DK145932B - Fremgangsmaade til fremstilling af substituerede cobamider - Google Patents

Description

(19) DANMARK (^)

lp (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 145932 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 4852/71 (51) lnt.CI.3 C 07 H 23/00 (22) Indleveringsdag 6· okt. 1971 (24) Løbedag 6. okfc. 1971 (41) Aim. tilgængelig 7· apr. 1972 (44) Fremlagt 18. apr. 1983 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag (62) Stamansøgning nr.

(30) Prioritet 6. okt. 1970, 7035985, FR

(71) Ansøger ROUSSEL-UCLAF S.A., Paris 7e, FR.

(72) Opfinder Lucien Penas se, FR: Pierre Bartheleray, FR.

(74) Fuldmægtig Patentagentfirraaet Magnus Jensens Eftf.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af substituerede cobamider.

Opfindelsen angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af analoge af vitamin B^· Opfindelsen angår nærmere betegnet en fremgangsmåde til fremstilling af cobamider med en carbonhydridgruppe R’ bundet til cobaltatomet. Disse forbindelser skal her betegnes Co-R’-cobamider, idet R' betegner en (Q alkylgruppe med 1-4 carbonatomer.

CM Strukturen af vitamin B, 9 er velkendt. Det er et kom- ro ^ plekst molekyle, som omfatter et centralt cobaltatom, som er bundet til forskellige grupper, bl.a, en cyangruppe, ved v- covalente eller halvpolære bindinger: *

Q

2 U5932 h3c ^ε3 H2N“f° A ^ X ΝΗ- \/ «2«? \ /7 \/ \ yCH -CH -C=0 \ Χ?Η γ Υ' 2 2

Α> ri A

Vs/ \% V

>\ *co® 7”CH3 .

\ /t\ /

>-Ν I N=^C

V I j \/CH3 o=c-ch2-ch2\. I H^\ / sch2 X ' \

• A-CH A ' I CH

2 , ®2 \2 , c=o "ΆνΝ °H \2 \ m 2 o y %c \y— HO 'Η 3 145932

Man kender ligeledes talrige analoge af vitamin B12, hvori molekylet er modificeret. I det nucleotide fragment kan Basen (5,6-dimethylbenzimidazol i tilfælde af vitamin B-^) f.eks. være erstattet med en anden heterocyklisk Base såsom 5-hydroxyBenzimida-zol, 5 -me thoxybenzimid az ol, naphthimid az ol, adenin, 2 -me thy lad enin, xanthin, hypoxanthin, 2-methylhypoxanthin og guanin. Hiosphatgruppen kan være Bundet til forskellige carBonatomer i riBosefragmentet.

Isopropylaminofragmentet kan være erstattet med en anden alkyl-aminokæde. liucleotidfragmentet kan være fraværende som i coBinamid eller faktor B eller erstattet med en CH- eller OH-gruppe. Amid-grupperne CO-NHg han være omdannet til carBoxylgrupper, som kan være esterificeret eller omdannet til andre amider.

Cyangruppen kan være erstattet med en sådan gruppe som hydroxyl, halogen (chlor, Brom eller iod), en sulfito-, nitrito-, thiocyanato-, cyanato- eller HH^-gruppe eller en histidingruppe eller en eventuelt suBstitueret carBonhydridgruppe såsom methyl eller 5*-desoxyadenosyl.

CoBaltatomet kan ligeledes forefindes i form af sine forskellige naturlige eller kunstige isotoper.

Alle ovennævnte forbindelser er Beskrevet i arbej-der om vitamin B^2 og dets analoge. Disse forBindelser skal her betegnes Co-Y-eobamider eller også Y-substituerede cobamider, idet det vil forstås, at det ene eller det andet af disse to udtryk ligeledes finder anvendelse i det tilfælde, hvor amidgrupperne i det betragtede molekyle er modificeret.

I disse udtryk Betegner Y især cyangruppen eller en af de ovenfor nævnte grupper, som kan suBstitueres for CN.

Blandt Co-Y-cobamiderne skal især nævnes Co-R-cobamiderne, hvor R Betegner en carBonhydridgruppe, som er bundet til cobalt-atomet ved en carbon-cobalt-Binding. Disse forbindelser, som allerede er beskrevet i litteraturen, har interessante Biologiske egenskaber. Co-R-cobamiderne i almindelighed og i særdeleshed methyl-eobalamin finder anvendelse ved de forsøg og den terapi, som er bundet til vitamin B^2’s metabolisme, især i henseende til methylcobal-arnin i den anaboliske proces, som er knyttet til biosyntesen af methionin.

Co-R-cobamiderne er hidtil blevet fremstillet ved reduktion af et Co-Y-cobamid, især et hydroxocobamid (Y = OH) efterfulgt af 4 145932 ' indvirkning af et alkyleringsmid de 1, som frembringer kationer R+. Denne reaktionsfølge kan gengives ved følgende skema, idet man betragter reduktionen som en erobring af elektroner (e“)i r T λ r n K * 31

Co® ti , Co R® j Co® s t \© / t \© . S t \e +T®

En sådan fremgangsmåde er beskrevet i fransk patentskrift 1*450.375 og i tysk patentskrift 1.213.842.

E. Wagner og K. Berahauer (inn. H.Y. Åcad. Sci. (1964) side 580-589) bar vist, at alkylering af cobalt i corrinoider ved hjælp af en alkylanion er mulig. Således har disse forfattere udført methylering af cobaltatomet i heptaethylesteren af dicyan-cobyrinsyre ved hjælp af methylmagnesiumiodid og ved hjælp af metbyllithium. Det benyttede opløsningsmiddel er en blanding af ether og tetrahydrofuran.

Det er vigtigt at bemærke, at heptaethylesteren af dicyan-eobyrinsyren er opløselig i sådanne organiske opløsningsmidler som en blanding af ether og tetrahydrofuran, så at Wagner og Bernhauer har benyttet meget reaktionsdygtige organometalforbin-delser såsom ©t magnesium- eller lithiumderivat. Imidlertid er den af disse forfattere beskrevne reaktion ikke begrænset til alkyle-ringen af cobalt, men man bemærker, at molekylets estergrupper ligeledes angribes og omdannes til tertiære alkoholer.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af substituerede cobamider, som er betegnet Co-R’-cob-amider, idet R‘ betegner en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, som er direkte knyttet til molekylets cobaltatom, og denne fremgangsmåde er ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l*s kendetegnende del anførte.

Det vides, at organometal- eller organometalloidderiva-terne er meget reaktionsdygtige og er i stand til at indvirke på talrige funktionelle grupper i organiske molekyler. Men vitamin B12 og dets analoge er komplekse molekyler, som har et stort antal centre, som er i stand til at reagere med organometal- og organometalloidderivater.

c 145932 5 Således kan man ikke benytte de af Wagner og Bernhauer angivne organometalforbindelser. ligeledes er brugen af Wagner og Bernhauers organometalforbindelser udelukket, fordi de vil blive ødelagt af opløsningsmidlet, idet Co-Z-cobamiderne principielt kun er opløselige i vand eller lavmolekylære alkanoler.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen tillader imidlertid al-kylering af cobaltatomet i eobamiderne uden forandring af de andre reaktionscentre i molekylet, og fremgangsmåden har derved en uventet karakter, let skal bemærkes, at man her ved alkylering af cobaltatomet skal forstå reaktionen til dannelse af en eobalt-car-, bon-binding mellem carbonhydridgruppen R' og cobaltatomet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er bemærkelsesværdig ved sin store enkelhed og ved de konstaterede store udbytter.

Dannelsesreaktionen for Co-R'-eobamiderne kan enten udføres i opløsning eller i suspension.

Opløsningsmidlerne for eobamiderne er først og fremmest vand og lavmolekylære alkanoler, især methanol og ethanol.

Det er altså nødvendigt at vælge et R '-metal- eller R*-metalloidreagens, som tillader selektiv alkylering af cobaltatomet i Co-Z-eobamid, som er opløseligt i vand eller i lavmolekylære alkanoler, og som ikke reagerer med disse opløsningsmidler.

Desuden er det nødvendigt, at det er i stand til at ophæve

Oo-Z-bindingen uden at påvirke de andre funktionelle grupper i cobamidmolekylet. Sådanne reagenser er de i krav 1 nævnte.

I det tilfælde, hvor man benytter siliciumderivater, benytter man derivater af typen R’SiF^fRH^ )g eller R'SiFg(llH^ )^, som kan fremstilles som beskrevet af R. Muller m.fl., Chem, Berichte, £8, 235 (1965) og ^8, 241 (1965). Til fremstilling af Co-methylenbalamin benytter man således især ammoniummethylpenta-fluorsilicat eller triammoniummethylhexafluorsilicat.

Uår man ønsker at udføre reaktionen i suspension, arbejder man i et opløsningsmiddel, som er indifferent over for reaktionsprodukterne, især i et opløsningsmiddel, hvori organometal-eller organometalloidreagenset er opløseligt, og cobamidet ikke er opløseligt, f.eks. hexan, sylen eller methylenchlorid.

Når Rf-metal- eller Rf-metalloidreagenset er let oxiderbart, udfører man reaktionen under en indifferent gasatmosfære, f.eks« nitrogen.

6 145932

Valget af reakt!oustemperatur afhænger først og fremmest af reaktionsdygtigheden af R’-metal- eller R*-metalloidreagenset, som man vælger, samt dets termiske stabilitet. Man kan altså alt efter omstændighederne afkøle eller opvarme reaktionsblandingen. Fortrinsvis udføres reaktionen mellem 0°C og 100°C.

Isoleringen af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede Oo-I^-cobamider udføres efter de gængse metoder, som anvendes i kemien i forbindelse med vitamin B^2 og dets analoge.

Man kan f.eks. arbejde ved chromatografi på kolonner, som er udstyret med cellulose eller modificerede celluloser såsom carboxy-methylcellulose eller diethylaminoethyleellulose, ved ekstraktion af vandige opløsninger ved hjælp af phenol eller en blanding af phenol og et chloreret opløsningsmiddel, ved fældning af vandige opløsninger ved hjælp af acetone eller andre organiske opløsningsmidler.

Da cobamiderne desuden normalt undergår omdannelse i lyset ligesom visse organometal- eller organometalloidforbindeiser, anbefales det at udføre reaktionen og ekstraktions- og isolerings-operationerne under beskyttelse mod dagslys, dvs. i dæmpet lys.

De farmaceutiske præparater på basis af Co-R*-cobamider fås efter medicinalindustriens gængse metoder.

Hedenstående eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved fremstilling af methylcobalamin.

Eksempel-1.

Man opløser 8 g hydroxocobalamin i 1 liter methanol og tilsætter derpå 1,4 g iod. Man opvarmer blandingen til 65°C i 3 timer.

lil den således opnåede iodcobalaminopløsning sættes 50 g methylkviksølviodid. Man holder blandingen 3 timer på 65°C og inddamper derpå til tørhed under formindsket tryk. Inddampningsresten vaskes med acetone, tørres og optages i 250 ml vand.

Man eliminerer den uopløselige fraktion ved filtrering.

Den vandige opløsning ledes derpå gennem en søjle med diethylaminoethyleellulose og derpå gennem en søjle med carboxymethyl-cellulose til fjernelse af urenheder og uomsat udgangsprodukt.

7 145932

Efter vaskning af søjlerne med vand forener man de vandige opløsninger og inddamper dem til et rumfang på ea. 180 ml. Der tilsættes 1800 ml acetone, og man lader henstå natten over ved stuetemperatur. Den dannede udfældning skilles fra ved filtrering og tørres. Der fås 1,81 g methyleobalamin, som er solvatiseret med vand.

På carboxymethylcellulosesøjlen genvinder man 2,87 g udgangsprodukt i form af hydroxoeobalamin.

Eksempel 2,

Man opløser 5 g hydratiseret hydroxoeobalamin (svarende til 3,9 g vandfrit produkt) i 250 ml vand og tilsætter 5 g triammo-niummethylhexafluorsilicat.

Blandingen holdes i 2 timer på 50°0 under omrøring, hvorpå man afkøler til stuetemperatur.

Man ekstraherer med 300 ml af en blanding af phenol og dichlorethan i forholdet 1*3.

Man tilsætter derpå langsomt under omrøring 625 ml acetone og derefter 22 ml vand. Man fortsætter omrøringen i 1 time og isolerer derpå udfældningen ved filtrering og tørrer den under formindsket 1ryk. Der fås 4 g rå methyleobalamin.

Man opløser 3,5 g råprodukt i 200 ml af en blanding af lige dele vand og acetone og tilsætter derpå langsomt 900 ml acetone. Man lader henstå natten over ved stuetemperatur og isolerer derpå den fremkomne krystallinske udfældning ved filtrering og tørrer den under formindsket tryk. Der fås 3,43 g methyleobalamin, som er 3,3$ hydratiseret,svarende til 3,32 g vandfrit produkt.

Eksempel 3.

Man opløser 100 mg 5'-desoryadenosyl^^-dimethylbenzimida-zolcobamid (5’-desoxyadenosylcobalamin) i 5 ml vand og tilsætter 100 mg triammoniummethylhexafluorsilicat.

Man holder blandingen i 2 timer på 50°C under omrøring, hvorpå man afkøler til stuetemperatur.

Der fås en opløsning af methyleobalamin, som man renser ved chromatografi, jvf. eksempel 1.

145932 8

Methylcobalamin har intet karakteristisk smeltepunkt.

Nedenfor er anført U.V,spektret for methylcobalamin fremstillet ifølge eksempel 2.

a) Stødpude pH 7.

-ri 1$ E lem

Max. ved 552 nm 69,7 " " 342 nm 106,5 " ” 266 nm 153

Min. ved 410 nm 26,2 " " 367 nm 87 " " 329 nm 91,3

Vendepunkt ved 375 nm 88,2

b) HC1 0.05 N

E ^ lem

Max. ved 462 nm 74 " " 304 nm 182 " " 264 nm 209,5

Min. ved 408 nm 39,1 " » 292 nm 153,8

Vendepunkt ved 375 nm 72,3