DK143970B - Fremgangsmaade til fremstilling af et aktivtinjicertbart stabilt vand-i-olie-emulsionspraeparat og middel til udoevelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

(19) DANMARK (®)

i® 02) FREMLÆGGELSESSKRIFT (in 11*3970 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 489/76 (51) IntCI.* A 61 K 47/00 (22) Indfeveringsdag 6. fet). 1976 (24) Løbedag 6. feb. 1976 (41) Aim. tilgængelig 8. aug. 1976 (44) Fremlagt 9· nov. 1981 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. “

(30) Prioritet 7. feb. 1975* 7504003, FR

(71) Ansøger AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE (ANVAR), 92522

Neuilly-Bur-Seine, FR.

(72) Opfinder Francoise Audibert, FR: Edgar Lederer, FR: Louis

Chedid, FR.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et aktivt injicerbart, sta?= bilt vand-i-olie-emulsionspræ= parat og middel til udøvelse af fremgangsmåden.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til frem-» stilling af et aktivt, injicerbart, stabilt vand-i-olie-emulsionspræ-parat indeholdende et immunologisk adjuvansmiddel, der er i stand til, på en ikke-specifik måde, hos en vært at stimulere de immunologiske svar på antigener af forskellig type, ved hvilken fremgangsmåde adju-q vansmidlet opløses eller suspenderes i en emulsion, der er frembtil-3 let ud fra en metaboliserbar vegetabilsk olie, og som indeholder mindre ^ vand end olie. Opfindelsen angår endvidere et middel til udøvelse af v) fremgangsmåden bestående af en stabil emulsion fremstillet ud fra en £ metaboliserbar vegetabilsk olie og vand, hvilken emulsion indeholder mindre vand end olie.

t 3 2 143970

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede emulsionspræparat muliggør indgift i en effektiv og godt tålt form af immunologiske adjuvanser, der i en værtsorganisme kan stimulere immunologiske reaktioner på antigener af forskellige typer. Især muliggør dette præparat en effektiv og godt tålt indgift af adjuvans-midler, som tjener til at forstærke og forøge virkningen af svage immunogener, som kan anvendes til immunisering af mennesker og varmblodede dyr mod bakterie-, virus- og parasit-infektioner samt mod forskellige vævs-antigener af normal eller patologisk oprindelse, især sådanne, som hidrører fra tumorer.

I litteraturen findes allerede beskrevet talrige midler, der er effektive som immunologiske adjuvanser. De mest kendte er Freunds adjuvanser: a) det inkomplette Freunds adjuvans, som er baseret på mineralolie (f.eks. mineralolien kendt under betegnelsen "Bayol F") plus et emulgeringsmiddel (mannitolmonooleat), kendt under betegnelsen "Arlacel"; b) det komplette Freunds adjuvans, som har samme sammensætning som det første, men som indeholder dræbte mycobakterier.

I dette sidste adjuvans kan man erstatte mycobakterierne med rensede vægge eller lipo-opløselige fraktioner, såsom voks D. Man har for nylig beskrevet vandopløselige adjuvans-midler, som ligeledes kan fremstilles ud fra mycobakterier, men også ud fra andre bakterier.

For nyligt er der endvidere beskrevet adjuvans-midler, som er fremstillet ad syntetisk vej.

Hjælpevirkningen af adjuvanser af Freund-typen på basis af mineralolie og "Arlacei' kræver, at de bringes på emulsionsform ud fra en oliefase i en vandig fase. Anvendelsen af "Arlacel" er uundgåelig og forholdet mellem den vandige fase og oliefasen er af afgørende betydning.

Trods deres stærke adjuvans-evne er sådanne præparater imidlertid uanvendelige i praksis på grund af den agressivitet, som hidrører fra et ikke-metaboliserbart middel, på grund af manglende uskadelighed på grund af emulgeringsmidlet samt for det komplette adjuvans vedkommende de immunopatologiske virkninger, som denne komposition udviser for visse mycobakterie-præparaters vedkommende.

Det er ikke muligt at erstatte mineralolien i Freunds inkomplette adjuvans med en vegetabilsk, metaboliserbar olie uden anden modifikation, idet man ikke opnår stabile emulsioner. Man har gjort forskellige forsøg på at stabilisere sådanne emulsioner, men man har måttet betale en pris i form af betydelige andele emulgerings- eller stabiliseringsmidler, som vanskeligt kan accepteres på grund af deres manglende uskadelighed.

3 143970 Således er det i SE-fremlæggelsesskrift nr. 322.018 nævnt, at emulsioner af vand og vegetabilsk olie er af begrænset værdi, måske endog uanvendelige, omend det også hævdes, at man har fundet en metode til fremstilling af anvendelige emulsioner baseret på vegetabilsk olie. Imidlertid er man ifølge nævnte SE-fremlæggelsesskrift bundet til også at anvende aluminiummonostearat og mannitolmonooleat, altså ikke-meta-boliserbare substanser med de ovenfor omtalte ulemper. Den foreliggende opfindelse tilstræber at gøre sådanne sekundære emulgeringsmidler overflødige.

Endvidere er det fra FR-patentskrift nr. 5900 M kendt, at serumalbumin er egnet som dispergeringsmidde1, dog forudsat at der er tale om olie-i-vand-emulsioner, dvs. emulsioner, som indeholder mere vand end olie. Sådanne emulsioner er imidlertid uegnede, når det drejer sig om indgift af adjuvanser af den type, som den foreliggende opfindelse drejer sig om. Ydermere er det umuligt at forudse, hvorledes serumalbumin vil opføre sig i en vand-i-olie-emulsion, da det har vist sig, at det er umuligt at opnå stabilitet af en serumalbuminholdig emulsion, hvis man erstatter vandoverskuddet med lige dele vand og olie*

Den til grund for opfindelsen liggende opgave går ud på at afhjælpe de omtalte ulemper ved den kendte teknik og tilvejebringe et emulgeret præparat, i hvilket alle bestanddele uden undtagelse er ikke-toksiske og let metaboliserbare, idet disse bestanddele samtidig tillader de immunologiske adjuvanser at udøve en kraftig hjælpevirkning i henseende til de vaccinerende antigener, især til svage immunogener, som kan anvendes til immunisering af mennesker eller dyr.

Det har ifølge opfindelsen vist sig, at denne opgave er løst med det her omhandlede vand-i-olie-emulsionspræparat, som er ejendommeligt ved, at emulsionen indeholder fra ca. 2,5 til ca. 4 volumendele vand pr. 10 volumendele vegetabilsk olie og som stabiliseringsmiddel 4-12% vc.ndopløselige proteiner af serumalbumin- eller glo-, bulintypen.

Præparatet indeholder fortrinsvis ca. 3 volumendele vand pr.

10 volumendele vegetabilsk olie.

Opfindelsen beror på erkendelsen af, at det er muligt at realisere en særdeles stabil vand-i-olie-emulsion ud fra en vegetabilsk olie og vand i nærværelse af proteiner som eneste stabiliseringsmiddel, når man vel at mærke anvender olien i mængder, som er klart større end vandmængden .

Hvis man ikke overholder denne sidste betingelse og anvender lige store volumendele af de to bestanddele ved fremstillingen af en 4 143970 emulsion af vand i olie, er det ikke muligt at tilvejebringe en stabil emulsion udelukkende i nærværelse af proteiner.

Det er imidlertid bemærkelsesværdigt at det udelukkende ved modifikation af forholdet mellem vand og olie er muligt med proteiner alene at tilvejebringe en stabil emulsion, dvs. uden tilstedeværelse af andre inden for dette område velkendte stabiliseringsmidler, især "Arlacel".

Når den nævnte emulsion skal anvendes som bærestof for et lægemiddel, bør de anvendte proteiner naturligvis ikke være immunogene over for den værtsorganisme som lægemidlet er bestemt for. I dette tilfælde fås imidlertid en emulsion, i hvilken alle bestanddelene er metaboliserbare.

Mængderne af de anvendte proteiner varierer inden for et ret bredt interval. Mængderne ligger mellem ca. 40 og ca. 120 mg, f.eks.

60 mg, protein pr. ml vandig fase i emulsionen.

Anvendt i disse mængder tilvejebringer proteinerne stabilitet af den færdige emulsion. De kan ligeledes tjene til at bibringe mediet den isotoni-karakter, som kræves til injektion hos mennesker eller dyr for at minimalisere bivirkningerne. Derfor foretrækkes det ifølge opfindelsen, at proteinerne indgår i en mængde, som er tilstrækkelig til at bibringe emulsionen en isotonisk karakter. Denne mængde varierer naturligvis noget afhængigt af de i hvert enkelt tilfælde anvendte proteiner. Om nødvendigt eller ønsket kan man imidlertid ifølge opfindelsen også opnå denne minimalisering af bivirkningerne ved, at den vandige fase i emulsionen er en isotonisk opløsning, især indeholdende natrium-chlorid eller glucose i de mængder, som kræves til tilvejebringelse af isotoni.

Oprindelsen af den anvendte vegetabilske olie spiller ikke nogen væsentlig rolle for stabiliteten af emulsionen. Man får analoge resultater når man anvender olie ifølge la Pharmacopée Francaise 8. udgave 1965, side 574-581, især f.eks. arachidolie eller olivenolie, eller andre olier, f.eks. sesamolie.

De anvendte proteiner består af serumalbuminer eller globu-liner udvundet fra humant eller animalsk blod, plasma eller placenta. Disse proteiner kan opbevares i vandigt miljø.

5 143970

De således fremstillede emulsionspræparater repræsenterer fremragende bærematerialer for de aktive stoffer i vacciner. Man har konstateret, at disse aktive stoffer i vacciner er i stand til at udøve deres virkning på bedre måde, når de indgives i værtsorganismen i emulsionspræparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Specielt er effektiviteten af stimuleringen i værtsorganismen af immunologisk respons med de anvendte adjuvans-midler af samme størrelsesorden, som når de indgives suspenderet i Freunds in-komplette adjuvans. Denne aktivitet er så meget mere bemærkelsesværdig, som indgiften af adjuvanset i denne form praktisk taget ikke er ledsaget af de ovenfor nævnte for Freunds adjuvans karakteristiske ulemper.

Det skal bemærkes, at emulsionspræparaternes karakter af en vand-i-olie-emulsion er vigtig i henseende til den rolle, som de skal spille indenfor den foretrukne anvendelse af opfindelsen. Det er specielt vigtigt, at disse emulsionspræparater er stabile, endog i nærværelse af en vandig fase, især i den slags situationer, som de vil -møde i de organismer, i hvilke de indføres, sammen med et vaccinerende antigen. Det er især vigtigt, at de små vanddråber suspenderet i oliefasen i vand-i-olie-emulsionen ikke udviser tilbøjelighed til at undslippe i det øjeblik, hvor denne emulsion bringes i kontakt med en vandig fase. Denne stabilitet synes at ligge til grund for den forsinkede diffusion af de i organismen indførte aktive stoffer, som uden tvivl er nødvendig for at gøre det muligt, at de opfanges af immunologisk kompetente systemer, f.eks. macrophager, ganglioner, osv.

De her omhandlede emulsionspræparater finder anvendelse i lægemidler, der som aktive forbindelser indeholder et vaccinerende antigen.

Et foretrukket adjuvans består af en oligomer indeholdende få eller slet ingen neutrale sukkerarter, hvis monomerenhed består af amino--sukkerarter og aminosyrer af de polymere, som danner cellevæggene i mycobakterie- eller Nocardia-celler. Fremgangsmåder til fremstilling af sådanne hjælpemidler er beskrevet i FR-patentskrift nr. 2.160.326 samt i FR-tillægspatentskrift nr. 2.189.019.

Andre foretrukne adjuvanser består af opløselige fragmenter af peptidoglycan, som indgår i konstitutionen i procarioters cellevægge, især oligosaccharider-oligopeptider, dannet af enhederne N-acetyl-glucos-amin og N-acyl-muraminsyre, hvor acylgruppen fortrinsvis er af glycolyl-eller acetyl-typen samt tripeptid-, tetrapeptid-, heptapeptid-grupper 6 143970 især ud fra L-alanin, D-glutaminsyre, meso-a-£-diamino-pimelinsyre og D-alanin, hvilke midler især er beskrevet i FR-tillægspatentskrift nr. 2.248.025. De er ligeledes beskrevet i "Biochemical and Biophysical Research Communications"^ 1974. bind 56 nr. 3, side 561-567.

Atter andre består af en sammensat forbindelse dannet ud fra N-acyl-muraminsyre med en kort peptidkæde indeholdende mindst to aminosyrer, i hvilken acylgruppen er dannet af en glycolyl- eller acetylgruppe, og i hvilken den korte peptidkæde indeholder en første aminosyre bundet til N-acyl-muraminsyren bestående af L-alanin og en anden aminosyre bestående af D-glutaminsyre, hvor denne anden aminosyres carboxylgrupper er individuelt snart frie snart aminerede (i det tilfælde, hvor en peptidkæde kun omfatter to aminosyrer), snart indgår i en binding med en anden amineret syre (i det tilfælde, hvor peptidkæden er længere). Sådanne hjælpemidler er beskrevet i FR-tillægspatentskrift nr. 2.292.486. Blandt disse adjuvans-midler skal nævnes N-acety1-muramyl-dipeptid, hvor dipeptidet indeholder L—alanin og D—glutaminsyre, mere præcist N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin. Adjuvansvirkningen af dette stof er beskrevet i "Biochemical and Biophysical Research Communications", 1974, bind 59, nr. 4, side 1317-1325.

Andre adjuvans-midler består af lipo-opløselige præparater isoleret af Mycobacterium tuberculosis, f.eks. voks D eller cord-faktor ekstrakter fra Peurois-stammer.

De således fremstillede adjuvans-præparater på emulsionsform er særdeles stabile. Ved forsøg har det vist sig, at præparater af denne type kan bevare deres stabilitet efter tre måneders opbevaring.

Emulgeringen af sådanne præparater er desuden særdeles let at foretage. Den kan realiseres på enkelt måde ud fra de ovenfor beskrevne bestanddele i de angivne forhold med simpel blanding og direkte i injektionssprøjten, som anvendes til indgiften af præparatet i værtsorganismen.

Opfindelsen angår et middel til udøvelse af den her omhandlede fremgangsmåde, hvilket middel er ejendommeligt ved, at emulsionen indeholder fra ca. 2,5 til ca. 4 volumendele vand pr. 10 volumendele af den vegetabilske olie og som stabiliseringsmiddel 4-12% vandopløselige proteiner af serumalbumin- eller globulintypen.

På samme måde som ved den her omhandlede fremgangsmåde og af samme grund foretrækkes ifølge opfindelsen et middel, som er ejendommeligt ved, at dets proteinindhold er tilstrækkeligt til at bibringe det en isotonisk karakter, eller at den vandige fase i emulsionen er en isotonisk opløsning.

7 143970

Til fremstillingen af de omhandlede emulsionspræparater kan bestanddelene forefindes i samme eller forskellige glas eller beholdere med forud bestemt volumen eller vægt afhængigt af de ovenfor definerede forhold med henblik på øjeblikkelig fremstilling af et emulsionspræparat.

Det ikke-specifikke immunologiske adjuvans og i påkommende tilfælde yderligere et vaccinerende antigen kan forefindes enten indbyrdes adskilt i hver sit glas eller beholdere, eller de kan forefindes sammen i et enkelt glas eller beholder.

I det følgende beskrives forsøgseksempler, især forsøg, som har gjort det muligt at bestemme de relative andele af de forskellige bestanddele, som kræves til tilvejebringelse af en stabil emulsion ud fra de ovenfor definerede bestanddele. Den test, som anvendes til at konstatere emulsionens stabilitet, består i, at man observerer emulsionens adhærens til væggen af beholderen, når man vender bunden i vejret af denne, eller bedre ved anbringelse af en dråbe af denne emulsion på en vandoverflade ved den teknik, som er beskrevet af W.J. Herbert i "Handbook of Experimental Immunology, D.W. Weir, Blackwell Scientific Publications Oxford and Edinburg, 1967, 1211", under overskriften "Methods for the preparation of water-in-oil, and multiple, emulsions for use as antigen adjuvants; and notes on their use in immunization procedures". Når emulsionen ikke er stabil, falder dråben fra hinanden ved adskillelse af de to faser.

1) Betingelser for tilvejebringelse af en stabil vand-i-olie--emulsion._ a) Studium af forholdet mellem vand og vegetabilsk olie i emulsionen: sammenligning mellem Freunds inkomplette adjuvans (mineralolie) og en emulsion ifølge opfindelsen på basis af arachidolie.

Hvis man tager en vandig opløsning indeholdende 60 mg/ml serum-albuminbovin (SAB), anbringer 10 volumenenheder af denne opløsning i en blander af typen POTTER og tilsætter 10 volumendele olie og emulgerer ved 2000 omdrejninger pr. minut i 1 minut, får man som sædvanlig en god emulsion med mineralolie, men der fås ingen emulsion med vegetabilsk olie. Hvis man under samme betingelser imidlertid tager 3 volumendele af opløsningen af SAB og 10 volumendele olie, får man en god emulsion i den vegetabilske olie, men ingen emulsion i mineralolie.

143970

O

Der gennemføres analoge forsøg, idet man systematisk til 10 volumendele arachidolie sætter 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 volumendele vand indeholdende 60 mg SAB pr. ml. Som vist i nedenstående tabel fås en emulsion i den vegetabilske olie, på betingelse af at man ikke overskrider forholdet 6/10, fortrinsvis 5/10. Den optimale virkning og stabilitet fås, når forholdet er 3/10.

Tilvejebringelse og stabilitet af emulsionen som funktion af forholdet mellem vand og olie

Antal volumendele vandig SAB-opløs- ις ? o c 3 4 r r 7 a q i λ ning*>sat til 10 1 1,5 2 2,5 3 4 5 6 7 8 9 10 volumendele arachidolie ___

Tilvejebringelse af _ _ _ + + en emulsion

Stabilitet af + + + _ emulsionen - --------L..........

*)

Den vandige opløsning indeholder 60 mg SAB pr. ml.

Når der anvendes mineralolie er det derimod nødvendigt at holde forholdet på 10/10. Resultater analoge med resultaterne for arachidolie fås, hvis man anvender olivenolie ifølge la Pharmacopée Francaise 1965, 8. udgave eller sesamolie, idet der ikke fås nogen virkning for forhold større end 5/10, idet optimum ligger ved 3/10 for olivenolie og 2,5/10 for sesamolie.

b) Virkningen af proteinindholdet i den vandige opløsning.

I de nedenfor beskrevne forsøg sættes hver gang 1 volumenenhed vand indeholdende SAB til 3 volumendele arachidolie. Indholdet af SAB i vandet varierer mellem 15% og 0%. Det fremgår af nedenstående tabel, at de stabile emulsioner fås, når proteindholdet varierer mellem 4 og 12%. Onder 4% og over 12% er de dannede emulsioner ikke stabile.

9 143970

Tilvejebringelse og stabilitet af emulsionen som funktion af proteinindholdet i den vandige opløsning (forhold vand/olie = 1/3)

SAB

(% i den vandige opløsning) 0 0,25 0,5 1 2 3 4 6 8 10 12 15 —______I___________

Tilvejebringelse ! af emulsionen - - -;-- + + + + + + +

Stabilitet af ' "" emulsionen -- + + + + + - ___i.....i......L. , 1 ..... .

Analoge resultater fås, når man anvender humant serumalbumin (SAH) eller serum-proteiner fra mus.

Det skal også bemærkes, at emulsionerne i de vegetabilske olier - i modsætning til det, som konstateres med Freunds adjuvanser -ikke kræver tilstedeværelse af Arlacel". Tilstedeværelsen af dette produkt i emulsionen ifølge opfindelsen er unyttig, ja nærmest ufordelagtig.

De foregående resultater viser, at det er muligt at tilvejebringe en stabil emulsion af vand i vegetabilsk olie, når man overholder de veldefinerede forhold for blandingen og de veldefinerede koncentrationer af proteinerne i vand. SAH kan anvendes som protein. Nærværelsen af "Arlacel" er ikke nødvendig. Det skal tilføjes, at disse emulsioner kan opbevares ved +4°C i adskillige dage eller uden vanskelighed genemulgeres i en injektionssprøjte.

2) Farmakologiske egenskaber af emulsionspræparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

a) Demonstration af adjuvans-egenskaberne af emulsionspræpara-tet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.__~ I de følgende forsøg dokumenteres forøgelsen af det immunologiske respons på et antigen, idet man til sammenligning anvender Freunds ufuldstændige adjuvans, Freunds fuldstændige adjuvans samt emulsionerne af vand i arachidolie indeholdende forskellige adjuvans-præparater. De anvendte adjuvans-fraktioner er, som i Freunds fuldstændige adjuvans, hele mycobakterie-celler (Mycobacterium smegmatis) eller rensede cellevægge fra mycobakterier, f.eks. et lipo-opløseligt præparat isoleret fra Mycobacterium tuberculosis, f.eks. voks D eller cordfaktor ekstraheret fra Peurois-stammen, eller et vandopløseligt adjuvans som det oven 10 143970 for beskrevne, fremstillet ad syntetisk vej, f.eks. det ovenfor beskrevne muramy1-dipeptid.

De anvendte antigener er SAB, ovalbumin eller en influenza--vaccine, som er i handlen under betegnelsen "muTAGRIp" (Institut Pasteur).

Det i den fysiologiske væske opløste SAB eller ovalbumin injiceres enten ublandet eller i forskellige emulsioner. Emulsionerne er fremstillet ved hjælp af en POTTER ved 2000 omdrejninger pr. minut og fremstillet i følgende forhold: for præparaterne på mineraloliebasis er forholdet mellem vand og olie 1/1, for emulsionerne på basis af vegetabilsk olie (arachidolie) er dette forhold 1/3 (i dette sidste tilfælde er antigenet ligeledes stabilisator i emulsionen). Før emulgeringen suspenderes de uopløselige hjælpestoffer i olien, den lipo-opløselige fraktion er opløst i oliefasen, og det vandopløselige præparat i antigen-opløsningen.

Når influenzavaccinen er antigen, tilvejebringes stabiliteten af emulsionen ved tilsætning af en fysiologisk væske indeholdende vaccinen indeholdende 50 mg/ml af en fraktion af serum-proteiner fra mus opløst i en tredjedel mættet ammoniumsulfat.

Forsøgene gøres på mus og rotter.

Forsøg gjort på mus.

Musene er Swiss-hunner med en alder på 2 måneder opdrættet af C.N.R.S. (Orleans). De fordeles i grupper på 9.

Respons på SAB.

På dag nr. 0 får dyrene via fodsålerne 500 yug SAB i et volumen på 0,05 ml af de forskellige ovenfor beskrevne emulsioner. Dosen af adjuvans-præparatet pr. mus er 200 jag (doserne for alle præparaterne udtrykkes som tørvægt) undtagen ved et eksperiment, hvor man indgiver variable doser af lipoopløselige fraktioner (voks D eller cordfaktor).

På dag nr. 17 eller 30 gives en efterbehandling på 100 jag SAB i fysiologisk opløsning ligeledes via fodsålerne.

Fra halen udtages blodprøver fra musene hver uge indtil fire uger efter efterbehandlingen, og seks uger efter denne aflives musene, idet deres blod udtømmes fra abdominal-aorta.

Rotte-forsøg

De anvendte dyr er Lewis-hanner på 250 g opdrættet hos C.N.R.S. (Orleans). De fordeles i grupper på 7.

På dag nr. 0 indgives via fodsålerne 1 mg ovalbumin i 1 volumenenhed på 0,1 ml af de ovenfor beskrevne præparater. Adjuvanserne indgives i en dosis på 500yug.

11 143970

En efterbehandling med 100 /ig antigen gives på dag nr. 35. Ugentlige blodprøver udtages fra halen, og dyrene aflives på dag nr. 42 ved blodudtømning via abdominal-aorta.

Bestemmelse af antistof-mængden.

1) Anti-SAB eller anti-ovalbumin.

Passiv hæmagglutination.

Til fortyndingsrækker af de afprøvede sera sættes en konstant mængde røde fåreblodlegemer mærket med SAB eller ovalbumin afhængigt af serum-typen. Seraenes titer udtrykkes ved den reciprokke værdi af den kraftigste opløsning, som fremkalder agglutinering af blodlegemerne .

For de mellemliggende blodprøvers vedkommende sættes doseringerne til blandingen af sera (fra hver gruppe). For den sidste blodprøves vedkommende repræsenterer titeren for hver gruppe middelværdien af de foretagne doseringer på de adskilte sera.

"Antigen binding capacity"

Seraenes kapacitet til at fiksere SAB måles ved hjælp af SAB 125 mærket med I ved Farrs metode beskrevet af P. Minden og s. Farr "Méthode de mesure au sulfate d'ammonium de la capacité de fixation des antigénes", "Handbook for Exp. Immunol",· D.M. Weir Blackwell Scientific Publications, Oxford and Edinburgh, 1967, side 463-492. Resultaterne udtrykkes ved den reciprokke værdi af den maksimale fortynding, som er i stand til at udfælde 33% af det tilsatte antigen.

2) Anti-influenzavaccine.

Antistoffer, som inhiberer hæmagglutineringen af erythrocyter fra høns med influenzavirus: doseringen gennemføres under anvendelse af stigende serum-fortyndinger og 4 doser hæmagglutinanter af influenzavirus. Efter inkubering tilsættes den bestemte mængde kyllinge-erythrocy-ter. Man bestemmer den fortynding, som fuldstændigt inhiberer haanag-glutinering.

Resultater.

1) Immunisering med SAB eller ovalbumin.

Tabel 1 og 2 viser de tilvejebragte antistof-titerværdier hos mus. Man ser ved sammenligning med kontrolgruppen, som har modtaget antigenet ublandet, at der fås betydelige forøgelser af det immunologiske respons hos alle de grupper, som er immuniseret med adjuvans-præ-parater indgivet på emulsionsform, samt at niveauet for antistof-mængden, ved det sekundære respons, efter genbehandlingen, efter en første injek- 12 143370 tion med arachidolie - er ækvivalent med niveauet hos de grupper, som har fået mineralolie.

En betydelig virkning opnås i nærværelse af en emulsion på basis af arachidolie alene, medens adjuvans-aktiviteten af rensede cellevægge ikke kan konstateres, hvis de indgives suspenderet i den vegetabilske olie.

Det fremgår af tabel 3, at man hos Lewis-rotten opnår analoge antistof-dannelser efter indgift af Freunds fuldstændige adjuvans, hvor hele celler er inkorporeret i en arachidolie-emulsion.

2) Immunisering med influenzavirus.

De i tabel 4 viste resultater viser, at præparaterne fremstillet ved inkorporering af enten den lipoopløselige fraktion (cordfaktor eller voks D) eller rensede cellevægge i arachidolien har en adjuvans--virkning, som er større en den, der kan konstateres hos Freunds adjuvans. Resultaterne illustrerer endvidere muligheden for anvendelse af serum-proteiner fra samme art til tilvejebringelse af en stabil og effektiv emulsion..

b) Tolerance for emulsionen af vand i vegetabilsk olie;

Fraværelse af arthrogenicitet og polyarthrogenicitet hos Lewis rotten.____

Indgivet i poten suspenderet i Freunds ufuldstændige adjuvans inducerer hele celler eller vægge fra mycobakterier samt voks D fra visse stammer hos Lewis-rotten en arthritis på injektionsstedet, som kan brede sig til polyarthritis, der undertiden betragtes som en auto--immunologisk sygdom.

Hos Lewis-rotten har man sammenlignet den arthrogene aktivitet af mycobakterie-celler og den lipoopløselige fraktion, idet man injicerer disse dels i Freunds ufuldstændige adjuvans - dels i arachidolie.

De anvendte dyr er Lewis-hanrotter på 250 g opdrættet hos C.N.R.S. (Orléans).

Præparaterne af mycobacteriel oprindelse er følgende: hele celler, vægge fra Mycobacterium smegmatis. Den lipoopløselige fraktion anvendt ved eksperimenterne er udvundet ud fra M.tuberculosis Peurois--stammen.

Doseringerne for alle præparaterne er udtrykt i tørvægt. Alle præparaterne er suspenderet i Freunds ufuldstændige adjuvans eller i vegetabilsk olie og injiceret i den bageste højre trædepude i et volumen på 0,1 ml. Dyrene vejes, og deres poter undersøges på dag nr. 0, 7 og 14.

13 143970

Dyrene aflives på dag nr. 21, og bagpoterne vejes. Graden af arthritis-angrebet udtrykkes ved vægtforskellen mellem den injicerede pote og den ikke-injicerede pote samt ved tegnene på udbredelse af inflammationen på bagpoterne og halen. 1

De i tabel 5 viste resultater bekræfter, at hele celler af M.smegmatis indgivet i Freunds ufuldstændige adjuvans inducerer en kraftig arthritis og en betydelig polyarthritis, der viser sig fra den 14. dag. De samme præparater injiceret i vegetabilsk olie fremkalder hverken arthritis eller ledsagende polyarthritis hos Lewis-rotten.

Adjuvans-forsøgene på mus og rotter viser, at det er muligt at tilvejebringe en adjuvans-virkning svarende til virkningen af Freunds adjuvans under anvendelse af assimilerbar vegetabilsk olie som medium for uopløselige (hele celler), lipoopløselige eller vandopløselige myco-bakterie-præparater. For at opnå dette, er det nødvendigt at anvende stofferne i visse præcise eksperimentelle sammensætninger, der gør det muligt at tilvejebringe stabile emulsioner.

Det skal anføres, at man kan emulgere den vegetabilske olie uden tilsætning af midler, såsom "Arlacel", samt at man kan stabilisere emulsionen ved tilsætning af proteiner homologe med den immuniserede art, hvilket fremgår af de resultater, som er konstateret med influenzavaccine og anført i tabel 4.

Forsøgene med fremkaldelse af polyarthritis hos Lewis-rotten viser, at der findes en forskel mellem emulsionen på basis af mineralolie og emulsionen på basis af vegetabilsk olie. Faktisk kan præparater på mineraloliebasis fremkalde en alvorlig lokal inflammation og en generel arthritis hos rotter. Dette er ikke tilfældet for præparater på basis af vegetabilsk olie.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således et særdeles værdifuldt præparat hvorudfra der kan fremstilles farmaceutiske præparater, som gør det muligt på effektiv måde at forbinde aktive stoffer i vacciner med adjuvanser, som er kendt for deres effektivitet, men hvis anvendelse i lægemidler til human eller veterinær terapi hidtil altid har været forbundet med vanskeligheder.

De således fremstillede farmaceutiske præparater kan anvendes til forstærkning af immun-forsvaret hos mennesker eller dyr over for de mest forskelligartede antigener. Som eksempel kan nævnes anvendelsen af opfindelsen til vacciner på basis af svækkede mycobakterier af typen BCG, vacciner mod malaria osv. Opfindelsen kan ligeledes anvendes til vacciner bestemt til imødegåelse af virussygdomme, f.eks. aphtøs feber, virus-hæpatitis eller parasithæpatitis, f.eks. bilharzioser.

143970 14

Indgiften af de således fremstillede lægemidler foregår fortrinsvis ad subcutan eller intramuscular vej. Indgiften kan også gennemføres ad oral vej.

15 H3S79

O OOO OOOO

cn ooo o w o in co o cm cm σι cn

u , cm <D

-8* S S/ 01 ft CM < ........ d 01 ----S fl CO OOO 000(0 > ft θ' oooooo d øi (dm., to (N m co cm ιΟ -n ω Ό g V con con Od h m ni aj øj ---L -------------Ό (8 --" 1 " ... Øj Λ OOOOOOOO O' (8 U CM OOO id in O CN · ft ft •<8 M N 01 CO CM CM d) Ό ft ft ft g v v ? p cm V d SH ft ft ^ Qi ft Q)

0J O (OOOO 000(0 WWW

ft dO> w o o in o o Ό ti ft ti ftitiflt, 10 CO M1 cl Μ H ft ft OTSHV ft kJ Si 8 o ns c__a__________ 4-> ή ja 01 « i.® . '\e 5|3 ft a r- , o d .. v \ . \ \ ΛνΛ ΐ 3 o 9 H ;A ft Λ ' \v\ V'\ QJ 13 ft ft hh ' V ·, ' \\\ as η as as O' as Ό v V ' A \ +J ft Λ ft øjccsftd·. , \ . \ v \øio iti '-’Ό ft <8 ' Λ v\ : V 1 , \ Q) ft (8 · ft _ai .d tv·.· . >" . ·' ' ' ’ 'ii' & « ft c

(8 ——.......... ............18 (8 O

ft o m o o r^oor" ja ft ft

SB CMlOOOl iOMPt'-CM CDØJØJ

ft C^H (OH d Ό H H

ft ϋ aj d as d as 3 S V 10 § 1 § H ------- " ........-..... 1 " Η P φ Ή Μ Η Θ β Φ φ Φ arn vooo ro o ro m φ o p φ •h 4Jio rf o in in . w fi > η Ό

U -Η Ό 3 V go ‘H OP

Φ -P ___- ---- T5 Η t>

ft I , ---SS---- d QJ

Λ IH 18 01 (O ft <8 O O O OOOO ft O ft

Λ ft Ucmcmcmcm cm m γ~- cm S3 - O

o øi a o> &Ό y ft g V V Øjddft >| ft ______Ό ft ft Æ S c t" a d c o < (O roiDro (OOOcO W Bl Bl B}

•0 _ ; X OO O-SSM

ft Ol O' i ft , . CM CM ft H ft (8 ’j <8 I § V V \J V/ B Udi ft ft · O ft v O' O O ft QJ ft QJ »id 3 QJ ft Οι A! Ai 01

Jo Ai H øl øl 0)

E-J 01 O CSi O' dftftH

ft -Η ft o) O' O' as O Λ! H ft >0 Ο Ο Τ) ή 01 0) α> ft ft d ft øl øl IH 0 0 Q) *0 ft Ό. «· 18 ft ft Q) Q) Λ ft ft øl øl øl a j3 a & m > d _ ft o o rtfttHøi <3 QJ o 8 cn < O' Q, (¾ ft ft 0]

CO QJ »(8 ft ft tjl D> (D Φ G

_> a ft HC 388 < ts ·Η ^ d d > qj O' øi e dri oaJcud BO ft 0 0 & oBS-h · ω ft ft -H m 9 g ό pq oqj o +j -PH ftHiag qj ft fl j^aj A<ajg}d moo to

Hft Ή01 itsbipS aj>>0> QJO Π MG' POttPo 0'0»0' 3 ί 0,° y g V f 11 5HHft νΛ dH dftOi 01 01, CO Ό Ό TJ QJ ft dai js d i iftoi i η oj Q)'-' OSQJddfto |d >ft^ ο ό saaajooo S ft 3ιβ H QJ HOJQJC O' ft (8ft •η a s to 00130 oi-i-jftftfta Ό180 cud » d StI d as φ u « « ts 01¾ gacM Oi qj ft qj Qj W ftftftddoo,

30, SB ft H S-l H 8 ft ft 8 ft S

θ 0 d ft ft ft ft O' & · j 6 WPftHddOi øl »CJI .O'O'® ØlØlØlOHftd 0 ft ft® a j I H oj a a > ο» ό ft

S3 p da PS i fi Λ ® «Ρ DdH

oj ftøi ftoira® s-ι η ι8ήό 9 έ · · ’ · ft Ώ · <H <H * a J3 g O D3 SS S S S P H O' ffi <8 0 ftdddjpdji

ft O O ft 0) QJ

øi —------01 ft ft d > o> ja

QJ d 01 ØJ P ft ft M

p I ^ a ft Η H ØJ ft <8

qj qj ddøiøidP

ac + >·η a i oj 18 id ih

01 ft UBØJ3 fts I

ft Α«ί ΜΗ CU ft O

O' M (8 ft 18 „

O ft O' ft J4 Μ W

ft oi d -y 01 o 4J0101

0 O *H JO »ri { iy *W 1—{ Λ O

d HdHøiid Høift am d Η o 01 d id ft diaft mg 1 qj ft-aajaa, ftjaro ? a μ øiftWdffp +-Θ-Χ+-0 H i« >, o, H »Id ft H ·« 01 m fcjoOjQia Oj Oi O' 16 143970 r —— -—-i ο ο ο ο ο ο · noioo ο ο ο ω 2 lo νο ^ ο co c ω ^ V ΝΗ Η s η----3 -π oirt ro ο Ο Ο ο Ο Ό g, S ρ, om νοιηο 3 ® ,3 ro γ·» m ο ro υ fe V ΟΜ Η ΗΗ 0) <3 ------------ 5

Irt · Ό 2 υ Ο Ο Ο m Ο Ο Ο) 3 S ,* ta cm om 3· ω t" <ΰ ft!

S, rtj 31 C" N N 3 P

S* ™ V H ft M

S _ TI H

P* i? ft ro OO LO O O ai3

. . ® < OO CM O O P >P

H Λ fe n/ 00 00 HH P 3 ® I 5--O A\'\\\\\v · -'W S -S i ® 3 ®g 'IB '> v\vW -X % A V V- S B -¾ 1 »* i ω S Ώ ti

S 01 in oo moo G c G

Π ” o 3> m r-~ 31 γ~- 3* Φ <u ω

S 3.« co cm Ό g S

1¾ 1-1 ι»-ί---—— ----"P Η H

•3 Γ O 0 n _ ft m OO in in O O' > >

•S S’ rfCM 00 -cm m G

H I b ' HH 01 η h ro g. Ό LO Η T) S’ .. ..___________G O' & B m f= = - — --—-- ® o o Q) , j_| S, j UO OO OOO Λ O' Os

S τ! η CM CM CN CM CM CM 3 G

cm d . Ϊ < V v v W ^ S "d « h 2 5 S ^----SS*

0) O roro rororo O Η H

"S o ° p * \J V V VVV "iB O O

Tj H .*« $ S A « « S 5--- G O' O' B -3 ® O 0 n S 10 o o «I 3 o « s5 , s ^ *

B S’ O W Η H

p “3 - ft ® ® 2 3 ft H 5 § Ή g O H G O s i 5 d O -3 § 3 H m S 2 3 ω P O 0 ri S m M O' 0)¾ P > > w § e G G O' O' O' 3 ® · _ •h| gω 3. g s· a g1 h H v. §:

“ih -r> O 1 ' ® 1 ffl TJ ® ® G H O

g 3 Ό -P O O ® H OSSOOg

B (33H ® TIO S H3H

m p ω ® P P P P ft S m 3 G cn 3 010)0)33¾ S."} o. 0) G® G Η H GO®

ftj P ®ft HHHHS

m3 P POi G Η H -P 0> SS ft · Η P P P G G O’

S-p tn · h 8 cn cn Η h G

S, p ® &i · ® MSSOITIH

hr p ε ωρω ®®®0>GH

S ® cn 8G-S Λ P P <g -η Ό

2 >. * »PH PPSflG

M fe a · · ft · i 3 JL S S O P G c Λ G Λ .2 Η Η > 0> Λ i —______cn cn cn Η h p S’ i -Θ- 3HHtnP®

H + ® S33MG+J

7^ ! 0> ® Sfi®®1« S ^;!p® o3 ® h cnøKlfts® g cn ® η η. > h S H O’ H o I '’’fi +! 52 -^¾ μ II« fl . ° d ίΰ -rf d c« Λ -¾ " r-1 C G !Λ lu Ui p 0^8¾¾ o 5 j S u ® H O. å Λ g cl -P -P S ® P cnHfflr^G ffS-3 *< m i? o* fifta pi λ -p + -Θ- x-b o

Tabel 3.

17 143970

Antistof-respons hos Lewis-rotter efter injektion ad plantær vej af ovalbumin indgivet i emulsion med mycobakterier i præparater på basis af mineralolie og vegetabilsk olie.

dag 7 dag 21 dag 35 dag 42 “ efterbe-

HAP HAP handling ° HAP

Præparat på mineraloliebasis + '^· + M. smeg. hele celler 500 μg 50 <3 >-< 12.800 -—----

Præparat på basis af vege- ^ y s' ^ tabilsk olie + M.smeg. hele 25 3 '' 7.400 I celler 500 ,»g 'i' " 7 dyr pr. besætning modtager 1 mg ovalbumin i den højre trædepude.

+ Emulsion fremstillet med 1 volumendel fysiologisk opløsning og 1 volumendel af Freunds ufuldstændige adjuvans <}> Emulsion fremstillet med 1 volumendel fysiologisk opløsning og 3 volumendele arachidolie x HAP: passiv hæmagglutination o efterbehandling med 100 yug ovalbumin.

18 143970 01 Ρ

0ί CO CO

Ifl cm O O O O O dl 3

n 1001000¾ B

CM CM "d< G dl «id ft (1) ft id

ft · cd ¾ P H

¾ P ¾ p H _1----------r—: £ Et

φ cco: -----ft fij H

+j °cd -P tu

id ft co C

U I-H Op

Id 04OOIOO O C P dl

ft C01OCMOO013P

CM P ¾ P 0

HO 3 H

a id p ft -Ο rag p , ----— · a ¾ 3 -- —Λ1' -Λλνν , -V.^ ί Η c οι Οι \ϋ\ \ > V ν- tn α> w •Η ©β Λ ν χ ν< \ VS, \Ν^ο\λ^ β Μ Η PH \ Υ V. , \ ·. \\·\ NVN^Oi -¾ 1¾ "Ν θ’ HH ν ' , \\ \\nSV^ 3 , S' S S: V ' ,: Λ·%; . * ΐ " Ξ σιακ^ν , , .’ν' c· \\\ ·' ^ μ η ο — c <— \\ \ 'ιΛ \ ,-ο. Λ \ X ¾ <ΰ η ν\\ ' ν>\ 'Λ\'· ' V . Ο ® Ό ra

οι >υ· to ν ν . . .\ ^Ν'· ν > \ \. Ρ S 'S

3 s ρ vvv'Λ \.\ λ\v\ \ > e S c

η >. ·\\ · Xv nn \ \S' » 1 <B

P P ft Y> · X \ ' Ox \ y >\ „ R tJ

S o oVnxv'V \·-^ ^\>\ v ".’:,A co o o N p Kv.w.vtV \\ · ' X' λΆ·^· - -·' -χ ^xx - > Λ 5 § ' 01-1¾

3 H _ C

p dl ,· ft P

p ra *- „ H o C '-'-Hyl ^-10 .J ΟΪ ** O* &>0*

«d< H S! CM 0) CM CM ft C C

1¾ dl ft ^ P di—! P Cd Ρ p

p di ρ cd Ό · S G

di S p rø ft 01 01 Λ dl P --- —:----- ------- " ' "Cd ·Η & Όι

Id +) ·Η I a Η -Η -Η εη di η ή ο a a

Ho Ο ·η id 0 ο φ _μ · · · · · dl Ρ tnc^&i ο ft σ> ft > c ,¾ χ •η » ρ 2 2 2 2 2 s οι οι ϋ Η Ρ Ρ CCS G Ρ Ρ Ρ ϋ-Η GOi «ΡΟΟ ί d <ιΰ didioo 6 in ¾ C ¾ Η Η Ρ-----:--1 -0 C 0 Ο 01 φ Ρ Π) ·Η ·Η

3 U ·Η γ-4 0) W

a οι 01 η ρ >ι >1 > ·Η^ ο ΟΟΙΡΡΙΗ οι οι ο 1 ι ιο oft

Oft ο 1 1 HCdHHH· r< ο ¾ Η dl dl ΰ) d) ____- Ρ ¾ ¾ ¾ ·Η

C dl ---- C dl C C H

O -Η -Η P 00 dl 0 •rl r—I β S B ¾ +J O Ό dl Ρ Ρ ·Η

Id H Cd P rH ρ C Id G O 0 O Cl -HH 0 Hco!>>id

ρ di ra -η di H

3 a -H+lOi dlft'r-IHld

rH >H 01 ,H ft Id CO

ftg m OidH oiftpp ¾ d di

to c HHdl-HM'O 2 2H

cd 43 cd , , ,2ρμΡ>ο·Β Sdi ged >1 itoi-scdBH ¾

« 3 Hwh I®y_C P PC

ρ τι v-piaft'Sftdisd) <ά POO dl II B Dl H Pø di rf rho ara ρ id p pc

¾ P3ftraCG¾·H·HP

C — ^Ή-Γ,Φ+Ι+’-ΡΡ dl SftP SHS.cd 01 01> h __w a a s ni -____— di di di 0

Ρ P ft Η H

-Η X O *W <H ft p ra · 0 P I m P HftCOld -η ra ® p ftcoco-^ •s -H+ P P P cd -H ft h diS ra o^w>oia

dl ft S dl P CCPSP

p o λ p di aras-o 3·

p ^P^to P SO S H

B -g °g,5 ft P W cd W ft p y ft +}. 2 +> p ^

ρ H O g- ω g cd^H

c g ρ h c y x < m 0 ® p o 01 p S' 8» s gep <u 01 c cB ja ra p y\ a c a cd Pc p o --1-— 19 143970 * w © g

n S

o* M oo vd r-· cn

G) Lil O t-A ro LO

d) s ·>» *» *» <h

Η 4π O Η H O O

Η ·Η ! P--1-1-- <U +a H - ®

^ Η N

5 CS <0 O HH r* r- Λ l O H VD O O CTi 0 φ Φ *H *>· *· * * ·*

p (C^-nCSCNCN CSr-J

b λ q S ' ·Η ·Η ® p__'______ ft « α) j +> *2 [j 0 3 H Dj Οί

® -u I

5 m oj d w d P ω γ~- oo tp ffi H miDtOH'jin in 0 -P ϋ «- *· - * “· -p

Ή CJl-HCNnM C4 CN

U. W 1~> ®

^ > C P

d -p *1 i —:-----a e -: —----si 0

•P · <D

4J <U + 4J

ml! i + i ii ω ® H 3 + d> p 5 XX ft + O' fi Ό a) ,p Id

•P rj Pi CM JO

Λ tjl *

5 “ C -d + + C

® d ιβ ϋ 4-> ++ +1+1 ω .+J y i d P o + d +1 id μ ό 5 + ® , -p + -Η © )-1 Jj.. ...... .......... Jj 6 ® ή e o * <1) i—I ij η Qj in +) rH 5 o -¾ -P d> +> . + m «

rn P .. P Kdl+I II SO ID

JJMWidrfl 0) d) H

^ 15 & ftp 5 io to d o-i___to ® Æ

E-1 > (d 3 U

£3^ tfl P O'

® 2? e H + <Ut-iO

J ^ ® H (J

,. d d ·++ + H -P P

w , d o xj +i + + +i ο a) ο® ρ d 33 + c p Λ ®> C3 d P + rP d) 0 •h Æ + a *d Dj W T3__a w ^ -H c ---- ‘ HW O' P fti » ·. id 71+) (0 -ρ O .-1

M to -Ρ r-4 I a -P

•P 03 to <U d) p d) P

P ·Ρ 0 tfl M d) d JO 3 13 & -a θ’ d 3 d tp Η Η id P 9 ><3 C ft ft -pol'd d „ <u 0 0 ¢) in id 0 w 00 0 c p ft”d d ft p ft soft ., S ® )4 Ή d) -P -rite ®p ID a OH HH 0> P O’ O « C , r4 H eds

3)4 id -P r4t0 d) to PSP

® ft >id tu-H o -p did ft , 3 P oo 0 v S d d -Ρ -ο d P d) Ρ « H © W , d ft O’ I d) 3 1—I 3 to 04 p "S+J <W3 rp® d) Φ tudft ®® M^tUOi Λ ft Λ-ΗΜ Η H ft si ,Lj ® 0 « · ip 04 04¾ +jo ·0· Mdd

IdC pLO 0< · Ή 01 · ft .,® d) ddoJdifl tjio> ,®ft > -d a3^s3 pee tew Wft to -P 3 to -P ο* o)-p-p P 3 · · p · · -P +J p p ® w asoogsH -p d) tu 03 ,. 0 Ό -d Η p----------- p p p <0 d) i 3 3 ^ +J C r- 5 > a d μ to i ® P -p C 03

0 * to Id -P

ft ft p d > si 0) ip -P 3 0 d)

P 3 O’ π id -P

IB 04 -P Ό P iP

rt Ddd ido +0