DK146447B - Fremgangsmaade til udvinding af renset riboflavin - Google Patents

Description

i U6447

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af renset riboflavin fra en riboflavinholdig fermenteringsvæske, hvorved dér opnås et produkt, der er direkte anvendeligt som dyrefodersupplement eller 5 tilpasseligt til yderligere rensning til farmaceutisk anvendelse.

Fremstillingen af riboflavin (vitamin B£) ved fermenteringsmetoder er kendt i teknikken, se f.eks. US patentskrifterne nr. 2 387 023, 2 445 128, 2 483 455 og 10 2 571 896. Konventionelle metoder til isolering af det ved fermentering fremstillede riboflavin giver imidlertid ret urent riboflavin, der må renses, før det er anvendeligt selv som supplement til dyrefoder. Rensningsbehandlingen for riboflavin er ikke blot tidsforbrugen-15 de og kostbar, men involverer ofte tilstande, under hvilke riboflavin er ustabilt og danner spildprodukter, der ikke er let bionedbrydelige.

Det tilsigtes følgelig med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en forbedret metode til udvin-20 ding af riboflavin, og fremgangsmåden ifølge opfindel sen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte. Den omhandlede fremgangsmåde er yderst økonomisk og giver maksimal riboflavin-udvinding.

Udgangsmaterialet for den foreliggende opfindelse er 25 som nævnt en riboflavin-fermenteringsvæske. Fremstil ling af riboflavin ved fermentering er velkendt og består i korte træk i, at man steriliserer et næringssubstrat og poder det med en organisme, der er i stand til at danne riboflavin. Når gæringsudbyttet nærmer 30 sig eller omtrent er ved det maksimale, varmes væsken til en temperatur på fra ca. 50 °C til 65 °C i fra ca.

15 til 45 minutter, fortrinsvis i fra ca. 25 til 35 minutter. Denne opvarmning tjener til at lysere cellerne og til at formindske væskens viskositet, hvorigennem 2 U6447 man forøger effektiviteten af de efterfølgende indvindings- og oprensningstrin. Opvarmning ud over ca. 45 minutter er uønskelig, eftersom dette forøger snarere end formindsker væskens viskositet.

5 Væsken køles derpå og fortyndes med en forud fastlagt mængde vand. Den valgte mængde vand er utilstrækkelig til at opløse faste bestanddele, der er suspenderet i fermenteringsvæsken, men den er tilstrækkelig til at optimere centrifugal-separation såvel ved fortynding 10 af de forinden opløste faste stoffer i væsken som ved at fremme adskillelsen af suspenderede faste partikler, der har en vægtfylde mindre end vægtfylden for krystallinsk riboflavin. Denne tilsatte mængde vand er fra ca.

25 til ca. 100 rumfangsprocent af fermenteringsvæskens 15 rumfang, fortrinsvis er den fra ca. en tredjedel til ca. halvdelen af rumfanget af fermenteringsvæsken.

Et proteolytisk enzym kan være til stede under opvarmningen, eller det kan tilsættes efter opvarmningen.

Man tillader enzymet at fordøje proteinholdigt mate-20 riale i adskillige timer i almindelighed fra ca. 1 til ca. 5 timer, fortrinsvis i fra ca. 3 til ca. 4 timer.

Under enzymbehandlingen justeres pH til et niveau, ved hvilket enzymet virker mest effektivt, i almindelighed til et pH på fra ca. 6,0 til ca. 9,0. Væsken køles der-25 på og pH, dersom dette er alkalisk, justeres til ca.

pH 7,0.

Den fortyndede væske enten med eller uden forudgående enzymbehandling omdannes derpå til et slam ved centrifugering. Slammet bringes derpå igen i suspension med 30 en forud fastlagt mængde vand. Den valgte mængde vand er utilstrækkelig til at opløse faste stoffer, der er suspenderet i det på ny suspenderede slam, men tilstrækkelig stor til at optimere adskillelsen af faste partikler, der har en vægtfylde mindre end vægtfylden for 3 146447 krystallinsk riboflavin. Denne mængde vand er lig med fra ca. 1 rumfang til ca. 3 rumfang pr. rumfang slam, fortrinsvis er den ca. 2 gange slammets rumfang. Beregnet på tørstof indeholder det på ny i suspension bragte 5 slam fra ca. 15 til 30 vaegtpct. fast stof. Det på ny suspenderede slam centrifugeres derpå, hvilket fører til et centrifugat, der er anvendeligt som sådanc som tilskud til dyrefoder.

Eksempler på enzymer, der er egnede til anvendelse ved 10 udførelsen af den foreliggende opfindelse, er alkaliske proteaser, såsom B. s’ubstilis protease, eller neutrale proteaser og B. amylofaciens protease, eller neutrale proteaser, såsom neutralt B. subtilis protease. Sådanne enzymer er kommercielt tilgængelige, et egnet alkalisk 15 proteaseenzym er f.eks. Rhozyme P-62, der leveres af

Rohm and Haas Co., og et egnet neutralt proteaseenzym er Enzeco Bacterial Protease, der leveres af Enzyme Development Corp.

De følgende eksempler illustrerer den foreliggende op-20 findelse yderligere. Hvor intet andet er anført, er al le temperaturer angivet i °C.

EKSEMPEL 1 1 liter riboflavin-fermenteringsvæske opvarmes til 60° i 30 minutter efter afslutningen af fermenteringen.

25 Væsken køles derpå til 25° og fortyndes til 1,4 liter med destilleret vand. Den fortyndede væske centrifugeres, og centrifugatet bringes på ny i suspension i 2 rumfang vand og centrifugeres igen. Renheden af det således fremstillede centrifugat er tre gange større 30 end renheden af ubehandlet, tørret fermenteringsvæske, og det er af tilstrækkelig stor renhed til at tillade anvendelse deraf som et dyrefodertilskud uden yderligere behandling.

U6U7 4 EKSEMPEL 2 X liter riboflavin-fermenteringsvæske opvarmes til 60° i 30 minutter efter afslutning af fermenteringen, derpå tilsættes en mængde svarende til 0r0.68 g B-subtilis alkalisk 5 protease med en casein-enhedsaktivitet på 3,65, og den får lov til at indvirke i 3 timer. En casein-enhed defineres som evnen for 1 g enzym til at solubilisere 270 g azo-casein på 1 time ved 40° og ved pH 8,0. Efter opvarmning køles væsken til 25°, neutraliseres til pH 7»0 og for-10 tyndes til 1,4 liter med destilleret vand. Den fortyndede væske centrifugeres, og centrifugatet bringes på ny i suspension i 2 rumfang vand og centrifugeres igen. Renheden af det således fremstillede centrifugat er 20% større, end det var tilfældet i eksempel 1.

15 EKSEMPEL 3

En prøve riboflavin-fermenteringsvæske bearbejdes nøjagtigt analogt med eksempel 2, men under anvendelse af 0,48 g af en B. ligninoformis alkalisk protease med 3»0 Anson-enheders aktivitet i stedet for B. subtilis alka-20 lisk protease. En Anson-enhed defineres som det antal gram hæmoglobin, der fordøjes af 1 g enzym på 10 minutter ved 25° og ved pH 10,1, og som ikke udfældes af tilsat trichloreddikesyre. Renheden af det enzymbehandlede slam er 27% større end renheden af det ikke-enzymbehandlede slam.

25 Det enzymbehandlede slam er 3>4 gange renere end ubehandlet, tørret fermenteringsvæske.

Enzymbehandlingen af fermenteringsvæsken kan udføres samtidig med en varme-sterilisationsbehandling i fermenteringsvæsken under opnåelse af lignende resul-30 tater.

146447 . 5 EKSEMPEL 4

En portion på 553 ml pasteuriseret riboflavin fermenteringsvæske podes med 10 ml B. subtilis (National Collection Type Culture Nr. 3610) næringssubstratpodningskultur.

5 Fermenteringen får lov til at fortsætte 48 timer ved 37°.

Mængden af faste stoffer i suspension falder 72% under fermenteringen. Den med B. subtilis fermenterede væske opvarmes til 60°C i 30 minutter, fortyndes til 750 ml med vand og centrifugeres. Centrifugatet bringes i suspension med 200 10 ml vand og centrifugeres på ny. Centrifugatet er 53% renere end en kontrolprøve, der ikke er fermenteret med B. subtilis, og det er 4,4 gange renere end tørret fermenteringsvæske.

EKSEMPEL 5

Fremgangsmåden i eksempel 1 gentages med undtagelse af, 15 at man før centrifugering bringer det på ny suspenderede centrifugat til pH lig med 8,0 og at man opvarmer til 60°.

Man tilsætter 0,049 g B. subtilis alkalisk proteaseenzym med en aktivitet på 3,65 casein-enheder, og man lader det reagere igennem 3 timer. Opslæmningen køles, neutra-20 liseres og centrifugeres. Renheden af centrifugatet er 41% større end renheden af en kontrolprøve, der ikke er underkastet nogen enzymbehandling. En tilsvarende enzymbehandling udført på den samme væske fra samme fermenteringsproduktion førte kun til 20% forøget renhed sammenlig-25 net med kontrolprøven.