DK158362B - Fremgangsmaade til fremstilling af ethanol ved fermentering - Google Patents

Description

DK 158362 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af ethanol- ved kontinuerlig mi-kroaerob fermentering af et medium i en fermenteringsbeholder, ved hvilken man kontinuerligt tilfører frisk 5 medium til beholderen, kontinuerligt udtager fermenteret medium fra beholderen og tilbagefører den største del af gæren, til stede i det udtagne medium, til beholderen.

Man kender forskellige fremgangsmåder til frem-10 stilling af ethanol ved fermentering af et kulturmedium, som er rigt på fermenterbart sukker, og som betegnes med udtrykket medium i den foreliggende beskrivelse. Visse af disse fremgangsmåder sikrer en stor produktivitet, dvs. fremstilling af en stor mængde ethanol 15 pr. time i forhold til anlæggets volumen, andre sikrer mere specielt et godt udbytte, dvs. en god omdannelse af fermenterbart sukker til ethanol, andre gør det muligt at arbejde i stor målestok, og endnu andre sikrer et lille ydre energiforbrug eller en relativ simpel 20 konstruktion af anlægget.

Blandt fremgangsmåderne, der sikrer en stor produktivitet, kan man nævne fermentering under reduceret tryk, ved hvilken ulempen er af teknologisk art, idet det krævede anlæg er kompliceret. Blandt fremgangsmå-25 derne, der sikrer et godt udbytte, kan man f.eks. nævne de fremgangsmåder, ved hvilke der anvendes adskillige fermenteringsbeholdere sammen, og ved hvilke man successivt anvender forskellige typer gær. Det krævede anlæg er også her kompliceret, og produktiviteten rela-30 tivt beskeden.

Generelt genfindes den kontinuerlige fermentering med tilbageføring af den største del af gæren, til stede i det udtagne medium, ved de fleste af de kendte fremgangsmåder, idet den skulle gøre det muligt 35 at arbejde med en stor gærkoncentration i mediet, hvilket er gunstigt for produktiviteten. De problemer, der

DK 158362B

2 skal løses, er altså f.eks. inhiberingen af fermenteringen, hvis mediets ethanolindhold er for højt, den bakteriologiske usikkerhed, hvis mediets ethanolindhold er for lille, energiudgiften til blanding, hvis mediets 5 viskositet er for stor, eller hvis den overførte oxygenmængde er for lille, det formindskede udbytte, hvis gæren regenereres dårligt, eller fremstilling af en for stor mængde gær, hvis en for stor mængde oxygen anvendes til opretholdelse af gærens aktivitetsniveau i an-10 lægget.

Blandt de kendte fremgangsmåder kan man især nævne dem, der består i, at man anvender mindst to successive fermenteringsbeholdere, idet fermenteringsbetingelserne i den første beholder er reguleret således, 15 at en hurtig vækst af gæren favoriseres, og fermenteringsbetingelserne i den anden beholder er reguleret således, at en hurtig ethanoldannelse favoriseres, og at gæren tilstede i det udtagne medium fra den anden beholder føres tilbage til den første beholder. Ved 20 denne kendte fremgangsmåde kan en betydelig udefra kommende energimængde forbruges i den første beholder til sikring af en tilstrækkelig overført mængde oxygen, og de herskende betingelser i den anden beholder favoriserer indtræden af irreversible, mangelfulde åndingsfunk-25 tioner hos gæren, hvilke ikke kan afhjælpes ved tilbageføring til den første beholder. Gærcellerne med mangelfuld åndingsfunktion formerer sig i den første beholder og danner der sekundære, ikke-ønskede metabolit-ter, som f.eks. glycerol eller ravsyre. Af disse årsa-30 ger kan denne kendte fremgangsmåde kun udøves ved anvendelse af relativt lave gærkoncentrationer i mediet, og anvendelse af flokkulerende gær medfører ikke særlige fordele.

En anden kendt fremgangsmåde beregnet til sik-35 ring af en god oxygenoverførsel og gunstige og homogene fermenteringsbetingelser samtidig med et minimalt for-

DK 158362 B

3 brug af udefra kommende energi, omfatter anvendelse af et lukket kredsløb i en enkelt beholder forsynet foroven med en mammutpurnpe, der fungerede alene under indvirkning af carbondioxidgassen frigjort i beholderen, 5 idet oxygenet tilføres i en minimal mængde i toppen af en tilbageløbsledning og er fuldstændigt opløst i mediet, inden dette igen indføres i bunden af beholderen, et højt tryk og en god homogenitet af mediet sikres i hele fermenteringsbeholderens højde takket være tilba-10 geløbsrørets højde og tilstedeværelsen af en modtryksventil i toppen af fermenteringsbeholderen, den anvendte gær er flokkulerende, fraskillelsen af gæren, der er til stede i det udtagne medium, sker udenfor fermenteringsbeholderen i en dekanteringsbeholder under 15 tryk, og trykket i dekanteringsbeholderen og tilbageføringen af gæren ligeledes opnås ved hjælp af tilbageløbsrørets højde. Denne kendte fremgangsmåde kan udøves i stor målestok, samtidig med, at man opnår en god produktivitet og et godt udbytte. Imidlertid er en be-20 rigelse af mediet med gærceller med en degenerering af åndingsfunktionen, dvs. en irreversibel mangelfund åndingsfunktion, uundgåelig i længden, og dette begrænser i praksis varigheden af en sådan fermenteringsproces til ca. en til to uger, i løbet af hvilke udbyttet og 25 produktiviteten formindskes, især ved dannelse af sekundære metabolitter, som f.eks. glycerol eller ravsyre.

Den foreliggende opfindelse har til formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af eth-30 ahol ved kontinuerlig fermentering, hvilken fremgangsmåde muliggør opnåelse af et særligt godt udbytte samtidig med en god stabilitet i lang tid. Den har især til formål at tilvejebringe en fremgangsmåde, som kan udøves i et væsentligt længere tidsrum end en til to 35 uger, uden produktiviteten og udbyttet formindskes.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er til dette

DK 158362B

4 formål ejendommelig ved, at man hæmmer gærens vækst i beholderen ved begrænsning af koncentrationen af assi-milerbart phosphat til en værdi på mellem 0,01 og 0,2 g/1 i det frisk tilførte medium, og at man regenererer 5 gæren i beholderen ved kontinuerlig tilførsel af frisk gær til beholderen.

Med assimilerbart phosphat menes gennem nærværende beskrivelse med krav phosphat, der er tilgængeligt i mediet for metabolisme, dvs. opløst uorganisk 10 phosphat og phosphat foreliggende i organiske molekyler.

Man har konstateret, at en begrænsing af phos-phatkoncentrationen i mediet overraskende gør det muligt at begrænse væksten af gæren anvendt til fremstil-15 ling af ethanol uden at fremkalde dannelse af sekundære metabolitter. Dette muliggør opnåelse af et udbytte, med andre ord en faktor for kontinuerlig omdannelse af fermenterbart sukker til ethanol, i mediet nær ved den maksimale teoretiske værdi, som er ca. 51 vægt%. Den 20 foreliggende fremgangsmåde muliggør især opnåelse af et udbytte på ca. 49% eller mere, hvilket er højere end udbytterne opnået med hovedparten af de kendte fremgangsmåder nævnt ovenfor, ved hvilke udbytterne i almindelighed ligger mellem 44 og 48%. Man har konsta-25 teret, at man ved samtidig regenerering af gæren i beholderen ved kontinuerlig tilførsel af frisk gær i en minimal mængde dertil, især ved tilførsel af en vægtmængde frisk gær pr. time svarende til en fraktion på vægt% af gæren indeholdt i beholderen, kan holde udbyt-30 tet og produktiviteten på samme niveau praktisk talt i ubegrænset tid eller i hvert fald i et tidsrum, der er væsentligt længere end de karakteristiske en til to uger for den maksimale, mulige varighed for de fleste af de kendte fremgangsmåder nævnt ovenfor.

35 Den foreliggende kombination af de to essentiel le karakteristika ved den foreliggende fremgangsmåde,

DK 158362B

5 dvs. inhiberingen af gærens vækst ved begrænsning af den assimilerbare phosphatmængde i mediet og regenereringen af gæren ved kontinuerlig tilsætning af frisk gær, muliggør således overraskende samtidig opnåelse af 5 et særligt godt udbytte og en god stabilitet i lang tid. En anden fordel ved den foreliggende fremgangsmåde er, at den muliggør opnåelse af disse overraskende resultater såvel med flokkulerende gær som med ikke-flokkulerende gær. Endnu en fordel ved denne frem-10 gangsmåde er, at den i en foretrukket udførelsesform, kan udøves ved alene at anvende den nødvendige mængde oxygen til opretholdelse af gærens aktivitet. Man kan således formindske den anvendte mængde oxygen, selv i forhold til den der anvendes ved den sidste af de oven-15 nævnte kendte fremgangsmåder, uden at risikere dannelse af uønskede sekundære metabolitter, som f.eks. glycerol eller ravsyre.

Det er kendt at anvende styring af phosphatmæng-den til regulering af forskellige forhold i forbindelse 20 med fermentering.

Pra US-patentskrift nr. 2356381 kendes således en fremgangsmåde med tilsætning af phosphat samtidig med enzymer til forsukring af et stivelsesmateriale inden fermentering af det forsukrede stivelsesmateriale.

25 Formålet med denne phosphattilsætning er alene at begrænse tabet af fermenterbart materiale som følge af dannelse af ikke-fermenterbare carbonhydrater under forsukringen.

I dansk patentskrift nr. 123108 beskrives en 30 fremgangsmåde til fremstilling af et gærprodukt ved fermentering af et carbonhydridbaseret medium i to trin i to serie-ordnede fermentorer. I den anden fermentor holdes phosphatmængden så lavt, at gærens vækst hæmmes. Formålet hermed er at forbedre phosphatøkonomien.

35 I Eur. J. Appl. Microbiol, and Biotechnol.

(1982), 16, s. 10-16, beskrives en undersøgelse af ind-

DK 158362B

6 flydelsen af en begrænsning af phosphatmængden på væksten af gær og gærens syntese af enzymerne invertase og phosphatase i et medium med ethanol som eneste carbon-kilde.

5 I ingen af disse skrifter nævnes eller antydes der noget om, at man ved begrænsning af phosphatkoncen-trationen i fermenteringsmediet kan begrænse gærens vækst og samtidig øge udbyttet af ethanol.

Til udøvelse af den foreliggende fremgangsmåde 10 kan man som primært materiale fortrinsvis anvende et medium med et indhold af fermenterbart sukker mellem 100 og 200 g/1, foruden de nødvendige næringsstoffer for gæren. Hvis mediets indhold af fermenterbart sukker er mindre end 100 g/1, vil det udtagne mediums lil-15 le ethanolindhold gøre det efterfølgende trin til fra-skillelse af ethanolen fra mediet, f.eks. ved destillation unødvendigt dyrt. Hvis mediets indhold af fermenterbart sukker er større end 200 g/1, vil det store ethanolindhold sænke fermenteringshastigheden for meget 20 og formindske produktiviteten.

Man tilfører fortrinsvis et volumen frisk medium svarende til 0,1-0,3 gange volumenet af mediet, til stede i beholderen, pr. time til fermenteringsbeholderen. Hvis man pr. time tilfører mindre frisk medium 25 end den mindste af de således definerede mængder, kan man måske arbejde med en større ethanolkoncentration i beholderen, men med en langsommere rytme, hvilket formindsker produktiviteten. Hvis man pr. time tilfører mere frisk medium end den største af de således define-30 rede mængder, kan man ikke arbejde med en tilstrækkelig ethanolkoncentration i beholderen, hvilket fordyrer det efterfølgende trin til adskillelse af ethanolen fra mediet unødvendigt.

Hvad angår den anvendte gær, kan man vælge den 35 blandt gærsorter, der er kendte for at egne sig godt til ethanolfremstilling. Afhængigt af typen af det an-

DK 158362B

7 vendte fermenteringsanlæg kan man vælge en gærsort, der er kendt for at egne sig godt til dannelsen af aggregater, som letter dens sedimentering, dvs. en flokkule-rende gær, eller en gær, som ikke specielt har tendens 5 til at danne aggregater, dvs. en ikke-flokkulerende gær. Når man anvender en flokkulerende gær, kan man hensigtsmæssigt skille den fra mediet ved dekantering, især ved en dekantering under tryk, hvilket komprimerer carbondioxidgassen til stede i mediet og hindrer den i 10 at få aggregaterne til at flyde. Når man anvender en ikke flokkulerende gær, kan man f.eks. skille den fra mediet ved centrifugering eller filtrering.

Mediet i beholderen kan indeholde 30-80 g tørvægt gær pr. liter. Hvis man anvender mindre end 30 15 g/1 formindskes produktiviteten unødvendigt. Hvis man anvender mere end 80 g/1 udsætter man sig for viskositetsproblemer i beholderen og under fraskillelsen af gæren fra det udtagne medium.

Til regenerering af gæren i beholderen, dvs. til 20 opretholdelse af gærens aktivitet indenfor rammen for den foreliggende fremgangsmåde, tilfører man fortrinsvis pr. time til beholderen en vægtmængde frisk gær svarende til ca. 0,2-0,5 vægt% af gæren indeholdt i beholderen. Disse værdier svarer til en fuldstændig for-25 nyelse af gæren i beholderen i løbet af et tidsrum af 8-20 dage.

Til inhibering af gærens vækst i beholderen begrænser man således koncentrationen af assimilerbart phosphat i mediet. Man begrænser koncentrationen af 30 assimilerbart phosphat til en værdi på mellem 0,01 og 0,2 g/1 i det frisk tilførte medium. Med mindre end 0,01 g/1 risikerer man ikke at sikre opretholdelse af den ønskede aktivitet for gæren. Med mere end 0,2 g/1 risikerer man ikke at opnå den ønskede inhiberende ef-35 fekt på væksten.

Ved en foretrukken udførelsesform af den fore-

DK 158362 B

8 liggende fremgangsmåde begrænser man koncentrationen af assimilerbart phosphat ved tilsætning af et opløseligt aluminiumsalt, som f.eks. aluminiumsulfat eller -chlor-id i en molær koncentration, der er mindst 3 gange 5 større end phosphatkoncentrationen i det friske medium, til det frisk tilførte medium eller direkte til beholderen. På den måde bundfældes den største del af phos-phatet i form af aluminiumsalt, og koncentrationen af opløst phosphat i mediet kan ikke overskride en meget 10 lille værdi, som er en funktion af systemets ligevægtskonstant. Skønt de små mængder opløst phosphat gendannes efterhånden som de forbruges af gæren, må gæren vedvarende yde en stor anstrengelse for at finde adgang til denne lille mængde, hvorved den inhiberende virk-15 ning på væksten sikres.

Den foreliggende fremgangsmåde kan udøves ved anvendelse af praktisk talt alle de kendte fermenteringsanlæg udformet til kontinuerlig drift. Den egner sig især til anvendelse ved et anlæg med en beholder, 20 der er under tryk og foroven er forsynet med en mammutpumpe, i hvilket anlæg mediet cirkulerer kontinuerligt i et lukket kredsløb alene under påvirkning af carbondioxidgassen frigivet ved fermenteringen.

De følgende eksempler gives til nærmere belys-25 ning af opfindelsen eller til sammenligning.

Eksempel 1

Man anvender et fermenteringsanlæg omfattende en 30 15 liters fermenteringsbeholder med en højde på 50 cm og en diameter på 20 cm, midler til tilførsel af det friske medium, frisk gær og gas til beholderen, et middel til udtagelse af fermenteret medium og et middel til evakuering af gas fra beholderen, en dekanterings-35 beholder udenfor beholderen og et middel til tilbageføring af gæren for at bevare en konstant vægtmængde gær

DK 158362B

9 i beholderen.

Man holder volumenet af mediet i fermenteringsbeholderen på 10 1. Man tilfører 1,35 1/h frisk medium med den følgende sammensætning, i g/1, til beholderen: 5 saccharose 165 CaCl2.2H20 0,05 gærekstrakt l MnS04.7H20 0,01 K2S04 0,5 FeS04.7H20 0,01

MgS04.7H20 0,5 ZnS04.7H20 0,005 10 (NH4)2S04 0,5 H3P04 0,05

Man tilfører ligeledes 150 ml/h af et medium indeholdende 3 g tørvægt frisk gær til beholderen. Man opnår denne friske gær ved dyrkning af gæren 15 Saccharomyces cerivisiae CBS 2961 under aerobe betingelser med et udbytte på 50% på saccharose. Det vil sige, man anvender 6 g saccharose til fremstilling af disse 3 g tørvægt frisk gær.

Man tilsætter endelig 2,4 1/h luft blandet med 20 nitrogen, således at man opnår at ialt 180 1 gas evakueres pr.time fra fermenteringsanlægget. Man omrører mediet i beholderen ved hjælp af to turbiner med 4 kvadratiske blade med en sidelængde på 90 mm, hvilke blade drejede 300 omdrejninger/min. Man holdt pH-værdien af 25 mediet i. beholderen på en konstant værdi på 4,7 ved tilsætning af svovlsyre eller ammoniak. Man holdt temperaturen af mediet i beholderen på 33°C.

Man udtog 4 1/h fermenteret medium indeholdende 65 g/1 tørvægt gær fra beholderen. Man ledte det ud-3 0 tagne medie til en dekanteringsbeholder på 5 l i hvilken der herskede et tryk på 3 bar. Man tilbageførte 2,5 1/h af den koncentrerede gærsuspension til beholderen samtidig med, at man holdt vægten af gær konstant i beholderen. Man opsamlede 1,5 1/h medium indeholdende 35 70 g ethanol pr. liter, mindst 1 g saccharose og mindst 0,5 g gærtørstof.

DK 158362B

10

Den mængde ethanol der kan udvindes, destilleret med gassen, der forlader fermenteringsanlægget, er 6,3 g/h. Man opnår således et udbytte på 49% og en produktivitet på 11 g ethanol pr. time og pr. liter effektivt 5 volumen af beholderen. Forholdet mellem tørvægten af den frisk tilførte gær og vægten af fremstillet ethanol er mindre end 0,03. Efter en måneds uafbrudt drift af fermenteringsanlægget under de samme betingelser kunne man ikke konstatere nogen formindskelse af hverken ud-10 byttet eller produktiviteten.

Eksempel 2 15 Man anvender fremgangsmåden beskrevet i Eksempel 1, bortset fra at det friskt tilførte medium indeholder 0,2 g/1 H3P04 i stedet for 0,05 g/1, og at man desuden tilfører 2,7 g/h Al2(S04)3.18H20 til beholderen, hvilket svarer til en molær koncentration af Al, der er tre 20 gange større end den molære koncentration af H3P04.

Man opnår det samme udbytte og den samme produktivitet som i Eksempel 1.

Sammenliqningseksempel 25

Man anvender en lignende fremgangsmåde som fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1, bortset fra at man tilfører 2,25 1/h frisk medium, der pr. liter indeholder 130 g saccharose i stedet for 165 g og 0,8 g H3P04 30 i stedet for 0,05 g, til beholderen, at man ikke tilfører frisk gær, og at man tilfører luft med en hastighed på 90 ml/h i stedet for 40 ml/h.

Man udtager 4,75 1/h fermenteret medium indeholdende 50 g/1 tørvægt gær fra beholderen. Man udfører 35 dekanteringen og tilbagefører ligeledes 2,5 1/h koncentreret gærsuspension, men man udtager 13,8 g/h tørvægt

Claims (6)

20 N.B.: I den foreliggende beskrivelse mener man med ud trykket "frisk gær" en gær som er opnået ved ae-rob fermentering, og som har en intakt åndingsfunktion, dvs. en forhøjet åndingsaktivitet. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2

1. Fremgangsmåde til fremstilling af ethanol 3 ved kontinuerlig mikroaerob fermentering af et medium i 4 en fermenteringsbeholder, ved hvilken man kontinuerligt 5 tilfører frisk medium til beholderen, kontinuerligt ud- 6 tager fermenteret medium fra beholderen og tilbagefører 7 den største del af gæren, til stede i det udtagne medi 8 um, til beholderen, kendetegnet ved, at man 9 hæmmer gærens vækst i beholderen ved begrænsning af 10 koncentrationen af assimilerbart phosphat til en værdi på mellem 0,01 og 0,2 g/1 i det friskt tilførte medium, og at man regenererer gæren i beholderen ved kontinuer- DK 158362B lig tilførsel af frisk gær til beholderen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at man pr. time til beholderen tilfører et volumen frisk medium svarende til 0,1-0,3 gange 5 volumenet af mediet, til stede i beholderen, og at indholdet af fermenterbart sukker i det friske medium er 100-200 g/1.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man pr. time til beholderen tilfø- 10 rer en vægtmængde frisk gær svarende til 0,2-0,5% af vægten af gæren indeholdt i beholderen, og at mediet i beholderen indeholder 30-80 g tørvægt gær pr. liter.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man begrænser koncentrationen af 15 assimilerbart phosphat ved tilsætning til det friskt tilførte medium af et aluminiumsalt i en molær koncentration, der er mindst 3 gange større end den molære koncentration af phosphat, der er til stede i det friske medium.

5. Fremgangsmåde ifølge krav l, kende tegnet ved, at den anvendte gær er en flokkule-rende gær, som man skiller fra mediet ved dekantering.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende tegnet ved, at den anvendte gær er en ikke-flok- 25 kulerende gær, som man skiller fra mediet ved centrifugering .