DK143524B - Optisk-elektrisk maaleindretning til kvantitativ bestemmelse af haemolyseret blods indhold af mindst et oploest haemoglobindervat - Google Patents

Description

(19) DANMARK

|p (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT ου 143524 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 3727/75 (51) IntCI.3 θ 01 N 21/27 (22) Indleveringsdag 19* aUg. 1975 (24) Løbedag 19· aug. 1975 (41) Aim. tilgængelig 21 . feb. 197 β (44) Fremlagt 31 · aug. 1981 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 20. aug. 1974, 011328/74, CH

(71) Ansøger jCONTRAVES AG, 8052 Zuerich, GH.

(72) Opfinder Raymond Rrey, CH.

(74) Fuldmægtig Firmaet Chas. Hude.

(54) OptiEk-elektrlBk måleindretning til kvantitativ bestemmelse af hæmolyseret blods indhold af mindst et opløst hæmoglobinderivat.

Opfindelsen angår en optisk-elektrisk måleindretning til kvantitativ bestemmelse af hæmolyseret blods indhold af mindst et opløst hæmoglobin-derivat ved at sammenligne en opnået elektrisk om- ® former-udgangsstørrelse - idet alle lysbølgelængder inden for et d* \j bestemt spektralområde under ca. 620 mm bidrager partielt til ^ integralværdien af denne udgangsstørrelse - for en målekuvette, indsat i lysvejen mellem en glødetrådslampe og en fotoelektrisk ^ omformer og gennemlyst, med værdien af denne omformer-udgangsstør- * 3 2 U3524 relse for en hæmoglobinfri standardopløsning i målekuvetten.

En kendt måleindretning af denne art er beskrevet i ITS-PS 2.051.320. Det angår et problem, som opstår, når man med en glødetrådslampe gennemlyser en målekuvette med blodhæmolysat, som kun indeholder oxyhæmoglobin. Dette lys har et kontinuert bredt spektrum og sendes over imod en fotoelektrisk omformer. Eor at undgå målefejl ved en udmatning af den anvendte fotocelle på grund af opvarmning, indskydes et optisk filter, således at den røde og infrarøde del af lyset med en bølgelængde på over ca. 620 nm udskilles.

Medicinsk klinisk er der interesse for ikke blot at kunne vise indholdet af oxyhæmoglobin (Eb00^) i hæmolysatet eller andre særlige hæmoglobin-derivater, men også kunne vise det totale indhold af alle i hovedsagen forekommende hæmoglobinderivater, således også af reduceret hæmoglobin (Hb), af carboxy-hæmoglobin (HbCO) og af methæmo-globin (Hi) ved så nøjagtige målinger som muligt.

Der kendes en metode til dette formål fra en artikel af ¥. G·. Zijlstra i Elin. Wochenschrift Jg. 34, Heft 13/14, pag. 384-389 under kapitel b. Det foreslås dér ved anvendelse af et spektro-fotometer, som indskydes i lysvejen mellem en wolfram-tråd-lampe og en fotoelektrisk omformer, at anbringe en spektralopløsnings-anordning for lyset og en smal spalteblænde, som kan indstilles på et passende smalbåndet bølgelængdeområde for spektralbåndet, såvel som en målekuvette, der kun gennemlyses monokromatisk af spalte-gennemgangslyset, med hæmolysat, som er forbehandlet med cyan-derivat til overføring af alle hæmoglobinderivater i cyan= me thæmoglobin (HiCIT). Ekstinktionen bestemmes i mindst ét smalbåndet bølgelængdeområde som en formindskelse af den elektriske omformers udgangsstørrelse i forhold til en hæmoglobinfri sammenligningsopløsning .

Moderne måleindretninger, som arbejder efter denne fremgangsmåde kendes f.eks. fra følgende litteratursteder: a) S.M. lewis: "International standard for hemoglobinometry" 3 143524 J.clin.path. (1967) Vol. 20, 791, b) O.W. van Assendelft: "Photometry and the standardized method for the determination of haemoglobin"

Schweiz, med. Wochenschrift, bind 101, 1649-1652 (1971), og c) O.W. van Assendelft: "Spectrometry of Haemoglobin - Derivates" Forlag: Royal Vangorcum Ltd., Assen NL (1970).

Ved disse kendte metoder udnytter man af det disponible lysspektrum kun et smalt bølgelængdebånd med et maksimum ved λ = 540 nm og en halvværdibredde på kun 20 nm, idet man f.eks. ved hjælp af en belyst spalte eller ved anbringelse af et smalbåndet gennem-gangsfarvefilter i lysvejen foretager en spektral opdeling af lyset.

Da man ved bestemmelsen af det totale hæmoglobinindhold må tage hensyn til flere hæmoglobin-derivater, nemlig Hb, HbOj og HbCO, hvis transmissionskurver ved λ = 540 nm er forskellige, er det nødvendigt ved anvendelsen af de kendte standard-måleindretninger at tilsætte hæmolysevæsken en cyanholdig kemisk reaktionsopløsning for at omdanne alle hæmoglobin-derivaterne til den samme kemiske forbindelse (cyanmet-metode)..

Anvendelsen af cyanholdige eller tilsvarende giftige reaktionsopløsninger til præparering af den hæmoglobinopløsning, der skal undersøges , er i mange tilfælde forbundet med en fare for det personel, der udfører undersøgelsen, samtidig med, at ventetiden forøges med reaktionstiden, som er på nogle minutter. Derved beskadiges også de i opløsningen værende leukocyter, hvad der ofte er uønsket. Desuden fordrer en smalbåndet lysudnyttelse i fotometriske undersøgelsesapparater af energimæssige årsager, at der anvendes en forholdsvis kostbar spaltebelysnings- og afbildnings-optik.

Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe en forbedret hæmoglo-bin-måleindretning af den indledningsvis nævnte art, der ligeledes udviser lysabsorption i en hæmoglobinopløsning i ét bestemt bølgelængdeområde, men i et bredbåndet i stedet for i et smalbåndet område, nemlig over hele bølgelængdeområdet fra 500 til 600 nm, og 143524 4 som gør det muligt at "bestemme det totale indhold af alle i hovedsagen forekommende hæmoglobin-derivater uden at omdanne de forskellige hæmoglobin-derivater til den samme kemiske forbindelse ved anvendelse af giftige reaktionsstoffer. Med måleindretningen skal der frembringes en visningsstørrelse, der så lineært som muligt svarer til det totale hæmoglobinindhold i opløsningen.

Opfindelsen beror på en erkendelse af, at de vigtigste hæmoglobinderivater Hb, Hb02, HbCO, Hi indeholdt i en opløsning ved samme koncentrationer bevirker tilnærmelsesvis samme integral-absorption, når der udnyttes et udvalgt lysbølgelængdeområde fra 500 til 600 nm. Derved er absorptionen i en blanding af disse derivater uafhængig af den relative sammensætning og er derved et direkte mål for den totale hæmoglobinkoncentration.

Formålet opnås, ved at den optisk elektriske måleindretning af den. i indledningen til krav 1 angivne art er ejendommelig ved, at glødelampens emissionsspektrum, -den resulterende lysemission gennem de konstruktionsdele, der bestråles af lyset på dets vej til omformeren, såvel som den spektrale følsomhed for omformeren, er afstemt efter hinanden og kombineret således, at i tilfælde af, at der ingen hæmoglobin er i målekuvetten, forløber omformerudgangsstørrelsen som en ubrudt og klokkeformet funktion af lysbølgelængden og har sit maksimum i bølgelængdeområdet mellem 540 nm og 560 nm og aftager til begge sider med en halvværdibredde på mindst 60 nm bestandigt til mindre end 20% af maksimalværdien ved bølgelængdeværdier på 500 nm og 600 nm og aftager uden for disse mellemværdier asymptotisk mod værdien nul. Derved opnås, at når der er hæmoglobin tilstede i kuvetten, svarer omformerudgangsstørrelsen uafhængigt af partialkoncentrationen af den hyppigste hæmoglobinderivat intydigt til den totale hæmoglobinkoncentration i målekuvetten.

Opfindelsen har i forhold til kendte fotoelektriske hæmoglobin-måleindretninger efter princippet for lysekstinktion blandt andet følgende fordele: a) Eftersom primærlyset bidrager til omformningen i de elektriske omformerudgangsstørrelser over et bredt emissions-spektralspektrum for en glødetrådslampe, f.eks. en wolframlampe i stedet for som ved det i dag anbefalede standardudstyr kun smalbåndede udsnit her- 5 143524 af, kan der renonceres på højeffektlamper og/eller på en bekostelig belysningsoptik, b) eftersom der kan renonceres på den tidsrøvende kemiske omdannelse af alle Hb-derivater ved hjælp af giftige cyan-forbindelser i cyanmet-hæmoglobin, hvilke forbindelser tilmed beskadiger leu-cosyterne, uden at det medfører en begrænsning af målenøjagtighe-den ved bestemmelsen af det totale hæmoglobinindhold i hæmolysa-tet, og det er tilstrækkeligt at anvende kemisk mindre aktive hæmolysereagenser med tilsætning af en detergent og af kogsalt for at undgå forplumring af hæmolysatet og deraf betingede målefejl, c) de viste måleresultater er omtrent rigtige straks efter blodets blanding med hæmolysevæsken og holder sig konstante i timer derefter, d) måleudstyrets tekniske enkelthed byder på meget gode forudsætninger for en linearisering af omformerudgangsstørrelsen med hensyn til den totale hæmoglobinkoncentration ved en kombination af omformerne og en referenceomformer i en lineariserings-målebro og således også for en automatisering af hæmoglobin-målingen.

For øjeblikket er der ingen kendte fotoelektriske omformere, hvis spektrale følsomhed alene i samvirkning med almindelige lyskilders emissionsspektrum formår at frembringe den ønskede spektrale afhængighed. Derfor er det for at frembringe den ønskede afhængighed nødvendigt at anbringe optiske filtre i lysvejen. Der kan dertil anvendes gennemgangsfarvefiltre, som f.eks. et grønfilter eller et højpas-blåfilter i kombination med et lavpas-gulfilter og/eller et reflektionsfilter.

I en særlig fordelagtig udførelsesform er en del af det fra lyskilden udsendte lys ført hen til en anden fotoelektrisk omformer til dannelse af en referenceværdi. Herved kan der med fordel indsættes to ensartede fotomodstande som fotoelektriske omformere i to parallelle længdegrene i en elektrisk brokobling, i hvis tværgren et viserinstrument til visning af hæmoglobinindholdet er indsat.

Til brug ved den her beskrevne udførelsesform er det ved måling fordelagtigt at følge nedenstående trin: 6 143524 a) at anbringe en hæmoglobinfri standardopløsning og indstille brokoblingen til nul, b) anbringe en standard-hæmoglobinopløsning og justere den viste måleværdi, og c) indsætte en hæmoglobinopløsning med et ukendt hæmoglobinindhold.

Opfindelsen skal nærmere forklares i det følgende under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser et principdiagram af måleindretningen ifølge opfindelsen, fig. 2 de vigtigste karakteristikker, nemlig følsomheden for omformeren, der i forbindelse med de spektralselektive konstruktionsdele til påvirkning af lyset ved en hæmoglobinfri standardopløsning har følsomhedskurven I.j_q, °9 ^en PrincipieHe transmissionskarakteristik Tjj af opløst oxy-hæmoglobin Hb02, alle som funktion af lysbølgelængden λ, fig. 3 et principkredsløb af en i måleindretningen anvendelig line-ariserings-målebro M, fig. 4 en variation af fig. 1 med et reflektionsfilter anbragt i lysvejen til den fotoelektriske omformer F i stedet for gennem-gangsfarvefiltrene E^, , fig. 5 et udførelseseksempel af måleindretningen ifølge opfindelsen, set i retning af pilene V-V i fig. 6, delvis i snit, og fig. 6 den samme måleindretning set i retning af pilene VI-VI i fig. 5, ligeledes delvis gennemskåret. 1 det i fig. 1 viste principdiagram betegner L en lyskilde, fortrinsvis en wolframtråd-mikroglødelampe med ringe ydeevne og lang levetid. På lampens L højre side er der anbragt en fotomodstand F.

I lysvejen mellem lampen L og fotomodstanden F er der efter hinanden anbragt en hulblænde B, en lille spredeplade C, en udskiftelig kol- 7 143524 be D til en hæmoglobinopløsning og to gennemgangsfarvefiltre og E2/ fortrinsvis et højpas-blåfilter og et lavpas-gulfilter E2·

Det på fotomodstanden F indkommende lys omsættes i afhængighed af den over fotomodstanden påtrykte spænding til en strøm 1^. På lampens venstre side er der anbragt en lignende fotomodstand F', som via en hulblænde B' og en spredeplade C rammes af en del af lampens L udsendte lys, og som herved frembringer en referencestrøm V· I fig. 2 viser følsomhedskurven 1^ den strøm i^, der frembringes gennem fotomodstanden F, som er påtrykt en normalspænding, og som påvirkes af lys af en bestemt intensitet, og af den i abscisseretningen angivne bølgelængde. Denne kurve svarer til det menneskelige øjes farvefølsomhed, men ikke til den følsomhed, der ktæves ifølge opfindelsen, dvs. den følsomhed , der fås ved at indsætte en kolbe D med en hæmoglobinfri standardopløsning. Denne er ligeledes vist i fig. 2 i en fordelagtig og realiserbar form.. En sådan følsomhedskurve frembringes ved en passende udformning af måleindretningen ifølge fig. 1, af de i lysvejen til fotomodstanden F indsatte gennemgangsfarvefiltre E^ og E2 i samvirkning med lampens L ikke viste udstrålingsspektrum og fotomodstandens F tegnede følsomhed If. Den herved resulterende følsomhedskurve It0 har maksimum ved λ = 540 til 560 nm og en halwærdibredde på mindst 60 nm og aftager ud imod begge båndgrænser til en restværdi på højst 20% af maksimalværdien og aftager uden for båndgrænserne asymptotisk imod nvil. Der er endvidere i fig. 2 vist den resulterende transmissionskurve for en oxy-hæmoglobinopløsning ved gennemlysning med hvidt lys, af hvilken den i fig. 1 viste måleindretning udnytter det mellem båndgrænserne λ = 500 nm henholdsvis λ = 600 nm beliggende udsnit. 1 fig. 3 er der skematisk vist en lineariseringsmålebro M, i hvilken begge fotomodstandene F og P2 er anbragt i to med hinanden parallelle længdegrene. I tværgrenen af denne målebro M er der anbragt en indretning H til visning af den ønskede elektriske målestørrelse nemlig den til det totale hæmoglobinindhold i kolben D svarende strøm- eller spændingsværdi. Ved passende dimensionering af modstandene R og R' i de to øvrige længdegrene af målebroen M kan der opnås et kvasilineært forhold mellem deri i visningsappara-tet H viste strøm- henholdsvis spændingsværdi og mellem hæmoglobin- 2 8 143524 koncentrationen i kolben D i det tekniske vigtige område af hæmoglobinindholdet (8 til 24 mg/100 ml). Ligeledes er det muligt, i givet fald under anvendelse af yderligere kredsløbselementer, i stor udstrækning at gøre den i visningsindretningen H i lineariserings-målebroen viste elektriske måleværdi uafhængig af svingninger i lampens lys, således at det er overflødigt at stabilisere lampens lys.

Fig. 4 viser som en variation af fig. 1, hvordan den Ønskede resulterende følsomhedskurve kan opnås ved i stedet for som i fig. 1 at benytte gennemgangsfarvefiltrene E^ og E2 i lysvejen fra lampen L til fotomodstanden F på den anden side af en hulblænde B og en prøvekolbe D ved at benytte et reflektionsfilter E^.

Fig. 5 og 6 viser en variant af måleindretningen ifølge fig. 1. På en grundplade 1 er der anbragt en holdeindretning 10, 11 til lampen L, en fatning 12 til fotomodstanden F, en fatning 13 til en hulblænde B2 og til to gennemgangsfarvefiltre E^ og E2, en udskiftelig målekolbe D eller en fast indbygget gennemstrømningskolbe, en fatning 15 til hulblænden B^ og spredeskiven C samt en holdeindretning 16 til de aktive dele F’, B" og C' på referencestørrelse-frem-bringelsesindretningen for fotomodstanden F'. Hele hæmoglobin-kon-centrations-måleindretningen er indeholdt i et hus 17, der er forsynet med et aftageligt dæksel 170, hvorigennem kolben D kan udskiftes.

I stedet for den i fig. 1, 5 og 6 viste måleindretning, kan konstruktionsdelene C, E^, e2 og målekolben D i almindelighed placeres i vilkårlig rækkefølge. Lystabet ved spredning i målekolben D kan reduceres ved, at fotomodstanden F anbringes tættest muligt denne kolbe, hvorfor filtrene E^ og E2 anbringes mellem lyskilden L og kolben D.

Af de tidligere nævnte grunde kan man ved anvendelse af den nævnte bredbåndede måling af reaktionsopløsningen undgå at benytte den tidligere nævnte cyanmet-metode. Dette eliminerer omgangen med en giftig substans, forkorter den forberedende fase og forhindrer en beskadigelse af leukocyterne, hvad der frem for alt er vigtigt ved den samtidige tælling og i særdeleshed ved volumendiskrimineringen af leukocyterne i en tællerautomat.

Claims (2)

143524 9 Principielt er ethvert hæmolyserende ikke for stærkt farvende for-tyndingsmiddel egnet ved hæmoglobinbestemmelse, f.eks. destilleret vand. En fordel af teknisk art fremkommer ved, at der ved den bred-båndede måling falder tilstrækkelig lysmængde på de som detektorer tjenende fotoelektriske modstande F, F', således at fokuserende optiske elementer er gjort overflødige, hvorved den kritiske optiske justering også bortfalder. Det fremgår således, at prøvetillavningen er hurtigere, enklere og billigere, og at materialeomkostningerne i den optiske del er formindsket. Patentkrav.

1. Optisk-elektrisk måleindretning til kvantitativ bestemmelse af hæmolyseret blods indhold af mindst ét opløst hæmoglobinderivat, ved at sammenligne en opnået elektrisk omformer-udgangsstørrelse - idet alle lysbølgelængder inden for et bestemt spektralområde under ca. 620 nm bidrager partialt til integralværdien af denne udgangsstørrelse - for en målekuvette (ΰ) indsat i lysvejen mellem en glødetrådslampe (l) og en fotoelektrisk omformer (P) og gennemlyst, med værdien af denne omformer-udgangsstørrelse for en hæmoglobinfri standardopløsning i målekuvetten, kendetegnet ved, at glødetrådslampens (L) emissionsspektrum, den resulterende lystransmission (T^) gennem de konstruktionsdele (C, D, E), der bestråles af lyset på dets vej til omformeren (P), såvel som den spektrale følsomhed (ΐ^ί/Ό) for omformeren (P) er afstemt efter hinanden og kombineret således, at i tilfælde af, at der ingen hæmoglobin er i målekuvetten (D), forløber omformerudgangsstørrelsen (It0) som en ubrudt og klokkeformet funktion (Ι^0(λ)) af lysbølgelængden (λ), har sit maksimum i bølgelængdeområdet mellem 540 nm og 560 nm5 aftager til begge sider med en halwærdibredde på mindst 60 nm bestandigt til mindre end 20% af maksimalværdien ved bølgelængdeværdier på 500 nm og 600 nm og aftager uden for disse mellemværdier asymptotisk mod værdien nul.

2. Indretning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den nødvendige spektrale afhængighed (i (λ)) for omformerudgangs-