DK146447B

DK146447B - Process for recovering purified riboflavin

Info

Publication number: DK146447B
Application number: DK199479A
Authority: DK
Inventors: Albert Epstein; Glen Graham; William Arthur Sklarz
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1979-05-15
Filing date: 1979-05-15
Publication date: 1983-10-10
Also published as: DK146447C; DK199479A

Description

i U6447in U6447

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af renset riboflavin fra en riboflavinholdig fermenteringsvæske, hvorved dér opnås et produkt, der er direkte anvendeligt som dyrefodersupplement eller 5 tilpasseligt til yderligere rensning til farmaceutisk anvendelse.The present invention relates to a process for recovering purified riboflavin from a riboflavin-containing fermentation liquid, thereby obtaining a product directly usable as animal feed supplement or adaptable for further purification for pharmaceutical use.

Fremstillingen af riboflavin (vitamin B£) ved fermenteringsmetoder er kendt i teknikken, se f.eks. US patentskrifterne nr. 2 387 023, 2 445 128, 2 483 455 og 10 2 571 896. Konventionelle metoder til isolering af det ved fermentering fremstillede riboflavin giver imidlertid ret urent riboflavin, der må renses, før det er anvendeligt selv som supplement til dyrefoder. Rensningsbehandlingen for riboflavin er ikke blot tidsforbrugen-15 de og kostbar, men involverer ofte tilstande, under hvilke riboflavin er ustabilt og danner spildprodukter, der ikke er let bionedbrydelige.The preparation of riboflavin (vitamin B £) by fermentation methods is known in the art, see e.g. U.S. Patent Nos. 2,387,023, 2,445,128, 2,483,455, and 10,571,896. Conventional methods for isolating the riboflavin produced by fermentation, however, provide fairly unclean riboflavin which must be purified before it is useful even as a supplement to animal feed. . The purification treatment for riboflavin is not only time-consuming and costly, but often involves conditions under which riboflavin is unstable and forms wastes that are not readily biodegradable.

Det tilsigtes følgelig med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en forbedret metode til udvin-20 ding af riboflavin, og fremgangsmåden ifølge opfindel sen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte. Den omhandlede fremgangsmåde er yderst økonomisk og giver maksimal riboflavin-udvinding.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an improved method for the extraction of riboflavin and the process of the invention is characterized by the characterizing part of claim 1. The present process is extremely economical and provides maximum riboflavin recovery.

Udgangsmaterialet for den foreliggende opfindelse er 25 som nævnt en riboflavin-fermenteringsvæske. Fremstil ling af riboflavin ved fermentering er velkendt og består i korte træk i, at man steriliserer et næringssubstrat og poder det med en organisme, der er i stand til at danne riboflavin. Når gæringsudbyttet nærmer 30 sig eller omtrent er ved det maksimale, varmes væsken til en temperatur på fra ca. 50 °C til 65 °C i fra ca.The starting material of the present invention is, as mentioned, a riboflavin fermentation liquid. The production of riboflavin by fermentation is well known and consists briefly in sterilizing a nutrient substrate and inoculating it with an organism capable of forming riboflavin. When the fermentation yield is approaching or is about the maximum, the liquid is heated to a temperature of from ca. 50 ° C to 65 ° C for approx.

15 til 45 minutter, fortrinsvis i fra ca. 25 til 35 minutter. Denne opvarmning tjener til at lysere cellerne og til at formindske væskens viskositet, hvorigennem 2 U6447 man forøger effektiviteten af de efterfølgende indvindings- og oprensningstrin. Opvarmning ud over ca. 45 minutter er uønskelig, eftersom dette forøger snarere end formindsker væskens viskositet.15 to 45 minutes, preferably from about 25 to 35 minutes. This heating serves to brighten the cells and to reduce the viscosity of the liquid, thereby increasing the efficiency of the subsequent recovery and purification steps. Heating beyond approx. 45 minutes is undesirable as this increases rather than decreases the viscosity of the liquid.

5 Væsken køles derpå og fortyndes med en forud fastlagt mængde vand. Den valgte mængde vand er utilstrækkelig til at opløse faste bestanddele, der er suspenderet i fermenteringsvæsken, men den er tilstrækkelig til at optimere centrifugal-separation såvel ved fortynding 10 af de forinden opløste faste stoffer i væsken som ved at fremme adskillelsen af suspenderede faste partikler, der har en vægtfylde mindre end vægtfylden for krystallinsk riboflavin. Denne tilsatte mængde vand er fra ca.5 The liquid is then cooled and diluted with a predetermined amount of water. The amount of water selected is insufficient to dissolve solids suspended in the fermentation liquid, but it is sufficient to optimize centrifugal separation both by diluting 10 the pre-dissolved solids in the liquid and by promoting the separation of suspended solids. having a density less than that of crystalline riboflavin. This added amount of water is from approx.

25 til ca. 100 rumfangsprocent af fermenteringsvæskens 15 rumfang, fortrinsvis er den fra ca. en tredjedel til ca. halvdelen af rumfanget af fermenteringsvæsken.25 to approx. 100% by volume of the volume of the fermentation liquid, preferably it is from approx. one third to approx. half the volume of the fermentation liquid.

Et proteolytisk enzym kan være til stede under opvarmningen, eller det kan tilsættes efter opvarmningen.A proteolytic enzyme may be present during heating or it may be added after heating.

Man tillader enzymet at fordøje proteinholdigt mate-20 riale i adskillige timer i almindelighed fra ca. 1 til ca. 5 timer, fortrinsvis i fra ca. 3 til ca. 4 timer.The enzyme is allowed to digest proteinaceous material for several hours generally from 1 to approx. 5 hours, preferably for about 5 hours. 3 to approx. 4 hours.

Under enzymbehandlingen justeres pH til et niveau, ved hvilket enzymet virker mest effektivt, i almindelighed til et pH på fra ca. 6,0 til ca. 9,0. Væsken køles der-25 på og pH, dersom dette er alkalisk, justeres til ca.During the enzyme treatment, the pH is adjusted to a level at which the enzyme works most effectively, generally to a pH of from ca. 6.0 to approx. 9.0. The liquid is then cooled and the pH, if alkaline, is adjusted to approx.

pH 7,0.pH 7.0.

Den fortyndede væske enten med eller uden forudgående enzymbehandling omdannes derpå til et slam ved centrifugering. Slammet bringes derpå igen i suspension med 30 en forud fastlagt mængde vand. Den valgte mængde vand er utilstrækkelig til at opløse faste stoffer, der er suspenderet i det på ny suspenderede slam, men tilstrækkelig stor til at optimere adskillelsen af faste partikler, der har en vægtfylde mindre end vægtfylden for 3 146447 krystallinsk riboflavin. Denne mængde vand er lig med fra ca. 1 rumfang til ca. 3 rumfang pr. rumfang slam, fortrinsvis er den ca. 2 gange slammets rumfang. Beregnet på tørstof indeholder det på ny i suspension bragte 5 slam fra ca. 15 til 30 vaegtpct. fast stof. Det på ny suspenderede slam centrifugeres derpå, hvilket fører til et centrifugat, der er anvendeligt som sådanc som tilskud til dyrefoder.The diluted liquid either with or without prior enzyme treatment is then converted to a sludge by centrifugation. The slurry is then brought back into suspension with a predetermined amount of water. The amount of water selected is insufficient to dissolve solids suspended in the newly suspended sludge, but sufficiently large to optimize the separation of solids having a density less than the density of crystalline riboflavin. This amount of water is equal to from approx. 1 volume to approx. 3 volumes per volume of sludge, preferably it is ca. 2 times the volume of the sludge. Calculated on dry matter, it contains 5 sludges from suspension in approx. 15 to 30 weight percent solid. The resuspended sludge is then centrifuged, leading to a centrifugate useful as such as supplementation for animal feed.

Eksempler på enzymer, der er egnede til anvendelse ved 10 udførelsen af den foreliggende opfindelse, er alkaliske proteaser, såsom B. s’ubstilis protease, eller neutrale proteaser og B. amylofaciens protease, eller neutrale proteaser, såsom neutralt B. subtilis protease. Sådanne enzymer er kommercielt tilgængelige, et egnet alkalisk 15 proteaseenzym er f.eks. Rhozyme P-62, der leveres afExamples of enzymes suitable for use in the practice of the present invention are alkaline proteases such as B.substilis protease, or neutral proteases and B. amylofaciens protease, or neutral proteases such as neutral B. subtilis protease. Such enzymes are commercially available; a suitable alkaline protease enzyme is e.g. Rhozyme P-62 provided by

Rohm and Haas Co., og et egnet neutralt proteaseenzym er Enzeco Bacterial Protease, der leveres af Enzyme Development Corp.Rohm and Haas Co., and a suitable neutral protease enzyme is Enzeco Bacterial Protease, supplied by Enzyme Development Corp.

De følgende eksempler illustrerer den foreliggende op-20 findelse yderligere. Hvor intet andet er anført, er al le temperaturer angivet i °C.The following examples further illustrate the present invention. Where nothing else is stated, all temperatures are given in ° C.

EKSEMPEL 1 1 liter riboflavin-fermenteringsvæske opvarmes til 60° i 30 minutter efter afslutningen af fermenteringen.EXAMPLE 1 1 liter of riboflavin fermentation liquid is heated to 60 ° for 30 minutes after the end of the fermentation.

25 Væsken køles derpå til 25° og fortyndes til 1,4 liter med destilleret vand. Den fortyndede væske centrifugeres, og centrifugatet bringes på ny i suspension i 2 rumfang vand og centrifugeres igen. Renheden af det således fremstillede centrifugat er tre gange større 30 end renheden af ubehandlet, tørret fermenteringsvæske, og det er af tilstrækkelig stor renhed til at tillade anvendelse deraf som et dyrefodertilskud uden yderligere behandling.The liquid is then cooled to 25 ° and diluted to 1.4 liters with distilled water. The diluted liquid is centrifuged and the centrifugate resuspended in 2 volumes of water and centrifuged again. The purity of the centrifugate thus prepared is three times greater than the purity of untreated, dried fermentation liquid, and it is of sufficient purity to permit its use as an animal feed supplement without further processing.

U6U7 4 EKSEMPEL 2 X liter riboflavin-fermenteringsvæske opvarmes til 60° i 30 minutter efter afslutning af fermenteringen, derpå tilsættes en mængde svarende til 0r0.68 g B-subtilis alkalisk 5 protease med en casein-enhedsaktivitet på 3,65, og den får lov til at indvirke i 3 timer. En casein-enhed defineres som evnen for 1 g enzym til at solubilisere 270 g azo-casein på 1 time ved 40° og ved pH 8,0. Efter opvarmning køles væsken til 25°, neutraliseres til pH 7»0 og for-10 tyndes til 1,4 liter med destilleret vand. Den fortyndede væske centrifugeres, og centrifugatet bringes på ny i suspension i 2 rumfang vand og centrifugeres igen. Renheden af det således fremstillede centrifugat er 20% større, end det var tilfældet i eksempel 1.EXAMPLE 2 X liter of riboflavin fermentation liquid is heated to 60 ° for 30 minutes after the fermentation is completed, then an amount corresponding to 0.68 g of B-subtilis alkaline protease with a casein unit activity of 3.65 is added. allowed to take effect for 3 hours. A casein unit is defined as the ability of 1 g of enzyme to solubilize 270 g of azo-casein in 1 hour at 40 ° and at pH 8.0. After heating, the liquid is cooled to 25 °, neutralized to pH 7 0 and diluted to 1.4 liters with distilled water. The diluted liquid is centrifuged and the centrifugate resuspended in 2 volumes of water and centrifuged again. The purity of the centrifugate thus prepared is 20% greater than was the case in Example 1.

15 EKSEMPEL 3EXAMPLE 3

En prøve riboflavin-fermenteringsvæske bearbejdes nøjagtigt analogt med eksempel 2, men under anvendelse af 0,48 g af en B. ligninoformis alkalisk protease med 3»0 Anson-enheders aktivitet i stedet for B. subtilis alka-20 lisk protease. En Anson-enhed defineres som det antal gram hæmoglobin, der fordøjes af 1 g enzym på 10 minutter ved 25° og ved pH 10,1, og som ikke udfældes af tilsat trichloreddikesyre. Renheden af det enzymbehandlede slam er 27% større end renheden af det ikke-enzymbehandlede slam.A sample of riboflavin fermentation liquid is processed exactly analogously to Example 2, but using 0.48 g of a B. ligninoformis alkaline protease with activity of 3 0 Anson units instead of B. subtilis alkaline protease. An Anson unit is defined as the number of grams of hemoglobin digested by 1 g of enzyme in 10 minutes at 25 ° and at pH 10.1, and which is not precipitated by added trichloroacetic acid. The purity of the enzyme-treated sludge is 27% greater than the purity of the non-enzyme-treated sludge.

25 Det enzymbehandlede slam er 3>4 gange renere end ubehandlet, tørret fermenteringsvæske.The enzyme-treated sludge is 3> 4 times cleaner than untreated, dried fermentation liquid.

Enzymbehandlingen af fermenteringsvæsken kan udføres samtidig med en varme-sterilisationsbehandling i fermenteringsvæsken under opnåelse af lignende resul-30 tater.The enzyme treatment of the fermentation liquid can be carried out simultaneously with a heat sterilization treatment in the fermentation liquid to obtain similar results.

146447 . 5 EKSEMPEL 4146447. EXAMPLE 4

En portion på 553 ml pasteuriseret riboflavin fermenteringsvæske podes med 10 ml B. subtilis (National Collection Type Culture Nr. 3610) næringssubstratpodningskultur.A portion of 553 ml of pasteurized riboflavin fermenter is seeded with 10 ml of B. subtilis (National Collection Type Culture No. 3610) nutrient substrate seed culture.

5 Fermenteringen får lov til at fortsætte 48 timer ved 37°.5 The fermentation is allowed to continue for 48 hours at 37 °.

Mængden af faste stoffer i suspension falder 72% under fermenteringen. Den med B. subtilis fermenterede væske opvarmes til 60°C i 30 minutter, fortyndes til 750 ml med vand og centrifugeres. Centrifugatet bringes i suspension med 200 10 ml vand og centrifugeres på ny. Centrifugatet er 53% renere end en kontrolprøve, der ikke er fermenteret med B. subtilis, og det er 4,4 gange renere end tørret fermenteringsvæske.The amount of solids in suspension drops 72% during the fermentation. The fermented B. subtilis liquid is heated to 60 ° C for 30 minutes, diluted to 750 ml with water and centrifuged. The centrifugate is suspended with 200 ml of water and centrifuged again. The centrifugate is 53% cleaner than a control sample not fermented with B. subtilis and it is 4.4 times cleaner than dried fermentation liquid.

EKSEMPEL 5EXAMPLE 5

Fremgangsmåden i eksempel 1 gentages med undtagelse af, 15 at man før centrifugering bringer det på ny suspenderede centrifugat til pH lig med 8,0 og at man opvarmer til 60°.The procedure of Example 1 is repeated except that before centrifugation, the resuspended centrifugate is brought to pH equal to 8.0 and heated to 60 °.

Man tilsætter 0,049 g B. subtilis alkalisk proteaseenzym med en aktivitet på 3,65 casein-enheder, og man lader det reagere igennem 3 timer. Opslæmningen køles, neutra-20 liseres og centrifugeres. Renheden af centrifugatet er 41% større end renheden af en kontrolprøve, der ikke er underkastet nogen enzymbehandling. En tilsvarende enzymbehandling udført på den samme væske fra samme fermenteringsproduktion førte kun til 20% forøget renhed sammenlig-25 net med kontrolprøven.0.049 g of B. subtilis alkaline protease enzyme with an activity of 3.65 casein units is added and allowed to react for 3 hours. The slurry is cooled, neutralized and centrifuged. The purity of the centrifugate is 41% greater than the purity of a control sample that is not subjected to any enzyme treatment. A similar enzyme treatment performed on the same liquid from the same fermentation production resulted in only 20% increased purity compared to the control sample.