DK151267B - Xanthanase og fremgangsmaade til fremstilling og anvendelse deraf - Google Patents

Description

i 151267

Den foreliggende opfindelse angår et xanthangummidepolymeriserende enzym kaldet xanthanase og en mikrobiel fremgangsmåde til fremstilling deraf samt en anvendelse deraf.

Xanthangummi og andre polysaccharider såsom carboxymethylcellulose 5 og traganth anvendes til forskellige kommercielle formål, idet f.eks. xanthangummi anvendes ved den kommercielle ekstraktion af olie, hvor sådanne polysaccharider kan anvendes til at forøge viskositeten i boreslam og sekundære ekstraktionsvæsker. Imidlertid kan den forøgede viskositet ofte gøre den påfølgende behandling vanskeligere, og 10 det ville derfor være fordelagtigt, hvis xanthanet (eller andre poly-saccharider) efter brug kunne depolymeriseres, hvorved dets viskositet ville blive reduceret. Det har nu vist sig, at en sådan depoly-merisering kan opnås ved et hidtil ukendt enzym, som fremkaldes af en hidtil ukendt stamme af Corynebacterium.

15 Den foreliggende opfindelse bygger på denne erkendelse og angår dette xanthangummidepolymeriserende enzym (herefter kaldet "xanthanase") og en fremgangsmåde til fremstilling deraf. Xanthanasen er ejendommelig ved, at den er identisk med det xanthangummidepolymeriserende enzym, der dannes ved dyrkning af Corynebacterium-stam-20 me 20/122 (deponeret hos NCIB under nummer 11535) i nærværelse af xanthan. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at Corynebacte-rium-stamme 10/122 (deponeret hos NCIB under nummer 11535) dyrkes under aerobe betingelser i et flydende vækstmedium, som omfatter assimilerbare kilder til nitrogen og essentielle mineralsalte og, som 25 eneste carbonkilde, xanthangummi, at de bakterielle celler skilles fra reaktionsmassen, og at xanthanasen udvindes fra det resulterende brugte vækstmedium.

Corynebacterium 20/122 blev isoleret ved at pode jordprøver i en serie sterile flydende berigede kulturmedier med den i tabel I angivne 30 sammensætning: 2 151267

Tabel I

Komponent Koncentration (pr. liter)

Xanthan 1,0 g 5 Na2HP04 3,0 g KH2P04 3,0 g (NH4)2S04 0,3 g

MgS04.7H20 0,2 g

FeCI3.6H20 16,7 mg TO CaCI2.2H20 0,66 mg

ZnS04.7H20 0,18 mg

CuS04>5H20 0,16 mg

MnS04.4H20 0,15 mg

CoCI2.6H20 0,18 mg 15 HgBOg 0,10 mg

Na2Mo04.2H20 0,30 mg

Hvis hele mediet blev steriliseret ved autoklavering, optrådte der nedbrydning af xanthangummien, hvilket blev konstateret ved viskositetsnedgang. I praksis blev separate opløsninger af xanthan og salte 20 deraf, i det dobbelte af den endelige styrke, autoklaveret separat, og lige store rumfang af de sterile opløsninger blev iblandet til dannelse af det komplette medium. Xanthanopløsningen blev autoklaveret ved 100°C i 25 minutter og saltopløsningen ved 110°C i 25 minutter. Podet vækstmedium blev inkuberet ved 30°C i et roterende rysteapparat, 25 indtil mediet havde tabt sin viskositet, og mikrobiel vækst var synlig. Bakterien blev isoleret og renset fra denne kultur under anvendelse af sædvanlige mikrobiologiske teknikker ved udstrygning på agarplader, som indeholdt samme medium, stivnet med 1,2% agar.

I praksis har det vist sig, at selv den modificerede teknik, som 30 anvendes ved autoklavering af det berigede medium til inokulet, ikke var tilstrækkelig til at garantere sterilitet. For at forhindre forurende 3 151267 kulturer blev en streptomycin resistent mutant af den oprindeligt isolerede organisme derfor vundet ved udstrygning af denne organisme på agarplader af det ovennævnte medium indeholdende 100 yg/ml streptomycinsulfat. En af de resulterende organismer, som voksede på 5 disse plader, blev kaldt Corynebacterium 20/122 og blev deponeret hos NCIB under nr. 11.535. Alt yderligere arbejde blev udført med denne mutantstamme, og i vækstmediet blev altid inkorporeret streptomycinsulfat i en koncentration på 100 yg/ml. Antibiotiket blev inkorporeret sammen med xanthanopløsningen under autoklaveringen.

10 Corynebacterium 20/122 har de i tabel II nedenfor viste egenskaber.

Disse blev bestemt ved den i "Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria", anden udgave (1974) beskrevne standardtestmetode. Ved sammenligning af disse egenskaber med dem, der er anført i "Bergy's Manual of Determinative Bacteriology, Eighth 15 Edition" viser det sig, at organismen hører til slægten Corynebacterium, men der er ikke tilstrækkelige data tilgængelige for at henføre den til en bestemt art; den er derfor betegnet Corynebacterium 20/122.

Tabel II

20 Egenskaber ved Corynebacterium 20/122 1. Fysiske egenskaber: a) Form: Pleomorfisk, aflange stave til kølleform og coccale former.

Celler ofte arrangeret i en "pallisade" i kulturer. Synlige granuler ved farvning med Loeffler's methylenblåt.

25 b) Motilitet: Ikke-motil.

c) Størrelse: 0,5 - 2,5 μ.

d) Sporedannelse: Ikke-sporedannende.

e) Gram's prøve: Postitiv.

2. Kulturegenskaber: 30 Næringsagarplade: Kolonier off-white, cirkulære, hele, lavt konvekse, glatte og bløde. Diameter 0,5 mm efter 24 timer ved 30°C.

4 151267 3. Fysiologiske egenskaber: a) Katalase: Positiv.

b) Oxidase: Negativ.

c) Ureasedannelse: Positiv.

5 d) Oxygenforhold: Aerob.

e) Temperaturforhold: Vækst mellem 4 og 42°C, optimum ved 30°C.

f) pH-Forhold: Vækst mellem pH-værdi 5 og 8, optimum ved 6-7.

g) Methylrødttest: Negativ.

h) Carbonhydratnedbrydning: Fermentativ.

10 i) Voges-Proskauerreaktion: Negativ.

j) Nitratreduktion: Negativ.

(D

k) "Tween" -hydrolyse: Negativ.

l) Gelatinesmeltning: Positiv.

m) Caseinhydrolyse: Negativ.

15 n) Syrefasthed: Negativ.

o) Pigmentdannelse: Kings A-medium - lysegul,

Kings B-medium - bleg lyserød-organge.

p) Indoldannelse: Negativ.

q) Produktion: Negativ.

20 r) Udnyttelse af carbon kilder: Vækst på glucose, lactose, saccharose, xylose, maltose, arabinose og gluconat (dårligt). Citronsyre udnyttes ikke til vækst. Syre dannes fra glucose, saccharose, xylose, maltose og arabinose.

s) Antibiotisk følsomhed: Tetracyclin, erythromycin, lincomycin.

25 t) Antibiotisk resistens: Penicillin G, streptomycin.

Det flydende vækstmedium, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, omfatter en nitrogenholdig forbindelse, som f.eks. kan være ammoniak, urinstof eller et ammoniumsalt, som f.eks. sulfat, chlorid eller nitrat, f.eks. a I kalimetal nitrat. Forbindelsen forekommer 30 hensigtsmæssigt i en koncentration på 1 - 50 g/liter.

Andre grundstoffer, som helst skal forekomme i mediet, er phosphor, svovl, magnesium og jern. Phosphorkilden er fortrinsvis ét eller flere phosphater, f.eks. ^HPO^, Kf^PO^, eller (NH^HPO^, eller phosphorsyre, fortrinsvis i en koncentration på 1 - 20 g/liter.

35 Svovlkilden kan være svovlsyre eller et sulfat, f.eks. ammoniumsulfat, hensigtsmæssig i en koncentration på 0,1 - 5,0 g/liter. De to 5 151267 metaller fås som et salt deraf, f.eks. magnesiumsulfat-heptahydrat i en koncentration på 0,1 - 2,0 g/liter og ferrichlorid-hexahydrat i en koncentration på 5-50 mg/liter. Mediet kan også indeholde spor af andre grundstoffer i form af egnede salte, f.eks. calcium, mangan, 5 zink, cobalt, molybden og bor.

Inkuberingen af den podede kultur udføres bekvemt ved rystning under temperatur- og pH-betingelser, som styres til dannelse af den ønskede xanthanase i maksimalt udbytte, nemlig ved en temperatur mellem 25 og 40°C, fortrinsvis ved 30°C, og en pH-værdi på mellem 5 10 og 8, fortrinsvis mellem 6,0 og 7,0. Inkuberingen fortsættes, indtil protein koncentrationen i vækstmediet når en maksimalværdi, hvilket normalt forekommer efter 40 - 48 timers forløb. Bakteriecellerne fjernes derefter, hensigtsmæssig ved centrifugering, og xanthanasen udvindes fra det brugte dyrkningsmedium, hensigtsmæssigt ved 15 udfældning med f.eks. ammoniumsulfat eller ethanol. De udfældede materiale kan derefter genopløses i et lille rumfang vand (hensigtsmæssigt 100 ml vand for hver liter oprindelig kultur), og resterende udfældningsmiddel kan fjernes ved dialyse mod destilleret vand efterfulgt af koncentration til slut ved frysetørring. Alternativt kan xan-20 thanasen udvindes ved frysetørring af det brugte dyrkningsmedium, fra hvilke cellerne er fjernet.

Xanthanasen karakteriseres også ved de reaktionsprodukter, der fås ved den enzymatiske depolymerisation af deacetyleret xanthangummi.

Der er 4 dominerende produkter, som har R^-værdier på 0,55, 0,50, 25 0,14 og 0,05, når de adskilles ved chromatografi på tyndtlagsplader af cellulose under anvendelse af ethylacetat-pyridin-iseddike-vand i volumenforholdet 5:5:1:3 som opløsningsmiddel og påvisning med standard sølvnitrat-natriumhydroxid-spray-reagens. De fire produkter identificeres yderligere ved sukkeranalyse i faldende R^-værdiorden 30 som værende mannose, mannose ketalbundet til pyruvat, et oligo-saccharid, som indeholder glucose, mannose og uronsyre i et forhold på henholdsvis 1,0:0,5:0,34, og et oligosaccharid indeholdende glucose, mannose og uronsyre i forholdet 1,0:0,84:0,55.

6 151267

Opfindelsen omfatter endvidere en fremgangsmåde til depolymerisering af xanthangummi eller carboxymethylcellulose (CMC), ved hvilken fremgangsmåde en vandig opløsning af gummien eller CMC omsættes med den på den ovenfor beskrevne måde fremstillede xanthanase ved 5 en temperatur mellem 25 og 70°C, fortrinsvis 30°C, og en pH-værdi på mellem 5 og 7, fortrinsvis 5,6.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler:

Eksempel 1.

Corynebacterium 20/122 blev podet i 200 ml medium i en 1 liters 10 kolbe. Mediet var som beskrevet i tabel I med 100 vg/ml streptomycinsulfat tilsat, og mediet havde en pH-vaerdi på 6,8. Det podede medium blev inkuberet ved 30°C i et frem- og -tilbagegående rysteapparatur, og bakteriens vækst blev fulgt ved måling af den optiske tæthed ved 625 nm og ved at følge nedgangen i viskositet i 1 ml's 15 prøver af væsken i et Wells-Brookfield-mikroviskosimeter. Efter 48 timers forløb, havde koncentration af xanthanaseenzymprotein i vækstmediet nået sit maksimum bedømt ved enzymaktivitet (se nedenfor), hvorefter cellerne blev fjernet ved centrifugering og filtrering af den klare overstående væske gennem 0,22 μ millipore-filtre. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Xanthanaseenzymet blev derefter isoleret fra det resulterende cellefrie 2 vækstmedium ved tilsætning under omrøring af fast, omkrystalliseret 3 ammoniumsulfat i en mængde, som var tilstrækkelig til at give en 4 endelig ammoniumsulfatkoncentration på 70% af mætning. Alternativt, 5 kan der sættes ethanol til en endelig koncentration på 60%. Det ud- 6 fældede stof blev isoleret ved centrifugering (filtrering er en alter 7 nativ teknik) og genopløst i et lille rumfang vand (ca. 100 ml/liter 8 oprindelig kultur), og resterende ammoniumsulfat eller ethanol blev 9 fjernet ved dialyse mod 3 portioner destilleret vand ved 4°C. Den 10 endelige koncentration af xanthanaseenzymet blev derefter udført ved 11 frysetørring til dannelse af et produkt, hvis aktivitet kunne påvises, enten ved at følge nedgangen i viskositet i en 10 minutters periode ved 40°C i en 1 ml's prøve af en 1 g/liter/opløsning af xanthangummi 7 151267 i vand efter tilsætning af 0,1 ml enzymopløsning, hvor der blev anvendt et Wells-Brookfield LVT-mikroviskosimeter, eller ved frigørelse af reducerende sukkerarter i et 10 minutters interval ved 30°C fra en blanding indeholdende enzym og 1 mg xanthangummi i 2 5 ml af en 25 millimolær acetatpuffer, pH-værdi 5,6. (Reducerende sukker blev målt ved Nelson's metode (Journal of Biological Chemistry 153, 375 (1944))).

Det har vist sig, at enzymet er stabilt i mindst 3 måneder i destilleret vand ved 0°C. Dets begyndelsesaktivitet er optimal ved pH-værdi 5,6 10 og ved en temperatur på 70°C. Aktiviteten falder imidlertid ved forhøjet temperatur; i et tidsrum på 1 time tabes 30% af aktiviteten ved 30°C, 50% tabes ved 45°C og 100% tabes ved 50°C (dvs. total inaktivering).

Eksempel 2.

15 200 mg xanthangummi i 200 ml destilleret vand blev inkuberet ved 30°C med 0,5 mg af det ifølge eksempel 1 fremstillede xanthanase-enzym i et tidsrum på 15 timer under rystning. Et par dråber chloroform blev sat til blandingen for at forhindre mikrobiel vækst. Under disse betingelser faldt opløsningens viskositet hurtigt (målt med 1 mi's 20 prøver i et Wells-Brookfield mi krovis kosimeter), hvilket viser nedbrydning (eller depoiymerisering) af xanthangummiet.

Lignende forsøg blev udført med carboxymethylcellulose, hvilket viser, at xanthanaseenzymet også effektivt kan depolymerisere dette stof, hvorhos dets aktivitet er 2 1/2 gange større end dets aktivitet 25 over for xanthangummi. I tilfældet af andre kommercielle polysaccha-ridgummier, f.eks. traganth og carrageenin, viste enzymet en hurtig startaktivitet, men denne gik hurtigt ned, før der var opnået en signifikant grad af depoiymerisering.

8 151267

Eksempel 3.

Slutprodukterne fra den i eksempel 2 beskrevne xanthangummide-polymerisering og slutprodukterne fra lignende behandlinger af deace-tyleret xanthangummi blev underkastet tyndtlagschromatografi og 5 sukkeranalyse for at identificere deres sammensætning og således xanthanaseenzymets virkningsmåde.

Det depolymeriserede slutprodukt fra eksempel 2 blev inddampet til tørhed under reduceret tryk ved 40°C, og remanensen blev opløst i vand. Reaktionsprodukterne i denne opløsning blev opspaltet ved 10 chromatografi på tyndtlagsplader af cellulose under anvendelse af ethylacetat-pyridin-iseddike-vand i et volumenforhold på 5:5:1:3 som opløsningsmiddel hvorhos påvisning på chromatogrammerne blev udført med et sølvnitrat-natriumhydroxid-spray-reagens (data for Biochemical Research, Editors R. Dawson, D. Elliott, W. Elliott, K. Jones; anden 15 udgave, Oxford at the Clarendon Press, 1969, p.541).

Ved anvendelse af denne teknik blev der dannet mindst 9 reaktionsprodukter ud fra xanthangummi. Hvis xanthanet imidlertid først blev deacyleret ved behandling under nitrogenatmosfære i 2 timer ved stuetemperatur med 25 millimoiær kaliumhydroxid i nærværelse af 1% 20 kaliumchlorid og derefter depolymeriseret på den i eksempel 2 beskrevne måde, blev der kun dannet 4 dominerende sukkerholdige reaktionsprodukter. Flere andre stoffer, som reagerer med sølvnitrat-sprayen, ses også på chromatog rammerne, men optrådte kun i små mængder og blev ikke karakteriseret yderligere. R^-Værdierne i 25 hovedprodukterne i de ovennævnte tyndtlagschromatografisystemer var 0,05, 0,14, 0,50 og 0,55.

De fire produkter fra deacetyleret xanthangummi blev adskilt, renset og karakteriseret. Adskillelsen blev udført ved papirchromatografi som beskrevet ovenfor, og de 4 komponenter blev renset ved gelpermea-30 tion og ionbytningschromatografi under anvendelse af kendte teknikker. De kaldes PI, P2, P3 og P4 på basis af stigende R^-værdier i det ovennævnte tyndtlagschromatografisystem.

9 151267

Disse fire produkter blev derefter karakteriseret med hensyn til deres sukkerbestanddele. Neutrale sukkerarter blev bestemt efter hydrolyse af stofferne ved gasfasechromatografi efter omdannelse til aldononi-tril-acetat-derivaterne deraf. Produkterne (0,5 mg) blev hydrolyseret 5 med 0,2 ml 0,25 M svovlsyre ved 95°C i 20 timer.

Blandingen af dannede sukkerarter blev neutraliseret med en ion-bytterharpiks ("Bio-Rad" AGI - X2, bicarbonatform) og blev inddampet til tørhed med en nitrogenstrøm. Sukkerarterne blev omdannet til aldononitril-acetaterne og analyseret ved gasfasechromatografi som 10 beskrevet af R. Varma og R.S. Varma (Journal of Chromatography 128, 45 - 52 (1976)).

Uronsyrerne i de rensede enzym reaktion s produkter blev bestemt ved carbazolreaktion (T. Bitter og H.M. Muir (1962) Analytical Biochemistry 4, 330 - 334) under anvendelse af glucuronsyre som reference-15 standard.

Enzymproduktet P4 viste sig at være mannose ved sammenligning med den autentiske sukkerart ved gasfasechromatografi som aldonitrilace-tatet i det ovennævnte system og ved tyndtlagschromatografi på celluloselag i følgende opløsningsmidler: 20 1. Ethylacetat-pyridin-iseddike-vand i volumenforholdet 5:5:1:3.

2. Propan-2-ol-ethylacetat-vand i volumenforholdet 6:1:3.

Påvisningen på tyndtlagspladerne foregik med sølvnitrat-natriumhydroxid og gav R^-værdier på henholdsvis 0,51 og 0,62. Autentisk mannose reagerede identisk både ved tyndtlagschromatografisystemer 25 og ved gas-væske-chromatografi.

Enzymproduktet P3 blev hydrolyseret, og den eneste frigjorte sukkerart blev påvist at være mannose. Når P3 blev hydrolyseret i 40 minutter ved 100°C med 2M HCI, og hydrolysatet blev neutraliseret til pH-værdi 7,0 med natriumhydroxid, kunne der påvises pyrodruesyre.

30 Syren blev identificeret og bestemt ved anvendelse af lactat-dehy-drogenase som beskrevet af Bergmeyer (Methos of Enzymatic Analysis 151267 ίο (1965) Academic Press, New York & London pp. 253 - 259). Omtrentlig ækvimolaere mængder af pyruvat og mannose blev fundet i hydro-lysaterne fra P3. I lyset af den fastlagte struktur for xanthangummi (Jannson, Kenne and Lindberg (1975) Carbohydrate Research 45, 5 275 - 282; Melton, Mindt, Rees and Sanderson (1976) Carbohydrate

Research 46, 245 - 257), angiver analysen af P3, at dette stof er afledt af de terminale rester af trisaccharidsidekæden, hvor pyruvatet er bundet som ketal til mannose. P3 kan derfor være 4.6-0-(l-carb-oxyethyliden) mannose.

10 Enzymproduktet P2 blev efter hydrolyse påvist at indeholde glucose og mannose i molforholdet 1:0,50. Uronsyre blev også påvist ved carbazoltesten, og molforholdet mellem glucose og uronsyre (som glucuronsyre) var 1:0,34. Imidlertid viste absorptionsspektret af P2 et stærkt bånd ved 232 nm, og P2 reagerede også kraftigt i Weissbach 15 og Hurwitz's thiobarbitursyretest (Journal of Biological Chemistry, 234, 705 - 709 (1959)), hvilket viser, at uronsyren forekom som det umættede Δ 4,5-derivat, formodentlig som umættet 4,5-glucuronsyre.

Den tidligere angivelse, at glucuronsyre og dens Δ 4,5 umættede derivat giver samme farve i carbazoltesten, er ikke blevet bekræftet, 20 da der ikke forefandtes en autentisk prøve af det umættede materiale.

Det er derfor ikke klart, om molforholdet mellem glucose og uronsyre i P2 på 1,0:0,34, som bestemt ved carbazolreaktion under anvendelse af glucuronsyre som standard, er helt nøjagtigt.

Yderligere information om P2’s struktur blev opnået ved methyle-25 ringsanalyse under anvendelse af Hakomori's metode som beskrevet af Lindberg (Methos in Enzymology, Vol. 28B, pp. 178 - 195 (1972)). Methyleringsanalyse indebærer erstatning af alle udsatte hydroxy-grupper i oligosaccharidet med methylgrupper. Når det modificerede oligosaccharid derefter hydrolyseres til sine sukkerbestanddele (me-30 thylerede), stammer de derefter udsatte hydroxygrupper fra nedbrydningen af bindinger mellem sukkerresterne. Analyse af de delvist methylerede sukkerarter til bestemmelse af hydroxygruppernes position indicerer derfor de positioner i sukkermolekylet, som er involveret i bindingerne mellem sukkerarterne i oligosaccharidet. Analyse udføres 35 ved kombineret gasfasechromatografi og massespektroskopi.

151267 η

Resultaterne med P2 viste, at methyleringsteknikken kun resulterede i trimethylderivater af sukkerarter, nemlig 3,4,6-, 2,4,6- og 2,3,6-tri-methylhexoser. Dette viser, at P2 er et uforgrenet oligosaccharid (da der ikke er dannet dimethylsukkerarter) og at, som ventet, den 5 ikke-reducerende endegruppe i molekylet er besat af den umættede uronsyrerest (da der ikke dannes noget tetramethylderivat, og der ikke udvindes uronderivater i denne proces). I lyset af den kendte struktur af xanthangummi er derfor tegn på, at P2 er et tetrasac-charid med molekylstrukturen som vist i formlen I

10 Denne struktur ville indebære et glucose:mannose:uronsyre molforhold på 1,0:0,5:0,5 i modsætning til det bestemte forhold på 1,0:0,5:0,34.

P2 indeholder ikke pyrodruesyre.

Enzymproduktet PI blev efter hydrolyse påvist at indeholde glucose, mannose og uronsyre i et molforhold på 1,00:0,84:0,55. PI reagerede 15 ikke i thiobarbitursyretesten, ej heller afsorberede det ved 232 nm, hvorfor det ikke indeholder en umættet uronsyre. Methyleringsanalyse viste dannelse af de samme tre trimethylhexoser som i P2 og desuden 2,3,4,6-tetramethylhexose. Tetramethylderivatet er afledt af den ikke-reducerende terminal i oligosaccharidet. Også her var der ingen 20 dimethylsukkerarter. PI antages derfor at være et uforgrenet oligosaccharid med den formlen II anførte molekylstruktur

Claims (9)

151267 Denne struktur ville indebære et gJucose:mannose:uronsyreforhold på 1,0:1,0:0,50.

1. Xanthanase, 5 kendetegnet ved, at det er identisk med det xanthangum-midepolymeriserende enzym, der dannes ved dyrkning af Corynebac-terium-stamme 20/122 (deponeret i NCIB under nummer 11535) i nærværelse af xanthan.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af xanthanasen ifølge krav 1, 10 kendetegnet ved, at en Corynebacterium-stamme 20/122 (deponeret i NCIB under nr. 11535) dyrkes under aerobe betingelser i et flydende vækstmedium, som omfatter assimilerbare kilder til nitrogen og essentielle mineralsalte og, som eneste carbonkilde, xan-thangummi, bakteriecellerne skilles fra reaktionsmassen, og xantha-15 nasen isoleres fra det resulterende brugte vækstmedium.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at dyrkningen udføres ved en temperatur mellem 25 og 40°C og en pH-værdi på mellem 5 og 8.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, 20 kendetegnet ved, at dyrkningen udføres ved en temperatur på 30°C og ved en pH-værdi på mellem 6,0 og 7,0.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, 3 eller 4, kendetegnet ved, at isoleringen af xanthanasen udføres ved udfældning ved tilsætning af ammoniumsulfat eller ethanol. 1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at xanthanaseprecipitatet renses ved opløsning i destilleret vand, dialyse og frysetørring. 151267

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, 3 eller 4, kendetegnet ved, at xanthanasen isoleres ved frysetørring af det cellefrie brugte dyrkningsmedium.

8. Fremgangsmåde til depolymerisering af xanthangummi og/eller 5 carboxymethylcellulose (CMC), kendetegnet ved, at en vandig opløsning af gummiet eller CMC omsættes med xanthanasen ifølge krav 1 ved en temperatur mellem 25 og 70°C og en pH-værdi på mellem 5 og 8.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, 10 kendetegnet ved, at omsætningen udføres ved en temperatur på 30°C og en pH-værdi på mellem 5,5 og 7.