DK150805B - Kemisk analyseapparat til koncentrationsbestemmelse ved hjaelp af reaktionshastighedsmaaling - Google Patents

Description

150805

Opfindelsen angår et kemisk analyseapparat til bestemmelse af koncentrationen af en bestanddel i en prøve, hvor prøven efter at være blevet indført i opløsning med et reagens reagerer med dette, idet reaktionsgraden og reaktionshastigheden er indikativ for koncen-5 trationen af bestanddelen i prøven. Opfindelsen angår især men ikke udelukkende et apparat til gennemførelse af enzymatiske analyser, der beror på reaktionen af stoffer, der skal påvises, med bestemte enzymer og kan tjene til kvantitativ bestemmelse af koncentrationen af de pågældende stoffer.

10 Sådanne analysemetoder finder især anvendelse ved bestem melse af biologiske stoffers kemiske sammensætning. Det er således almindeligt at bestemme koncentrationen af glukose i blod eller urin, idet koncentrationen af glukose i disse legemsvæsker er et udtryk for forløbet af forskellige fundamentale legemsfunktioner. En anden kendt 15 metode er at bestemme koncentrationen af urinstof i blodserummet, idet koncentrationen af urinstof i denne legemsvæske er et udtryk for nyrernes funktion.

De fleste kendte analysemetoder til bestemmelse af den kemiske sammensætning af biologiske stoffer er baserede på kolorime-20 trisk analyse. Således er f.eks. en kendt metode til enzymatisk bestemmelse af glukose i blod og urin baseret på oxidation af glukosen i blodet med enzymet glukose-oxidase under dannelse af hydrogenpero-xid og glukonsyre. Et kendt kemisk analyseapparat er baseret på spektralfotometrisk måling af farvereaktionen mellem hydrogenpero-25 xid, peroxidase og et chromogen. Et andet eksempel er bestemmelsen af urinstof i blod ved reaktion af urinstof og enzymet urease under dannelse af ammoniumcarbonat og under anvendelse af kolorimetriske metoder til bestemmelse af koncentrationen af reaktionsproduktet.

Skønt sådanne kolorimetriske, kemiske analysemetoder kan 30 give nøjagtige angivelser af koncentrationen af en bestanddel i en prøve, er forskellige problemer forbundne med disse metoder. Således er de fleste kolorimetriske metoder meget følsomme over for forstyrrelser og andre påvirkninger, hvilket kan forringe målenøjagtigheden betydeligt. Således kan ved enzymatisk bestemmelse af glukose i blod 35 og urin ved hjælp af oxidation af glukose med glukose-oxidase det stærke oxideringsmiddel hydrogenperoxid reagere med andre reducerbare stoffer, og endvidere kan andre urenheder forstyrre peroxid-per-oxidasereaktionen, hvilket medfører en betydeligt nedsat nøjagtighed af bestemmelsen. Endvidere kræver de kendte kolorimetriske analysesy- 2 150805 stemer en måling af intensiteten af produktets farve efter afslutningen af reaktionen, og analysen er derfor tidskrævende. Dertil kommer, at analysen ofte ikke kan gennemføres uden en forudgående fjernelse af protein fra blodprøverne eller en forrensning af urinprøverne.

Til nogle enzymatiske reaktioner er det foreslået at bestemme koncentrationen af en bestanddel i en prøve ved måling af ledningsevnen, idet der ved visse enzymatiske reaktioner sker en ændring fra en ikke-ionisk til en ionisk stofart, og mediets vekselstrømsledningsevne i disse tilfælde tjener som et direkte mål for reaktionsgraden, og den hastighed, hvormed vekselstrømsledningsevnen ændrer sig, er et mål for reaktionshastigheden. Da reaktionshastigheden er ligefrem proportional med koncentrationerne af visse reaktanter, såsom enzymet og substratet, kan koncentrationen af disse bestanddele overvåges og bestemmes ved måling af hastigheden, hvormed vekselstrømsledningsevnen ændrer sig.

Et eksempel på denne reaktionstype er den reaktion, der finder sted, når blod, der indeholder urinstof, blandes med enzymet urease. Det ikke-ioniske urinstof i serummet reagerer med enzymet urease under dannelse af ionisk ammoniumcarbonat. Graden og hastigheden af ammoniumcarbonatdannelsen er proportional med mængden af urinstof i serumprøven. Da ammoniumcarbonat er ionisk, ændrer opløsningens vekselstrømsledningsevne sig med en hastighed, der er proportional med mængden af urinstof i prøven.

I beskrivelsen til US-patent nr. 3.421.982 foreslås til enzymatisk analyse et system til måling af denne ændring af vekselstrømsledningsevnen. Ved dette system anvendes en passende ureasekoncen-tration til opnåelse af en konstant hastighedsændring for koncentrationen med tiden. I beskrivelsen til det nævnte US-patent anføres, at omdannelsen af substratet foregår i flere minutter, men at hastigheden af ændringen af ledningsevnen er i det væsentlige lineær i det første minut. Disse betingelser er en forudsætning for, at der med en tilstrækkelig tilnærmelse til reaktionshastigheden, der bestemmes ved måling af den i et fast tidsinterval inden for den lineære del af reaktionen optrædende endelige ændring af ledningsevnen, hensigtsmæssigt skal kunne anvendes en kinetisk topunktsmetode. Matematisk er dette en måling af Δ C, hvor Δ t Δ C er ændringen af ledningsevnen i det faste tidsinterval Δ t, der er tilnærmelsesvis ét minut. Dette kendte system er derfor omstændeligt, 3 150805 tidskrævende og unøjagtigt.

Fra det tyske offentliggørelsesskrift nr. 2.054.012 kendes et analysesystem, som ikke blot eliminerer de med de kendte kolorime-triske analysesystemer forbundne problemer, men også løser de foran-5 nævnte problemer ved det ifølge USA patentbeskrivelsen nr. 3.421.982 foreslåede på ledningsevnemåling baserede system. Ved dette fra det tyske offentiiggørelsesskrift nr. 2.054.012 kendte system opnås en forholdsvis enkel fremgangsmåde til en hurtig opnåelse af kvantitative oplysninger for en række kemiske og især biologiske prøver. Med det 10 i det nævnte offentliggørelsesskrift angivne analyseapparat kan koncentrationen af med enzymer reagerende stoffer hurtigt og nøjagtigt bestemmes under anvendelse af små prøvemængder. Dette kendte analyseapparat er baseret på måling af den sande øjeblikkelige reaktionshastighed på meget tidlige stadier af reaktionen, før en større 15 andel af reaktanterne er forbrugt. Det registrerede hastighedssignal har en meget skarpt defineret spidsværdi, der svarer til den (tilsyneladende) maksimumhastighed og er direkte proportional med begyndelseskoncentrationen. Det (tilsyneladende) maksimum af reaktionshastigheden opnås i løbet af et forholdsvis kort tidsinterval, hvorved 20 der spares analysetid og gennemføres flere prøver i et givet tidsrum.

Ved en tilsvarende anvendelse af 'it sådant system til direkte bestemmelse af oxygenforbruget ved en glukoseoxidase-glucosereaktion kræves der ingen forudgående rensning eller fjernelse af protein fra blod- eller urinprøverne, og systemet giver meget nøjagtige resultater 25 og er uømfindtligt over for mange urenheder, der erfaringsmæssigt har en skadelig indflydelse på mange andre analysemetoder.

Skønt det fra det tyske offentliggørelsesskrift nr. 2.054.012 kendte analyseapparat løser de ved de kendte i det foregående beskrevne systemer optrædende problemer, har det imidlertid vist sig, 30 at heller ikke dette analyseapparat er helt velegnet til mange enzymreaktioner. F.eks. volder bestemmelsen af koncentrationen af urinstof i blodserum ved hjælp af serummets reaktion med urease under dannelse af ammoniumcarbonat og overvågningen af denne reaktion ved hjælp af en ledningsevnemåleføler til måling af ændringen af opløsnin-35 gens ledningsevne problemer i forbindelse med målingen af den maksimale ændringshastighed (dC) af vekselstrømsledningsevnen.

max dt

Vanskelighederne skyldes, at selve blodserummet er ledende, og at der derfor sker en stor ledningsevneændring i opløsningen ved til- 4 150805 sætningen af serummet til reagenset. Denne øjeblikkelige pludselige stigning af opløsningens ledningsevne medfører, at der optræder en mod uendeligt tenderende maksimumværdi af den tidsmæssige ændringshastighed af ledningsevnen, der dog ikke kan anses at være et ud-5 tryk for den egentligt interessante milestørrelse, nemlig ændringen af ledningsevnen som følge af dannelsen af ionisk ammoniumcarbonat ved enzymreaktionen, således at der ikke kan opnås en anvendelig udgangsstørrelse. Yderligere vanskeligheder for opnåelsen af en entydig og for prøven, der skal analyseres, virkelig repræsentativ udgangs-10 størrelse i et tidligt stadium af bestemmelsen af reaktionen, kan forårsages af inhomogeniteter af prøvekammerindholdet ved indførslen af prøven samt af overgangs- og indsvingningsfænomener i måleapparaturets elektriske kredsløb.

Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe et kemisk ana-15 lyseapparat af den i krav 1's indledning angivne art, d.v.s. med direkte måling af den tidsmæssige ændringshastighed af den fysiske målestørrelse, ved hvilket det er forhindret, at måleresultaterne forfalskes, f.eks. som følge af at en målestørrelse ved tilsætning af reagenset eller prøven undergår pludselige ændringer, der forårsages 20 af at reagenset eller en fra stoffet, der skal påvises, forskellig komponent af prøven, f.eks. af blodserummet ved målinger af koncentrationen af biologiske stoffer i dette, har en egen ledningsevne, og disse ændringer af målestørrelsen overlejrer den egentlige siginifikan-te ændring af den del af den fysiske målestørrelse, der skyldes 25 stoffet, der skal påvises. Endvidere skal en forringelse af måleresultaterne som følge af inhomogeniteter af prøvekammerindholdet umiddelbart ved indførslen af prøven samt af optrædende overgangs- og indsvingningsfænomener i måleapparaturets elektriske kredsløb udeluk kes. Ved hjælp af opfindelsen skal således sikres, at de foran beskrev-30 ne og andre umiddelbart efter tilsætningen af prøven tænkelige forstyrrende påvirkninger ikke kan forfalske måleresultaterne, og samtidig skal den hurtigst mulige opnåelse af signifikante måleresultater for hver prøve efter tilsætningen af prøven sikres, idet den direkte målte ændringshastighed af den fysiske størrelse netop på et tidligt stadium 35 opfylder kravet om proportionalitet med koncentrationen af stoffet, der skal påvises, og der desuden tilstræbes en så kort analysetid som muligt og anvendelsen af så små prøvemængder som muligt. Ved hjælp af opfindelsen skal der således tilvejebringes et analyseapparat, med hvilket der uden kvalificeret personale kan gennemføres en automatise- 150805 5 ret og hurtig analyse af et stort antal prøver, således som det kræves til kliniske og forskningsmæssige formål.

Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved et apparat af den i krav 1's indledning angivne art, som er ejendommeligt ved, at 5 måleorganerne til måling af det tidsafledede signal indbefatter tidsforsinkelsesorganer, dér reagerer ved en pludselig ændring af det første signal og automatisk frembringer et elektrisk styre- eller spærresignal, hvis karakteristik ændrer sig efter et forudbestemt fast tidsinterval, samt organer, der er indrettede til i afhængighed af det 10 tidsafledede signal og af ændringen i karakteristikken for det elektriske styre- eller spærresignal at bestemme den øjeblikkelige værdi af det tidsafledede signal.

Ved hjælp af apparatet ifølge opfindelsen sker der på et meget tidligt stadium af reaktionen, inden reaktanten er forbrugt, en 15 nøjagtig måling af den samme øjeblikkelige hastighed, hvormed den fysiske målestørrelse ændrer sig. Selv ved gasformige reaktanter kan reaktionerne være åbne til atmosfæren, idet de til målingen væsentlige data, opnås inden en tilbagediffusion af gas i opløsningen kan influere på resultaterne. Opfindelsen er baseret på den erkendelse, at 20 indførelsen af prøven i opløsning med reagenset kan forårsage en øjeblikkelig ændring af den fysiske målestørrelse, der lægges til grund for analysen, hvilket uden særlige modforanstaltninger kan forårsage en forfalskning af måleresultaterne. Ifølge den foreliggende opfindelsen spærres målingen af det signal, der udtrykker hastighe-25 den af ændringen af den fysiske målestørrelse, f.eks. ledningsevnen, i et forudbestemt fast tidsinterval, der begynder ved indførelsen af prøven i reagenset. Der vælges et tidsinterval med en tilstrækkelig varighed, til at virkningen af den nævnte øjeblikkelige ændring i opløsningen er elimineret, og en grundig gennemblanding af prøven 30 med reagenset er opnået. Derpå måles værdien af ændringshastigheden for reaktionen umiddelbart efter afslutningen af det faste tidsinterval. Apparat ifølge opfindelsen egner sig således til analytisk måling af et reaktionsforløb, ved hvilket der efter en stor øjeblikkelig ændring i opløsningen, der er uden interesse for målingen, følger en 35 mindre og langsommere ændring, der er entydigt indikativ for koncentrationen af den bestanddel i prøven, der skal bestemmes.

Ved hjælp af opfindelsen opnås således et apparat til kemisk analyse, især til kvantitativ bestemmelse af koncentrationen af stoffer, der reagerer med enzymer. Opfindelsen tillader en vidtgående automa- 150805 6 tisk bestemmelse af koncentrationen af et med et enzym reagerende stof ved måling af værdien af reaktionshastigheden efter et forudbestemt fast tidsinterval efter indførelsen af stoffet i enzymet. Opfindelsen muliggør derved en hurtig og nøjagtig måling af enzymatiske 5 reaktioner under anvendelse af små prøvemængder.

Opfindelsen er især egnet til enzymatiske analyser, hvor den elektriske ledningsevne anvendes som fysisk målestørrelse, f.eks. enzymatisk analyse af koncentrationen af urinstof i blodserum. Opfindelsen er dog ikke begrænset hertil, men er egnet til anvendelse 10 inden for et bredt område af enzym reaktion er og andre analytiske reaktioner.

Tidsforsinkelsen ifølge opfindelsen udløses af den pludselige ændring af den overvågede fysiske milestørrelse henholdsvis af det til denne svarende første udgangssignal. Til dette formål er en fore-15 trukken udførelsesform for apparatet ifølge opfindelsen ejendommelig ved et følerkredsløb, som får tilført det første elektriske signal og er indrettet til i afhængighed af værdien af dette ved en pludselig ændring af det første signal ved indføringen af prøven i reagensen at afgive et udgangssignal, som aktiverer tidsforsinkelsesorganerne.

20 Det af tidsforsinkelsesorganerne afgivne styre- eller spærre signal kan enten føres til differentiatorkredsløbsorganerne eller til de på det tidsafledede signal reagerende organer, der bestemmer det tidsafledede signals øjeblikkelige værdi, hvorved det opnås, enten at det tidsafledede signal frembringes af selve differentiatorkredsløbet, 25 eller at bestemmelsen af den øjeblikkelige værdi af dette afledede signal henholdsvis spærres eller undertrykkes i det forudbestemte faste tidsinterval. I det sidstnævnte tilfælde, d.v.s. når det elektriske styre- eller spærresignal føres til organerne til bestemmelse af den øjeblikkelige værdi af det afledede signal, kan ifølge en hensigts-30 mæssig udførelsesform for opfindelsen tidsforsinkelsesorganerne være indrettede til at frembringe yderligere et styre- eller spærresignal, hvis egenskab ændrer sig på et tidspunkt inden for det forudbestemte faste tidsinterval, og dette yderligere styre- eller spærresignal kan føres til differentiatorkredsløbsorganerne til henholdsvis spærring 35 eller undertrykkelse af frembringelsen af det tidsafledede signal under en første del af det forudbestemte faste tidsinterval.

I det følgende beskrives udførelseseksempler for opfindelsen under henvisning til tegningen. På tegningen viser: fig. 1 en grafisk afbildning, der viser koncentrationen 150805 7 af oxygen (Og) som en funktion af tiden (t) ved en glukoseoxidase-glukosereaktion, fig. 2 en grafisk afbildning, der viser tidsdifferentialet

dO

for oxygen koncentrationen _2 for reaktionen 5 ifølge fig. 1, dt fig, 3 en grafisk afbildning, der viser vekselstrømsledningsevnen (C) som en funktion af tiden (t) for visse enzymreaktioner, såsom en urinstof-urease-rea ktion, 10 fig- 4-6 grafiske afbildninger af vekselstrømsledningsev-

dC

nens ændringshastighed ^ som funktion af tiden (t) ved det i fig. 3 viste tilfælde, og tre alternative fremgangsmåder til måling af værdien af ændringshastighedssignalet efter et 15 forudbestemt fast tidsinterval fra indføringen af prøven i reagenset, fig. 7 et blokdiagram over en udførelsesform for et apparat ifølge opfindelsen, og fig. 8 et delvist blokdiagram over en modifikation af ap-20 paratet ifølge fig. 7.

Opfindelsen muliggør en enkel og hurtig bestemmelse af koncentrationen af stoffer, der reagerer med enzymer ved måling af sand øjeblikkelig reaktionshastighed på meget tidlige stadier af reaktionen. Til bestemmelse af mængden af glukose i blod eller urin ved 25 hjælp af analyseapparatet ifølge opfindelsen anvendes en måling af hastigheden af oxidation af glukose med glukose-oxidase under dannelse af hydrogenperoxid og glukonsyre. Målingen foretages ved anbringelse af en oxygenføler i en prøvebeholder og måling af hastigheden for ændringen af oxygen koncentrationen.

30 I fig. 1 kan indholdet af oxygen Og have en værdi Og^ i tidspunktet tø forud for indføringen af den glukoseholdige prøve i den oxygenholdige glukoseoxidase. Efter indføringen af prøven i tidspunktet tj følger indholdet af oxygen en kurve 10, der aftager asymptotisk. Dersom oxygenføierens udgangssignal føres til et diffe-35 rentiationskredsløb kan der fås et elektrisk signal, der er tidsdifferentialet af oxygen koncentrationssignalet og dermed er proportionalt med den tidsmæssige ændringshastighed af oxygen koncentrationen. I fig. 2 ses kurver 11,12 og 13 over tre mulige udgangssignaler fra et sådant differentiationskredsløb. I hvert af tilfældene stiger det ved 150805 8 differentiation af udgangssignalet fra oxygenføleren opnåede tidsdif-ferential først til en maksimumværdi og aftager derefter, efterhånden som reaktionshastigheden aftager. Maksimumværdien af udgangssignalet, der udtrykker ændringshastigheden, er direkte proportional 5 med den oprindelige koncentration af glukose og giver en enkel, hurtig og nøjagtig bestemmelse.

Ved mange andre enzymatiske reaktioner optræder der ved indføringen af prøven i opløsning med reagenset ingen øjeblikkelig ændring af den egenskab ved opløsningen, der lægges til grund for 10 målingen, og den foran beskrevne metode kan derfor anvendes uden komplikationer i disse tilfælde. Ved andre enzymatiske reaktioner optræder der imidlertid ved indføringen af prøven i opløsning med reagenset en pludselig øjeblikkelig ændring af opløsningens karakteristiske egenskab, der skal måles. F.eks. kan man bestemme urinstof-15 koncentrationen i blodserum ved, at man bringer serummet til at reagere med enzymurease under dannelse af ammoniumcarbonat. Den hastighed, hvormed ammoniumcarbonatdannelsen sker, er proportional med mængden af urinstof i serumprøven. Da urinstoffet er ikke-ionisk, og ammon iumcarbonatet er ionisk, ændrer opløsningens veksel strøms led-20 ningsevne sig med en hastighed, der er proportional med mængden af urinstof i prøven. Ved målingen af maksimumværdien af udgangssignalet fra en vekselstrømsledningsevneføler er det imidlertid et problem, at blodserummet i sig selv har en ledningsevne, og der derfor ved indføringen af serummet i reagenset optræder en stor ændring af 25 opløsningens ledningsevne.

I fig. 3 viser kurven 15 ændringen af vekselstrømsledningsevnen med tiden ved måling med en i prøvebeholderen anbragt ledningsevneføler. I tidspunktet tø ved tom beholder har vekselstrømsledningsevnen en værdi Cq=0. I tidspunktet t|, i hvilket prøvebehol-30 deren fyldes med enzymureasen, springer vekselstrømsledningsevnen som følge af reagensets ledningsevne til en værdi C^. I tidspunktet t2 for indføringen af serummet i prøvebeholderen optræder der som følge af blodserummets ledningsevne et spring i ledningsevnen til en værdi C2. Derefter stiger ledningsevnen asymptotisk til en maksimumværdi 35 c , idet denne ledningsevneændring fra C2 til forårsages af ammoniumcarbonatdannelsen.

dC

Som det ses i fig. 4, springer ændringshastigheden ^ for vekselstrømsledningsevnen, således som vist ved den stiplede kurve 16 i begyndelsen mod uendelig som følge af det øjeblikkelige spring i 150805 9 opløsningens ledningsevne i tidspunktet t?. Efter tidspunktet t? af-tager ^ asymptotisk langs den stiplede kurve 17. Det vil forstås at dette øjeblikkelige spring i opløsningens ledningsevne i tidspunktet t0 dC c giver en tilsyneladende maksimumværdi for , der går mod uende- 5 lig, og at en metode, der således er baseret pi måling af maksimumværdien for hastigheden af ændringen af følerens udgangssignal ikke kan give et anvendeligt udgangssignal.

Fig. 7 viser et blokdiagram over en udførelsesform for et analyseapparat ifølge opfindelsen til kemisk analyse, med hvilket der 10 selv under disse vanskelige betingelser kan opnås pålidelige resultater ved metoden med direkte måling af målestørrelsens, i det foreliggende tilfælde ledningsevnens, ændringshastighed. Det i sin helhed med 20 betegnede apparatur har en prøvebeholder 21, i hvilken enzymreaktionen finder sted. Prøvebeholderen 21 kan være af en hvilken som helst 15 kendt udformning og har organer til indføring af reagenset og prøven samt organer til en grundig blanding af opløsningen.

En føler 22 til overvågning af en karakteristisk egenskab ved opløsningen eller en reaktionsdeltager eller et reaktionsprodukt strækker sig ind i prøvebeholderen 21. En føler 22 afgiver et med 20 denne karakteristiske egenskab proportionalt første elektriske udgangssignal til en ledning 23. Føleren 22 kan være en hvilken som helst kendt følertype, f.eks. den ved den foran beskrevne bestemmelse af glukose anvendte oxygenføler eller en spektral fotometrisk føler eller en ledningsevneføler med i afstand fra hinanden anbragte 25 første og anden elektroder til måling af vekselstrømsledningsevnen af opløsningen i prøvebeholderen 21.

En vekselspænding med konstant amplitude fra en oscillator 24 føres til føleren 22's ene elektrode. Oscillatoren 24's udgangssignal kan være en svingning med en hvilken som helst ønsket symmetrisk 30 bølgeform, d.v.s. sinusformet, firkantet, triangulær osv. og med en hvilken som helst ønsket frekvens afhængig af kredsløbsparametre, som det senere forklares. Ændringen i opløsningens vekselstrømsledningsevne bevirker en ændring af strømmen i den med føleren 22‘s anden elektrode forbundne ledning 23. Denne strøm optræder som en 35 amplitudemodulation af det af oscillatoren 24 leverede grundfrekvenssignal.

Det af føleren 22 leverede amplitudemodulerede signal føres til en demodulator 25, der afgiver en med vekselstrømsledningsevnen af opløsningen i beholderen 21 proportional jævnspænding til lednin- ίο 150805 gen 26. Ledningen 26 er forbundet med en fast klemmeskrue 27 i en kontakt 28, der har en bevægelig kontaktarm 29. Den bevægelige kontaktarm 29 er forbundet med et aflæsningsinstrument 30, f.eks. et digitalt voltmeter. Når kontakten sluttes mellem kontakten 28's kontakt-5 arm 29 og klemmeskruen 27, kan den med opløsningens vekselstrømsledningsevne proportionale jævnspænding aflæses direkte på aflæsningsinstrumentet 30. Dette signal vil optræde som kurven 15 i fig. 3. Det er dermed muligt at måle den aktuelle vekselstrømsledningsevne af opløsningen i prøvebeholderen 21 til bestemmelse af værdierne for Cq, 10 09 C3.

Den med vekselstrømsledningsevnen proportionale jævnspænding pi ledningen 26 føres endvidere også til et differentiationskredsløb 31, der afgiver et med tidsdifferentialet af det over ledningen 26 tilførte vekselstrømsledningsevnesignal proportionalt elektrisk 15 udgangssignal til en ledning 32. Det til ledningen 32 afgivne elektriske signal er således proportionalt med den hastighed, hvormed vekselstrømsledningsevnen af opløsningen i prøvebeholderen 21 ændrer sig og er dermed ligefrem proportional med koncentrationen af reaktanterne i prøvebeholderen 21.

20 Det vil heraf forstås, at apparatet 20 muliggør måling ved en stor gruppe af enzymatiske reaktioner, f.eks. sådanne reaktioner, hvor der optræder en ændring fra et ikke-ionisk stof til en ionisk stoftype eller omvendt. En sådan reaktion finder f.eks. sted, når blodserum, der indeholder urinstof, bringes til at reagere med en-25 zymurease under dannelse af ammoniumcarbonat. Da urinstoffet i sig selv er ikke-ionisk, og ammoniumcarbonatet er ionisk, ændrer opløsningsevnens vekselstrømsledningsevne sig som allerede beskrevet med en hastighed, der er proportional med begyndelses koncentrationen af u r ion stof.

30 I fig. 3 og 4 betegner kurven 15 demodulatoren 25‘s til ledningen 26 afgivne udgangssignal i afhængig af tiden. På tidspunktet ΐβ ved tom prøvebeholder 21 har ledningsevnen værdien Cq=0. På tidspunktet t^ indføres i prøvebeholderen 21 et afmålt rumfang reagens, der indeholder enzymet urease og fuldstændig dækker føleren 35 22. Derved stiger vekselstrømsledningsevnesignaiet på ledningen 26 pludseligt til en værdi på grund af reagensets ledningsevne. Reagenset omtales senere mere udførligt. Derefter indføres et meget lille rumfang prøveserum på tidspunktet t, i prøvebeholderen 21 og blandes med reagenset. Som følge heraf optræder der, som vist i fig.

150805 11 3, på tidspunktet t2 et øjeblikkeligt spring af ledningsevnen til en værdi C2 som følge af blodserummets ledningsevne. Endvidere reagerer det ikke-ioniske urinstof med ureasen under dannelsen af ammo-niumcarbonat med en hastighed, der er proportional med mængden af 5 urinstof i prøven, og ledningsevnen fortsætter derfor med at stige, indtil den har nået en maksimumværdi Cg.

Differentiationskredsløbet 31 afgiver en med vekselstrømsledningsevnens ændringshastighed proportional udgangsspænding. Som følge af det øjeblikkelige spring af opløsningens ledningsevne på 10 tidspunktet t2, stiger ledningsevnens ændringshastighed til at begynde med springvis mod uendelig (vist ved den stiplede linie 16), hvilket forhindrer en måling af maksimumværdien for ændringshastigheden. Ifølge opfindelsen føres demodulatoren 25's udgangssignal over udgangsledningen 26 til et ændringshastighedsfølekredsløb 35, der 15 registrerer den ved indførslen af serumprøven optrædende springvise ændring af ledningsevnen og i afhængighed heraf afgiver et elektrisk signal over en ledning 36. Alternativt kan udgangssignalet på demodulatoren 25's udgangsledning 26 føres til et ikke vist ledningsevne-niveaufølel^redsløb, der registrerer den ved indførsel af prøven 20 optrædende springvise ændring af ledningsevnen og ligeledes afgiver et elektrisk signal til påvisning af denne springvise ændringer. I begge tilfælde føres signalet på ledningen 36 til et tidsforsinkelseskredsløb 37, der over en udgangsledning 38 afgiver et elektrisk styre- eller reguleringssignal med en karakteristisk værdi, der æn-25 drer sig efter et forudbestemt fast tidsinterval. Længden af dette faste tidsinterval vælges på grundlag af flere overvejelser. Således vælges et tidsinterval, der er tilstrækkeligt langt til at sikre, at de af springet i ledningsevnen betingede indsvingnings- og overgangsfænomener når at aftage tilstrækkeligt til at muliggøre en nøjagtig 30 måling af hastigheden, hvormed ledningsevnen ændrer sig. Endvidere vælges tidsintervallet pi en sådan måde, at andre overgangs- og indsvingningsfænomener, såsom en temperaturstigning og lignende, kan elimineres. Endelig vælges det faste tidsinterval tilstrækkeligt langt til at der sikres en grundig gennemblanding af prøveserummet 35 med reagenset. Ifølge en foretrukken udførelsesform, der omtales nærmere i det følgende, sker ændringen af den karakteristiske størrelse af tidsforsinkelseskredsløbet 37's udgangssignal ca. 12 sekunder efter prøvens indføring.

Tidsforsinkelseskredsløbet 37's udgangssignal føres over 150805 12 ledningen 38 til differentiatorkredsløbet 31 for at spærre dettes funktion indtil afslutningen af tidsintervallet i tidspunktet t^. På tidspunktet t3, d.v.s. efter tidsintervallets afslutning, stiger differentiatorkredsløbet 31 's til ledningen 32 afgivne udgangssignal 41, som vist i 5 fig. 4, til det aktuelle signalniveau (vist ved den stiplede kurve 17) og falder derefter med reaktionshastigheden. Herunder optræder der en signalspidsværdi 42, der er proportional med værdien af ændringshastighedssignalet efter et forudbestemt fast tidsinterval efter indføringen af prøven i reagenset og dermed proportional med koncentratio-10 nen af urinstof i prøven. Dette på ledningen 32 optrædende udgangssignal fra differentiatorkredsløbet 31 føres til et hastighedsmålekredsløb 40, der ved denne specielle udførelsesform registrerer og lagrer spidsværdien 42, og over en ledning 43 fører denne værdi til en anden klemmeskrue 44 i kontakten 28. Ved omskiftning af kontakten 15 28's bevægelige kontaktarm 29 til kontaktslutning med klemmeskruen 44 kan spidsværdien af differentiationskredsløbet 31's udgangssignal aflæses på aflæsningsinstrumentet 30.

Det vil forstås, at den foran beskrevne anvendelse af tidsforsinkelseskredsløbet 37, differentiations kredsløbet 31 og hastigheds-: 20 målekredsløbet 40 kun er en enkelt udførelsesform for den til grund for den foreliggende opfindelse liggende idé, nemlig måling af værdien af differentiationskredsløbet 31's udgangssignal efter udløbet af et forudbestemt fast tidsinterval efter indføringen af prøven i reagenset.

Ved den i fig. 4 og 7 anskueliggjorte udførelsesform tjener tidsfor-25 sinkelseskredsløbet 37's over ledningen 38 afgivne udgangssignal til spærring af differentiationskredsløbet 31 til tidspunktet t3, hvorpå hastighedsmålekredsløbet 40 umiddelbart derefter måler maksimumværdien for signalet på ledningen 32. Det er indlysende, at også andre metoder er mulige. Ifølge fig. 5 og 8 vil hastighedsmålekreds-30 løbet 40 f.eks. kunne være udformet som et sample- and holdkredsløb, og tidsforsinkelseskredsløbet 37's til ledningen 38 afgivne udgangssignal vil kunne føres til hastighedsmålekredsløbet 40 til udvælgelse af tidspunktet eller tidspunkterne for samplingen af differentiationskredsløbet 31's udgangssignal. Hertil vil tidsforsinkelseskredslø-35 bet 37 over en ledning 48 kunne afgive et andet udgangssignal, hvis karakteristiske egenskab ændrer på et tidspunkt t^ efter tidspunktet t£, men før tidspunktet t3- Som det ses i fig. 5, ville dette udgangssignal på ledningen 48 spærre differentiationskredsløbet 31 i tidsrummet fra tidspunktet t^ til tidspunktet t3 og dermed forhindre, at 150805 13 differentiationskredsløbet 31 forstyrres af det store spring i ledningsevnen i tidspunktet tSisnart dette spring henholdsvis indsvingningerne er aftaget, tillader udgangssignalet på ledningen 48 at differentiationskredsløbet 31 træder i funktion, således at dettes udgangssig-5 nal stiger langs kurven 49, indtil det når det aktuelle ved den stiplede kurve 17 viste signalniveau og derefter falder med reaktionshastigheden. Skønt det er muligt at lade differentiationskredsløbet 31 træde i funktion på tidspunket t4, er det dog stadig ønskeligt at vente med målingen af differentiationskredsløbet 3‘s udgangssignal, 10 indtil tidspunktet tg, således at de nævnte forstyrrende virkninger når at forsvinde. Derfor føres tidsforsinkelseskredsløbet 37's udgangssignal over ledningen 38 til hastighedsmålekredsløbet 40, der derved først aktiveres i tidspunktet tg. Hastighedsmålekredsløbet 40 måler den øjeblikkelige værdi 50 af differentiatorkredsløbet 31's udgangssig-15 naf på tidspunktet tg. Dette signal føres over kontakten 28 til aflæsningsinstrumentet 30. Ifølge en anden udførelsesform og som vist i fig. 6 bestemmer hastighedsmålekredsløbet 40 værdien 51 af signalet på ledningen 32 på et forudbestemt tidspunktet tg, der ikke nødvendigvis behøver at falde sammen med det tilsyneladende maksimum af 20 ændringshastigheden.

Ved hjælp af den foreliggende opfindelse opnås et enkelt og hensigtsmæssigt apparat, med hvilket der hurtigt kan opnås kvantitative bestemmelser af biologiske prøver. Analyseapparatet ifølge opfindelsen er baseret på måling af sande øjebliksværdier for reaktionsha-25 stigheden på et meget tidligt stadium af denne, inden der er forbrugt en væsentlig andel af reaktanterne. Da denne hastighedsmåling opnås inden for et forholdsvis kort tidsinterval, spares der analysetid, således at der kan gennemføres et større antal analyser i det samme tidsrum. Den til grund for målingen liggende reaktion er en tilnærmel-30 sesvis eksponentiel ændring af ledningsevnen som vist i fig. 1 og 3 med en typisk tidskonstant på 20 sekunder. Dette er i direkte modsætning til den fra USA patentbeskrivelsen nr. 3.421.982 kendte teknik, ved hvilken der anvendes en så lille mængde reagens, at reaktionen forløber meget langsomt og kan anses at være tilnærmelses-35 vis lineær.

Ved gennemførelsen af en ledningsevnemåling som den foreliggende skal der tages hensyn til yderligere en faktor. Ved enzymreaktioner pufres reagenset sædvanligvis med salte, der har en stor ledningsevne, således at opløsningens pH-værdi forbliver forholds- 150805 14 vis konstant under reaktionen. Herved opnås, at reaktionen kan fortsætte med sin maksimale hastighed. Ved den til grund for opfindelsen liggende målemetode ville dette naturligvis være uheldigt, idet det netop er ønskeligt, at opløsningens ledningsevne skal kunne 5 ændre sig, idet denne ændring og hastigheden af denne måles til bestemmelsen af koncentrationen af en af reaktionsdeltagerne. Ifølge den foreliggende opfindelse gås der derfor ud fra stort set rent urease opløst i vand på et svagt saltpræparat med en forholdsvis lav begyndelsesledningsevne. Før prøven indføres, er ledningsevnen 10 som vist i fig. 3 typisk ca. 20-25% af slutledningen Cg. Som allerede nævnt er koncentrationen af enzymreagenset valgt forholdsvis stor i forhold til den sædvanlige koncentration af enzym. Når prøven indføres på tidspunktet t2, springer ledningsevnen til d.v.s. til en værdi, der ligger nær ca. 80% af slutledningsevnen Cg. Naturligvis 15 kan værdien af reagensets begyndelsesledningsevne C^ ligge inden for et bredt område, idet der under ammoniumcarbonatdannelsen stadig sker en ændring af ledningsevnen. Som følge af den med målingen af en lille ændring i et stort signal forbundne vanskelighed er det imidlertid ønskeligt at holde begyndelseskoncentrationen så lille som '· 20 muligt.

Ved hjælp af den foreliggende opfindelse er der således opnået et apparat til kemisk analyse, der ikke blot løser de samme problemer som det fra det tyske offentliggørelsesskrift nr. 2.054.012 kendte apparat, men derudover også kan anvendes i forbindelse med 25 langt flere enzymreaktioner. Apparatet ifølge opfindelsen muliggør en hurtig bestemmelse af koncentrationen af en bestanddel i en prøve, såsom koncentrationen af bestanddele i biologiske væsker. Det i form af blokdiagrammet 20 anskueliggjorte apparat kan hurtigt opstilles og klargøres til hurtig og nøjagtig gennemførelse af kvantitative bestem-30 melser af sand koncentration under anvendelse af små prøvemængder.

Apparat ifølge opfindelsen er ligesom det fra det tyske offentliggørelsesskrift nr. 2.054.012 kendte apparat baseret på måling af sande øjebliksværdier af reaktionshastigheden på et meget tidligt stadium af reaktionen, inden reaktanten er forbrugt og under en 35 ikke-lineær del af reaktionen. Sammenlignet med det fra det nævnte tyske offentliggørelsesskrift kendte apparat er apparatet ifølge opfindelsen desuden baseret på den erkendelse, at indførelsen af en prøve i opløsning med et reagens kan forårsage en øjeblikkelig ændring af den til grund for målingen lagte karakteristiske egenskab ved opløs- 150805 15 ningen. Ved apparatet ifølge den foreliggende opfindelse undertrykkes derfor målingen af ændringshastighedssignalet i et forudbestemt fast tidsinterval, der begynder med indføringen af prøven i reagenset og er af en tilstrækkelig længde til, at virkningen af den øjeblikkelige 5 ændring \ opløsningen kan nå at fortage sig, og der samtidig kan ske en grundig blanding af prøven med reagenset. Umiddelbart efter afslutningen af det faste tidsinterval sker målingen af en værdi af ændringshastigheden af reaktionen.

Claims (4)

150805 Patentkrav.

1. Kemisk analyseapparat til bestemmelse af koncentrationen af en bestanddel i en prøve, hvor prøven efter at være blevet indført 5 i opløsning med et reagens reagerer med dette, idet reaktionsgraden og reaktionshastigheden er indikativ for koncentrationen af bestanddelen i prøven, hvilket apparat omfatter føleorganer til måling af en karakteristisk egenskab ved opløsningen eller ved en bestanddel af opløsningen eller ved et produkt dannet ved reaktionen og til frem-10 bringelse af et første med denne karakteristiske egenskab proportionalt elektrisk signal, et differentiations kredsløb til frembringelse af et andet elektrisk signal, som er proportionalt med den tidsafledede af det første signal, hvilket tidsafledede signal er indikativt for koncentrationen af den nævnte bestanddel i prøven, samt organer til måling 15 af størrelsen af det tidsafledede signal, kendetegnet ved, at måleorganerne til måling af størrelsen af det tidsafledede signal (32) omfatter et tidsforsinkelseskredsløb (37), der aktiveres ved en pludselig ændring i det første signal (26) og automatisk frembringer et elektrisk styre- eller spærresignal (38), hvis karakteristik ændrer 20 sig efter et forudbestemt fast tidsinterval (t3-t2), samt organer (40), der er indrettede til i afhængighed af det tidsafledede signal (32) og af ændringen i karakteristikken for det elektriske styre- eller spærresignal (38) at bestemme den øjeblikkelige værdi af det tidsafledede signal (32).

2. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved et følekredsløb (35), som får tilført det første elektriske signal (26), og er indrettet til i afhængighed af værdien af dette ved en pludselig ændring af det første signal (26) ved indføringen af prøven i reagenset at afgive et udgangssignal, som aktiverer tidsforsinkelseskreds-30 løbet (37).

3. Apparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at differentiationskredsløbet (31) får tilført det elektriske styreeller spærresignal (38) for at spærre eller undertrykke det tidsafledede signal (32) i det forudbestemte faste tidsinterval (t3~t2).

4. Apparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at de nævnte på det tidsafledede signal (32) reagerende organer (40) for at spærre for eller undertrykke bestemmelsen af den øjeblikke værdi af det tidsafledede signal (32) i det forudbestemte faste tidsinterval (t3~t2) får tilført det elektriske styre- eller spærresignal