DK155159B - Apparat til dyrkning af mikroorganismer og fremgangsmaade til anvendelse af dette - Google Patents

Description

DK 155159 S

i

Opfindelsen angår et apparat til dyrkning af mikroorganismer af den i krav l's indledning angivne art. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til dyrkning af mikroorganismer under anvendelse af det omhandlede appa-5 rat, idet fremgangsmåden ikke omfatter dyrkning af virus.

Hidtil er dyrkningen af anaerobe mikroorganismer blevet udført i dyrkningsbeholdere, der er fuldstændigt forseg-10 lede med elastiske propper, som f.eks. gummipropper, skruelåg, kronlukker eller lignende.

Når man ved dyrkningen af anaerobe mikroorganismer fører en injektionspodenål gennem proppen for at overføre mi-15 kroorganismer efter dyrkningen, har dyrkningssubstratet en tendens til at sprøjte gennem nålen på grund af det frembragte indre tryk. Yderligere har skruelåg, kronlukker eller lignende en tendens til at ryge af, når beholderne flyttes, således at laboratoriepersonalet ofte er 20 udsat for fare. Når sådanne uheld sker, kommer den ydre luft i kontakt med dyrkningssubstratet, hvorved bakterier fra luften kan forurene substratet.

Dersom man anvender propper med simple fastgørelsesdele, 25 kan propperne ryge af under dyrkningen på grund af det forøgede indre tryk i dyrkningsbeholderen, der frembringes af de gasarter, der udvikles af de anaerobe mikroorganismer, hvorved dyrkningssubstratet bliver forurenet med bakterier fra luften. Yderligere bliver omgivelserne 30 forurenet med anaerobe organismer, der spredes rundt omkring, når propperne ryger af.

Ved dyrkningen af aerobe mikroorganismer har man anvendt dyrkningsbeholdere, der er lukket med propper, der er 35 2

DK 155159 B

permeable for luften, som f.eks. Morton-lukker, vatpropper, aluminiumlåg, papirkuglepropper eller lignende.

Dyrkningen af aerobe mikroorganismer har imidlertid forskellige ulemper: Dyrkningssubstratet kan ikke lagres 5 gennem længere tid på grund af proppernes luftpermeabi-litet; substratet forurenes let med bakterier fra luften, dersom proppen tages af, når man udtager prøver; det er vanskeligt at transportere beholderne på grund af udsivning af substratet og laboratoriepersonalet er ud-10 sat for fare på grund af denne udsivning.

Ved almindelige dyrkningsmetoder er det nødvendigt at fjerne propperne, når man udtager prøver. Dette gør imidlertid, at bakterier fra luften kan trænge ind i 15 dyrkningsbeholderen, således at bakterier udefra inkuberes sammen med de dyrkede mikroorganismer. Dette bevirker, at det sommetider er vanskeligt at skelne de dyrkede organismer fra de forurenende bakterier.

20 Når aerobe og anaerobe mikroorganismer dyrkes under anvendelse af samme dyrkningsbeholdere eller -apparater, er der yderligere de problemer, at dersom man anvender de ovenfor nævnte lufttætte propper, forhindres propageringen af de aerobe mikroorganismer, og dersom der an-25 vendes luftgennemtrængelige propper, forhindres propageringen af anaerobe mikroorganismer. Det har derfor været nødvendigt at anvende specielle dyrkningsapparater til dyrkning af henholdsvis aerobe og anaerobe mikroorganismer. Dyrkningen bliver besværlig, og det er vanskeligt 30 eller umuligt at udføre dyrkningen på en rationel, sikker og korrekt måde.

USA patentskrift nr. 3 033 408 omhandler et dyrkningsapparat således som beskrevet i indledningen til krav 1.

35 3

DK 155159 B

Dette kendte apparat er udstyret med et lukke, hvor en gummiprop er kombineret med en vatprop udelukkende til anvendelse ved aerob dyrkning. Vattet eller lignende materiale anvendes som et filter til opretholdelse af ste-5 rilitet. Det kendte apparat er særdeles kompliceret opbygget, og det er derfor også besværligt at fremstille.

Opfindelsen har til hensigt at tilvejebringe et apparat til dyrkning af mikroorganismer, der muliggør, at den 10 indre atmosfære bibeholdes hermetisk forseglet inden dyrkningen af mikroorganismerne, medens de frembragte gasarter under dyrkningen kan bortledes, samtidig med at man bibeholder dyrkningsmiljøet.

15 Opfindelsen tilvejebringer således et apparat, der er velegnet til dyrkning af aerobe eller anaerobe mikroorganismer.

Desuden er det omhandlede apparat til dyrkning af mikro-20 organismer simpel i opbygning og let at håndtere.

Apparatet er i følge opfindelsen ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

25 Herudover tilvejebringer opfindelsen fremgangsmåder til dyrkning af aerobe og anaerobe mikroorganismer under anvendelse af apparatet. Fremgangsmåderne er ejendommelige ved det i den kendetegnende del af krav 10 og 11 angivne.

30

Dyrkningssubstratet kan være et, hvori man kan dyrke enten aerobe eller anaerobe mikroorganismer, men substrater, hvor man både kan dyrke aerobe og anaerobe mikroorganismer, foretrækkes.

35 4

DK 155159 B

Opfindelsen forklares nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 er et delvist snitbillede, set fra siden, af et 5 omhandlet apparat til dyrkning af mikroorganis mer, og fig. 2 er et delvis snit, set fra siden, der viser en tilpropningsdel, der indgår i det omhandlede ap-10 parat til dyrkning af mikroorganismer.

Fig. 1 viser det omhandlede apparat til dyrkning af mikroorganismer med en beholder 1 med en åbning 3. Beholderen 1 kan være fremstillet af et hvilket som helst 15 passende materiale, f.eks. plast eller glas; imidlertid foretrækker man et transparent materiale, specielt glas, for at kunne se det indre af beholderen under inkubationen. Udformningen af beholderen er ikke begrænset til den i fig. 1 angivne rørform, men den kan være af en 20 hvilken som helst form, som f.eks. en flaske eller kolbe. Et ringformet fremspring 3a findes på den indre omkreds af den øverste del af beholderens åbning 3. Dette fremspring kan være dannet ved en hel række forskellige metoder, som f.eks. ved at opvarme den øverste del af 25 åbningen.

Beholderen 1 er lufttæt forseglet ved åbningen 3 ved hjælp af en tilpropningsdel 4. Tilpropningsdelen skal være uigennemtrængelig for luft og er fremstillet af et 30 for en nål gennemtrængeligt materiale, specielt af gum-miagtigt, elastisk materiale. Tilpropningsdelen 4 er udstyret, således som bedst vist i fig. 2, med en udsparing 4a i bunden, og udsparingen 4a danner en forholdsvis tynd ydre væg 6, der udgør tilpropningsdelens lege-35 5

DK 155159 B

me. Den ydre væg 6 passer lufttæt med åbningsdelen 3 af beholderen. Tilpropningsdelens legeme 6 er udformet ud i ét med en hoveddel 5, der har en lidt større diameter end selve legemet, og en ydre væg 5a af hoveddelen er 5 tilspidset bort fra legemet 6. Hoveddelen 5 er også udstyret med en udsparing 5c foroven, der reducerer hovedets tykkelse, således at den er lettere at gennemtrænge.

10 Legemet 6 er udstyret med en gennemhulning 7, der står i forbindelse med den indre atmosfære i beholderen 1. Gen-nemhulningen 7 er, når den ses forfra, i form af en cirkel, der har en diameter på omtrent 0,3-3 mm eller en elipsoid form med en mindste akse på 0,3-2 mm og en 15 største akse på 2-3 mm. Der kan være adskillige gennem-hulninger 7 dannet i legemet 6. Fortrinsvis er symmetrisk anbragt to cirkulære huller, der hver har en diameter på 0,7-1,5 mm, med en afstand af 3-5 mm fra toppen af legemet 6. En ringformet rille 8 er dannet rundt om 20 legemet 6 under gennemhulningen 7.

Tilpropningsdelen kan fremstilles ved at extrudere foropvarmet, gummiagtigt materiale under tryk i en form, hvorved der ved størkning dannes en formet tilpropning, 25 der endnu er uden nogen gennemhulning. Herefter laves hullet gennem sidevæggen med en varm nål, der er af forudbestemt størrelse og form, eller med en dorn eller lignende. Den således fremstillede tilpropning tørres herefter i luften eller ved opvarmning. Det er fordelag-30 tigt at overtrække tilpropningsdelene med en siliconolie for at lette indførslen i beholderen.

Med henvisning igen til fig. 1 forefindes et substrat 9 til dyrkning af mikroorganismerne i beholderen 1. Sub-35

DK 155159 B

6 stratet 9 kan være et dyrkningssubstrat, der er velegnet til dyrkning af anaerobe mikroorganismer, som f.eks. hjerne-hjerte-infusionssubstrat, således som beskrevet side 895 i "Manual of Clinical Microbiology", 2. udgave, 5 udgivet af Edwin H. Lennette, Earle H. Spaulding og Joseph P. Truant (American Society for Microbiology, 1975), thioglycollatsubstrat beskrevet af Brewer i J.

Amer. Ass. 115, 598 (1940), brucella bouillonsubstrat beskrevet side 896 i "Manual of Clinical Microbiology", 10 2. udgave, eller et substrat, der er velegnet til dyrk ning af aerobe mikroorganismer, som f.eks. Columbia bouillonsubstrat, der fås ved at udelade agaren fra substratet, beskrevet af Ellner et al. i Amer. J. Clin. Pathol. 45, 502 (1966), næringsbouillonsubstrat beskrevet 15 side 912 i "Manual of Clinical Microbiology", 2.. udgave, trypticase-sojabouillonsubstrat, beskrevet på side 241 af "Shin Saikin Baichi Gaku Koza", vol. 1, af Saka-zaki (K.K. Kindai Shuppan, 1978). Til den foreliggende opfindelse foretrækkes et substrat, hvori man kan dyrke 20 både anaerobe og aerobe mikroorganismer. Sådanne substrater er velkendte af fagmanden og omfatter f.eks. det anaerobe basale dyrkningssubstrat formuleret af Gifu University, beskrevet side 338 i "Anaerobic Bacteria and Anaerobic Bacteria Disease" af Kosaki og Suzuki (Igaku 25 shoin, 1968). Sammensætningen af substrater, der er velegnede til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er vist nedenfor som substrat (A) og (B).

30 35

DK 155159 B

7

Substrat (A)

Sammensætning (g/liter

Ingredienser destilleret vand)_ 5

Trypton 5 -20

Sojapepton 1 - 5 Kødekstrakt 2 - 5 Gærekstrakt 3 - 10 10 Leverfordøjelsesprodukt 0,5 - 2

Glucose 2-3

Kaliumphosphat, dibasisk 0,1 - 3

Natriumchlorid 2 - 5 L-cysteinhydrochlorid 0,35 - 0,5 15 p-aminobenzoesyre 0,04 - 0,06

Natriumpolyanetholsulfonat 0,25 - 0,35 Hæmin 0,003- 0,007

Agar 0 - 0,01

Gelatine 10 - 14 20 pH 7,3 ± 0,1

Substrat (B)

Til substrat (A) sættes 1,5-2,5 g natriumbicarbonat pr.

25 liter destilleret vand.

I substrat (A) og (B) kan polypepton anvendes i stedet for trypton, kødpepton i stedet for kødekstrakt, dibasisk natriumphosphat i stedet for dibasisk kaliumphos-30 phat og dextran i stedet for gelatine.

Sammensætningen af særligt velegnede substrater (substrat (C) og (D)) er angivet nedenfor.

35 8

DK 155159 B

Substrat (C)

Trypton 17 g

Sojapepton 3 g Kødekstrakt 3 g 5 Gærekstrakt 5 g

Leverfordøjelsesprodukt 1 g

Glucose 2,5 g

Kaliumphosphat, dibasisk 2,5 g

Natriumchlorid 5 g 10 L-cysteinhydrochlorid 0,45 g p-aminobenzoesyre 0,05 g

Natriumpolyanetholsulfonat 0,35 g Hæmin 0,005 g

Agar 0,01 g 15 Gelatine 12 g

Destilleret vand 1000 ml pH 7,3 ± 0,1

Substrat (D) 20 Trypton 10 g

Sojapepton 3 g Kødekstrakt 3 g

Leverfordøjelsesprodukt 1 g Gærekstrakt 5 g 25 Glucose 2,5 g

Natriumchlorid 4,0 g L-cysteinhydrochlorid 0,45 g p-aminobenzoesyre 0,05 g

Natriumpolyanetholsulfonat 0,25 g 30 Natriumbicarboant 2 g Hæmin 0,005 g

Gelatine 12 g

Destilleret vand 1000 ml pH 7,3 ± 0,2 35 9

DK 155159 B

Substraterne (A) - (D) fremstilles på følgende måde. Ingredienserne bortset fra gelatine afvejes og opløses i 500 ml destilleret vand. Den anførte mængde L-cysteinhy-drochlorid og hæmin opløses i henholdsvis 0,01 N saltsy-5 re og i vand, inden de tilsættes opløsningen. Herefter afvejes gelatinen for sig, og gelatinen opløses fuldstændigt i 500 ml destilleret vand under opvarmning.

Begge opløsninger blandes grundigt og afkøles til stuetemperatur, hvorefter der indstilles med alkalisk opløs-10 ning, som f.eks. 2 N vandig natriumhydroxidopløsning, til den angivne pH-værdi, og der filtreres gennem absorberende vat. Filtratet filtreres herefter på et glasfilter under reduceret tryk, og filtratet anvendes som substrat.

15

Det indvendige af beholderen 1 holdes på et forudbestemt reduceret tryk, dvs. et tryk, således at det muliggør, at en forudbestemt mængde væske indeholdende mikroorganismerne suges ind. Et lukke 10 til at lukke det ydre af 20 tilpropningsdelen 4 og beholderåbningen 3 påsættes, idet der er et lille mellemrum mellem dette og det nedre fremspring 5b af hoveddelen 6 af tilpropningsdelen 4.

Lukket 10 forhindrer ikke bevægelse af tilpropningsdelen 4 og kan være udformet af et hvilket som helst materia-25 le, f.eks. plast eller aluminium.

Det omhandlede dyrkningsapparat med den ovennævnte udformning kan fremstilles på følgende måde: 30 Et 20 ml reagensglas (diameter 15,5 mm, længde 165 mm) eller en passende beholder i form af en kolbe eller flaske fyldes med en forudbestemt mængde af et substrat (18 ml til et 20 ml reagensglas eller 45 ml til en 50 ml kolbelignende eller flaskelignende beholder). Herefter 35 10

DK 155159 B

udluftes beholderen under reduceret tryk, og en blandet gasart (nitrogen:carbondioxid = 9,1) indføres langsomt for at give et næsten normalt tryk. Herefter reduceres trykket for at muliggøre, at en forudbestemt mængde 5 prøvemateriale kan suges ind. Tilpropningsdelen påsættes beholderen for at forsegle under reduceret tryk. Herefter steriliseres beholderen ved høj temperatur, idet man anvender en højtryksdampsterilisator ved en temperatur på 115-121 °C og et tryk på 1,5-2 kg/cm2 i 15-20 minut-10 ter.

Dyrkningen af mikroorganismerne under anvendelse af det omhandlede apparat kan udføres ved først at udtage en flydende prøve indeholdende mikroorganismer, f.eks. fra 15 en patients blod og derefter indføre prøven i beholderen. I dette tilfælde er det bekvemt at anvende en holder til vakuumblodopsamlingsrør (fremstillet af Terumo Corporation). Holderen består af et hult legeme, der er i stand til at optage apparatet til dyrkning af mikroor-20 ganismer, og en nål til udtagning af en prøve, hvilken nål er fastgjort ved den yderste del af det hule legeme og udformet således, at den danner en nålespids i begge ender. Efter at tilpropningsdelen af apparatet er blevet desinficeret med f.eks. alkohol eller iodtinktur, indfø-25 res dyrkningsapparatet i holderen, der har prøveudtagningsnålen. En af prøveudtagningsnålenes spidser indst ikkes i patientens åre, og den anden spids indstikkes i beholderen gennem tilpropningsdelen ved at indstikke udstyret dybt i holderen, således at en forudbestemt 30 mængde blod indsuges i dyrkningsapparatet af det reducerede tryk i apparatet. I en anden udførelsesform kan en injektionsnål anvendes til formålet. I dette tilfælde anvendes injektionsnålen til at udtage en prøve, og den indføres herefter i centret af den desinficerede til-35 11

DK 155159 B

propningsdel af dyrkningsapparatet. Da dyrkningsappara-tet bibeholdes under reduceret tryk, suges en forudbestemt mængde af prøven automatisk fra injektionssprøjten og føres over i apparatet ved sugning.

5

Efter at prøven er opsamlet og suget ind i apparatet, inkuberes den anaerobe kultur ved 27-37 °C i 1-14 dage.

Dersom det er nødvendigt, kan inkuberingen yderligere fortsættes. Frembragte gasarter kan let bortledes ved at 10 dreje tilpropningsdelen én omdrejning for at forøge gli-deevnen af propdelen.

Når man dyrker anaerobe kulturer, frembringer i det mindste en del anaerobe mikroorganismer, der er indført 15 uden at bryde den hermetiske forsegling, gasarter under inkuberingen, hvilket forøger det indre tryk af beholderen 1, fordi gennemhulningen 7 er lukket med den indre væg af beholderen. Når trykket forøges over et vist niveau, vil det tvinge tilpropningsdelen op til et punkt, 20 hvor gennemhulningen 7 når eller let overskrider toppen af åbningen 3 af beholderen 1. Herved vil de frembragte gasarter i beholderen bortledes gennem gennemhulningen 7 til det ydre af beholderen, og tilpropningsdelen standser der. Selv om tilpropningsdelen 4 eventuelt skulle 25 blive tvunget yderligere op af de frembragte gasarter, vil det ringformede fremspring 3a af beholderåbningen passe ind i den ringformede rille 8, der findes rundt om legemet 6, hvorved yderligere bevægelse af tilpropningsdelen 4 standses. Efter at gasarterne er bortledet, kan 30 tilpropningsdelen 4 tvinges ned manuelt for at lukke gennemhulningen 7 med den indre væg af åbningsdelen af dyrkningsbeholderen 1, således at beholderen 1 atter holdes lufttæt tillukket. Således forhindrer det omhandlede apparat, der muliggør bortledning af frembragte 35

DK 155159 B

12 gasarter, medens der samtidigt opretholdes en i det væsentlige lufttæt tilstand, at tilpropningsdelen 4 ikke ryger af under eller efter inkuberingen på grund af de frembragte gasarter, og substratet bibeholdes i beholde-5 ren uden udsivning, således at man med sikkerhed kan håndtere denne.

Ved aerob dyrkning kan dyrkningen på den anden side udføres under samme dyrkningsbetingelser som ved anaerob 10 dyrkning ved at udtage og indføre en prøve, således som nævnt ovenfor, trække tilpropningsdelen 4 op til et niveau ved hvilket gennemhulningen 7 delvis kommer ud af eller helt er over topdelen af åbningen 3 af dyrkningsbeholderen 1, og påsætte lukket 10. Det omhandlede dyrk-15 ningsapparat muliggør således forbindelse af det indre af beholderen med den ydre atmosfære, som f.eks. luften uden for beholderen, medens tilpropningsdelen 4 knyttet til åbningen 3 af dyrkningsbeholderen 1 stadigvæk forhindrer substratet i beholderen i at blive forurenet.

20

Eksempler på en hel række mikroorganismer, der dyrkedes i det omhandlede apparat, vist i fig. 1, er angivet nedenfor.

25 I efterfølgende tabeller er følgende forkortelser anvendt i forbindelse med de enkelte bakteriestammer.

30 35

DK 155159 B

13 NIHJ = The National Institute of Health, Japan ATCC = The America Type Culture Collection IID = The Institute of Infections Diseases IAM = The Institute of Applied Microbiology 5 RIMD = The Reserach Institute for Microbial Diseases IFO = The Institute for Fermentation, Osaka EKSEMPEL 1 10 Til anaerob dyrkning fremstilledes en suspension ved at opslæmme forskellige gasproducerende mikroorganismer angivet i tabel 1 og 2 i en sådan mængde steriliseret vand, at man fik fra 101 til 102 CFU/ml, og man udtog 2 cnr* af suspensionen og anbragte i beholderen 1, og der 15 dyrkedes ved 37 °C. Apparatet undersøgtes dagligt for vækst af mikroorganismer i dyrkningsbeholderen og for tilpropningsdelens bevægelse, forårsaget af gastrykket.

Man fik de i tabel 1 og 2 angivne resultater. Bevægelsen af tilpropningsdelen er angivet som antal dage, der kræ-20 ves for, at en del eller hele tilpropningsdelen bevæger sig til dyrkningsudstyrets øverste åbning. Man så ikke yderligere bevægelse af tilpropningsdelen efter de dage, der krævedes for den ovenfor angivne bevægelse, ved fortsat inkubering.

25 30 35

Dyrkning under anvendelse af Substrat C

TABEL 1 14

DK 155159 B

Vækst af Bevægelse af 5 Navn på mikroorganisme mikroorganisme tilpropningsdel Escherichia coli NIHJ glimrende 2 dage

Citrobacter freundii ATCC 8090 glimrende 1 dage n Salmonella typhimurium IID 971 glimrende 2 dage

Salmonella paratyphi IID 605 glimrende 1 dag

Salmonella enteritidis IID 604 glimrende 2 dage 15

Arizona arizonae ATCC 13314 glimrende 2 dage

Salmonella pullorum 3H-2 glimrende 2 dage „n Klebsiella pneumoniae IID 875 glimrende 2 dage

Enterobacter cloacae IAM 1624 glimrende 2 dage

Enterobacter aerogenes RIMD 0502001 glimrende 1 dag 25

Hafnia alvei ATCC 13337 glimrende 3 dage

Proteus morganii IID 602 glimrende 2 dage _n Proteus mirabilis RIMD 1641002 glimrende 2 dage

Bacillus macerans IFO 3490 glimrende 4 dage

Clostridium tetani IID 524 glimrende 8 dage 35

Clostridium sporogenes IAM 19235 glimrende 2 dage

Clostridium spheroides glimrende 1 dag _i_i_

15 DK 155159 B

TABEL 2

Dyrkning under anvendelse af Substrat D

Vækst af Bevægelse af

Navn på mikroorganisme mikroorganisme tilpropningsdel

Escherichia coli NIHJ glimrende 2 dage 5

Citrobacter freundii ATCC 8090 glimrende 1 dag

Salmonella typhimurium IID 971 glimrende 2 dage , n Salmonella paratyphi IID 605 glimrende 1 dag

Salmonella enteritidis IID 604 glimrende 2 dage

Arizona arizonae ATCC 13314 glimrende 2 dage 15

Salmonella pullorum 3H-2 glimrende 2 dage

Klebsiella pneumoniae IID 875 glimrende 2 dage 9n Enterobacter cloacae IAM 1624 glimrende 2 dage

Enterobacter aerogenes RIMD 0502001 glimrende 1 dag

Hafnia alvei ATCC 13337 glimrende 3 dage 25

Proteus morganii IID 602 glimrende 2 dage

Proteus mirabilis RIMD 1641002 glimrende 2 dage 3Q Bacillus macerans IFO 3490 glimrende 4 dage

Clostridium tetani IID 524 glimrende 8 dage

Clostridium sporogenes IAM 19235 glimrende 2 dage

Clostridium spheroides glimrende 1 dag 35 16 TABEL 2 (fortsat)

Dyrkning under anvendelse af Substrat D

DK 155159 B

Vækst af bevægelse af

Navn på mikroorganisme mikroorganisme tilpropningsdel 5 Veillonella alcalle- cens ATCC 17745 udmærket 4 dage

Fusobacterium necro- phorum RIMD 0623001 glimrende 1 dag

Fusobacterium varium 10 ATCC 8501 glimrende 1 dag

Bacteroides melanino- genicus RIMD 0230004 glimrende 1 dag _I_I_ 15 20 25 30 35 17

DK 155159 B

EKSEMPEL 2

Ved en aerob dyrkning opslæmmedes hver stamme i en passende mængde destilleret vand, således at man havde ca.

1 x 10^-5 x 10"*· CFU/ml. Suspension af de respektive stammer indføres i de respektive substrater i det om-5 handlede apparat. Man inkuberede ved 37 °C efter at have trukket tilpropningsdelen op, således at tilpropningsdelens hul var over beholderens åbning. Antallet af levende organismer i dyrkningsvæsken måltes efter 2 dage på sædvanlig måde, og resultaterne er vist i tabel 3 og 4, 10 hvilket angav god vækst på 10^-10^ CFU/ml.

Som en kontrol holdtes dyrkningssubstraterne ved 37 °C i 21 dage uden tilsat bakteriestamme. Dyrkningsapparatets indre var i forbindelse med luften som angivet ovenfor 15 med eller uden lukke. Man så ingen forurening med bakterier fra den fri luft.

20 25 30 35 18

DK 155159 B

TABEL 3

Dyrkning under anvendelse af Substrat C

Antal udsåede Antal levende Navn på mikroorganisme mikroorga- mikroorganis- nismer/ml mer/ml 5 ---

Pseudomonas aeruginosa IID 1001 1,5 x 10 1 x 108

Escherichia coli NXHJ 1,0 x 10 7 x 108 , n Salmonella enteritidis IID 604 1,3 x 10 2 x 109

Shigella sonnei IID 969 1,0 x 10 4 x 108

Enterobacter cloacae IAM 1624 1,7 x 10 2 x 109 15

Proteus mirabilis RIMD 1641002 9,0 X 10 1 x 109

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 0,5 x 10 2 x 107 9n Streptococcus pyogenes υ IID 693 0,2 x 10 lx 109

Kontrol (med lukke) — ingen vækst

Kontrol (uden lukke) — ingen vækst

Pseudomonas aeruginosa 25 IID 1001 4,5 x 10 4 x 108

Pseudomonas maltophila IID 1275 4,7 x 10 4 x 108

Achromobacter xyloso- xidans ATCC 27061 1,6 x 10 1 x 109 30

Escherichia coli NIHJ 0,5 x 10 3 x 109

Shigella sonnei IID 969 1,3 x 10 1 x 109

Enterobacter cloacae .

35 IAM 1624 2,3 x 10 3 x 10y

Proteus mirabilis Q

RIMD 1641002 1,9 x 10 3 x 109

Staphylococcus aureus Q

ATCC 6538P 5,3 x 10 5 x 10° TABEL 4 (fortsat)

Dyrkning under anvendelse af Substrat D

19

DK 155159 B

Antal udsåede Antal levende Navn på mikroorganisme mikroorga- mikroorganis- nismer/ml mer/ml 5 Streptococcus pyogenes IID 693 1,2 x 10 5 x 10y

Bacillus subtilis ATCC 6633 7,1 x 10 3 x 108

Listeria monocytogenes 10 IID 579 3,4 x 10 5 x 108

Salmonella enteritidis IID 604 1,9 x 10 1 x 10y

Clostridium tetani IID 524 1,2 x 10 7 x 108 15 Pusobacterium necro- phorum RIMD 0623001 3,4 x 10 8 x 108

Bacteroides fragilis ss. fragilis RIMD 2,1 x 10 6 x 10' 0230001 -n Neisseria meningitidis ATCC 13090* 6,0 x 10 5 x 107

Kontrol (med lukke) — ingen vækst

Kontrol (uden lukke) — ingen vækst _I______I___ * En suspension af mikroorganismer fremstilledes ved O c at anvende menneskeblod i stedet for destilleret vand.

30 35

DK 155159 B

20 EKSEMPEL 3

Hver stamme angivet i tabel 5 og 6 opslæmmedes i en passende mængde steriliseret, destilleret vand, og man ind-5 stillede opslæmningen således, at den indeholdt ca. 1 x 10-^-5 x 102 CFU/ml, hvorefter man anvendte den til forsøg; Inkuberingen påbegyndtes ved 37 °C, efter at tilpropningens hul var trukket op over dyrkningsapparatets åbning, dersom det drejede sig om aerobe kulturer, og 10 uden at trække proppen op, dersom det drejede sig om anaerobe kulturer. Antal levende mikroorganismer måltes daglig på sædvanlig måde, og antal dage nødvendige for at nå omtrent 5 x 10^ CFU/ml eller mere noteredes. Resultaterne er vist i tabel 5 (anaerobe kulturer) og ta-15 bel 6 (aerobe kulturer), hvilket angav, at visse af de dyrkede stammer voksede bedre i substrat D end i substrat C.

20 25 30 \ 35 TABEL 5 21

DK 155159 B

Anaerobe kulturer

Dager der kræves for 5 Navn på mikro- Antal udsåede vækst på 5 x 10' eller organisme mikroorganismer mere CFU/ml levende pr. ml mikroorganismer

Substrat C Substrat D

Pseudomonas in aeruginosa 4,5 x 102 2 dage 1 dag u IID 1001

Pseudomonas fluorescens 3,4 x 101 2 dage 1 dag IFO 12055

Neisseria 15 meningitidis 6,0 x 10'1' 4 dage 2 dage ATCC 13090

Neisseria gonorrhoeae 1,0 x lO'1^ 5 dage 3 dage IID 828 ______I_I_I___ 20 25 30 35

DK 155159 B

22 TABEL 6

Aerobe kulturer

Dage, der kræves for

Navn på mikro- Antal udsåede vækst på 5 x 10' eller organisme mikroorganismer mere CFU/ml levende pr. ml mikroorganismer 5 --

Substrat C Substrat D

Staphylococcus Ingen epidermidis 3,8 x 101 vækst 2 dage ATCC 12228 in Fusobacterium Ingen nucleatum 2,0 x 101 vækst 2 dage IID 891

Fusobacterium Ingen varium 1,2 x 101 vækst l2' 1 dag ATCC 8501 15 Bacteroides Ingen fragilis ass. 3,4 x 101 vækst *2' 1 dag distasonis RIMD 00230002

Peptostrepto- Ingen coccus micros 2,5 x 102 vækst '2' 3 dage 20 RIMD 1636001

Peptostrepto- Ingen coccus 2,6 x 101 vækst '2' 3 dage parvulus RIMD 1637001

Bifidobac- 25 terium adole- 1,5 x 102 3 dage 1 dag scentis ATCC 15705 _I___ (1) Suspensionen af mikroorganismer fremstilledes ved at 30 anvende menneskeblod i stedet for destilleret vand.

Observeret i 7 dage.

35

DK 155159 B

23

Som beskrevet udvikles der i det omhandlede apparat gasarter under inkuberingen af den anaerobe kultur, hvilke let bortledes gennem hullet i tilpropningsdelen. Med det samme apparat kan en aerob kultur også dyrkes simpelt 5 hen ved at trække tilpropningsdelen op, således at hele gennemhulningen eller en del heraf er over dyrkningsbeholderens åbningsdel. Apparatet, der har samme tilpropning og samme dyrkningssubstrat, kan således anvendes til både anaerobe og aerobe kulturer, inkuberingen kan 10 udføres sikkert og uden fare, fordi tilpropningsdelen ikke har tendens til at ryge af, og substratet herved blive spredt rundt omkring. Yderligere er andet udstyr ikke nødvendigt for at bortlede gasarterne eller luften fra apparatet, således at apparatet har den yderligere 15 fordel, at det er let at fremstille og billigt.

20 25 30 35

Claims (14)

1. Apparat til dyrkning af mikroorganismer omfattende en 5 beholder (1) med en åbning (3), et dyrkningssubstrat (9) anbragt i beholderen til dyrkning af mikroorganismerne, og en tilpropningsdel (4), der hermetisk forsegler beholderens (1) åbning (3), og i hvis ydervæg der findes et gennemgående hul (7), som står i forbindelse med be-10 holderens indre, kendetegnet ved, at beholderens (1) indre holdes under reduceret tryk, og at der ved beholderåbningen på beholdervæggens inderside findes et fremspring (3a), som kan fastholdes i en neden for hullet (7) beliggende rundtgående rille (8) i tilprop-15 ningsdelen (4), at denne er udformet med en nedre udsparing (4a) for tilvejebringelse af et forholdsvis tyndt nedre vægparti (6), i hvilket hullet (7) er beliggende, at der i tilpropningsdelens (4) øvre endeparti (5) findes en udsparing (5c), og at tilpropningsdelen er frem-20 stillet af et for en nål gennemtrængeligt materiale.

2. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tilpropningsdelen (4) er fremstillet af gummiagtigt elastisk materiale. 25

3. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dyrkningssubstratet (9) er et substrat til dyrkning af anaerobe mikroorganismer.

4. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dyrkningssubstratet (9) er hjerne-hjerte-infusionssub-strat, thioglycolat-substrat eller brucella bouillonsubstrat. 35 DK 155159 B

5. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dyrkningssubstratet (9) er et substrat til dyrkning af aerobe mikroorganismer.

6. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dyrkningssubstratet (9) er et substrat, der er i stand til at opformere både anaerobe og aerobe mikroorganismer.

7. Apparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at dyrkningssubstratet (9) omfatter trypton, sojapepton, kødekstrakt, gærekstrakt, levernedbrydningsprodukt, glucose, dibasisk kaliumphosphat, L-cysteinhydrochlorid, p-aminobenzoesyre, natriumpolyanetholsulfonat, hæmin, agar 15 og gelatine.

8. Apparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at dyrkningssubstratet (9) omfatter trypton, sojapepton, kødekstrakt, gærekstrakt, levernedbrydningsprodukt, glu- 20 cose, dibasisk kaliumphosphat, L-cysteinhydrochlorid, p-aminobenzoesyre, natriumpolyanetholsulfonat, hæmin, gelatine og natriumbicarbonat.

9. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 25 apparatet er steriliseret ved hjælp af høj temperaturs højtryksdamp.

10. Fremgangsmåde til dyrkning af en anaerob mikroorganisme under anvendelse af apparatet ifølge krav 1, 30 kendetegnet ved, at man indfører mindst én anaerob mikroorganisme i beholderen uden at bryde den hermetiske forsegling, at man dyrker den anaerobe mikroorganisme med hullet i tilpropningsdelens væg lukket af beholderens indre væg, hvorved gassen, der frembringes 35 DK 155159 B ved propageringen af mikroorganismerne under dyrkningen, når den overskrider et vist trykniveau, tvinger tilpropningsdelen opad, således at en del af eller hele hullet når en stilling over beholderens øverste ende, så at be-5 holderens indre kommer i forbindelse med omgivelserne, og at gassen bortledes til beholderens yderside gennem hullet.

11. Fremgangsmåde til dyrkning af aerobe mikroorganismer 10 under anvendelse af apparatet i følge krav 1, kendetegnet ved, at man indfører en væskeprøve indeholdende i det mindste en aerob mikroorganisme uden at bryde den hermetiske forsegling, at man dyrker de aerobe mikroorganismer, idet beholderens indre atmosfære står i 15 forbindelse med beholderens ydre atmosfære ved, at en del af eller hele hullet er bragt i en stilling over beholderens øverste ende.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet 20 ved, at beholderens indre atmosfære udgøres af en blandingsgas bestående af carbondioxid og nitrogen.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at prøven er blod. 25

14. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at dyrkningen udføres ved en temperatur fra 27 °C til 37 °C fra 1 til 14 dage. 30 35