DK147809B - Immobiliseret immunoadsorbent - Google Patents

Description

147809

Opfindelsen angår en immobiliseret immunoadsorbent, navnlig til radioimmunoanalyse, hvilken immunoadsorbent omfatter en adsorbent og hertil bundne antistoffer.

En radioimmunoanalyse er en analytisk metode, som baserer sig på et antigens konkurrence om (affinitet overfor) antigenbindingssteder på antistofmolekyler. I praksis fastlægges der standardkurver ud fra data opnået på basis af en række prøver, der hver har (a) samme kendte koncentration af mærket antigen og (b) forskellige, men kendte, koncentrationer af umærket antigen. Antigener mærkes med et radioaktivt isotopsporstof. Blandingen inkuberes i kontakt med et antistof, det frie antigen skilles fra antistoffet og antigenet, der er bundet hertil, og derpå bestemmes ved hjælp af en passende detektor, såsom en gamma- eller beta-strålingsdetektor, det procentvise indhold af enten bundet eller frit mærket antigen eller begge. Denne fremgangsmåde gentages for en række prøver med forskellige kendte koncentrationer af umærkede antigener, og resultaterne indtegnes i et diagram. Det procentiske indhold af bundne sporstofantigener afsættes som en funktion af antigenkoncentrationen. I typiske tilfælde aftager den relative mængde af sporstofantigenet, som er bundet til antistoffet, med stigende total antigenkoncentration. Efter at der er fremstillet en standard kurve, anvendes denne til bestemmelse af koncentrationen af antigen i prøver, som underkastes analyse.

Ved den faktiske analyse blandes prøven, hvis koncentration af antigen skal bestemmes, med en kendt mængde sporstofantigen. Sporstofantigenet er det samme antigen, som vides at være til stede i prøven, men som er blevet mærket med en passende radioaktiv isotop. Prøven med sporstoffet inkuberes derpå i kontakt med antistoffet. Derpå kan der foretages en tælling ved hjælp af en passende detektor, som ved tælling bestemmer det frie antigen, som forbliver i prøven. Antigenet, som er bundet til antistoffet eller immunoadsorbenten, kan også bestemmes på tilsvarende måde ved tælling. Derpå bestemmes ud fra standard kurven koncentrationen af antigenet i den oprindelige prøve. Endelig bortkastes antistoffet eller immunoadsorbentmassen.

For at bestemme procentindholdet af antigen, som er bundet til antistoffet (bundet antigen) og/eller procentindholdet, som forbliver fri eller ubundet, er det nødvendigt først at skille prøven i en fraktion indeholdende bundet antigen og en fraktion, som kun 147809 2 indeholder frit antigen. En velkendt fremgangsmåde hertil består i at sætte dextranbelagt trækul til blandingen. Dextranen tillader ubundet antigen med lavere molekylvægt end for bundet antigen at passere gennem dextranen, og trækullet adsorberer det frie antigen.

Trækullet med adsorberet, frit antigen skilles derpå fra antistoffet (og bundet antigen) ved centrifugering.

En anden kendt fremgangsmåde består i til blandingen at sætte et andet antistof, som selektivt udfælder førstnævnte antistof (med bundet antigen) og således kun lader tilbage frit antigen i opløsning. En klassifikation til opnåelse af passende fraktioner af frie og bundne antigener udføres derpå ved at skille bundfaldet fra supernatanten ved centrifugering eller på anden passende måde.

Nogle forskere har anvendt en fremgangsmåde, hvorved antistoffet bindes til de indre vægge i en formstofbeholder, hvor beholderen fyldes med den antigenholdige prøve, hvor beholderen henstilles i et inkubationstidsrum, som typisk ligger mellem 4 og 72 timer, og hvor det frie antigen skilles fra bundet antigen ved bortdræning og skylning af beholderen, hvorved der kun her? efterlades antistoffet og bundet antigen. En senere udviklet fremgangsmåde består i at fremstille immunoadsorbenten ved at binde antistofferne på opløseligt tværbundet dextran. Immunoadsorbenten og den antigenholdige prøve inkuberes dernæst, og dextranen med bundet antigen skilles fra opløsningen på passende måde.

Ved alle de nævnte metoder bestemmes det procentiske indhold af mærket antigen i enten fraktionen, som indeholder bundet antigen, eller fraktionen, som indeholder frit antigen eller begge, og standardkurven anvendes til bestemmelse af antigen koncentrationen.

Derpå bortkastes immunoadsorbenten.

Selv om de ovenfor nævnte radioimmunoanalysemetoder har vist sig at være værdifulde redskaber og har vundet udbredt accept, lader de dog stadig noget tilbage at ønske som følge af, at antistoffet (immunoadsorbenten) forbruges ved hver analyse og derfor må bortkastes. Ydermere er de kendte metoder af batch-typen, og adskillige reagenser sættes til antistoffet i reagensrør, hvori de forskellige trin, såsom inkubering, skylning o.I., udføres, hvilket resulterer i en langsom og dyr operation.

Det er blevet foreslået at anvende samme immunoadsorbent til flere analyser ved at frigøre fra immunoadsorbenten antigenet, som er bundet til antistofmassen, idet sidstnævnte er immobiliseret 147809 3 pi adsorbenten, d.v.s. at der foretages en selektiv og støkiometrisk frigørelse af al antigenet pi immunoadsorbenten, efter at analysen er afsluttet. Opfindelsen vedrører en sådan genanvendelig immunoadsor-bent.

Det er velkendt fra litteraturen, at antistoffer kan isoleres ved anvendelse af immunologiske adsorbenter, og at denne fremgangsmåde er anvendelig til isolering og rensning af antistoffer, snarere end til kvantitativ bestemmelse heraf, se Campbell og medarbejdere, Proc. National.Acad.Sci. U.S. 37 (1951) 575.

Anvendelsen af et antifstof koblet til en uopløselig polymer til ekstraktion af specifikke antigener med det formål at isolere og rense samme, er beskrevet i Weetall og medarbejdere, Biochem.Bio-phys. Acta. 107 (1965) 150-152.

Porøst glas er blevet beskrevet som adsorbent til immobilisering af enzymer, se Weetall, Biochem.Biophys.Acta. 212 (1970) 1-7. Ifølge dette litteratur sted behandledes glas med gammaaminopro-pyltriethoxysilan, og isothiocyanatderivatet fremstilledes ved behandling med thiophosgen. Enzymet kobledes til isothiocyanatderivatet. Litteraturstedet beskriver også fremstillingen af et arylaminderivat ved omsætning af alkylaminglas med p-nitrobenzoylchlorid efterfulgt af anvendelsen af natriumdithionat til reduktion af nitrogrupperne. Arylaminglasset diazoteredes derpå, og enzymet kobledes hertil.

Weetall har i Biochem.J. (1970) 117, 257-261, også beskrevet anvendelsen af antistoffet bundet til porøst glas ved hjælp af et silankoblingsmiddel, idet immunoadsorbenten anvendes til isolering og rensning af specifikke antigener. De anførte data viser imidlertid, at en genanvendt kolonne, i hvilken antigenet var elueret fra den immobiliserede antistof-immunoadsorbent gav fejlagtige resultater, idet genudvindingen af frigjort antigen varierede mellem 74 og 100%.

Der henvises endvidere til beskrivelsen til U.S.A. patent nr.

3.652.761. Selv om det beskrevne system har været anvendeligt som et isoleringssystem, lider det af betydelige ulemper som et anvendeligt værktøj ved kvantitative analyser, hvorved der ml ske en væsentlig støkiometrisk frigørelse af antigenet.

I beskrivelsen til U.S.A. patent nr. 3.555.143 er der beskrevet radioimmunoanalysemetoder, hvorved en immobiliseret immu-noadsorbent alene anvendes én gang og derpå bortkastes, Immunoad-sorbenten er en dextran ("Sephadex" G 25 superfin) tværbundet med glycerinetherbroer og substitueret med p-nitrophenoxyhydroxy- 147809 4 propylethergrupper. Nitrogrupperne reduceres til aminogrupper under anvendelse af natriumdithionit. "Sephadex" substitueret med p-aminophenoxyhydroxypropylgrupper behandles dernæst med thio-phosgen til dannelse af "Sephadex" substitueret med p-isothiocyanat--phenoxyhydroxypropylgrupper, og antistoffet bindes til sidstnævnte substituerede produkt.

En reaktion, som i udstrakt grad anvendes til at gøre et protein uopløseligt, består i at tilvejebringe en kovalent binding mellem proteinet og et cyanogenbromidaktiveret cellulosematrixmateriale. Mekanismen ved en sådan aktivering er angivet i Bartling og medarbejdere, Biotechnology and Bioengineering, bind XIV (1972) 1039-1044.

Beskrivelserne til U.S.A. patenterne nr. 3.502.888, 3.639.559 og 3.720.760 omhandler også metoder af interesse.

Når en immobiliseret immunoadsorbent kun skal anvendes én gang og bortkastes, er adsorbentens langtidsegenskaber ikke af væsentlig betydning. Således virker materialer, såsom "Sephadex11 (dextran) eller "Sepharose" (partikelformet agaroseprodukt) tilfredsstillende som adsorbenter for antistoffer, som er bundet hertil, således som det er beskrevet i beskrivelsen til ovennævnte U.S.A. patent nr. 3.555.143. Når immunoadsorbenten skal anvendes gentagne gange, opstår der visse problemer.

Et af disse problemer er tendensen hos produkter af "Se-phadex"- og "Sepharose"-typen til at dehydratisere, d.v.s. at gelen kollaberer og pakker sammen i et sådant omfang, at strømmen gennem massen i væsentlig grad nedsættes, og antistoffets mulighed for at binde antigenet ændres. Herved påvirkes reproducerbarheden og stabiliteten af immunoadsorbenten for gentagen anvendelse.

Glas og andre faste uorganiske materialer udgør et ønskeligt alternativ som følge af, at de kan tifdannes til perlelignende legemer og derved give en bedre strømning og en lettere pakning til dannelse af et søjlelignende arrangement. Sådanne materialer kollaberer ikke og udsættes ikke for dehydratisering under lange brugspe-rioder. Selv om glas udgør et ønskeligt alternativ, har produkter af glastypen også visse ulemper. Et af problemerne er at få antistoffet til i tilstrækkelig grad at binde til adsorbenten. Enten fremkommer der en utilstrækkelig initialbinding til at fremkalde den aktivitet, som er nødvendig for en kvantitativ analyse, eller aktiviteten ændrer sig i løbet af immunoadsorbentens levetid ved uønsket frigørelse af 147809 5 antistoffer.

Når glas er stærkt porøst som glasset, der anvendes ved metoden, som er omtalt i forbindelse med ovennævnte Weetall-artikel, er der et så stort aktivt glasoverfladeareal, at der finder en rigelig binding af antistoffet sted, men der sker samtidig en ikke-specifik binding af antigenet. Antigenet, der er bundet til glasset, frigøres således ikke fuldstændigt. D.v.s., at der i stedet for at indtræde en støkiometrisk frigørelse ved hver anvendelse, som det er nødvendigt ved en kvantitativ analyse, er frigørelsesegenskaberne varierende og uforudsigelige. Dette bekræftes af resultaterne i den nævnte Weetall-artikel. Da sådant glas almindeligvis har en hulrumsbrøk på 96%, er der et betydeligt aktivt overfladeareal i glasset, som ikke er optaget af antistoffet, og som tjener som antigenbindingssted.

En anden vanskelighed ved stærkt porøse glasprodukter er, at der findes et stort antal forsænkninger i porerne, hvilket resulterer i en indeslutning i forsænkningerne og en langsom frigørelse som følge af en langsom diffusion i forsænkningerne. Når der kræves en hurtig reaktion, f.eks. i automatiseret udstyr, er diffusionen af reaktanterne en hastighedsbegrænsende faktor, og som bekendt kan diffusionen være en relativt langsom proces. Således er diffusionen af antigenet, selv om dette ikke er bundet til substratet, relativt langsom, og når det drejer sig om hurtigt, automatiseret analyseudstyr, sker der effektivt set snarere en binding af antigenet end en hurtig og støkiometrisk frigørelse.

I overfladen porøse bærermaterialer kendes til brug ved kromatografi, jfr. f.eks. beskrivelsen til U.S.A. patent nr.

3.505.785, som beskriver et produkt, der forekommer i handelen under varemærket "Zipax". Sådanne perler til brug som kromatografisk søjlepakning består af en række separate makropartikler, som har uigennemtrængelige kerner, og hvortil der irreversibelt er bundet en belægning af en række successivt absorberede monolag af ens kolloidale mikropartikler. Kugleformede mikroglasperler med en diameter på ca. 30 micron omfatter således en ydre porøs overfladeskal, som har en tykkelse på ca. 1 micron. Et sådant materiale vil anvendt som adsorbent frembyde et væsentligt overfladeareal, som står til disposition for den ønskede aktivitet, men adsorbenten skal fremstilles på passende måde for at sikre en passende hurtig reaktion, såvel som en støkiometrisk frigørelse.

Tilvejebringelsen af en genanvendelig immunoadsorbent, 147809 6 som støkiometrisk frigør antigenet efter hver analyse, er således i høj grad ønskelig. Hvis en sådan immunoadsorbent i det væsentlige også er fri for at dehydratisere og lejrer sig således, at strømningsforholdene gennem massen er tilfredsstillende over immunoadsorben-tens brugstid, er der tilvejebragt en væsentligt forbedret genanvendelig immobiliseret immunoadsorbent.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes en forbedret immobiliseret immunoadsorbent til brug og fornyet brug ved radioimmunoanalysemetoder. Denne immunoadsorbent er ejendommelig ved, at adsorbenten består af en masse af faste partikler, som er modstandsdygtige mod dehydratisering og kollabering, hvor hver partikel har en ydre overflade med et stort overfladeareal, at en vanduopløselig polymer er kemisk bundet til den ydre overflade af de faste partikler, og at der til polymeren med kovalente bindinger er bundet antistoffer til binding af et specifikt antigen.

En foretrukket udførelsesform for immunoadsorbenten ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at de faste partikler er overfladeporøse, tungtsmeltende partikler, hvorhos hver partikel omfatter en uigennemtrængelig kerne, hvortil der er bundet tilstrækkelige lag af mikropartikler til dannelse af en ydre porøs belægning på kernen.

Som nævnt er en vanduopløselig polymer kemisk bundet til den ydre overflade af de faste partikler. Polymeren kan være bundet til denne overflade ved behandling af de faste partikler med det formål herpå at danne et aminoalkylsilanderivat efterfulgt af en behandling til dannelse af et isothiocyanoalkylsilanderivat, hvortil polymeren fastbindes. Et typisk eksempel på anvendelige polymermaterialer er dextran.

Dextranen virker som en barriere, der dækker de aktive steder på adsorbenten, hvortil antigenet kan bindes på en sidan måde, at der interfereres med efterfølgende analyser. Da immunoadsorbenten ifølge opfindelsen ved anvendelse af et elueringsmedium, som skiller antigenet fra bundne antistoffer, anvendes og genanvendes, fremkalder frigørelsen af eventuelt antigen, som kan være bundet til adsorbenten, fejl under efterfølgende analyser. Sådanne fejl opstår som følge af den uforudsigelige og ukendte mængde, der bibeholdes eller frigøres. Polymeren virker således effektivt som en barriere, der forhindrer adsorbenten i at binde antigen.

Polymeren aktiveres derpå til at binde antistoffet gennem en kovalent binding ved behandling med cyanogenbromid. Reaktions 147809 7 mekanismen herfor er beskrevet i ovennævnte artikel af Bartling og medarbejdere.

Den dannede immobiliserede immunoadsorbent kan anbringes derpå i en kammerholder.

Opfindelsen skal herefter beskrives nærmere under henvisning til tegningen, hvor figuren er et perspektivisk billede, som delvis i snit skematisk illustrerer en adsorbent ifølge den foreliggende opfindelse.

Den forbedrede immobiliserede immunoadsorbent ifølge opfindelsen er principielt beregnet til brug ved radioimmunoanalyseme-toder.

Typiske eksempler på materialer, som kvantitativt kan måles ved anvendelse af adsorbenten ifølge den foreliggende opfindelse, er følgende: estriol, digoxin, digitoxin, testosteron, estradiol, aldosteron, progesteron, cortisol, 11-desoxycortiosterone, 11-desoxy-cortisol, thyroidhormoner, såsom thyroxin (T^), triiodothyronin (Tg), polypeptider, såsom angiotensin, TSH (thyroidstimulerende hormon), ACTH, GH (væksthormon), HP (humant placento-lactogen), parathormon, calcitonin, insulin, glucagen, polypeptidproteiner, såsom CEA (carcino-embryonisk antigen), aIphafetoprotein, interferon, vira, såsom australsk antigen, vitaminer, såsom D og B^, folsyre og lægemidler, såsom dilantin og barbiturater, for blot at nævne nogle.

Antisera for ovennævnte antigener er velkendte, hvilket også er mærkede antigener, som forekommer i form af materialer 125 mærket med radioaktive isotoper, almindeligvis i form af I -isotoper 3 eller H -isotoper.

De immobiliserede immunoadsorbenter ifølge opfindelsen omfatter en adsorbent, hvormed antistofferne er relativt permanent forbundne. Under brugen bringes en prøve indeholdende umærket antigen med en kendt koncentration af mærket antigen i kontakt med den immobiliserede immunoadsorbent anbragt i en kammerholder. Herved bindes en del af blandingen af mærket antigen og umærket antigen til det specifikke antistof, som er bundet på adsorbenten. Derpå måles det ikke-bundne antigen eller det bundne antigen eller begge, og koncentrationen af umærket antigen bestemmes ud fra standarddata.

Derpå skylles den immobiliserede immunoadsorbent med en passende vandig opløsning indeholdende opløsningsmidler, såsom me-thylalkohol, isopropylalkohol eller ethylalkohol samt dimethylformamid 147809 8 for at fremkalde en støkiometrisk frigørelse af det bundne mærkede og umærkede antigen fra den immobiliserede immunoadsorbent. Skylnings- eller elueringsoperationen regenererer på effektiv måde immu-noadsorbenten til fornyet anvendelse, og derpå kan samme immunoadsorbent anvendes gentagne gange til bestemmelse af antigenet, overfor hvilket det immobiliserede antistof er specifikt, med udvaskninger som ovenfor beskrevet mellem hver anvendelse.

Da antigenmaterialet bringes til at strømme ind i et kammer, som understøtter immunoadsorbenten, som skal genanvendes, bør adsorbentens strømningskarakter være en sådan, at der opnås kontakt mellem de til adsorbenten bundne antistoffer og antigenblandingen. Ydermere skal adsorbenten være af en sådan type, at der ikke interfereres med frigørelsen af bundet antigen, medens det bundne antistof bibeholdes. Reproducerbarhed, stabilitet og hastighed er nogle af de fordele, der knytter sig til den forbedrede metode, og adsorbenten skal derfor være sådan, at der kan opnås tilstrækkelig aktivitet med hensyn til bundet antistof med de tilstedeværende antigenbindingssteder. Adsorbenten er derfor partikelformet og dannet af en masse af adskilte partikler, idet der herved opnås en forbedring af de ønskede gennemstrømningsegenskaber, ikke alene for prøveblandingen indeholdende mærket og umærket antigen, men også for skylle- og elueringsmediet.

Partikelformede materialer, som er i stand til at tilvejebringe den nødvendige antistofaktivitet, er velkendte, f.eks. "Se-phadex", "Sepharose" og porøst glas. Materialer, såsom "Sephadex" og "Sepharose", er geltypematerialer, og over længere tids brug har de tendens til at dehydratisere, hvilket resulterer i et sammenfald med resulterende pakning, hvilket hæmmer gennemstrømningen.

Materialer, såsom porøst glas, er så aktive, at antigenet bindes til glasset og ikke frigøres herfra.

Et vigtigt træk ved immunoadsorbenten ifølge opfindelsen er således dannelsen af en barrierebelægning over hver partikel, idet barrierebelægningen tjener til at tilvejebringe en maske, som forhindrer de potentielt aktive steder på partiklen i irreversibelt at binde antigenerne.

Barrieren fungerer også som en immobiliseret komponent i adsorbenten, hvortil antistofferne kan knyttes.

Da analyser udføres i vandige og ikke-vandige opløsningsmidler, er barrierebelægningen fortrinsvis uopløselig og påvirkes 147809 9 ikke i ugunstig retning af opløsningsmidlerne og af de opløsninger, der anvendes ved fremgangsmåden. Vanduopløselige polymermaterialer, såsom dextran, er fortrukne til brug i forbindelse med adsor-benten ifølge opfindelsen.

Selve adsorbenten er modstandsdygtig mod dehydratisering og sammenfald. En hurtig masseoverføring ved relativt store strømningshastigheder er en funktion af formen af adsorbenten og pakningsforholdene i kammerholderen. Et foretrukket materiale har en styret overfladeporøsitet omfattende overfladeporøse, tungtsmeltelige partikler dannet af adskilte makropartikler med uigennemtrængelige ikke-porøse kerner, og hvortil der er bundet en belægning af en række efter hinanden adsorberede, ens monolag af ens, uorganiske mi kroparti kier.

I figuren, der belyser opfindelsen, omfatter en overfladeporøs, tungtsmeltelig partikel 10, som danner adsorbenten, en kerne 12 i form af en makropartikel, som danner en uigennemtrængelig, ikke-porøs kerne. Kernen 12 er vist kugleformet, idet denne form . foretrækkes af hensyn til pakningen. Kernen i form af en kugle har en diameter på mellem 5 og 500 micron og er sammensat af glas men kan også bestå af sand, keramiske materialer o.I.

Kernerne er fortrinsvis af ensartet størrelse, d.v.s. at de alle ligger inden for ca. 50% af den gennemsnitlige diameter. Bundet til kernen 12 er en række lag af mi kroparti kier 14, som danner en ydre porøs belægning. Mi kroparti kiernes størrelse kan ligge mellem 5 millimicron og 1 micron, og antallet af lag kan være mellem 2 og 30.

Mi kroparti kierne kan bestå af amorf siliciumdioxid, aluminiumoxid, thoriumoxid o.I.

Adsorbenten har et relativt stort overfladeareal som følge af den porøse belægning 15 og er relativt fri for porer i kernematerialet. Med kugleformede legemer med en samlet diameter på 30 micron og en porøs skal på 1 micron opnås et overfladeareal på p mellem 0,8 og 1,0 m /g med en massefylde for et pakket lag på 1,5 3 g/cm . Den regulære geometriske opbygning, stabiliteten mod dehy-dratisering og sammenfald og voluminøsiteten gør ovennævnte materiale exceptionelt som adsorbent.

Der er imidlertid en tendens til, at et sådant materiale, såfremt det anvendes i den beskrevne form som direkte adsorbent for antistofmaterialet, indeholder aktive steder, som har tendens til at binde antigenblandingen eller en bestanddel heraf på en sådan måde, 147809 10 at den ikke kan frigøres. Dette problem kan være ret generende, når den immobiliserede immunoadsorbent genanvendes. Da analysenøj-agtigheden og den hastighed, hvormed analysen udføres, delvis afhænger af antistoffets evne til at binde antigenet og støkiometrisk at frigøre samme, når det skylles, vil eventuelt ikke-frigjort antigen på ugunstig måde påvirke nøjagtigheden af en efterfølgende analyse.

Selv om der kunne foretages en baggrundstælling, er dette ikke fuldt tilfredsstillende, idet tilbageholdelses-frigørelsesfænomenerne synes at være uensartede og uforudsigelige.

Ifølge opfindelsen kan denne tendens elimineres ved anvendelse af en barrierebelægning, som er bundet til adsorbenten ved hjælp af et silankoblingsmiddel, d.v.s. at polymeren er bundet direkte til de ydre dele af overfladen af adsorbenten med silanbin-dinger. Polymeren aktiveres derpå ved behandling med cyanogenbro-mid, som kovalent binder proteinet (antistoffet) til den polymeraktiverede partikelformede adsorbent. Polymerbelægningen virker ikke alene som en barriere, der effektivt maskerer latente aktive steder på den omhandlede adsorbent, men frembyder også en aktiv overflade, hvortil antistoffet kovalent kan bindes, idet der opnås en binding, som anses for at være relativt stærk.

Ved en typisk fremgangsmåde til fremstilling af adsorbenten ifølge opfindelsen sattes 12 g af et partikelformet materiale (overfladeporøse, tungtsmeltelige partikler med en diameter på 30 micron, som beskrevet ovenfor) til en 500 ml kolbe, hvortil der var sat 20 ml (18,84 g) 3-aminopropyltriethoxysilan og 180 ml toluen.

Blandingen tilbagesvaledes i 22 timer til dannelse af aminoalkylsilan-derivatet af det partikelformede materiale. Derivatet frafiltreredes, vaskedes med 200 ml toluen, medens det befandt sig på filterbærer-materialet og lufttørredes. Denne behandling efterfulgtes af en anden udvaskning med 100 ml chloroform og en anden lufttørring.

Isothiocyanoalkylsilanderivatet fremstilledes ved at behandle det fremstillede aminoalkylsilanglasderivat med 16,6 ml (25 g) thio-phosgen og 150 ml chloroform. Reaktionsbeholderen beskyttedes mod lys, og der gennemførtes en tilbagesvaling i 18 timer til dannelse af det beskrevne derivat, som frafiltreredes, vaskedes i chloroform og lufttørredes.

Resultatet af de beskrevne foranstaltninger var, at der fremstilledes en "aktiveret" adsorbent, hvortil den vanduopløselige polymer kan bindes.

U7809 11

Ifølge opfindelsen foretrækkes det at anvende dextran med en molekylvægt pi 70.000, selv om andre materialer også kan anvendes.

200 ml af en 1% opløsning af dextran i 0,1 M natriumhy-drogencarbonat med en pH-værdi på 9,0 sattes til den "aktiverede" adsorbent. Blandingen omrørtes i 3 timer, filtreredes, vaskedes med 300 ml vand og derpå med 100 ml acetone samt lufttørredes til dannelse af 11,6 g polymerbelagt partikelformet adsorbent.

De resterende trin omfatter aktiveringen af den polymerbelagte adsorbent og eventuelt rensningen af antistoffet og fastbindingen af antistoffet til den belagte overflade. Dette betegnes undertiden som konjugeringen af antistoffet til den fremstillede adsorbent.

For at aktivere dextranen opløstes 20 g cyanogenbromid i 200 ml vand. Cyanogenbromid er ret toksisk, og der tages derfor standard-sikkerhedsforanstaltninger. Den dextranbelagte adsorbent (11,6 g) tilsattes derpå, og blandingen omrørtes. pH-værdien forøgedes fra 3,6 til 10-11 ved anvendelse af 23 ml 6N natriumhydroxid. pH-værdien holdtes mellem 10 og 11 ved tilsætning af 6N natriumhydroxid i 2 minutter. Den aktiverede dextranbelagte adsorbent vaskedes derpå med 400 ml vand, 400 ml 50% blanding (på volumenbasis) af vand og acetone, 400 ml 25% blanding (på volumenbasis) af vand og acetone og endelig 400 ml acetone. Produktet lufttørredes derpå.

Behandlingen af den polymerbelagte adsorbent med cyanogenbromid resulterer i en reaktion med hosliggende hydroxylgrupper på polymeren til dannelse af et imidocarbonat, som kobler med de nucleofile grupper (aminogrupper) på antistoffet til dannelse af kulsyreesteren ved hydrolyse. En hurtig hydrolyse af imidocarbona-tet i sure medier resulterer i dannelsen af et cyklisk carbonat, som ikke er så effektivt med hensyn til binding som imidocarbonatet. Der må således drages omsorg for at undgå betingelser, som fremmer dannelsen af et cyklisk carbonat.

En simpel rensning af antistoffet forud for konjugeringen kan eventuelt udføres på følgende måde: 1 ml 18% natriumsulfatopløs-ning sattes til 0,1 ml af de anvendte antisera. Opløsningen omrørtes og inkuberedes i 1 time til udfældning af gammaglobuliner. Den dannede blanding centrifugeredes derpå i 5 minutter ved 1000 G ved stuetemperatur efterfulgt af dekantering og bortskaffelse af den øverstliggende væske. De opnåede pellets suspenderedes i 10 ml 18% natriumsulfatopløsning ved en tilsætning af 0,10 ml vand. Den dan 147809 12 nede blanding omrørtes derpå og centrifugeredes igen. Den øverstliggende væske fjernedes ved dekantering, medens de dannede pellets opløstes i 0,8 ml 0,1M natriumhydrogencarbonatopløsning.

Det foretrækkes at konjugere antistoffet ti! adsorbenten, medens antistoffet er mættet med det antigen, overfor hvilket det er specifikt. Formålet hermed er at opnå en forbedret aktivitet ved at beskytte de aktive steder på antistoffet under konjugeringsprocedu-ren og således sikre, at antistoffet indtager en sådan stilling i forhold til adsorbenten, at aktive steder er tilgængelige. Bindingen af de aktive steder med antigen muliggør i nogen grad en orientering af antistoffet, som reducerer afdækningen af bindingsstederne ved konjugeringsmetoden.

Således opløstes en 0,5 ml aliquot af en opløsning indeholdende 0,1 mg/ml af antigen, som er specifikt i forhold til antistoffet, i en ethanol-vandopløsning (to dele ethanol og en del vand) og udtørredes i et reagensglas med nitrogengas. De rensede antisera opløst i 0,8 ml 0,1M natriumhydrogencarbonatopløsning eller 0,1 ml antisera i 0,8 ml 0,1IVI natriumhydrogencarbonatopløsning sattes til reagensglasset indeholdende det tørrede antigen efterfulgt af en inkubering i en time i et tillukket dyrkningsglas. Derefter sattes 300 mg af den cyanogenaktiverede, polymerbelagte adsorbent til glasset indeholdende antistofopløsningen, og der inkuberedes i 1 til 3 dage ved 4°C under omrøring. Under inkuberingen sker der en konjuge-ring med antistoffet, som har antigenbindingsstederne beskyttet af bundet antigen.

Efter inkubering centrifugeredes suspensionen ved 1000 G i 5 minutter, og den øverstliggende væske fradekanteredes og bortkastedes. De opnåede pellets vaskedes 2 gange med 10 ml 0,5M na-triumhydrogencarbonatopløsning. Efter hver udvaskning centrifugeredes suspensionen, og den øverstliggende væske bortkastedes. Den antistofbelagte adsorbent vaskedes derpå 2 gange med 10 ml 0,1M acetatpuffer med en pH-værdi på 4. Den antistofbelagte adsorbent vaskedes derpå med 10 ml 0,05M phosphatpuffer med en pH-værdi på 7,5 indeholdende 0,05M natriumchlorid og 0,5% okseserumalbumin samt 0,02% natriumazid som konserveringsmiddel. Det dannede produkt gensuspenderedes derpå i 10 ml af den sidste vaskeopløsning og opbevaredes ved 4°C.

Det resulterende produkt skylles forud for anvendelsen ved en analyse med en af de ovenfor beskrevne opløsninger til 147809 13 frigørelse af antigenet, som er bundet til det immobiliserede antistof.

Under oplagring foretrækkes det imidlertid, at antigenet forbliver bundet til antistoffet.