CN111154816B - 一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法 - Google Patents

一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，属于生物技术技术领域。本发明包括如下步骤：(1)培养大肠杆菌，得到大肠杆菌菌液；(2)大肠杆菌液经高压匀浆破碎后制备大肠杆菌胞内蛋白液；(3)大肠杆菌胞内蛋白液冷冻干燥，得大肠杆菌胞内蛋白粉；(4)将黄原胶和大肠杆菌胞内蛋白粉分别溶于缓冲液中，继而混溶反应一段时间后，反应液煮沸后离心，所得上清液即为黄原胶寡糖。本发明提供了大肠杆菌降解黄原胶的方法，提供了制备黄原胶寡糖的最优条件，为黄原胶寡糖的工业化生产建立起夯实的基础。

Description

一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法
技术领域
本发明涉及一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，属于生物技术领域。
背景技术
黄原胶是一种由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的水溶性多糖，对黄原胶分子结构进行改造，有望为生物医药及食品工业等领域提供新型材料，有着很高的应用价值和发展前景。
关于黄原胶的降解主要方法有：物理法，化学法，生物法。然而黄原胶寡糖的制备领域，目前已有的技术水平仅能通过化学法的随机切割得到，但是化学方法对黄原胶的活性基团具有破坏性，且污染环境。
黄原胶在水环境下会呈现出有序构象，这严重阻碍了纤维素酶对其主链的降解，使得人们并未发现能够有效降解黄原胶的水解酶，这阻碍了人们对其进行理性改造的进程。
黄原胶寡糖制备的方法有基于历遍还原糖浓度计算的方法，其普遍适用性差，由于多因素不同排列组合后试验次数极多，工作量大导致其效率低下，且其易受到随机误差的影响，精确度低。
发明内容
本发明为了更高效的制备黄原胶寡糖，本发明利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖，并针对五种关键因素设计了正交试验，利用正交试验结果选取制备黄原胶寡糖的最优参数，由此可以得到最适条件下的黄原胶寡糖。
本发明不但简单高效，适应范围也更加广泛，大肠杆菌不仅廉价易获得而且极易破碎，从而能够快速获取大量胞内蛋白。而正交试验能在有限的试验次数内获得比遍历试验精度更高的试验结果，大量节省计算时间并避免了大规模数据处理，提高了大肠杆菌降解黄原胶制备寡糖的效率和精确度。如此便捷准确的黄原胶寡糖制备方法，在新型材料开发利用过程中尤为重要，其商业化应用前景也随之凸显。
为解决上述技术问题，本申请提供了一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，包括如下步骤：
一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养大肠杆菌，得到大肠杆菌菌液；
(2)将步骤(1)所得菌液离心后弃上清，沉淀用水和缓冲液清洗后，溶于缓冲液中，再经高压匀浆破碎后离心，保留上清液，即为大肠杆菌胞内蛋白液；
(3)将所得大肠杆菌胞内蛋白液冷冻干燥，得大肠杆菌胞内蛋白粉；
(4)将黄原胶溶于缓冲液中，得溶液1，所述溶液1中黄原胶的浓度为2-10mg/ml；再将大肠杆菌胞内蛋白粉溶于溶液1中，得溶液2，所述溶液2中大肠杆菌胞内蛋白粉的浓度为0.5-2.5mg/ml；反应一段时间后，将反应液煮沸后离心，留上清液，所得上清液即为黄原胶寡糖。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中培养大肠杆菌的方法包括如下步骤：
(1)将-80℃冻存的大肠杆菌于LB Ph7.0的无抗性固态平板上划线培养，在37℃培养箱中培养12h；
(2)挑取单菌落于37℃ 200rpm摇床中培养16h得到种子液；
(3)将种子液接种到液态LB Ph7.0培养基中，在37℃ 200rpm摇床中培养1.5h培养，其中种子液和培养基的体积比例为1:50，之后放入到16℃ 200rpm摇床中培养20h，得大肠杆菌菌液。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中将步骤(1)所得菌液离心的转速为8000rpm，时间为5min；经高压匀浆破碎后离心的转速为10000g，时间为10min。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中的缓冲液为20mM PB pH6.0缓冲液。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(3)中冷冻干燥所用时间为3天。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(4)中的缓冲液为20mM PB缓冲液，缓冲液的pH为6.0-8.0；离心的转速为10000g，离心时间为10min。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(4)中反应一段时间为0.5-2.5min，反应温度为30-50℃，反应液煮沸20min后离心。
进一步地，上述技术方案中，所述大肠杆菌包括：HB101菌株、TOP10菌株、JM109菌株、BL21(DE3)pLysS菌株、BL21(DE3)菌株、DH5a菌株、DH10B菌株。
一种由大肠杆菌降解黄原胶的寡糖制备方法的确定；
设定影响黄原胶寡糖制备的因素，其中包括黄原胶底物浓度，酶浓度，反应温度，反应时间，体系pH值。为各个关键因素选取参数，且每个因素所选取的参数个数是一致的。依据选取的因素及其参数生成正交试验表。依照正交试验表进行正交试验，将试验结果添加至正交试验表中，根据正交试验结果设计制备黄原胶寡糖的最优参数。
A、计算各因素的极差，极差值表示该因素在不同参数下的波动情况，极差越大为为影响黄原胶寡糖制备的主要因素，极差越小的因素为次要因素；
B、依据极差值大小确定各因素影响黄原胶寡糖制备的主次顺序；
C、对于主要因素，选取其DE(葡萄糖当量)值最大的参数为最优参数；对于次要因素，选取最经济的参数作为最优参数；
D、按照最优参数设计反应条件，即为黄原胶寡糖制备的最优方案。
发明有益效果
本发明首先对大肠杆菌的胞内蛋白进行了提取，使之与黄原胶共同孵育后通过酶活的测量分析其作用位点，确定其具有内切酶和裂解酶活性。随后对针对制备黄原胶寡糖的5种主要因素中的参数进行了正交优化。最后通过葡萄糖当量的计算确定其最优方案。本方法不仅原始菌株易获取，对胞内蛋白的提取很便捷，而且其对黄原胶的降解作用十分明显。之后通过正交试验避免了全面试验以及随机误差，能够在大量减少试验次数的情况下得到制备黄黄原胶寡糖的最优方案，极大的减小了方案所需时间。既发现了能够有效降解黄原胶的大肠杆菌，又提高了黄原胶寡糖制备过程中条件优化的效率和精度，为黄原胶寡糖的工业化生产建立起夯实的基础。
附图说明
图1是本发明的大肠杆菌胞内蛋白液的SDS-PAGE电泳图；其中泳道1为大肠杆菌胞内蛋白液，M为Marker蛋白。
图2是本发明的大肠杆菌胞内蛋白液降解黄原胶的离子交换色谱。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明所述大肠杆菌：HB101菌株、TOP10菌株、JM109菌株、BL21(DE3)pLysS菌株、BL21(DE3)菌株、DH5a菌株、DH10B菌株均购买于生物风官网。
实施例1
本实例中所述的大肠杆菌胞内蛋白的获取，及作用位点的确定方法如下：
本实施例中所用大肠杆菌为BL21(DE3)。
A、将大肠杆菌通过高压匀浆破碎的方法获取大肠杆菌胞内蛋白，其中高压匀浆破碎时所用缓冲液为50mM HEPES-NaOH pH 7.0(或20mM PB pH6.0)，破碎完成后通过使用Beckman离心机10000g高速离心10min后得到的上清即为胞内蛋白，随后将大肠杆菌胞内蛋白液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，得到了其全部条带大小如图1，图1中所有条带均为所需蛋白；
B、通过黄原胶与大肠杆菌胞内蛋白共同孵育，检测其内切酶酶活力，具体方法如下：
酶活定义：每分钟生成1μM还原糖末端所需的酶量。
检测内切酶酶活力方法：
(1)用电子天平称出100μL(0.1g)黄原胶底物(底物浓度为2mg/mL，黄原胶粉末用50mM HEPES-NaOH pH 7.0溶解)至2mL离心管中，可接受最大误差为0.001g；
(2)将步骤A所得大肠杆菌胞内蛋白稀释至1mg/mL；稀释时的缓冲液为50mMHEPES-NaOH pH 7.0，然后与浓度为0.1mg/mL BSA(用5mM HEPES-NaOH pH7.0稀释)以9:1(体积比)的比例预混合(混合液中大肠杆菌胞内蛋的浓度为0.9mg/mL)，下文所述酶液均为大肠杆菌胞内蛋白液；
(3)将预混合好的酶液分成两份，一份用作实验组，一份用作对照组。实验组的酶于离心管中放入冰水混合物中待用，实验组对应的底物于离心管中放入40℃水浴锅，进行预热，至少15min；对照组的酶液于离心管中煮沸至少20min以灭活，对照组对应的底物于离心管中放在冰上预冷，待用。其中，所述实验组对应的底物和对照组对应的底物均为步骤(1)制备得到的黄原胶。
(4)对照组酶液灭活好后，10000g离心10min，取上清，然后放在冰水混合物中待用。
(5)取100μL实验组的酶液加入至步骤(3)所述预热好的实验组对应的底物中，注意每一枪手法要一致。加好底物后用混匀仪充分混匀，然后用桌面小离心机2000g离心两秒，以防酶液粘在管壁上，最后放入40℃水浴锅反应20min；
(6)向步骤(3)所述对照组的底物中加入100μL灭活好的酶液，混匀仪充分混匀，然后用桌面小离心机2000g离心两秒，以防酶液粘在管壁上，最后放入40℃水浴锅反应20min；
(7)将反应好的实验组与对照组从水浴锅中取出，移至冰上至少10min以终止反应；
(8)迅速向实验组和对照组中分别加入200μL 4℃的BCA，然后充分混匀。然后放入75℃水浴锅中，反应30min；
(9)30min反应结束后，将实验组与对照组取出，用桌面小离心机2000g离心2s。然后加入到96孔板中，在OD562下测其OD值并计算其比酶活，测酶活实验结束。检测结果如下：得到的比酶活值为104.0011±1.3554U/g，可以看出大肠杆菌胞内蛋白对黄原胶有着较大的内切酶酶活，因此可以证明其能够很好的切割黄原胶主链；
C、通过黄原胶与大肠杆菌胞内蛋白共同孵育(大肠杆菌胞内蛋白浓度:0.05mg/ml，孵育温度：40℃，反应体系缓冲液：20mM PB pH6.0，黄原胶底物浓度：0.5mg/ml，反应时间2h)，检测其裂解酶酶活力。
裂解酶酶活定义：每分钟235nm处吸光值增加1.0所需要的酶量。
测裂解酶酶活力方法：
(1)用电子天平称出150μL(0.15g)黄原胶底物(底物浓度为1mg/mL，黄原胶粉末用20mM PB pH 6.0溶解)至2mL离心管中，可接受最大误差为0.001g；
(2)将大肠杆菌胞内蛋白稀释至0.005mg/mL浓度，稀释时的缓冲液为20mM PB pH6.0，下文所述酶液均为大肠杆菌胞内蛋白液；
(3)将稀释后的酶液分成两份，一份用作实验组，一份用作对照组。实验组的酶液于离心管中放入冰水混合物中待用，实验组对应的底物于离心管中放入40℃水浴锅，进行预热，至少15min；对照组的酶液于离心管中煮沸至少20min以灭活，对照组对应的底物于离心管中放在冰上预冷，待用。其中，所述实验组对应的底物和对照组对应的底物均为步骤(1)制备得到的黄原胶。
(4)对照组酶液灭活好后，10000g离心10min，取上清，然后放在冰水混合物中待用。
(5)取150μL实验组的酶液加入至预热好的步骤(3)所述预热好的实验组对应的底物中，注意每一枪手法要一致。加好底物后用混匀仪充分混匀，然后用桌面小离心机2000g离心两秒，以防酶液粘在管壁上，最后放入40℃水浴锅反应2h；
(6)向步骤(3)所述对照组的底物中加入150μL灭活好的酶液，混匀仪充分混匀，然后用桌面小离心机2000g离心两秒，以防酶液粘在管壁上，最后放入40℃水浴锅反应2h；
(7)将反应好的实验组与对照组从水浴锅中取出，煮沸酶活10min，10000g离心10min；
(8)离心结束后取上清，加入到石英96孔板中，在OD235下测其OD值并计算其比酶活，测酶活实验结束。检测结果如下：得到的比酶活值为1.2844±0.6255U/mg，可以看出大肠杆菌胞内蛋白对黄原胶有裂解酶酶活，因此可以证明其能够很好的修饰黄原胶侧链，以得到不同生理活性的黄原胶寡糖，增加了黄原胶寡糖的多样性；
通过大肠杆菌胞内蛋白液与黄原胶底物共同孵育，由于裂解酶能够切割黄原胶侧链最末端的甘露糖，使葡萄糖醛酸末端的双键暴露。由于双键在235nm处有吸光值，从而能够通过吸光值的增量和酶活定义来计算其裂解酶酶活力。通过上述验证可知，大肠杆菌对黄原胶有良好的降解性，可利用大肠杆菌将黄原胶降解成黄原胶寡糖。
实施例2
将实施例1所用大肠杆菌分别替换成：HB101菌株、TOP10菌株、JM109菌株、BL21(DE3)pLysS菌株、DH5a菌株、DH10B菌株，其余步骤相同，均可得到黄原胶寡糖。采用这几种大肠杆菌对黄原胶同样具有良好的降解性，可用于将黄原胶降解成黄原胶寡糖。
实施例3
利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的具体操作步骤如下：
本实施例所用大肠杆菌的种类为BL21(DE3)。
1、从-80℃冰箱中取出大肠杆菌的甘油管后，取少量在LB Ph7.0的无抗性固态平板上划线培养，在37℃培养箱中培养12h。挑取单菌落接入中培养，在37℃ 200rpm摇床中培养16h得到种子液。随后进行扩大培养，将种子液与培养基1:50(体积比)比例，接入到液态LB Ph7.0培养基中，在37℃ 200rpm摇床中培养1.5h。之后将其放入到16℃ 200rpm摇床中培养20h。
2、将得到的菌液用Beckman离心机8000rpm进行收菌-水洗菌-缓冲液(20mM PBpH6.0缓冲液)洗菌处理后，将菌体溶于20mM PB pH6.0的缓冲液中。随后将菌液进行高压匀浆破碎，破碎完成后通过使用Beckman离心机10000g高速离心10min后得到的上清即为胞内蛋白。
3、通过冷冻干燥的方法对大肠杆菌的胞内蛋白进行冷冻干燥3天，即得到蛋白干粉。
4、将黄原胶溶于20mM PB pH6.0的缓冲液中，其中，黄原胶的浓度为2-10mg/ml。取蛋白干粉溶于黄原胶缓冲液中，其中，大肠杆菌胞内蛋白粉的浓度为0.5-2.5mg/ml，黄原胶与蛋白冻干粉的质量比为20:1-4:5，至反应液颜色由白至黄后，对其进行煮沸(20min)灭活处理后使用Beckman离心机10000g高速离心10分钟，得到的上清即为黄原胶寡糖。
5、将黄原胶与制备后的黄原胶寡糖分别进行离子色谱检测，检测结果如图2所示，通过与黄原胶相比较可以看出得到了聚合度在5-40之间的黄原胶寡糖。
实施例4
将实施例2所用大肠杆菌分别替换成：HB101菌株、TOP10菌株、JM109菌株、BL21(DE3)pLysS菌株、DH5a菌株、DH10B菌株，其余步骤相同，均可得到黄原胶寡糖。效果与实施例2相同。
实施例5
一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法的最适条件确定方法如下；
A、设定影响黄原胶寡糖制备的因素，其中包括黄原胶底物浓度，大肠杆菌胞内蛋白液浓度，反应温度，反应时间，体系pH值。为各个关键因素选取参数，且每个因素所选取的参数个数是一致的如表1所示。
表1正交实验设计
Figure BDA0002392054600000091
B、依据选取的因素及其参数生成正交试验表。
表2选取正交表L25(56)
Figure BDA0002392054600000101
表2中A-E五种因素分别代表：大肠杆菌胞内蛋白液浓度，黄原胶底物浓度，反应温度，pH值，反应时间，空列代表误差列。
C、依照正交试验表进行正交试验，将试验结果添加至正交试验表中，根据正交试验结果设计制备黄原胶寡糖的最优参数。
(1)计算各因素的指标大小
从表2中可以看出，A1、A2、A3、A4、A5各自所在的那组试验中，其它因素(B、C、D、E)的1、2、3、4、5水平都分别出现了一次。
计算方法如下：
K1 A＝x1+x2+x3+x4+x5；k1 A＝K1 A/5
K2 A＝x6+x7+x8+x9+x10；k2 A＝K2 A/5
K3 A＝x11+x12+x13+x14+x15；k3 A＝K3 A/5
K4 A＝x16+x17+x18+x19+x20；k1 A＝K4 A/5
K5 A＝x21+x22+x23+x24+x25；k1 A＝K5 A/5
依据正交设计的整齐可比性，我们在比较K1 A、K2 A、K3 A、K4 A、K5 A时，可以认为B、C、D、E对K1 A、K2 A、K3 A、K4 A、K5 A的影响是大体相同的。于是，可以把K1 A、K2 A、K3 A、K4 A、K5 A之间的差异看作是A取了5个不同水平引起的。
(2)确定因素的主次
将每列的k1、k2、k3、k4、k5中最大值于最小值之差称为极差(设k5为最大值k1为最小值)
即：第一列(A因素)＝k5 A-k1 A＝RA
第二列(B因素)＝k5 B-k1 B＝RB
第三列(C因素)＝k5 C-k1 C＝RC
第四列(D因素)＝k5 D-k1 D＝RD
第五列(E因素)＝k5 E-k1 E＝RE
影响大，就是该因素的不同水平对应的平均收益率之间的差异大。直观的看出一个因素对试验结果影响大，就是主要因素。
(3)最优解的确定
对于最优解的确定应该选取指标最大的水平。
选取原则：①对主要因素，选取指标最好的那个水平
②对次要因素，以节约方便原则选取水平
D、依照正交试验表进行正交试验，将试验结果添加至正交试验表中，根据正交试验结果设计制备黄原胶寡糖的最优参数。得到制备黄原胶寡糖的最适条件如下：
(1)制备寡糖最适酶浓度在0.5-2.5mg/ml范围内；
(2)制备寡糖最适黄原胶底物浓度在2-10mg/ml范围内；
(3)制备寡糖最适反应温度在30-50℃范围内；
(4)制备寡糖最适反应pH在6.0-8.0范围内；
(5)制备寡糖最适反应时间在0.5-2.5min范围内。
在最优参数的条件下得到的DE值为3.7％。

Claims (5)

1.一种利用大肠杆菌降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养大肠杆菌，得到大肠杆菌菌液；
(2)将步骤(1)所得菌液离心后弃上清，沉淀用水和缓冲液清洗后，溶于缓冲液中，再经高压匀浆破碎后离心，保留上清液，即为大肠杆菌胞内蛋白液；
(3)将所得大肠杆菌胞内蛋白液冷冻干燥，得大肠杆菌胞内蛋白粉；
(4)将黄原胶溶于缓冲液中，得溶液1，所述溶液1中黄原胶的浓度为2-10mg/ml；再将大肠杆菌胞内蛋白粉溶于溶液1中，得溶液2，所述溶液2中大肠杆菌胞内蛋白粉的浓度为0.5-2.5mg/ml；反应一段时间后，将反应液煮沸后离心，留上清液，所得上清液即为黄原胶寡糖；
所述步骤(2)中的缓冲液为20mM PB pH6.0缓冲液；
所述步骤(4)中的缓冲液为20mM PB缓冲液，缓冲液的pH为6.0-8.0；离心的转速为10000g，离心时间为10min；
所述步骤(4)中反应一段时间为0.5-2.5min，反应温度为30-50℃，反应液煮沸20min后离心。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养大肠杆菌的方法包括如下步骤：
(1)将-80℃冻存的大肠杆菌于LB pH7.0的无抗性固态平板上划线培养，在37℃培养箱中培养12h；
(2)挑取单菌落于37℃ 200rpm摇床中培养16h得到种子液；
(3)将种子液接种到液态LB pH7.0培养基中，在37℃ 200rpm摇床中培养1.5h培养，其中种子液和培养基的体积比例为1:50，之后放入到16℃ 200rpm摇床中培养20h，得大肠杆菌菌液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将步骤(1)所得菌液离心的转速为8000rpm，时间为5min；经高压匀浆破碎后离心的转速为10000g，时间为10min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中冷冻干燥所用时间为3d。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌选自HB101菌株、TOP10菌株、JM109菌株、BL21(DE3)菌株、DH5a菌株或DH10B菌株。
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