DK144905B - Fremgangsmaade til fremstilling af et middel til forhindring af gastro-intestinale forstyrrelser hos kalve - Google Patents

Description

(19) DANMARK

6 (12) FREMIÆGGELSESSKRIFT <id 11+4905 B

DIREKTORATET FOR

PATENT- 06 VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 5039/72 (51) ft $1 K 39/02 (22) Indleveringsdag 12. okt. 1972 // A 23 K 1/18 (24) Løbedag 12. okt. 1972 (41) Aim. tilgængelig 15· apr. 1973 (44) Fremlagt 5· jul. 1982 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 14. okt. 1971, 47853/71, GB

(71) Ansøger UNILEVER N.V., Rotterdam, NL.

(72) Opfinder Raymond Kenworthy, GB: Philip Porter, GB.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et middel til forhindring af gastro-intestinale forstyr** reiser hos kalve.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et middel til forhindring af gastro-intestinale forstyrrelser hos kalve, og denne fremgangsmåde er af den art, hvor man dyrker én eller flere patogene, kalvetarminficerende bakterier, skiller bakterierne fra kulturen og dræber de fraskilte bakterier på en sådan måde, at endotoxiner frigøres fra bakte-

ED

_ riernes celler.

O En af de nævnte forstyrrelser eller sygdomme er salmonel- ^ losis, som skyldes indtrængen i kalvetarmen af én eller flere af 3· bakteriestammerne Salmonella dublin og Salmonella typhimurium.

En anden, men sædvanligvis noget mindre alvorlig tarmforstyrrel-^ se, som kalve er tilbøjelige til at få, er den, som skyldes in- ® fektion med patogene stammer af bakterien Escherichia coli, især 144905 2 stammerne af serotyperne (International Serotype Classification) 09, 015, 078, 0114 og 0137.

Når kalvens omgivelser eller foder ændres, f.eks. når den transporteres, flyttes eller tages fra koen, efterlader de dermed følgende psykiske belastninger kalvens system mindre modstandsdygtigt mod formeringen af patogene organismer, og enhver Salmonella eller E. coli, der kan være indtaget, er tilbøjelig til at bevirke en alvorlig "udrensning" (diarré), som, når der er tale om S. dublin og S. typhimurium, kan være virkelig meget alvorlig. For kalve, der er indkøbt til opdrætning, og som almindeligvis angribes 1-3 uger efter købet, kan således dødeligheden på grund af infektion med Salmonella-stammer være 30% eller mere.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at kalvetarmen kan stimuleres til at danne antistoffer til sådanne patogene organismer som de ovenfor nævnte Salmonella- og E. co- li-stammer ved, at der i tarmen (og ikke i blodstrømmen som ved injektion) indføres endotoxinerne af organismerne, praktisk taget fri for de levende organismer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er af den allerede angivne art, er således ejendommelig ved, at man fremstiller endotoxiner fra én eller flere af de patogene E. coli-serotyper 09, 015, 078, 0114 og 0137 og/eller Salmonella dublin og/eller Salmonella typhimurium, hvorefter de frigjorte endotoxiner blandes med sædvanlige foderbestanddele.

Ved angivelsen som "endotoxiner" af det materiale, der skal indføres i kalvetarmen, er det ikke ment at udelukke fra dette materiale tilstedeværelsen af exotoxiner eller tilstedeværelsen af det cellulære materiale, hvori endotoxinerne er indeholdt i den levende bakterie, men det er blot ment, at endotoxinerne er af primær betydning for opnåelse af den ønskede immuno-loge virkning, medens dette ikke gælder for exotoxinerne og celleresterne. Imidlertid vil det undertiden være hensigtsmæssigt at lade enten exotoxiner eller cellerester eller begge dele forblive sammen med endotoxinerne, for det første for at spare besværet med at adskille dem, og for det andet for at tillade en udnyttelse af deres antigene evne.

3 14A906

Indføring i tarmen (indgivning) af endotoxinerne af kun én af de ovenfor nævnte Salmonella-stammer eller af kun én af de ovenfor nævnte E. coli-stammer har nogen gunstig virkning, forsåvidt som den pågældende stammes evne til at gøre fortræd derved vil blive formindsket, men det er at foretrække at indgive endotoxinerne af både S. dublin og S. typhimurium og endotoxinerne af alle E. coli-stammerne. De endotoxiner, der skal indgives, kan fås ved dyrkning af hver stamme, hvoraf prøver kan fås fra Central Veterinary Laboratory, Ministry of Agriculture and Fisheries, New Haw, Weybridge, Surrey, UK eller fra National Collection of Type Cultures, og, når mikroorganismens vækst og dermed dannelsen af endotoxiner er skredet frem i passende grad, dræbning af de prolifererende mikroorganismer og frigørelse af endotoxinerne, hvilket kan gøres ved kogning eller autoklavering.

Hele de steriliserede kulturer, som hver indeholder exotoxiner og cellerester såvel som endotoxiner, kan derefter forenes og indgives. I stedet for at sterilisere hele kulturerne kan man dog også fraskille bakterierne, således som det gøres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hensigtsmæssigt ved centrifugering, og behandle dem i et lille rumfang af et vandigt medium (f.eks. vand eller saltopløsning) til dræbning af bakterierne og frigørelse af endotoxinerne.

Den simpleste og mest økonomiske måde til dræbning af de fraskilte bakterier består i en opvarmning. Hvis opvarmningen er tilstrækkelig langvarig, f.eks. 1 time ved 100°c eller 20 minutter ved 125°C, vil det meste af endotoxinet blive frigjort fra forbindelsen med cellevæggene i de dræbte bakterier og gå ud i det medium, hvori opvarmningen udføres. De resterende bundne endotoxiner kan om ønsket bringes i opløsning ved behandling med et enzym såsom trypsin som beskrevet i hollandsk patentskrift nr. 7.107.538.

I praksis sker indgivningen af endotoxinerne på kalven selvfølgelig gennem munden, enten simpelthen ved tvungen indgivning af steriliseret dyrkningsmateriale eller gennem drikkevandet eller i fast eller flydende form blandet med én eller flere af de essentielle komponenter for kalvefoderet, dvs. protein, fedtstof, carbonhydrater, vitaminer og mineralsporstoffer (f.eks. cal- 4 144905 cium og phosphor). Endotoxinerne kan således til indgivning blandes med skummetmælkpulver, korn eller mineralsporstoffer, eller de kan inkorporeres i et komplet foder, dvs. et foder, der indeholder alle kostens essentielle komponenter som nævnt ovenfor.

Opfindelsen er af særlig betydning til forbedring af kalves modstandsevne mod infektion, når de tages fra koen og dermed er særlig udsatte for psysiske belastninger. Ved påbegyndelse af indgivningen af endotoxin-materialet på et tidligt tidspunkt, hensigtsmæssigt på 4.-10. dagen og fortrinsvis på det tidspunkt, hvor kalven for sidste gang får mælk fra koen, eller kort tid derefter, og fortsættelse over et passende tidsrum, hensigtsmæssigt op til den 4.-6. leveuge, kan kalvetarmen stimuleres til at danne de pågældende antistoffer, således at der på det tidspunkt, hvor kalven udsættes for en alvorlig infektionsfare, er en antistof-cirkulation i tarmen, der er tilstrækkelig høj til enten at klare formeringen af enhver indtaget patogen bakterie eller i det mindste til at formindske farligheden af enhver opstået sygdomstilstand. Endotoxin-materialet kan til dette formål inkorporeres i en såkaldt "mælkeerstatning", dvs. et foder, der er specielt sammensat til at opfylde kalves næringsmiddelkrav, når de tages fra koen. Endotoxin-materialet kan også inkorporeres i det første tørfoder, der indgives sammen med mælk eller mælkeerstatning ved fravænning. Det vil være hensigtsmæssigt at forhandle endotoxinerne i form af en tør, fast for-blanding sammen med et eller flere af foderbestanddelene protein, fedtstof, carbonhydrater eller mineral-sporstoffer og overlade det til brugeren at blande denne for-blanding med foderets øvrige bestanddele.

Om ønsket kan foderet sammensættes således, at det indeholder endotoxiner af Salmonella-stammerne sammen med endotoxiner af E. coli-stammerne.

Minimumsdoserne ligger i området 1-10 enheder (angående måling af en enhed henvises til de følgende eksempler) af endotoxinerne af hver bakterie-serotype pr. kalv pr. dag, men det er konstateret, at kalve, der fik 1000 gange denne mængde, ikke viste nogen uønskede virkninger. En meget hensigtsmæssig mængde i et kalvefoder vil være 10-1000 enheder af endotoxinerne af hver 5 U6905 serotype pr. kg foder, og det er således ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt, at endotoxinerne fra hver af de anvendte bakterier inkorporeres i en mængde på 10-1000 hæmagglu-tinationsenheder pr. kg af produktet.

De følgende eksempler skal tjene til nærmere illustrering af opfindelsen.

Eksempel 1

Fremstilling og isolering af endotoxinerne Endotoxiner kan fremstilles ud fra Salmonella-stammerne og de fem E. coli-serotyper på den nedenfor beskrevne måde, der generelt er i overensstemmelse med den af Westphal, Luderitz og Bister foreslåede metode (Z. Natur. Forsch. 7, 148, 1952).

En frysetørret kultur af mikroorganismen rekonstitueres i peptone-vand og inkuberes ved 37°C i 6 timer. Efter en passende vækst kontrolleres kulturen for renhed på en vasket fåreblod/agar--plade, hvorefter den anvendes til podning af skråkulturer af næringsagar (Oxoid) i Roux-kolber. Kulturen dyrkes ved 37°C natten over, og bakterierne høstes i sterilt destilleret vand. Den opnåede bakteriesuspension kommes aseptisk i Universal-kolber på 30 ml og centrifugeres i 10 minutter med 4000 rpm. Derefter fjernes den overliggende væske, og den tilbageblivende kage af bakterier re-suspenderes i 4 ml sterilt destilleret vand og frysetørres.

Til isolering af endotoxinerne suspenderes 0,5 g af dette frysetørrede materiale i 5 ml 0,15 M NaCl-opløsning, og der tilsættes 10 ml 90%'s vandig phenol som lyseringsmiddel. Blandingen opvarmes derefter til 68°C i 30 minutter under kontinuert omrøring, hvorpå den centrifugeres ved 4000 rpm til sammenpresning af celleresterne. Den vandige fase fjernes, køles til 4°c og tilsættes langsomt 10 rumfang iskold ethanol. Det herved fremkomne bundfald genopløses i vand, og nucleinsyrer udfældes fra opløsningen ved tilsætning af 2 rumfang ethanol og fjernes. Af den tilbageblivende opløsning udfældes endotoxinerne ved tilsætning af yderligere 8 rumfang ethanol, hvorefter de fraskilles ved centrifugering, vaskes med iskold ethanol og genopløses i 0,15 M NaCl--opløsning. Denne opløsning vil i det følgende blive omtalt som Reagens 1.

6 144905

Prøve for endotoxiner a* Fremstilling af antiserum

Specifikke hyperimmun-sera ("antisera") fremstilles i hvide New Zealand-kaniner mod vaskede, varme-dræbte (100°C, 2 1/2 time) organismer af hver E. coli- og Salmonella-serotyper-ne.

I 0,15 M NaCl-opløsning fremstilles suspensioner af den 9 varmedræbte organisme (ca. 3 x 10 organismer pr. ml), som derefter injiceres intravenøst. Immuniseringsskemaet begynder med et injektionsrumfang på 0,1 ml og fortsættes hver fjerde dag med fordobling af rumfangene op til 1,6 ml. Kaninerne tappes for blod 10 dage efter afslutning af skemaet, og blodet centrifugeres. Det øverste lag af hyperimmun-serum opsamles, og dette antiserum vil i det følgende blive betegnet som Reagens 2.

b. Måling af antistof(anti-endotoxin)aktivitet i antiserum Fåre-erythrocyter sensibiliseres ved behandling af en 5%'s suspension af vaskede, sammenpakkede celler med et lige så stort rumfang af endotoxin-opløsningen Reagens 1 ved 37°C i 30 minutter. De sensibiliserede celler fraskilles ved centrifugering, vaskes fri for overskud af endotoxiner og -gen-suspenderes i 0,15 M NaCl-opløsning til dannelse af en 2,5%'s suspension af endotoxin og sensibiliserede fåre-erythrocyter. Denne suspension vil i det følgende blive betegnet som Reagens 3.

Reagens 2 (antiserummet) fortyndes seriemæssigt med 0,15 M NaCl-opløsning til opnåelse af en række opløsninger af lige stort rumfang (1 vol.) med antistof-koncentrationer på 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 ..... 1/(5 x 2n "S af koncentrationen af Rea gens 2, og til hver af disse opløsninger sættes 1/5 rumfang af Reagens 3. En hæmagglutinering sker i de stærkere antiserum-op-løsninger og ikke i de svagere, og slutpunktet for titreringen (ved 4°C) tages som den opløsning, hvori der lige netop sker en hæmmagglutinering. I et typisk tilfælde kan slutpunktet ligge ved den tolvte opløsning, dvs. ved opløsningen med en antistofkoncentration på 1/(5 x 2·*··*·) af koncentrationen af Reagens 2.

Reagens 2 kan da siges af have en antiserum-titer på 5 x 211 (= 10.240).

144905 7 c. Måling af endotoxin-koncentrationen i en opløsning af ukendt koncentration

Den opløsning (Y), der skal måles, fortyndes seriémæs-sigt med 0,15 M NaCl-opløsning til opnåelse af en række opløsninger af ens volumen (3 volumen) med endotoxin-koncentrationer på 1/3, 1/6, 1/12, 1/24 etc. af koncentrationen af opløsningen Y. Til hver af disse opløsninger sættes 1 rumfang Reagens 2 (antiserum) , fortyndet til en titer på 20 (se ovenfor) og derefter (efter nogle få minutters forløb) 1 rumfang Reagens 3 (sensibiliserede fåre-erythrocyter), hvilket giver endotoxin-koncentratio- ner på 1/5, 1/10, 1/20..... 1/(5 x 211-1) af koncentrationen af opløsning Y. En hæmagglutinering hæmmes i de stærkere endotoxin--opløsninger, men sker i de svagere, og slutpunktet for titreringen tages som den opløsning, hvori hæmagglutineringen kun lige netop hæmmes. I et typisk eksempel kan dette være ved den 5 sjette opløsning, dvs. ved en endotoxin-koncentration på 1/(5 x 2 ) af koncentrationen af opløsning Y, og opløsningen Y siges da at have en titer på 5 x 2 (= 160), svarende til 160 endotoxin-enhe- der pr. ml (se eksempel 2).

Eksempel 2 A. Fremstilling af råt endotoxin-materiale

Den nedenfor beskrevne metode blev fulgt for hver af de tidligere nævnte Salmonella-stammer og E. coli-serotyper.

(i) Bakterien blev fra en stamkultur strøget ud på vaskede blodagarplader (E. coli) eller næringsagarplader (Salmonella) og inkuberet ved 37°C i 24 timer, hvorefter pladerne kontrolleredes på sædvanlig måde for stammerenhed.

(ii) Kolonier af bakterien blev overført fra pladerne til 50 ml af "Oxoid Nutrient Broth nr. 2" (katalog nr. CM 67), og dyrkningsvæsken holdtes på 37°c i 24 timer.

(iii) Hele den i (ii) opnåede kultur anvendtes til podning af 1,5 liter "Oxoid Nutrient Broth No. 2", som derefter inkuberedes med omrystning ved 37°C i 24 timer. Hver af de således 9 10 opnåede kulturer indeholdt 10 -10 levedygtige bakterier pr. ml.

144905 8

Dampbehandlet ved 125°c i 2 timer og underkastet prøven ifølge eksempel 1 gav prøver af E. coli-kulturerne en titer på 2560, svarende til 2560 endotoxin-enheder pr. ml af den dampbehandlede kultur. Dampbehandlet og prøvet på samme måde gav prøver af S. dub-lin- og S. typhimurium-kulturer hver en titer på 1280. Hver af de 9 kulturer (7 med E. coli og én af hver af Salmonella-serotyper-ne) centrifugeredes til fraskillelse af bakterierne, som derefter blev gen-suspenderet i en del af den fraskilte overliggende væske til dannelse af en suspension med en 30 gange så stor koncentration som kulturen før centrifugeringen. Hver suspension blev damp-behandlet for sig selv i to timer i en autoklav (125°C) til dræbning af bakterierne, og de ni damp-behandlede suspensioner samledes.

B. Fremstilling af et kalvefoder

Det ifølge afsnittet A opnåede, samlede damp-behandlede materiale (1 vægtdel) sammenblandedes med vallepulver (19 vægtdele) , og den fremkomne blanding inkorporeredes i en sædvanlig mælkeerstatning af følgende sammensætning: Vægtprocent skummetmælkpulver med tilsat fedtstof 77 vallepulver 17,1 glucose 5 fældet kridt 0,3 dicalciumphosphat 0,4 spormineraler & vitaminer i bærer 0,2 således at der opnåedes et produkt, hvori koncentrationen af en- dotoxinerne var følgende: endotoxiner af hver E. coli-serotype 100 enheder/kg foder endotoxiner af hver Salmonella-serotype 50 enheder/kg foder