DK150618B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af somatostatinanaloge eller farmaceutisk acceptable salte deraf - Google Patents

Description

150518

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til . fremstilling af hidtil ukendte somatostatinanaloge eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

Det er blevet påvist, jf. Brazeau et al., Science, 179, 77 (1973), at den cycliske somatotropin-frigørelsesinhiberingsfaktor (SRIF), kendt som somatostatin, har nedenstående struktur

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH S--—S

(A) hvor alle aminosyrerne har "naturlig" eller L-konfiguration.· 2 150518

Adskillige metoder til fremstilling af somatostatin er beskrevet i litteraturen indbefattende faststoffasemetoden ifølge Rivier, J. Am. Chem. Soc., 96_, 2986 (1974),, og opløsningsmetoderne ifølge Sarantakis et al., Biochemical Biophysical Research Communications, _54, 234, (1973) og Immer et al-, Helv. Chim. Acta., Sl_, 730 (1974), og der forskes meget inden for peptidområdet med henblik på at forbedre soma-tostatins farmakologiske virkning ved syntetisk modifikation af dets struktur.

Den reducerede form (åben kædeform) af somatostatin (RS) er det lineære tetradecapeptid med formlen

SH SH

I {

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

(B)

Den reducerede form (B) er blevet fremstillet ved totalsyntese, jf. Rivier et al., C.R. Acad. Sci. Ser. p. Sci. Natur (Paris), 276, 2737 (1973) og Sarantakis and McKinley, Biochem. and Biophys. Res. Communications, 54, 234 (1973), og denne form (B) kan omdannes til somatostatin (A) ved oxidation, hvorved der dannes en tværbinding imellem de to sulfhydrylgrupper i de to cysteinylaminosyrerester i tetradecapeptidet.

Mange polypeptider, som kan anses for at være strukturelle modifikationer af somatostatin, kan fremstilles syntetisk og er beskrevet i den kemiske litteratur. Sådanne polypeptider har visse strukturelle træk til fælles med somatostatin og adskiller sig fra somatostatin ved, at specifikke aminosyrerester eller funktionelle grupper, som oprindeligt var til stede i somatostatinmolekylet, enten mangler eller er erstattet af andre aminosyrerester eller funktionelle grupper. .

Således angår dansk patentansøgning nr. 3515/76 såvel som en tilsvarende artikel i Biochemical and Biophysical Res. Commun. bind 65,

O

nr. 2 (1975), side 746-751, D-Trp -Somatostatin og dens virkningsforøgelse i forhold til somatostatin under forskellige afprøvningsbetingelser, navnlig i henseende til modstandsdygtighed mod enzymatisk nedbrydning.

Dansk patentansøgning nr. 885/76 angår en bred mangfoldighed af N-terminerede og C-terminerede modifikationer af somatostatin og giver ikke udtryk for videre kritiske forhold, for såvidt angår strukturen i disse endestillinger.

3 150618

Det har dog efterhånden vist sig, at mange polypeptider, som er endog særdeles nærbeslægtede med somatostatin i strukturel henseende, kan være fuldstændig blottet for somatostatin--agtig aktivitet, se således Rivier et al., Peptides 1976, hvor dette punkt specielt illustreres i tabel III på side 439--440, hvoraf det klart fremgår, at selv meget små ændringer i struktur hyppigt resulterer i udtalte forskelle med hensyn til 5 aktivitet. Dette gælder f.eks. for en forbindelse ([Asp ]-SS), hvori den hydrofobe amidgruppe Asn i somatostatin-stilling er ændret til den hydrofile frie carboxylsyre Asp. Det ses, at denne ændring resulterer i et næsten fuldstændigt tab af aktivitet.

Dansk patentansøgning nr. 1404/75 beskriver eventuelle modifikationer af somatostatin med ornithin i 4- og/eller 9-stillingen og med alanin i 5-stillingen. Ud fra det, som er anført i beskrivelsen til sidstnævnte danske patentansøgning, må det konkluderes, at en hvilken som helst ændring i aktivitet set i forhold til somatostatin må hidrøre fra modifikationen ved molekylets N-termi-nåle stilling, fordi aminosyrerne i 4-, 5- og 9-stillingerne kan være de samme som i somatostatin. I hvert fald anføres det på side 4 i det tilsvarende tyske patentskrift, at peptiderne har nogenlunde samme aktivitetsspektrum som naturligt somatostatin, omend de er kraftigere virkende og har den fordel, at virkningen holder sig længere, idet kun 20-60 vægtprocent er nødvendigt for at opnå samme biologiske aktivitet som med det naturlige peptid.

Hvorledes kraften står i forbindelse med virkningens varighed, fremgår dog ikke tydeligt.

Den foreliggende opfindelse bygger nu på, at visse hidtil u-kendte, syntetiske polypeptider, som kan anses for at være en strukturel modifikation af somatostatin, men afviger fra somatostatin i følgende henseender: 1 2 (a) Ala -Gly -segmentet er fraværende, 4 (b) Lys -resten er erstattet af Arg eller His, 5 (c) Asn -resten er erstattet af His eller Glu og 8 (d) Trp -resten er erstattet af D-trp, har vist sig at være biologisk aktive på en helt særegen måde ved selektivt at sænke niveauet af såvel væksthormon som glucagon i blodet uden at påvirke dets insulinniveau i væsentlig grady når de anvendes i afpassede doser. Hertil kommer, at disse nye somato-statinanaloge udviser overrasksende lang virkningsvarighed.

150618 4 I forhold til somatostatins struktur er det aminosyrerester-ne i 4- og 5-stillingerne, der her er ændret.

Alle de optisk aktive aminosyrerester og aminosyrer har L-kon-figuration, medmindre andet er angivet.

I overensstemmelse hermed tilvejebringer opfindelsen en analogifremgangsmåde til fremstilling af somatostatinanaloge med den almene formel H-Cys-X1-X2-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X4OH i

i I

SA AS

hvori A er hydrogen, eller begge A'er tilsammen repræsenterer en S-S- 12 4

-binding, X betyder His eller Arg, X betyder His eller Glu og X

betyder Cys eller D-Cys, eller farmaceutisk acceptable salte deraf.

Symbolerne, som identificerer aminosyrerne og aminosyre-resterne i de her beskrevne polypeptider, er vedtaget af the IUPAC--IVB Committee on Biochemical Nomenclature Recommendation (1971) og beskrevet i the Archives of Biochemistry and Biophysics, 150, 1-8 (1972).

De fremstillede forbindelser er hvide til svagt gulbrune faste stoffer, som praktisk taget er uopløselige i chloroform, benzen o.lign., men som er opløselige i vand og vandige syreopløsninger, som f.eks. saltsyre og eddikesyre. Smeltepunkterne for de omhandlede stoffer er ikke klart erkendelige, og stofferne kan f.eks. renses ved kromatografiske fremgangsmåder. Ved hydrolyse af de omhandlede stoffer i f.eks. 4-N-methansulfonsyre kan deres ami-nosyreindhold bestemmes, hvilket er i overensstemmelse med de o-venfor angivne strukturer.

De omhandlede forbindelser har farmaceutisk virkning, især ved anvendelsen, som karakteriseres ved inhibering af frigørelsen af et eller flere af hormonerne somatotropin, glucagon og insulin, som påvist ved farmakologiske standardtests. Ved dosisregulering muliggør en virkningsselektivitet inhibering af somatotropin- og glucagonfri-gørelse, uden at endogene insulinsekretionsniveauer påvirkes væsentligt.

De omhandlede forbindelser kan endvidere anvendes i blanding med insulin til behandling af varmblodede dyr, som lider af diabetes melli-tus.

Den Jiu påviste selektive aktivitet samtidig med meget lang vxrkningsvarighed er bemærkelsesværdig, når man betænker, at aktivitetsvarigheden for somatostatin indgivet intravenøst er på ca.

150618 5 15 minutter (idet dets biologiske halvlevetid er under 4 minutter). Derfor må det regnes for en helt overraskende erkendelse når de ovenfor definerede somatostatinanaloge med formlen I har vist sig at være aktive i 2 timer og under visse omstændigheder endda længere. Tilvejebringelsen af sådanne forbindelser er ganske bemærkelsesværdig og frembyder bl.a. den tekniske fordel, at det ikke er nødvendigt at foretage intravenøse infusioner, således som man hidtil har været henvist til at benytte som almen indgivelsesvej med somatostatin for at udnytte dettes kendte aktivitet.

Analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at forbindelser med formlen l' 21 4

X-Cys-X -X -Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X -OR

1 I C · 7 I O I Q I

Sa Rb r' R Ry S3 (II) hvori R betyder en carboxybeskyttelsesgruppe eller en polysty- renharpiksbærer bundet via en methylengruppe, X er H eller en a- 1 ' aminobeskyttelsesgruppe, X betyder

His Arg i2 eller R1 2 3 hvori R betyder en beskyttelsesgruppe for sidekædenitrogenato- 2 merne i argxnin, og R betyder hydrogen eller en beskyttelses- 2' gruppe for imidazolnitrogenatornet i histidin; X betyder

His ' 2

R

2* 2 hvori R har den ovenfor angivne betydning, eller X betyder

Glu R3 4 5 6 3 4 hvor R betyder en beskyttelsesgruppe for sidekædecarboxygruppen 5 i glutaminsyre; R^ betyder en beskyttelsesgruppe for sidekædeami- 6 8 9 nogruppen i lysin, R , R og R hver især betyder beskyttelses- 4 grupper for hydroxylgrupperne i threonin og serin, X er som o-venfor anført, og α og 3 betyder hydrogenatomer, sulfhydrylbe-skyttelsesgrupper eller tilsammen udgør en direkte binding imellem svovlatomerne, befries for alle beskyttelsesgrupper og fjernes fra den eventuelle polystyrenharpiksbærer, om nødvendigt oxideres til dannelse af en direkte S-S-binding, og om nødvendigt produktet isoleres som den frie base eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

150618 6 12 1

Fortrinsvis betyder X og X His, eller X betyder Arg og X2 betyder Glu.

Som eksempler på særligt foretrukne forbindelser, som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan nævnes: H-Cys-Arg-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys-

S-S

-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

H-Cys-His-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys- å—......... f

-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

H-Cys-His-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys—

S--—S

i

-Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys-OH

. H-Cys-Arg-Glu-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH ί *

S________________________________ S

H-Cys-His-Glu-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

k.—..........—-----S

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte udgangsforbindelser for forbindelserne med formlen (I) er hidtil ukendte. Disse forbindelser har formlen 1* 9' Δ X-Cys-X -X —Phe—Phe—D-Trp-Lys—Thr—Phe—Thr—Ser—X -OR n 8a P P P P h hvor R betyder en carboxylbeskyttelsesgruppe (f.eks. alkyl eller aral-alkyl) eller en ved hjælp af en methylengruppe bundet polystyren-

fpolystyren-J

harpiksbærer, (dvs. R betyder en -C^- i harpiks- i,) X betyder nydro- ! bærer i’ 1 i gen eller en α-aminobeskyttelsesgruppe, χ betyder 150518 7 2 3

R i i R

I eller |

His Arg 3 hvor R betyder en beskyttelsesgruppe for sidekædenitrogenatomerne 2 i arginin, og R betyder hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for 2' imidazolnitrogenatomet i histidin, X betyder

His , 12 4 R R4 2 2’ ’ hvori R er som ovenfor anført, eller X betyder Glu.

4 hvor R betyder en beskyttelsesgruppe for sidekædecarboxygruppen g i glutaminsyre, R betyder en beskyttelsesgruppe for sidekæde- . 7 8 9 ammogruppen i lysxn, R , R og R hver især betyder beskyttelsesgrupper for hydroxylgrupperne i threonin og serin, X^ som ovenfor anført, og α og β betyder hydrogenatomer, sulfhydrylbeskyttelses-grupper eller tilsammen udgør en direkte binding imellem svovlatomerne.

Som eksempler på α-aminobeskyttelsesgruppen X kan nævnes (1) acylbeskyttelsesgrupper, som f.eks. formyl, trifluoracetyl, phthalyl, p-toluensulfonyl (tosyl), nitrophenylsulfe-nyl med flere, (2) aromatiske urethanbeskyttelsesgrupper, som f.eks. benzyloxycarbonyl, og substitueret benzyloxycarbonyl, som f.eks. p--chlorbenzyloxycarbonyl og p-nitrobenzyloxycarbonyl, (3) aliphatiske urethanbeskyttelsesgrupper, som f.eks. tert.butyloxycarbonyl, diiso-propylmethoxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2--trichlorethoxycarbonyl og amyloxycarbonyl, (4) cycloalkylurethan-beskyttelsesgrupper, som f.eks. cyclopentyloxycarbonyl, adamantyl-carbonyl og cyclohexyloxycarbonyl, (5) thiourethanbeskyttelsesgrupper, som f.eks. phenylthiocarbonyl, (6) alkylbeskyttelsesgrupper, som f.eks. triphenylmethyl (trityl), og (7) trialkylsilangrupper, som f.eks. trimethylsilan. Som α-aminobeskyttelsesgruppe foretrækkes tert.butyloxycarbonyl.

3

Som eksempler på R kan nævnes nitro, tosyl, benzyloxycarbonyl, 3 adamantyloxycarbonyl eller tert.butyloxycarbonyl. R betyder fortrinsvis tosyl.

Nitro- eller tosylgruppen beskytter enten N**'- eller N^-nitrogen-atomerne i argininet, medens oxycarbonylbeskyttelsesgrupperne beskytter N^- og enten N4*'- eller N^-nitrogenatomerne.

2

Som eksempler på R kan nævnes tosyl, benzyloxycarbonyl, adaman- 2 8 150818 tyloxycarbonyl og tert.butyloxycarbonyl. R betyder fortrinsvis tosyl.

g

Sidekædeaminogruppen i lysin beskyttes ved hjælp af R , som f.eks. kan være tosyl, tert.amyloxycarbonyl, tert.butyloxycarbonyl, diisopropyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, halogenbenzyloxycarbonyl, nitrobenzyloxycarbonyl o.lign., fortrinsvis 2-chlorbenzyloxycarbonyl.

Som eksempler på beskyttelsesgrupper R , R og R for hydroxyl-gruppen i threonin og serin kan nævnes acetyl, benzoyl, tert.butyl og fortrinsvis benzyl.

4

Som eksempler på R kan nævnes benzyl og tert.butyl.

Som eksempler på a- og β-beskyttelsesgrupper for sulfhydryl-grupperne i cysteinylaminosyreresterne kan nævnes benzyl, substitueret benzyl, hvor substituenten er mindst en af grupperne methyl, methoxy, nitro eller halogen (f.eks. 3,4-dimethylbenzyl, p-methoxybenzyl, p-chlorbenzyl, p-nitrobenzyl med flere), trityl, benzyloxycarbonyl, benzhydryl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, benzylthiomethyl, ethylcarba-moyl, thioethyl, tetrahydropyranyl, acetamidomethyl, benzoyl, s-sulfonsalt med flere. p-Methoxybenzylgruppen foretrækkes.

Forbindelserne med formlen (I) fremstilles således ved fjernelse af alle beskyttelsesgrupperne og polystyrenharpiksbæreren, når den er til stede, fra en forbindelse med formlen (II) med den ovenfor angivne definition. Produktet oxideres om nødvendigt til dannelse af en direkte S-S-binding, så man får den cycliske kædeform, og isoleres om nødvendigt som den frie base eller som et farmakologisk acceptabelt salt.

Fjernelsen af beskyttelsesgrupperne kan gennemføres på de for de respektive beskyttelsesgrupper kendte måder. Fortrinsvis fjernes beskyttelsesgrupperne i ét enkelt trin, f.eks. ved anvendelse af hydrogenfluorid i nærværelse af anisol.

Polystyrenharpiksbæreren kan fraspaltes samtidigt med fjernelsen af beskyttelsesgrupperne, f.eks. ved anvendelse af hydrogenfluorid i nærværelse af anisol, eller den kan fraspaltes ved transesterifikation, hvorved der fås et carboxylbeskyttet mellemprodukt med formlen (II), hvor R er en esterfunktion. F.eks. tilvejebringes ved methanolyse et methylestermellemprodukt med formlen (II), hvor R betyder methyl.

Ved hydrolyse af sådanne estere tilvejebringes den nødvendige C-ende-stillede carboxylfunktion.

Ved passende valg af beskyttelsesgrupper kan a- og β-beskyttel-sesgrupperne fjernes selektivt fra forbindelserne med formlen (II), hvorved fås de frie disulfhydrylderivater med formlen (II), hvor α og β 9 150518 betyder hydrogen. Når a og β betyder trityl eller acetamido, kan de f.eks. fjernes selektivt ved indvirkning af et merkuri- eller sølvsalt, hvorved fås det tilsvarende disulfhydrylderivat i form af dets tilsvarende merkuri- eller disølvsalt. Sidstnævnte salt kan underkastes virkningen af hydrogensulfid til dannelse af det tilsvarende frie disulfhydrylderivat med formlen (II).

Det frie disulfhydrylderivat med formlen (II) kan især cy-cliseres ved oxidation ved anvendelse af et oxidationsmiddel, som f.eks. iod, oxygen (f.eks. luft), 1,2-diiodoethan eller natriumeller kaliumferricyanid, til dannelse af dentilsvarende forbindelse med formlen (I), hvori A-A er en direkte S-S-binding.

De nødvendige mellemprodukter kan fremstilles ved den kendte faststoffasemetode, jf. f.eks. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 8j5, 2149 (1963), eller ved klassisk syntese. Til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringes således forbindelser med formlen (II) , hvor α og β er beskyttelsesgrupper, og R betyder en polystyrenharpiksbærer, hvorved de nødvendige, passende beskyttede og/eller aktiverede aminosyrer kobles fortløbende under faststoffasesyntesebetingelser til en chlormethyleret eller hydroxymethylharpiksbærer. Alternativt kan forbindelserne med formlen (II), hvor α og β er beskyttelsesgrupper, og R er en carboxylbeskyttelsesgruppe, fremstilles ved kobling af de nødvendige passende beskyttede og/eller aktiverede aminosyrer eller peptiddele på de til dannelse af peptidbindinger kendte måder til dannelse af den tilsigtede sekvens af amionsyrer. α- og β-beskyt-telsesgrupperne kan derpå fjernes selektivt, og produktet kan oxideres, hvorved fås det cycliske disulfid med formlen (II), hvor α og β danner en direkte binding.

Ved valg af en bestemt sidekædebeskyttelsesgruppe, som skal anvendes til fremstilling af de omhandlede peptider, bør følgende retningslinjer overholdes: (a) sidekædebeskyttelsesgruppen skal være stabil over for reagenset og under reaktionsbetingelserne valgt til fjernelse af α-aminobeskyttelsesgruppen i hvert fremstillingstrin, (b) beskyttelsesgruppen skal bibeholde dens beskyttende egenskaber (dvs. ikke fraspaltes under koblingsbetingelser), og (c) sidekædebeskyttelsesgruppen skal kunne fjernes ved syntesens afslutning under reaktionsbetingelser, som ikke forandrer peptidkæden.

Udgangsforbindelserne kan fremstilles efter i og for sig kendte metoder, hvorved man 150618 ίο oparbejder det tilsigtede peptid ved kondensation af aminosyrer eller peptiddele, som om nødvendigt beskyttes. Kondensationsreaktionerne kan gennemføres ved anvendelse af de inden for peptid-og penicillinkemien alment kendte metoder til dannelse af peptidbindinger. Med henblik på at fremme kondensationen af aminosyrerne anvendes fortrinsvis et kondensationsmiddel. Som eksempler på kondensationsmidler kan nævnes carbodiimider, som f.eks. N,N'-dicyclohexylcarbodi-imid (DCC) og N,N'-diisopropylcarbodiimid. Alternativt kan kondensationen gennemføres ved aktivering af én eller begge endestillede grupper. Som eksempler på en aktiveret form af endestillet carboxyl kan nævnes syrechloridet, anhydridet, azidet eller den aktiverede ester. Det vil være indlysende for en fagmand, at den foreslåede metode til gennemførelse af kondensationsreaktionerne bør være forenelig med beskyttelsesgrupperne i aminosyrerne.

Ovennævnte kendte metode· til oparbejdning af molekylet kan i princippet belyses ved kondensering af fortrinsvis et beskyttet peptid med formlen

X-Cys-X1-X2-Phe-OH

Sa (Via) med et beskyttet peptid med formlen 4

H-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X -OR

IC in i o IQ I

Rb R Ra Ry S3 hvor R betyder en carboxybeskyttelsesgruppe (fortrinsvis benzyl), X, R6, R2, R8, r9, X1, X2 og X4 har de ovennævnte betydninger, og α og β betyder beskyttelsesgrupper, fortrinsvis p-methoxybenzyl, hvorved fås en forbindelse med formlen (II), som derpå befries for beskyttelse og om ønsket cycliseres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Når faststoffasemetoden anvendes på de omhandlede forbindelser kobles α-amino- og sulfhydryl-beskyttet cystein først til en chlor-methyleret polystyrenharpiks, hvorpå α-aminobeskyttelsesgruppen fjernes med trifluoreddikesyre i methylenchlorid, trifluoreddikesyre alene eller HC1 i dioxan. Fjernelsen af α-aminobeskyttelsesgruppen gennemføres ved en temperatur på mellem 0°C og stuetemperatur. Andre standard-fraspaltningsreagenser og betingelser til fjernelse af specifikke a-aminobeskyttelsesgrupper kan anvendes, jf. Schroder and Lubke, "The Peptides", 1, side 72-75 (Academic Press, 1965). Når a-amino-beskyttelsesgruppen er fjernet, kobles de næste tilsigtede beskyttede 150618 11 aminosyrer individuelt til den harpiksbårne sekvens i rækkefølge. Alternativt kan der fremstilles små peptidfragmenter, f.eks. ved opløsningsmetoden, som kan sættes til en faststoffase-reaktor i den ønskede rækkefølge. Den individuelle beskyttede aminosyre eller aminosyresekvens sættes til faststoffase-reaktoren i et omtrentligt firedobbelt overskud. Koblingen gennemføres i dimethylformamid, methylenchlorid eller en blanding af de to opløsningsmidler. Udfaldet af hver koblingsreaktion i hvert trin i syntesen bestemmes ved hjælp af ninhydrinreaktionen, jf. E. Kaiser et al.,

Analyt. Biochem., 2Λ, 595 (1970). I tilfælde af ufuldstændig kobling, gentages reaktionen, før α-aminobeskyttelsesgruppen fjernes til indføring af den næste aminosyre eller aminosyresekvens.

De foretrukne koblingsreagenser er 1-hydroxybenzotriazol og diisopropylcarbodiimid. Andre sådanne reagenser vil være kendte for en fagmand.

Når den tilsigtede aminosyresekvens er fremstillet, fjernes polypeptidet fra harpiksbæreren ved behandling med f.eks. hydrogenfluorid og anisol, hvorved fås det ikke længere på nogen måde beskyttede lineære polypeptid. Det cycliske disulfid kan om ønsket fremstilles, f.eks. ved luftoxidation eller ved oxidation med K^FeiCNjg.

Ikke giftige additionssalte af de lineære og cycliske polypep-tider fremstilles ved de inden for teknikken kendte metoder ud fra saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre, phosphorsyre, polyphosphor-syre, maleinsyre, eddikesyre, citronsyre, benzoesyre, ravsyre, malon-syre eller ascorbinsyre o.lign. Eddikesyresaltet foretrækkes.

De under hele faststoffasefremstillingen anvendte beskyttelsesgrupper er kendte inden for teknikken. a-Aminobeskyttelsesgrupperne anvendt med hver aminosyre indført i sekvensen af det endelige polypeptid er (1) acylbeskyttelsesgrupper, som f.eks. formyl, trifluor-acetyl, phthalyl, p-toluensulfonyl (tosyl), nitrophenylsulfenyl o.lign., (2) aromatiske urethanbeskyttelsesgrupper, som f.eks. benzyl-oxycarbonyl, og substitueret benzyloxycarbonyl, som f.eks. p-chlor-benzyloxycarbonyl og p-nitrobenzyloxycarbonyl, (3) aliphatiske urethanbeskyttelsesgrupper, som f.eks. tert.butyloxycarbony1, diisopropyl-methoxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-tri-chlorethoxycarbonyl og amyloxycarbonyl, (4) cycloalkylurethanbeskyt-telsesgrupper, som f.eks. cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbo-nyl og cyclohexyloxycarbonyl, (5) thiourethanbeskyttelsesgrupper, som f.eks. phenylthiocarbonyl, (6) alkylbeskyttelsesgrupper, som f.eks. triphenylmethyl (trityl) og (7) trialkylsilangrupper, som f.eks. tri- 12 150613 methylsilan. Den foretrukne α-atoinobeskyttelsesgruppe er tert.butyl-oxycarbonyl.

De fremstillede forbindelser kan forekomme i den monomere cycliske form (også betegnet den "oxiderede" form), dvs. A-for-men hvor der er en enkeltbinding imellem svovlatomerne på de to

Cys-aminosyreester, eller de kan forekomme i den lineære B-form, hvori A betegner hydrogenatomer, dvs. den reducerede form.

På grund af de fremstillede somatostatinanaloges farmakologiske virkning, kan de anvendes ved behandlingen af akromegali og diabetes på samme måde som det er tilfældet for somatostatin selv. Peptiderne kan indgives på den for somatostatin og beslægtede polypeptider gængse måde under vejledning af en læge i en mængde, som retter sig efter dysfunktionens omfang konstateret af lægen. Forbindelserne kan indgives alene eller sammen med konventionelle farmaceutisk acceptabel bærere og hjælpestoffer i enhedsdosisform.

Som tidligere anført er de fremstillede forbindelser også anvendelige i blanding med insulin til behandling af varmblodede dyr, som lider af diabetes mellitus, jf. f.eks. beskrivelsen til US patent nr. 3.912.807, hvori er beskrevet anvendelsen af en effektiv mængde af et præparat indeholdende somatostatin blandet med insulin, til behandling af et varmblodet dyr, som lider af diabetes mellitus.

Når forbindelserne anvendes terapeutisk som midler til behandling af akromegali, juvenil diabetes og diabetes mellitus, påbegyndes behandlingen med små doser, som er mindre end den optimale dosis af forbindelsen. Derefter forøges dosis langsomt, indtil den under omstændighederne optimale virkning er opnået. Generelt indgives de fremstillede somatostatinanaloge i sådanne mængder, som sædvanligvis vil tilvejebringe effektive resultater u-den at forårsage skadelige eller ødelæggende bivirkninger. Dosis kan imidlertid varieres alt afhængigt af patientens behov og den anvendte forbindelse. For nemheds skyld kan den samlede dagdosis eventuelt deles og indgives portionsvis i løbet af dagen.

I overensstemmelse hermed bringes et sådant farmaceutisk præparat bestående af en forbindelse med formlen (I) eller et farmakologisk acceptabelt salt deraf i kombination med en farmakologisk acceptabel bærer fortrinsvis på enhedsdosisform.

Analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nær- 150618 13 mere i nedenstående eksempler, hvori benyttes følgende forkortelser for beskyttelsesgrupper, opløsningsmidler m.v.

Boc = tert.butyloxycarbonyl C^Bzl = dichlorbenzyl C1Z = 2-chlorbenzyloxycarbonyl Tos = tosyl(p-toluensulfonyl) TFA = trifluoreddikesyre EDT = 1,2-ethandithiol DMF = dimethylformamid TEA = triethylamin

AcOH = eddikesyre

EtOAc = ethylacetat n-BuOH = n-butanol NEt^ = triethylamin DIC = diisopropylcarbondiimid HF = hydrogenfluorid NH^OAc = ammoniumacetat 14 150618

Eksempel 1

Tert.-butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-Nim-tosyl-L--histidyl-Nim-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryp-tophyl-Nf-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L--phenylalanyl-O-benzyl-L—threonyl-0-benzyl-L-seryl-S“p-methoxybenzyl- 2L2cγsteinγl·2ίiZÉE22Σ2®ίίϊΣlE°iΣ£^Σ££2__

Chlormethyleret polystyrenharpiks (Lab Systems, Inc.), der er 1% tværbundet med divinylbenzen, esterificeres med BOC-Cys(SMBzl)OH i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Gisin, Helv. Chim. Acta., 56, 1976 (1973). Polystyrenharpiksesteren behandles ifølge nedenstående forskrift A til inkorporering af BOC-Ser(Bzl)OH, BOC-Thr(Bzl)OH, BOC-Phe-OH, BOC-Thr(Bzl)OH, BOC-Lys(Clz)OH, BOC-D-Trp-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-His(Tos)OH, BOC-His(Tos)OH og BOC-Cys(SMBzl)OH, hvorved fås den ønskede peptidoharpiks.

Forskrift A

1. Vaskning med 3 x CH2C12.

2. Behandling med TFA:CH2C12:EDT (1:1:5% , efter rumfang/rumfang) i 5 minutter. Å 3. Behandling som i trin 2 i 25 minutter.

4. Vaskning med 3 x CH2C12.

5. Vaskning med DMF.

6. Behandling med 12%' s TEA i DMF to gange i 3 minutter.

7. Vaskning med DMF.

8. Vaskning med 3 x CH2C12.

9. Behandling med 4 ækvivalenter af det tilsvarende aminosyrederivat i CH2C12:DMF og omrøring i 5 minutter.

10. Tilsætning i to portioner af 5 ækvivalenter DIC opløst i CH2C12 i løbet af 30 minutter. Reaktionstid = 6 timer.

11. Vaskning med 3 x DMF.

12. Vaskning med 3 x CH2C12- 13. Gennemførelse af ninhydrinreaktionen i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Kaiser et al., Annal. Biochem., 34 595 (1970).

I tilfælde af ufuldstændig reaktion gentages ovennævnte trin 9-13.

Eksempel 2 15 150618 L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D--tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L--cysteln-cyclisk (1-12) disulfid_ 9 g af peptidoharpiksen fremstillet ved den i eksempel 1 angivne fremgangsmåde blandes med 18 mg anisol og behandles med 180 ml flydende HF i 45 minutter i isbad. Overskydende HF fjernes i vakuum så hurtigt som muligt (ca. 1 time), og remanensen ekstraheres med afluftet 2M iseddike, hvorpå den filtreres. Filtratet vaskes med ether, og det vandige lag oxideres med K^FeiCNjg ved en pH-værdi på 7. Overskuddet af oxidationsmidlet fjernes ved hjælp af en "Bio Rad'^*AG-3-ionbytter-harpiks, hvorpå peptidet absorberes på en "Bio Rex "^-70-ionby tterharpiks og elueres med en pyridinpuffer med en pH-værdi på 7, og efter lyofili- sation fås 1,5 g materiale. Dette materiale sættes til en ,,Sephadex,,vsy G-15-søjle (2,5 x 160 cm) og elueres med 15%'s vandig eddikesyre. Fraktionerne (hver 5,2 ml) i rør 88-90 hældes sammen og lyofiliseres, hvorved fås den ønskede forbindelse i en mængde på 174 mg.

Rf (BWA, 4:1:1) 0,45

Rf (BWAP, 30:24:6:20) 0,64

Aminosyreanalyse: Thr(2) 1,87, Ser(l) 0,89, Cys(2) 1,16, Phe(3) 3,

Lys(1) 1,05, His(2) 1,76, Trp ej bestemt.

Eksempel 3

Den farmakologiske virkning in vivo for dodecapeptidet fremstillet ved den i eksempel 2 angivne fremgangsmåde påvises som beskrevet nedenfor med de anførte resultater.

Undertrykkelse af væksthormon

En subcutan (s.c.) injektion af peptid opløseliggjort eller suspenderet i fysiologisk saltopløsning gives til "Charles River" CD hanrotter, som ikke har fastet. Rotter, som tilsvarende har fået en s.c. injektion af en kontrolsaltopløsning, tjener som kontroldyr, således at hver forsøgsrotte sammenlignes med en kontrolrotte. Rotterne holdes i separate bure, og 20 minutter før forsøgsperiodens ophør giver man dem en intraperitoneal (i.p.) injektion "Nembutal"®i en dosis på 50 mg/-kcr. Blodprøver fås ved cardialounktur, οσ olasmaet isoleres til radio- 150618 16 på 2 og 4 timer efter injektion anvendes til at undersøge varigheden af peptidets evne til at undertrykke cirkulerende perifere VH-niveauer. VH-Værdier for kontrol og forsøg sammenlignes hver gang og bedømmes ifølge the Student "t"-test, og den statistiske signifikans (p) ved niveauet 0,05 eller derunder anvendes som virkningsindeks.

Forbindelse (dosis) 2 Timer 4 Timer

Kontrol 118 + 20 115 + 23

Forbindelse iflg. eksmpl. 2 32+6 62+13 (1 mg/kg) p = <0,01 p =^0,01

Undertrykkelse af væksthormon, glucagon og insulin.

Albino-hanrotter fordeles i tre grupper (9 rotter/gruppe) og injiceres i.p. med 50 mg/kg "Nembutal" Efter 15 minutter injiceres de s.c. afhængigt af deres gruppe med (a) testforbindelsen, typisk 10-2000 pg/kg, (b) SRIF 200 }ig/kg eller (c) fysiologisk saltopløsning. Efter 10 minutter injiceres 0,5 ml arginin (300 mg/ml, pH = 7,2) ind i hjertet på dyrene. Fem minutter efter arginininjektionen skæres hovederne af rotterne, og blodet opsamles i trasylol-EDTA. Passende alikvo-ter undersøges derpå for væksthormon, glucagon og insulin. En aktiv forbindelse er en forbindelse, som forandrer plasmaniveauet betydeligt for et vilkårligt af disse hormoner i forhold til plasmaniveauet for saltopløsningskontrollerne. Sammenligninger imellem kontrol-og forsøgsværdier foretages ved statistisk bedømmelse ved variansanalyse, og den statistiske signifikans (p) ved 0,05 eller derunder anvendes som virkningsindeks.

Forbindelse Insulin Glucagon (dosis ytg/kq) VH (ng/ml) (pl/ml) pg/ml

Kontrol (fysiologisk saltvand) 163 + 29 278 +32 69 + 13

Forbindelse iflg.

éksmpl. 2 (100^ug/kg) 20 + 8 202 + 49 20 + 8 p=<0,01 p = <0,05 p=<0,01

Eksempel 4 17 150618

Tert.-butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^-tosyl-L--arginyl-Nim-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryp-tophyl-N^-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L--phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl--L-cysteinyl-hydroxymethyl-polystyrenester_

Chlormethyleret polystyrenharpiks (Lab Systems, Inc.), der er 1% tværbundet med divinylbenzen, esterificeres med Boc-Cys(SMBzl)--OH i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Gisin, Helv. Chim. Acta., 56, 1976 (1973). Polystyrenharpiksesteren behandles ifølge forskrift A til inkorporering af Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys(C1Z)-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe--OH, Boc-Phe-OH, Boc-His(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH og Boc-Cys(SMBzl)--OH, hvorved fås den ønskede peptidoharpiks.

Forskrift A

1. Vaskning med 3 x CH2CI2· 2. Behandling med TFA: : EDT (1:1:5%, r/r) i 5 minutter.

3. Behandling som i trin 2 i 25 minutter.

4. Vaskning med 3 x C^C^.

5. Vaskning med DMF.

6. Behandling med 12%'s TEA i DMF to gange i 3 minutter.

7. Vaskning med DMF.

8. Vaskning med 3 x C^C^· 9. Behandling med 4 ækvivalenter af det tilsvarende aminosyrederivat i C^C^iDMF og omrøring i 5 minutter.

10. Tilsætning i to portioner af 5 ækvivalenter DIC opløst i i løbet af 30 minutter. Reaktionstid = 6 timer.

11. Vaskning med 3 x DMF.

12. Vaskning med 3 x 13. Gennemførelse af ninhydrinreaktionen i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595 (1970). I tilfælde af ufuldstændig reaktion gentages trinene 9-13.

18 150618

Eksempel 5 L-Cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L—threonyl-L-seryl-L--cystein-cyclisk (1-12) disulfid_ 8,5 g af peptidoharpiksen fremstillet yed den i eksempel 4 angivne fremgangsmåde blandes med 16 ml anisol og behandles med 100 ml flydende HF i 45 minutter. Overskydende HF fjernes i vakuum så hurtigt som muligt, og remanensen optages i 25%'s vandig eddikesyre. Polymerbæreren frafiltreres, og filtratet vaskes med ether. Det vandige lag hældes i 3,5 liter vand, pH-værdien indstilles med NH^OH på 7, hvorpå sulfhydrylforbindelsen oxideres med K^Fe (CN)g. pH-Værdien indstilles på 5 med iseddike, og det uorganiske oxidationsmiddel fjernes med "Bio Rad" AG 3. Peptidmaterialet absorberes på "Bio Rex"® 70 og elueres med en pyridinpuffer med en pH-værdi på 7, hvorved fås 2 g af den rå forbindelse. Dette materiale ledes igennem en "Sephadex"-G-15-søjle (2,5 x 160 cm) og elueres med 15%'s vandig eddikesyre. 886 mg' af dette materiale i fraktioner 47 til 93 (hver fraktion = 5,2 ml) sættes til en CM-"Sephadex" ®G-25-søjle og elueres med en trinvis NH4OAc-gradient (0,1 til 0,3 molært NH^OAc), hvorved fås den ønskede forbindelse. Dette materiale sættes til en "Sephadex"®,LH-20-søjle (2,5 x 92 cm) og elueres med 10%*s vandig eddikesyre. Den rene ønskede forbindelse fremkommer i fraktioner 55 til 63 (hver fraktion = 4,1 ml) i en mængde på 159 mg.

Rf (BWA, 4:1:1) 0,46

Rf (BWAP, 30:24:6:20) 0,65

Aminosyreanalyse: Thr (2) 1,94, Ser (1) 0,91, Cys (2) 1,79,

Phe (3) 3, His (1) 1,02, Lys (1) 0,85,

Arg (1) 0,95, Trp ej bestemt.

Eksempel 6

Den farmakologiske virkning in vivo for den ønskede forbindelse fremstillet ved den i eksempel 5 angivne fremgangsmåde påvises som beskrevet nedenfor med de anførte resultater:

Undertrykkelse af væksthormon, glucagon og insulin.

Albino-hanrotter fordeles i to grupper (9 rotter/gruppe) og injiceres i.p. med 50 mg/kg "Nembutal"®. Efter 15 minutter injiceres 150618 19 rotterne s.c. afhængigt af deres gruppe med testforbindelsen eller fysiologisk saltopløsning. Efter 10 minutter injiceres 0,5 ml arginin (300 mg/ml, pH = 7,2) ind i hjertet. Rotternes hoveder skæres af 5 minutter efter arginininjektionen, og blodet opsamles i trasylol-EDTA. Passende alikvoter undersøges derpå for væksthormon (VII) , glucagon (GLUN) og insulin (INS). En aktiv forbindelse er en forbindelse, som forandrer plasmaniveauet betydeligt for et vilkårligt af disse hormoner i forhold til plasmaniveauet for saltopløsningskontrollerne. Sammenligninger imellem kontrol- og forsøgsværdier foretages ved statistisk bedømmelse ved var.iansanalyse, og den statistiske signifikans (p) ved 0,05 eller derunder anvendes som virkningsindeks.

Resultater

Dosis VH INS GLUN

Forsøg pg/kg ng/ml μI/ml pg/ml

Kontrol --- 257 + 49 177 +19 61+9 (saltvand) ^ 6]_ ± 5* 52 ± 16* 0 + 0* 2 (saltvand) 131 ± 43 262 ± 26 42+6

10 71 + 21* 238+72 4 + 3X

x p =<0,01

Eksempel 7

Tert.-butyloxy-carbony1-S-p-methoxybenzy1-L-cysteinyl-Nim-tosyl-L--histidyl-N^-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryp-tophyl-£-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L--phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl--D-cysteinyl-hydroxymethyl-polystyrenester_

Chlormethyleret polystyrenharpiks (Lab Systems, Inc.), der er 1% tværbundet med divinylbenzen, esterificeres med Boc-D-Cys(SMBzl)OH i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Gisin, Helv. Chim. Acta, 56 1976 (1973). Polystyrenharpiksen behandles i overensstemmelse med forskrift A, jfr. eks. 1 til inkorporering af Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-Thr(Bzl)- 150618 20 OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr (Bzlj OH, Boc-Lys(C1Z)OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe--0H, Boc-Phe-OH, Boc-His(Tos)OH, Boc-His(Tos)OH og Boc-Cys(SmBzl)OH, hvorved fås den ønskede peptidoharpiks.

Eksempel 8 L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D--tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-D--cystein-cyclisk (1-12) disulfid-diacetatsalt_ 10 g af peptidoharpiksen fremstillet ved den i eksempel 7 angivne fremgangsmåde blandes med 20 ml anisol og behandles med 150 ml flydende HF i isbad i 45 minutter under udelukkelse af luft. Overskydende flydende HF fjernes under vakuum, og remanensen optages i 50%'s vandig eddikesyre. Blandingen filtreres, og filtratet fortyndes med vand indtil 3,5 liter. pH-Værdien indstilles på 7 med fortyndet NH^OH, og disulfhydrylpeptidet oxideres med K^FtCNjg til cyclisk disulfid. Blandingens pH-værdi indstilles på 5 med iseddike og be-handles med "Bio-Rad"®AG 3. Peptidmaterialet absorberes på "Bio Rex"^ 70 (H -form) og elueres med en pyridinpuffer (Py-^O-eddikesyre, 30:66:4, r/r). Fraktionerne indeholdende peptidmaterialet hældes sammen og lyofiliseres, hvorved fås 1,6 g råmateriale. Dette råprodukt sættes til en "Sephadex"®-LH-20-søjle (2,5 x 90 cm) og elueres med 10%'s vandig eddikesyre (hver fraktion = 5,8 ml). Materialet, som fremkommer i fraktioner 97-101 hældes sammen og lyofiliseres, hvorved fås det ønskede dodecapeptid i en mængde på 171 mg.

Tyndtlagskromatografi: forovertrukne glasplader ("Avicel",

Rf (BWA, 4:1:1, r/r) 0,32, Rf (BWAP, 30:24:6:20, r/r) 0,56.

Aminosyreanalyse: Thr(2) 1,85, Ser(l) 0,84, Cys(2) 1,29, Phe(3) 3, Lys(1) 1,05, His(2) 1,41, Trp(l) 0,75.

Den farmakologiske virkning in vivo for dodecapeptidet fremstillet ved den i eksempel 8 angivne fremgangsmåde påvises som beskrevet i eksempel 13. De fremkomne data er anført nedenfor: 150618 21

Undertrykkelse af væksthormon

Forbindelse (dosis) 2 Timer 4 Timer

Kontrol 127 +22 59 + 20

Forbindelse ifølge eksempel 8 (1 mg/kg) 20 + 3XX 107 + 34 xx p = <.0,001

Undertrykkelse af væksthormon, glucagon og insulin.

Forbindelse Insulin Glucagon (dosis pg/kg) VH (ng/ml) jil/ml pg/ml

Kontrol (saltvand) 279 + 53 323 + 30 42 +6

Forbindelse ifølge eksempel 8 (100) 64 + 20x 165 + 21* 5 + 2*

Undertrykkelse af væksthormon, glucagon og insulin, (fortsat)

Forbindelse T n . _______

Insulin Glucagon (dosis (pg/kg) VH (ng/ml) (μΐ/itil) (pg/ml)

Kontrol (saltvand) 201 + 35 397 + 36 117 + 11

Forb. iflg.

eksmpl. 8 (100) 110 + 22 318 + 54 70 + 7 x p «ί.0,01 + p ·<0,05

Af det ovenfor anførte fremgår det, at peptidet ifølge Eksempel 8 er karakteriseret ved undertrykkelsen af glucagon og væksthormon, uden at det påvirker insulinsekretionen væsentligt.

Eksempel 9 22 150618

Tert.-butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^n-tosyl-L--arginyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryp-tophyl-Ni-2-chlor-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L--phenylal^iyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl--L-cystein-hydroxymethyl-polystyrenester_

Chlormethyleret polystyrenharpiks esterificeres med Boc-Cys-* (SMBzl)-OH i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Gisin, Helv. Chim. Acta., 56_, 1976 (1973). Aminosyreharpiksesteren behandles derpå ifølge nedenstående forskrift A, hvor der som den beskyttede aminosyre i trin 9 anvendes Boc-Ser(Bzl)-OH. Forskrift A gentages derpå med henblik på at inkorporere nedenstående aminosyrer fortløbende i peptidoharpiksen:

Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Phe-OH Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Lys(C1Z)-OH Boc-D-Trp-OH Boc-Phe-OH Boc-Phe-OH Boc-Glu(OBzl)-OH

Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Cys(SMBzl)-OH

Forskrift A: (til behandling af harpiksesteren) 1. Vaskning med 3 x methylenchlorid (C^C^) · 2. Behandling med trifluoreddikesyresmethylenchlorid (1:1, r/r) indeholdende 5%‘s 1,2-ethandithiol i 5 minutter 3. Gentagelse af trin 2 i 25 minutter.

4. Vaskning med 3 x CH^^· 5. Vaskning med dimethylformamid (DMF).

6. Behandling med 12%'s triethylamin i DMF i 3 minutter.

7. Vaskning med DMF.

8. Vaskning med 3 x C^C^· 23 150618 9. Behandling med 4 ækvivalenter af den passende beskyttede aminosyre i C^C^tDMF og omrøring i 5 minutter.

10. Tilsætning i to portioner af 5 ækvivalenter diisopropylcarbodiimid opløst i CH2CI2 i løbet af 30 minutter. Reaktionstid = 6 timer.

11. Vaskning med 3 x DMF.

12. Vaskning med 3 x CH2C12< 13. Gennemførelse af ninhydrinreaktionen i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Kaiser et al., Annal. Biochem., M 595 (1970).

I tilfælde af ufuldstændig reaktion gentagelse af trin 9-13.

Eksempel 10 L-Cysteinyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D--tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L--cystein-cyclisk (1-12) disulfid__ 8,5 g af peptidoharpiksen fremstillet ved den i eksempel 9 angivne fremgangsmåde suspenderes i 16 ml anisol og behandles med vandfrit flydende hydrogenfluorid (HF) i 45 minutter i isbad, hvorpå overskydende HF fjer.^a under vakuum, og remanensen ekstraheres med 10%’s vandig eddikesyre. Filtratet vaskes med ether, og det vandige lag hældes i 5 liter vand, hvorpå pH-værdien bringes på 7 med fortyndet ammoniumhydroxid. Blandingen omrøres i fri luft i 48 timer, hvorefter pH-værdien indstilles på 5 med iseddike, og peptidet absorberes på "Amberlite" ® CG-50 (H+-form) . Peptidmateriale elueres med 50%'s vandig eddikesyre og lyofiliseres, hvorved fås 850 mg af et fast materiale.

Råproduktet sættes til en "Sephadex" ® LH-20-søjle (2,5 x 150 cm) og elueres med 10%'s eddikesyre. Fraktionerne 94-130 hældes sammen og lyofiliseres, hvorved fås 483 mg af materialet. Dette materiale sættes til en "Sephadex" ® 62 5-søj le (1,5 x 115 cm) og elueres med 10%'s vandig eddikesyre. Fraktionerne 43-53 hældes sammen og lyofiliseres, hvorved fås det ønskede peptid i en mængde på 286 mg.

Tyndtlagskromatografi: forovertrukne glasplader (Avicel),

Rf (BWA, 4:1:1, r/r) 0,40, Rf (BWAP, 30:24:6:20, r/r) 0,65.

Aminosyreanalyse: Thr(2) 1,92, Ser(l) 0,89, Glu(l) 1,03, Cys(2) 1,49, Phe(3) 3, Lys(l) 1,05, Trp(l) 0,81,

Eksempel 11 24 150618

Tert.-butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-Nim-tosyl-L--histidyHT-benzyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryp-tophyl-N£-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl“0-benzyl-L-threonyl-L--phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl--Ii-cysteln-hydroxyme thyl-polys tyrenes ter _

Chlormethyleret polystyrenharpiks esterificeres med Boc-Cys-(SMBzl)-OH i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Gisin, Helv. Chim. Acta., i>6, 1976 (1973). Aminosyreharpiksen behandles derpå i-følge forskrift A (jf. eksempel 9), idet der som den beskyttede aminosyre i trin 9 anvendes Boc-Ser(Bzl)-OH. Forskrift A gentages derpå med henblik på at inkorporere nedenstående aminosyrer fortløbende i pep-tidoharpiksen:

Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Phe-OH Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Lys(C1Z)-OH Boc-D-Trp-OH Boc-Phe-OH Boc-Phe-OH Boc-Glu(OBzl)-OH Boc-His(Tos)-OH Boc-Cys(SMBzl)-OH

Eksempel 12 L-Cysteinyl-L-histidyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D--tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl--L-cystein-cyclisk (1-12) disulfid_ 8 g af peptidoharpiksen fremstillet ved den i eksempel 11 angivne fremgangsmåde behandles med flydende vandfrit HF som beskrevet i eksempel 10, og det lineære disulfhydryldodecapeptid cycliseres ved oxidation med K^FeiCNjg ved en pH-værdi på 7,3 og i kraftig fortynding. pH-Værdien indstilles på 5 med iseddike, og blandingen behandles med en "Bio-Rad" ® -AG3-X4-ionbytterharpiks (Cl-form), hvorpå den absorberes på "Amberlite” ® CG 50 (H+-form). Peptidmaterialet elueres 150618 25 med 30%'s vandig eddikesyre og lyofiliseres, hvorved fås 500 mg af et råmateriale. Dette materiale kromatograferes igennem en "Sephadex"-LH-20-søjle, hvorved fås det ønskede dodecapeptid.

Tyndtlagskromatografi: forovertrukne glasplader (Avicel), R^ (BWA, 4:1:1, r/r) 0,43, Rf (tert.-AmOH-Py-W, 7:7:6, r/r) 0,74.

Aminosyreanalyse: Thr(2) 1,92, Ser(l) 0,93, Glu(l) 0,94, Cys(2) 1,59, Phe(3) 3, Lys(l) 1,02, His(l) 0,91,

Trp(l) 0,81.

Eksempel 13

Den biologiske virkning for peptiderne fremstillet ved de i eksemplerne 10 og 12 angivne fremgangsmåder påvises som følger.

Albino-hanrotter indgives i.p. 50 mg/kg "Nembutal"^· Efter 15 minutter injiceres rotterne s.c. med testforbindelsen af fysiologisk saltopløsning. Efter 10 minutter injiceres 0,5 ml arginin (300 mg/ml, pH = 7,2) ind i hjertet på dyrene. 5 Minutter senere skæres rotternes hoveder af, og blodet opsamles i trasylol-EDTA. En passende alikvote undersøges for væksthormon (VH), insulin og glucagon ved radioimmuno-analyse. Resultaterne er anført nedenfor:

Dosis VH Insulin Glucagon Antal

Forbindelse pg/kg ng/kg_p. I/ml_ pg/ml dyr t i

Kontrol ' — 277 + 69 301 +27 46+8 10

Forb. iflg. „ „ w eksmpl. 10 200 42 + 6 115 + 16x 1,5 + lx 10

Kontrol ' -- 216 + 35 283 + 28 55 + 5 j 10

Forb. iflg. ' eksmpl. 10 40 28 + 5X 158 +57 12 + 2 10

Kontrol — 454 + 106 269 +37 60 + 10 10

Forb. iflg.

eksmpl. 12 200 107 + 29x 205 +36 4 + 2X 10

Kontrol — 233 + 35 342 + 45 j 44 + 4 10 ]

Forb. iflg.

eksmpl. 12 50 84 + 17x 322 +40 10 + 4X 10 26 150618

Disse data indicerer, at peptiderne ifølge eksempel 10 og 12, er effektive midler til mindskelse af væksthormon og glucagon, uden at de væsentligt påvirker insulinniveauer ved en dosis på henholdsvis 40 mg/kg og 50 mg/kg. Peptiderne ifølge eksempel 10 og 12 testes også for varigheden af deres virkning på VH-sekrétion hos rotter behandlet med "Nembutal" ®. Peptidet ifølge eksempel 10 udviser en betydelig inhibering af VH i mindst 4 timer ved en s.c. dosis på 1000 mg/kg. Peptidet ifølge eksempel 12 udviser ingen betydelig inhibering af VH ved 2 og 4 timer.

De omhandlede forbindelser kan indgives til varmblodede pattedyr enten intravenøst, subcutant, intramuskulært eller oralt til regulering af serumglucose ved behandlingen af diabetes. Dosismængden vil variere alt afhængigt af hvilken tilstand, der skal behandles, graden af tilstanden og behandlingens varighed.

De omhandlede aktive forbindelser kan indgives alene eller i kombination med farmaceutisk acceptable bærere eller strækkemidler. Egnede farmaceutiske præparater vil være indlysende for en fagmand.

Eksempel 14

Klassisk syntese af L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl--L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-treonyl-L-phenylalanyl-L-treo-nyl-D-seryl-L-cystein-cyclisk (1—»12) disulfid (a) N-benzyloxycarbonyl-im-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl--methylester (I)

En suspension af 42,3 g (0,1 mol) Z-His(Z)-OH og 21,8 g (0,1 mol) Phe-OMe-HCl (98%'s) i 1000 ml afkøles til 0°C, hvorpå der til sættes 22 g (0,12 mol) DCC og 10,1 g (0,10 mol) triethylamin. Blandingen henstilles ved stuetemperatur natten over.

Det udskilte dicyclohexylurinstof frafiltreres, og filtratet koncentreres til et gummiagtigt materiale. Materialet opløses i ethylacetat, og uopløst materiale frafiltreres. Ethylacetatopløsningen vaskes med 5%'s citronsyre, I^O, iskold 5%'s natriumhydrogencarbonat-opløsning og ^0. Det organiske lag tørres over natriumsulfat og koncentreres til 1/3 af dets oprindelige volumen, der tilsættes 500 ml ether, indtil opløsningen bliver uklar, og opløsningen henstilles koldt natten over. Det fremkomne hvide faste stof isoleres og tørres. Udbytte: 32 g. Smp. 131-133°C.

Tyndtlagskromatografi: silicagel F-254, CH^C^iMeOH (9:1),

Rf = 0,8.

2? 150613 (b) Im-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanylmethylester-dihydro-bromidsalt (II) 30 g (0,5 mol) Z-His(Z)-Phe-OMe (I) opløses i 300 ml 32%'s HBr-HOAc (opløsningen bliver uklar efter 2 minutter), og blandingen henstilles ved stuetemperatur i 30 minutter. Der tilsættes ether med med henblik på udfældning. Det bløde faste stof filtreres og tørres natten over. Udbytte: 32 g fast stof, smp. 135-137°C.

Tyndtlagskromatografi: ingen bevægelse.

(c) N-Benzyloxycarbonyl-im-benzyloxycarbony1-L-histidyl-im-benzyloxy-carbony1-L-histidy1-L-phenylalanyl-methylester (III)

En suspension af 30,5 g (0,05 mol) His(Z)-Phe-OMe-2HBr (II) og 21,7 g (0,05 mol) Z-His(Z)-OH i 500 ml CH2C12 afkøles til 0°C. Derpå tilsættes 11 g DCC og 10,1 g (0,10 mol) triethylamin, og blandingen henstilles ved stuetemperatur natten over.

Det dannede dicyclohexylurinstof frafiltreres, og filtratet koncentreres til et glasagtigt materiale. Remanensen opløses i ethyl-acetat, og ethylacetatopløsningen vaskes med 10%'s citronsyre, H20, iskold 5%'s natriumhydrogencarbonatopløsning og H20. Ethylacetatopløsningen tørres over natriumsulfat og koncentreres til ca. 1/3 af dets volumen, der tilsættes ether, indtil opløsningen bliver uklar, og opløsningen henstilles koldt. Der isoleres et hvidt fast stof. Udbytte: 29,5 g.

(d) L-Histidy1-L-histidy1-L-phenylalanyl-methylester-trihydrochloridsalt (IV) Z Z

En blanding af 29 g Z-Åis-His-Phe-OMe (IV), 10,8 "1 koncentreret HC1, 180 ml MeOH og to spatelfulde 10%'s Pd-C hydrogeneres i 5 timer under anvendelse af et Parr-hydrogeneringsapparatur.

Efter filtrering koncentreres methanolet til en olie, og der tilsættes ether til dannelse af et fast stof. 18 g råmateriale anvendes til den næste reaktion uden yderligere rensning.

(e) Tert.-butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteiny1-L-histidy1--L-histidyl-L-phenylalanyl-methylester (V) 13 g (0,038 mol) Boc-Cys(MBzl)-OH, 5,4 g (0,040 mol) hydroxy--benztriazol og 8,3 g (0,040 mol) dicyclohexylcarbodiimid omrøres i 1 liter iskoldt methylenchlorid i 30 minutter. Der tilsættes 19,5 g (0,0345 mol) His-His-Phe-OMe-3HCl og 10,5 ml (0,096 mol) N-methyl- 28 150618 morpholin, og blandingen omrøres natten over, efterhånden som den får stuetemperatur. Suspensionen filtreres til fjernelse af dicyclohexyl-urinstoffet, og filtratet vaskes successivt med vand, 10%'s I^CO^ og H20 og tørres over Na2S04· Efter filtrering fjernes opløsningsmidlet i vakuum, hvorved der bliver 21,0 g råprodukt tilbage. Dette materiale omrøres i 100 ml acetonitril i 30 minutter ved stuetemperatur og filtreres. Bundfaldet vaskes med acetonitril og derpå med ether og tørres. Udbytte: 11 g.

Tyndtlagskromatografi: Rf 0,12,silicagel 60, CHC13:CH3:OH-HAc, 9:1:0,5, r/r.

Filtratet fra acetonitrilekstraktionen indeholder produkt og urenheder og kan anvendes til ekstraktion af andre råcharger.

(f) Tert.-butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L-histidyl--L-histidyl-L-phenylalanin (VI) 11,0 g (0,0142 mol) Boc-Cys(MBzl)-His-His-Phe-OMe opløses i 200 ml methanol, og der tilsættes 30 ml IN kaliumhydroxid. Opløsningen omrøres ved stuetemperatur i 2 timer, og methanolet fjernes i vakuum. Remanensen fortyndes med 200 ml vand og filtreres. Filtratet indstilles på en pH-værdi på 5 med 10%‘s citronsyre, og det gummi-agtige bundfald henstilles, efterhånden som det krystalliserer. Produktet filtreres, vaskes med vand og tørres i vakuum over P20j-. Udbytte: 7,3 g (67%).

Tyndtlagskromatografi: Rf 0,52, silicagel 60, n-butanol:ethyl-acetat:eddikesyre:H20, 1:1:1:1, r/r, Rf 0,43, silicagel 60, tert.--amylalkohol:pyridin:H20, 7:6:7, r/r.

(g) N-Tert.-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanin--methylester (VII)

En opløsning af 61,8 g (0,2 mol) Boc-L-Thr(Bzl)-OH og 22,4 ml (0,2 mol) N-methylmorpholin i THF afkøles til -15°C. Der tilsættes portionsvis 26,2 ml (0,2 mol) isobutylchlorformiat, idet temperaturen holdes på -15 - -10°C. Efter omrøring ved -15°C i 15 minutter tilsættes portionsvis en kold blanding af 43,1 g (0,2 mol) L-Phe-OMe-HCl og 22,4 ml (0,2 mol) N-methylmorpholin i DMF, idet temperaturen holdes på -10 - -5°C. Blandingen omrøres ved 0°C i 2 timer og derpå ved stuetemperatur natten over. Den filtrerede reaktionsblanding koncentreres i vakuum, og remanensen optages i ethylacetat. Ethylacetat-opløsningen vaskes fortløbende med 5%'s KHSO^, 5%'s KHC03 og salt- ?9 150618 opløsning og tørres over Na^SO^. Efter koncentration i vakuum fås en olie, som krystalliserer ved henstand. Det faste stof omkrystalliseres fra isopropylether:hexan. Udbytte: 74,9 g (80%). Smp. 78-81°C, 24 [<x]d + 10,75 (c 1,023, MeOH) , Rf (CHCI3) 0,35.

Analyse for C26H34N2°6: (4?0/55) C% H% N%

Beregnet: 66,36 7,28 5,95

Fundet: 66,72 7,32 5,85 (h) N-Tert.-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonin-L-phenylalanin (VIII) 23,5 g (0,05 mol) Boc-Thr(Bzl)-Phe-OMe opløses i en blanding af 100 ml MeOH:dioxan (1:1) og behandles med 55 ml IN NaoH i 3 timer, indtil udgangsmaterialet ikke kan påvises ved tyndtlagskromatografi.

Det meste af opløsningsmidlet inddampes i vakuum, og remanensen fortyndes med vand, hvorpå den syrnes med 5%'s citronsyre. Det udskilte gummiagtige stof optages i EtOAc og vaskes med vand (saltopløsning), hvorpå det inddampes til tørhed. Remanensen krystalliseres fra Et20:hexan. Udbytte 19,8 g (87%). Smp. 118-119°C.

(i) N-Tert.-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-serin--methylester (IX) 30,9 g (0,1 mol) N-tert.-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonin opløses i 200 ml tørt tetrahydrofuran, afkøles ved -20°C og behandles med 11 ml N-methylmorpholin og derpå med 13,4 ml isobutylchlorformiat. Den kolde reaktionsblanding omrøres i 5 minutter ved -20°C, hvorpå den behandles med en opløsning af O-benzyl-L-serin—.methylester og 25 g (ca. 0,1 mol) hydrogenchlorid indeholdende 11 ml N-methylmorpholin i DME, og blandingen henstilles natten over for at få stuetemperatur .

Opløsningsmidlet fjernes i vakuum, og remanensen fordeles imellem vand og ethylacetat. Den organiske fase vaskes med 5%'s citronsyre, vand, vandigt KHCO^ og vand og tørres over MgSO^, hvorpå den inddampes til tørhed, hvorved fås en olieformig remanens, som krystalliserer fra diethylether:hexan til et geléagtigt fast stof. Udbytte: 29 g.

Rf (CHCl3:MeOH, 25:1) 0,85, Rf (EtOAc:hexan, 1:1) 0,65.

1 b O 618 (j) N-Tert.-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-serin (X) 28.2 g (0,0563 mol) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-OMe opløses i ca. 50 ml methanol og behandles med 75 ml IN natriumhydroxid i 1,5 timer ved stuetemperatur. Den alkaliske opløsning neutraliseres til en pH-værdi på 7 med 10%'s citronsyre, og størstedelen af methanolet fjernes i vakuum. Remanensen fortyndes med noget vand og syrnes med 5%'s vandigt KHSO^, hvorpå den ekstraheres med EtOAc. Den organiske fase vaskes med H20, tørres over Na2S04 og inddampes til tørhed til en olie. Udbytte: kvantitativt.

(EtOAc:hexan, 1:1) 0,15 (lang plet).

(k) N-Tert.-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S--p-methoxybenzyl-L-cystein-benzylester (XI) 24.3 g (50 mmol) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-OH opløses i 250 ml ace-tonitril og dichlormethan (2:3) og blandes med 25 g (50 mmol) HCys-(SMBzl)-Bzl-TosOH, derpå med 6,8 ml triethylamin og 6,8 g N-hydroxy-benzotriazol, og blandingen afkøles i isbad.

Der tilsættes en opløsning af 11 g DCC (53 mmol) i 50 ml ace-tonitril, og reaktionsblandingen omrøres koldt i 2 timer og derpå i 2 dage ved stuetemperatur. Det udskilte DCU frafiltreres, og filtratet inddampes til tørhed. Den olieformige remanens fordeles imellem ethylacetat og vand, og den organiske fase vaskes med 10%'s citronsyre, vand, 5%'s KHC03 og saltopløsning og tørres over Na2S04· Opløsningsmidlet inddampes, og den olieformige remanens krystalliseres fra Et20:hexan, hvorved fås et hvidt fast stof i en mængde på 24,5 g, smp. 87-90°C.

(chloroform:methanol, 25:1) 0,54, spor ved 0,4 og 0,3 25 (heptan:EtOAc, 1:1) 0,64, spor ved 0,25, I2 positiv [a]D -14,7 (C 0,98, DMF).

Elementæranalyse for ^^H^N^SO^: (798,9) C% H% N%

Beregnet: 66,15 6,56 5,26

Fundet: 66,22 6,95 5,29 51 150818 (l) O-Benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein--benzylester-trifluoracetat (XII) 8 g (10 mmol) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl blandes med 100 mmol anisol og behandles med 100 ml TFA i 45 minutter. Opløsningsmidlet inddampes i vakuum, og remanensen opløses i tørt Et£0, hvorpå den inddampes til tørhed i højvakuum, hvorved fås en olieformig forbindelse i en mængde på 7,2 g (90%).

(n-butanol:vand:iseddike, 4:1:1) 0,9, (heptan:EtOAc) 0,0-0,1 lang plet, I2 positiv og nihydrin positiv.

(m) N-Tert.-butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O--benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxy-benzyl-L-cystein--benzylester (XIII) 9,2 g (20 mmol) Boc-Thr(Bzl)-Phe-OH fremstillet ved den i eksempel (c) angivne fremgangsmåde opløses i 100 ml DFM og blandes med 3,4 g N-hydroxysuccinimid og en opløsning af Thr(Bzl)Ser(Bzl)--Cys(SMBzl)OBzl-TFA-salt (20 mmol) i 20 ml DMF neutraliseret med triethylamin til en pH-værdi på 7. Blandingen afkøles i isbad og behandles med 4,5 g DCC i 2 timer under kulde og derpå i 2 dage ved stuetemperatur. DCU filtreres, og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen finsønderdeles med vand til dannelse af et bundfald, som optages i EtOAc, vaskes med 5%'s citronsyre, vand, 5%'s Na2C03 og vand, tørres over Na2SO^ og inddampes til tørhed. Remanensen bringes til at størkne fra Et20:hexan og kan krystalliseres fra MeOH (letopløselig i CHCl^). Udbytte: 17,3 g (70%). Smp. 105-107°C.

Rf (CHCl3:MeOH, 10:1) 0,90, [α]§5-3,6 (C 1, DMF).

Analyse for (1156,2) C% H% N%

Beregnet: 66,46 6,71 6,05

Fundet: 66,68 6,59 6,20 32 150618 (n) Tert.-butyloxycarbonyl-D-tryptophyl-N^-benzyloxycarbonyl-L-lysyl--methylester (XIV) 30,4 g (0,1 mol) Boc-D-Trp-OH, 33 g (0,1 mol) Lys(Z)-OMe-HCl og 13,6 ml triethylamin opløses i 400 ml DMF og afkøles i isbad, derpå tilsættes 22 g dicyclohexylcarbodiimid, og blandingen henstilles natten over ved stuetemperatur. Det udskilte dicyclohexylurinstof filtreres, filtratet koncentreres til et lille volumen, og derpå tilsættes rigeligt med vand til dannelse af et gummiagtigt materiale. Dette materiale optages i ethylacetat og vaskes med 10%'s vandig citronsyre, H20, mættet NaHC03 og H20, tørres over Na2S04 og inddampes til tørhed. Remanensen finsønderdeles med ether og derpå med hexan, hvorved fås et krystallinsk fast stof i en mængde på 28 g.

Tyndtlagskromatografi: silicagel G, hexan:EtOAc, 1:1, r/r,

Rf 0,3.

(o) Tert.-butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N^-benzyloxy-carbonyl-L-lysin (XV) A. 22 g (44 mmol) Boc-D-Trp-Lys(Z)-OMe sættes til en i forvejen afkølet blanding af 220 ml TEA og 25 ml anisol, og blandingen ararøres i isbad i 30 minutter. TFA inddampes så hurtigt som muligt ved 27°C på en rotationsfordamper, og den resterende olie finsønderdeles flere gange med en opløsning af hexan:ether (2:1), dekanteres og pumpes sluttelig til et gummiagtigt stof. Udbytte 21,3 g (36 mmol).

B. 9,6 g (36 mmol) Boc-Phe-OH, 5,3 g (39 mmol) HOBT og 8 g (39 mmol) DCC omrøres i 500 ml koldt dichlormethan i 20 minutter.

Der tilsættes 21,3 g (36 mmol) D-Trp-Lys(Z)-OMe-TFA-salt i 2000 ml dichlormethan og derpå 4,25 ml (39 mmol) N-methylmorpholin. Reaktionsblandingen omrøres natten over, efterhånden som den får stuetemperatur. Blandingen filtreres til fjernelse af DCC, og filtratet vaskes med 2 x H20, 2 x 10%'s citronsyre, 2 x mættet NaHCO^ og 2 x vand og tørres over Na2S04· Efter filtrering og inddampning fås remanensen i en mængde på 21,4 g (82%), der kan anvendes uden yderligere rensning.

Tyndtlagskromatografi: silicagel F-254/CHCl2 9:CHgOH 1: HAc 0,5, Rf 0,76 samt spor af mindre urenheder.

„ 150618 C. 22,9 g (31,4 mmol) Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-OMe opløses i 450 ml p-dioxan og 100 ml methanol, der tilsættes 39 ml vandigt IN KOH, og blandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Opløsningen inddampes på en rotationsfordamper. Remanensen opløses i 500 ml varmt vand, syrnes til en pH-værdi på 3 med 10%'s citronsyre, omrøres i 30 minutter og filtreres. Efter tørring i vakuum natten over fås et udbytte på 21,6 g (96%). Smp. 85-90°C. [α]ϋ6= +7,09 c, 0,987 MeOH.

0,63 CHCl^, 9:CH3OH, l=HAc, 0,5, silicagel F-254.

(p) Tert.-butyloxycarbony1-L-phenylalany1-D-tryptophy1-N^-benzyloxy-carbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-Q-benzyl-L-threo-nyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-benzylester (XVI) A. 40,5 g (35 mmol) Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)--OBzl (XIII) sættes til en kold opløsning af 400 ml TFA og 40 ml ani-sol, og blandingen omrøres i kold tilstand i 30 minutter. TFA inddampes på en rotationsfordamper, og remanensen finsønderdeles med 1 liter ether:hexan (1:1) til et hvidt pulver. Efter filtrering, vaskning med etherrhexan og tørring i vakuum over °9 NaOH-kugler fås et udbytte på 34,6 g (82%). Smp. 136-139°C, blødgøres ved 120°C. [cx]q6= -9,93 c, 1,04 MeOH. Rf 0,63 silicagel CHC13, 9:CH3OH, l:HAc, 0,05 lille mere polær urenhed. R^ 0,53.

B. 20,0 g (27,9 mmol) Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-OH, 4,15 g (30,8 mmol) HOBT og 6,3 g (30,8 mmol) DCC omrøres i 2,0 liter koldt dichlormethan 1 isbad i 30 minutter. Der tilsættes 32,6 g (27,9 mol) H-Thr(Bzl)--Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl-TFA-salt og derp* 3,35 ml (30,8 mmol) N-methylmorpholin, og omrøringen fortsættes natten over, efterhånden som blandingen opvarmes til stuetemperatur. Tyndtlags-kromatografi viser, at reaktionen praktisk taget er afsluttet efter 2 timer.

Blandingen filtreres, og filtratet vaskes med vand, 10%'s citronsyre, vand, mættet NaHCO^ og vand og tørres. Efter filtrering og inddampning viser tyndtlagskromatografi produkt og en mere polær urenhed, som fjernes ved, at råproduktet opløses i 200 ml varmt DMF, og der tilsættes 1 liter 2%'s vandigt NaHCO^. Produktet filtreres, vaskes med fortyndet NaHCO^ og vand og tørres i vakuum over ‘ Udbytte: 36,5 g (75%). Smp. 182-184°C (svinder ved 150°C) . [a]j*°= 0 c, 0,988 150618 34 CHCl^· &£ (enkelt plet) 0,76, silicagel CHClg, QtCH^OH, l:HAc, 0,05.

(q) H-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl--trifluoracetatsalt (XVII) 32 g Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys-(SMBzl)-OBzl og 33 ml anisol opløses i 50 ml dichlormethan, der tilsættes 100 ml trifluoreddikesyre, og blandingen omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur. Opløsningen inddampes på en rotationsfordamper ved 30°C. Remanensen finsønderdeles med vandfrit ether til et pulver, som filtreres, vaskes med ether og tørres i vakuum over ?2°5 °9 natriumhydroxidperler.

Tyndtlagskromatografi på silicagel 60 i CHCl^iCH^OHiHOAC (9:1:0:5) viser en enkelt plet. R_p = 0,65. Kernemagnetresonansspektroskopi (HNMR) viser ingen top for tert.butyl.

(r) Tert.-butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N^-benzyloxycar-bonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl--O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein-benzylester (XVIII) 5,5 g (7,2 mmol) Boc-Cys(SMBzl)-His-His-PheOH, 1,07 g (7,9 mmol) 1-hydroxy-benztriazol-monohydrat og 1,65 g (7,9 mmol) dicyclohexyl-carbodiimid omrøres i 100 ml tørt dimethylformamid i isbad i 30 minutter. Der tilsættes 12,5 g (7,2 mmol) H-Phe-D-Trp-Lys(z)-Thr(Bzl)-Phe--Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)OBzl-trifluoracetatsalt og 0,855 g (7,65 mmol) N-methylmorpholin, og blandingen henstilles til opnåelse af stuetemperatur natten over med omrøring. Suspensionen filtreres til fjernelse af dicyclohexylurinstof, og filtratet inddampes til 50 ml og fortyndes med 500 ml mættet vandig natriumhydrogencarbonatopløsning. Det fremkomne faste stof filtreres, vaskes med vand og opløses på ny i 200 ml DMF. Opløsningen fortyndes med 1 liter 5%'s vandig citronsyre og filtreres. Det faste stof vaskes med vand, opløses i 200 ml DMF og udfældes med 1 liter mættet natriumhydrogencarbonatopløsning, filtreres, vaskes med vand og tørres i vakuum over P2®5 ve^ stuetemperatur. Udbytte: 15 g.

Aminosyreanalyse: His 1,66(2,0), Lys 1,05(1,0), Phe (3,0),

Ser 1,02(1,0), Thr 2,2 (2,0).

55 150618 (s) L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl--D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-Ii-threonyl-L-seryl--L-cystein-cyclisk (1-12) disulfid (XIX) 5 g Boc-Cys(SMBzl)-His-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys(z)-Thr(Bzl)-Phe--Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)OBzl blandes med 10 ml anisol og behandles med 100 ml flydende HF under udelukkelse af luft og i isbad i 60 minutter. Overskydende HF fjernes i vakuum, og remanensen optages i 10%‘s vandig eddikesyre (200 ml) og hældes i 7 liter afluftet vand. pH-Værdien indstilles på 7 med fortyndet NH^OH og omrøres i fri luft i 24 timer, pH-værdien indstilles på 5 med iseddike, og opløsningerne ledes igennem en "Amberlite"®-CG-50-søjle (H^-form). Peptidmaterialet, som absorberes på ionbytterharpiksen, fortyndes med 50%'s vandig eddikesyre, og fraktionerne indeholdende peptidmaterialet hældes sammen og lyofiliseres, hvorved fås 2 g af råmaterialet. Dette rådodecapeptid renses ved søjlekromatografi ved hjælp af "Sephadex"® G 25 og elueringer med 10%'s vandig eddikesyre og fordelingskromatografi ved hjælp af "Sephadex" G 25 med tofasesysternet N-BuOH:vand:-iseddike, 4:5:1, r/r.

Tyndtlagskromatografi: silicagel (A.G. Merck), chlorpeptidspray, jf. D.E. Nitecki et al. Biochem. i), 665 (1966).

Rf (BWA, 4:1:1) 0,45, Rf (BWAP, 30:24:6:20) 0,64.

Aminosyreanalyse: Thr(2) 1,85, Ser(l) 0,79, Phe(3) 3, Lys(l) 1,02, His(2) 1,75, Cys, Trp ND.

Claims (3)

150818 PATENTKRÅV.

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af somatosta-tinanaloge med den almene formel H-Cys-X1-X2-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X4-OH (I) SA AS hvori A er hydrogen, eller begge A'er tilsammen repræsenterer 1 2 en S-S-binding, X betyder His eller Arg, X betyder His eller 4 Glu, og X betyder Cys eller D-Cys, eller farmaceutisk acceptable salte deraf/ kendetegnet ved, at forbindelser med formlen X-Cys-X1-X2-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X4-OR (II)

1. C 1 7 f Q I Q I Sa R6 R7 R8 R9 S3 hvori R betyder en carboxybeskyttelsesgruppe eller en polystyren-harpiksbærer bundet via en methylengruppe, X er H eller en a-amino- I* beskyttelsesgruppe, X betyder His eller Arg ' 2 ’3 R R-3 3 hvori R betyder en beskyttelsesgruppe for sidekædenitrogenato- 2 merne i arginin, og R betyder hydrogen eller en beskyttelsesgrup- 9/ pe for imidazolnitrogenatomet i histidin; X betyder His R2 2 2/ hvori R har den ovenfor angivne betydning, eller X betyder Glu έ4 4 hvor R betyder en beskyttelsesgruppe for sidekædecarboxygruppen i glutaminsyre; R8 betyder en beskyttelsesgruppe for sidekædeamino-gruppen i lysin, R , R og R hver især betyder beskyttelsesgrup- 4 per for hydroxylgrupperne i threonin og serin, X er som ovenfor ‘ anført, og α og β betyder hydrogenatomer, sulfhydrylbeskyttelses-grupper eller tilsammen udgør en direkte binding imellem svovlatomerne, befries for alle beskyttelsesgrupper og fjernes fra den eventuelle polystyrenharpiksbærer, og om nødvendigt oxideres til dannelse af en direkte S-S-binding, og om nødvendigt produktet isoleres som den frie base eller et farmaceutisk acceptabelt salt