fosfatbufrede oppløsninger inne-holdende 4 % polyethylenglycol (mblvekt 3000). Forskjellen i turbiditet av væsken i hvilken reaksjonene ble utført, ble bestemt under anvendelse av lys med bølgelengde 260 nm [Jacotsen og Steensgaard, Immunology, 36 (1979) ved 293-298].

Som vist i fig. 2 ble monoklonale antistoffprøver I - IV omsatt separat mot antigenet uten noen signifikant turbidi-tetsf orskj ell D, når den ble nedtegnet mot en tid T opp til 600 sekunder. En kombinasjon av antistoffprøver II og IV gav imidlertid en målbar turbiditetsforandring, fullstendige reaksjoner med en kombinasjon av prøver I og II, og en kombinasjon av prøver II og III som var ekvivalent med det som normalt erholdes i reaksjoner under anvendelse av polyklonale antistoffreagenser.

Det fremgår av fig. 2 at en reaksjon med en kombinasjon av prøve I, II og III resulterte i en turbiditetsforskjell mindre enn den som erholdes med kombinasjonen av prøver II og III. Dette resultat skyldes antagelig antistoffoverskudd i reaksjonen.

Fig. 3 viser , turbiditetsforskjeller D, erholdt for et antall verdier av antigenkonsentrasjon C, uttrykt i mg/ml. Den viste kurve ble erholdt ved titrering av IgG kappa paraproteinet, ved forskjellige konsentrasjoner, mot en standardkonsentrasjon av et antistoffpreparat. Antistoffene anvendt i dette tilfelle var de fra prøver I og II, dvs. de som var rettet mot den rommelige distinkte kappa lettkjede. og Cy3 regionen av antigenet.

Som ovenfor indikert utgjøres IgG-innholdet i humant serum av sub-populasjoner av IgG kappa og IgG lambda. I normalt serum ligger forholdet mellom IgG kappa og IgG lambda mellom . 3:1 og 1:1; et typisk forhold er tilnærmet 1:8:1. En signifikant- avvikelse fra dette område for forhold kan indi-kere et tidlig trinn av myeloma, som ellers kan utvikle seg i opp til tyve år før der utvises noen symptomer. Da påvisning og behandling ved et tidlig stadium kan forlenge livet betyde-lig, er det klart fordelaktig at mengdene av de ovenfor angitte sub-populasjoner er istand til å kunne bestemmes.

Monoklone antistoffpreparater har vært anvendt for å bestemme de relative mengder sub-populasjoner av immunoglobuliner tilstede i slikt polyklonalt IgG. F.eks. :vil en test omfattende IgG kappa og IgG lambda som omsettes med antistoffer fra prøver II og III, hvor begge er rettet mot Fc de-len av IgG molekylet, tillate mengdebestemmelse av det totale IgG innhold av testen. En identisk IgG prøve omsatt med en kombinasjon av antistoffer fra prøver I og II vil tillate mengdebestemmelse av IgG kappa innholdet. På samme måte vil en identisk IgG prøve omsatt med f.eks. et antistoffpreparat fra prøve II i kombinasjon med et ytterligere monoklonalt antistoff preparat som er spesifikt overfor IgG lambda lettkjede muliggjøre mengdebestemmelse av IgG lambda innholdet. Det er blitt funnet at summen av mengden av IgG kappa og IgG lambda utført som ovenfor beskrevet har en høy samsvarighet med mengden av totalt IgG innhold.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av mengden av et bestemt protein (IgG) i en prøve ved hvilken prøven omsettes med antistoffer til protein mder dannelse av antigen/antistoffutfel-ling, karakterisert ved at antistoffene omfatter to monoklonale antistoffpreparater (I eller II eller III eller IV) som er henholdsvis spesifikke overfor to distinkte antigene seter (L eller Cy2 eller Cy3) på makromolekylet av det angitte protein (IgG).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de to antistoffpreparater (I eller II, eller III eller IV) er valgt slik at de er spesifikke overfor relativt vidt adskilte antigene seter (L eller Cy2 eller Cy3) , hvorved bindingen av et monoklonalt antistoff til dets spesifikke determinant på molekylene av angitte protein UgG) ikke interfere-rer rommelig med bindingen av det annet monoklonale antistoff til dets spesifikke determinant.

3... Fremgangasmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte protein omfatter et immunoglobin (IgG), og at de to monoklonale antistoffer (I eller II eller III eller IV) er valgt slik at de er spesifikke overfor antigene determinanter uttrykt ved henholdsvis de lette (L) og de tunge (H) kjeder av makromolekylet av immunoglobin (IgG).

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at prøven innbefatter populasjoner av første og andre immunoglobuliner (IgG kappa og IgG lambda), og at de monoklonale antistoffer omfatter første og andre preparater (II og IV) som begge er spesifikke overfor antigene determinanter uttrykt ved de tunge kjeder (H)' av begge immunoglobuliner (IgG kappa, IgG lambda), en kombinasjon av nevnte første og andre preparater (II og IV) omsettes med prø-ven, det totale nivå av immunoglobulinene (IgG kappa, IgG lambda) i prøven bestemmes av.det resulterende antigen/antistoff kompleks, prøven omsettes med en kombinasjon av første preparat (II) og et tredje monoklonalt antistoffpreparat (I) som er spesifikt overfor en antigendeterminant ut- . trykt ved bare én (IgG kappa) av nevnte immunoglobulin, og mengden av populasjonen av angitte ene immunoglobulin (IgG kappa) bestemmes av det resulterende kompleks.