DK143437B - Fremgangsmaade til fremstilling af en vaccine til hindring af sygdomme fremkaldt af katteleukaemivirus - Google Patents

Description

143437 i o

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine til hindring af sygdomme fremkaldt af katteleukæmivirus (felinleukæmivi-rus her forkortet til FeLV), ved hvilken man poder dyr-5 kede dyreceller med katteleukæmivirus og dyrker dette.

Katteleukæmivirus overføres mellem de enkelte katte, hvorved en forholdsvis høj andel af kattene indenfor et bestemt· område, en såkaldt "population" inficeres.

Man regner med, at kattes infektion med felinleukæmivirus 10 er ansvarlig for andre sygdomme end leukæmi, f.eks. immunosuppression og ikke-responsiv anæmi. Immunosuppresion er en sygdomstilstand, ved hvilken organismens normale immun-system undertrykkes, og legemets normale forsvar mod infektion ikke svarer igen ved et infektiøst angreb. Ikke 15 -responsiv anæmi er en anæmi, som ikke reagerer på konventionel behandling. Sommetider forekommer immunosuppression eller ikke-responsiv anæmi hos katte, der ikke har noget symptom på leukæmi. Det antages imidlertid, at disse symptomer skyldes FeLV. Når disse katte prøves for FeLV ved 20 teknik med fikseret celleimmunofluorescens viser det sig, at en høj procentdel deraf er FeLV-positive.

Fra dansk patentskrift nr. 123.307’kendes dyrkning af virus, herunder specielt infektiøs felinpatogen-virus, på vævsceller fra felinfostre, der podes med virus 25 og derefter dyrkes i et næringsmedium. Ved denne kendte fremgangsmåde anvendes vævsceller fra en heteroploid felinfoster-cellelinie. Denne opnås ved successive passager udover 40-50. Herved frembringes først et monolag af celler, som ikke er podet med FeLV. De er diploide og 30 passerer serievis videre til frembringelse af en heteroploid cellelinie, på hvilken man så propagerer det omhandlede virus. Ifølge det danske patentskrift, fremstilles vaccinen ud fra den således dyrkede virus. Dyrkningscellerne sprænges herved og skilles fra. I dansk patentskrift nr.

35 123.307 er der tale om brugen af inaktiveret virus som antigenmateriale i vaccinen. Den heteroploide cellelinie defineres som indeholdende over 25% abnorme celler, der 2

O

U3437 dyrkes over mange passager for at opnå svækkelse eller total inaktivering af virusstammens virulens. Disse svækkede og inaktiverede vacciner er afprøvet specifikt mod infektiøs felin enteritis.

5 I ovennævnte danske patentbeskrivelses eksempel 6 og 7 omtales fremstilling af vaccine ud fra de dyrkede kulturer· Det vil bemærkes, at kulturerne først underkastes nedfrysning og optøning tre gange. Formålet hermed er klart nok, idet nedfrysning til -30°C øde-10 lægger cellerne ved at itubryde cellemembranen og frigøre viruset inden i cellen. Dette er standardteknik til opnåelse af virus fra de celler, hvori det er dyrket.

Der er i og for sig intet i vejen for at injicere tilstedeværende cellerester sammen med det infektiøse felinenteri-15 tisvirus, som fås i eksempel 6; men man vil vel nok være forbeholden over for at lave en sådan vaccine i teknisk målestok, når henses til, at der er tale om abnorme celler, som er i stand til at danne tumorer i hamsterkind-poser efter injektion.

20 Den foreliggende opfindelse bygger på specifikke iagt tagelser i forbindelse med dannelsen af antistoffer i celler inficeret med netop katteleukæmivirus (FeLV-inficerede celler). Det er herved nemlig nu fastslået, at man ved dyrkning af katteleukæmivirus på dyrkede dyreceller af 25 gængs type til dette formål opnår dannelse af virusforbundet antigen på cellernes overflade eller i selve cellemembranen, og at man ved at vaccinere katte med de pågældende virusinficerede celler i den nedenfor specificerede koncentration sætter disse katte i stand til selv at frem-30 bringe antistoffer over for de virusinficerede celler. Herved vil dyrene vaccineres med både celler og virus. Den herved opnåede mekanisme bygger på, at der dannes antistoffer både mod viruset og mod de virusinficerede celler, således at der fås en art totrinsbeskyttelse, hvilket vil sige, 35 at antistofferne mod de inficerede celler angriber de celler, som senere påføres eller inficeres med FeLV, således at frembringelsen af nyt virus holdes i skak, samtidig med, 3

O

143437 at antistofferne mod viruset hindrer, at virus spredes til uinficerede celler, og levende virus udbredes af dyret.

Det ses således, at denne mekanisme er helt forskellig fra den, som udøves af konventionelle virale 5 vacciner, der kun indfører antistoffer mod viruset. Så-fremt der ved konventionelle vacciner er tale om injektion af eventuelle cellerester eller cellemateriale sammen med viruset (der benyttes i svækket eller inaktiveret form) tjener dette i hvert fald ikke det formål at tilvejebrin-10 ge yderligere beskyttelse mod sygdommen, men repræsenterer blot et manglende rensningstrin, som man eventuelt har været nødt til at finde sig i.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig * ved, at de med viruset inficerede celler, som bærer det 15 virale antigen på deres overflade, udvindes og anvendes til vaccinen, som oparbejdes på i og for sig kendt måde, idet 5 9 der tilvejebringes dosisenheder indeholdende 10 -2x10 inficerede celler pr. enhed. · ·'

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fås en vaccine 20 med forøget effektivitet sammenlignet med konventionelle vacciner, og dette opnås vel at mærke ved en enkelt eller nogle få dyrkninger i modsætning til de talrige passager af størrelsesordenen 50-75, som foretages ved den kendte virusdyrkning ifølge dansk patent nr. 123.307.

25 Til forskel fra enhver anden virusvaccine på mar kedet er det her omhandlede immunogen et celleprodukt og ikke et virionprodukt, og den beskyttende virkning udøves i vid udstrækning via et antistofangreb på inficerede celler og ikke via antivirale antistoffer.

30 Faktisk viser det ved celledyrkningen anvendte FeLV- -virus sig bagefter at være ikke infektiøst eller yderst lidet infektiøst og ikke i sig selv at fremkalde antistofdannelse hos katte, der ikke tidligere har været udsat for viruset. Disse resultater indicerer, at det 35 er selve membranantigenerne, der fremkalder beskyttelsesrespons, og ikke viruset, således som tilfældet er ved konventionelle vacciner. Ovennævnte beskyttende virkning skyl- 4

O

143437 des faktisk de virustilknyttede cellemembranantigener.

Hermed tilvejebringes beskyttelse ved injektion af ikke-infektiøse materialer. Dette betyder, at beskyttelse kan opnås ved at indsprøjte materialer, der ikke 5 fremkalder sygdom, f.eks. med virus podede celler, hvor virusantigenet er knyttet til cellernes overflade, idet som en ekstra sikkerhedsforanstaltning både celler og virus dog fortrinsvis er inaktiveret ved i og for sig kendte kemiske eller fysiske behandlinger.

10 Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstil lede vaccine tjener således til profylaktisk immunisering af katte ved fremkaldelse af meget høje antistofti-tere mod de til FeLV knyttede antigener og beskyttelse for dyrene mod infektion med selv højpatogene stammer af 15 dette virus. Denne vaccine tilvejebringer høje antistof-titere mod de til FeLV knyttede antigener i kattes blod uden i sig selv at fremkalde vedvarende virusinfektioner.

Derved opnås på effektiv og mild måde tilstrækkelig primær immunisering mod FeLV, der sætter en kat, som senere 20 inficeres med dette virus, i stand til at opbyde et sekundært respons og derved selv straks at overvinde infektionen. I alle tilfælde vil den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede vaccine yde tilstrækkelig beskyttelse for et dyr, som selv sættes i stand til at overvin-25 de en efterfølgende infektion med FeLV uden at fremkalde, vedvarende infektion hos dyret. Især opnås beskyttelse ved injektion af ikke-infektiøse materialer, når ifølge opfindelsen de udvundne inficerede celler med det virale antigen på deres overflade sammen med viruset svækkes eller 30 inaktiveres ved kemiske eller fysiske foranstaltninger, og der tilvejebringes dosisenheder på 10 -2x10 inficerede, svækkede celler pr. enhed.

Dette virus kan dyrkes på mange forskellige celler ved konventionelle foranstaltninger. Således kan kat-35 telymfekløvningsceller (lymphoblaster) dyrkes i suspension, og disse celler vil overføre levende virus i ikke-cytocid stabil tilstand til deres celleafkom. Lignende cellekul- 5

O

143437 turer kan udledes fra celler af andre dyrearter end katte såsom hunde eller mennesker, og disse kan også bære den ikke-infektiøse virusinfektion fra generation til generation. Alternativt er det muligt at dyrke katteembryocel-5 ler i monolag. Disse celler kan inficeres og Indsamles efter en hensigtsmæssig infektionsperiode. Celler fra ikke--kattearter kan også dyrkes i monolag og inficeres. Ydermere er det muligt at holde tumorceller fra en inficeret kat i kontinuerlig kultur. Det har vist sig, at viruspar-10 tiklerne fra sådanne celler kun udviser lav infektionsevne over for katte, men bliver ved med at kunne immunisere katte effektivt mod infektion med selv stærkt patogene stammer af inficerende virus. I alle tilfælde dyrkes kulturen af disse celler under konventionelle betingelser, som sør-15 ger for cellernes replikation.

Da det har vist sig, at sådanne celler inficeret med FeLV ved denne kultur frembringer store mængder af antigen knyttet til cellemembranens overflade, og at dette membranantigen er immunogenisk, tjener produktet til ef-20 fektiv indgivelse som vaccine i en kat ved injektion til immunisering af dyret mod senere inficering med dette virus; Sådanne antistoffer er også aktive mod celler, som efter inficering har dannet maligne tumorceller, dvs. vaccinen vil også virke repressivt.

25 Vaccine fremstillet ifølge opfindelsen kan derfor omfatte med FeLV podede celler, som på deres overflade bærer virusantigen, idet både celler og virus er inaktive-ret ved kemiske eller fysiske behandlinger, eller levende med FeLV podede celler, som dog er så lidt infektiøse, at kat-30 te let overvinder en sådan svag infektion under dannelse af høj antistoftiter.

Således kan hele levende celler, der er inficerede med FeLV, og som på deres overflader har store mængder af virustilknyttet cellemembranantigen FOCMA, indgives til 35 dyrene. Ved udvælgelse af en hensigtsmæssig dosis af celler er det muligt at opnå høje titere af antistof mod denne virus eller virusinficerede celler, uden at nogen leven- 143437 6

O

de virus bevares i dyret. Indgivelsen af inficerede celler til et dyr indebærer naturligt risikoen for at inficere dyret selv og eventuelt fremkalde sygdom. Ved udvælgelse af den dosis af celler, der skal indgives, er det dog muligt 5 at opnå immunisering uden vedvarende infektion.

Det foretrækkes naturligvis, at der benyttes ikke--inficerende materiale som vaccine, forudsat at denne er tilstrækkeligt immunogenisk. Hele celler kan enten gøres inaktive ved undertrykkelse af deres vækst eller dræbes ved et 10 stort antal behandlinger, der allerede er velkendte inden for teknikken. F.eks. kan levende celler gøres inaktive ved behandling med RNA/DNA-omlejring og overførelsesinhibitorer såsom mitomycin C. Alternativt kan inficerde celler dræbes ved f.eks. bestråling med hydroxylamin eller termisk inak-1^ tivering. To foretrukne midler til drab på inficerede celler er paraformaldehyd og acetylethylenimin, der anvendes enten særskilt eller sammen med hinanden. I alle tilfælde bør de til drab på de inficerede celler benyttede betingelser være tilstrækkelige til i det væsentlige at ødelægge de-20 res inficerende aktivitet uden at fjerne deres immunogeniske egenskaber.

Når man anvender paraformaldehyd som middel til drab på inficerede celler, bør koncentrationen og inku-beringsperioden være sådanne, at praktisk talt alle cel-lerne dræbes uden en uacceptabel formindskelse af deres immunogeniske aktivitet.

Konventionelle tilsætningsstoffer kan sættes til det immunogeniske materiale, der udgør vaccinen, for at stabilisere materialet og forøge immunreaktionen imod 30 det. Blandt disse tilsætningsstoffer, som er hensigtsmæssige til dette formål, er Freund's fuldstændige og ufuld- · stændige tilsætningsstof, dræbt hemophilus pertussis eller polynucleotidsammensætninger. Den foretrukne andel af tilsætningsstoffet kan konstateres ved forsøg.

35 Det i de her omhandlede vacciner anvendte immuno gene materiale kan indgives dyret i en hvilken som helst 143437 7

O

konventionel præparatform. F.eks. kan det være suspenderet i en pufferopløsning, i hvilken dets aktivitet er bevaret, i frysetørret form, eller det kan holdes i en frossen suspension. Vaccinen kan i en hvilken som helst 5 velegnet form til indgivelse injiceres i dyret ad enhver hensigtsmæssig vej. Af praktiske grunde foretrækkes de subcutanøse eller intramuskulære veje.

Det er muligt ved hjælp af vaccinen fremstillet ifølge opfindelsen at fremkalde immunitet hos et dyr med 10 en enkelt indgivelse i hensigtsmæssig form og dosering. Alternativt er det muligt at frembringe et primært respons ved en indledende injektion og et efterfølgende stærkt sekundært respons ved yderligere en injektion til et senere tidspunkt. Den førstnævnte fremgangsmåde foretræk-15 kes, da dyret så kun behøver at vaccineres ved €n lejlighed. Ydermere er det muligt at tilvejebringe et primært respons med en enkelt injektion af vaccine, således at en efterfølgende naturlig infektion af dyret derefter vil føre til en stærk sekundær reaktion på infektionen, som 20 vil være tilstrækkelig til at modvirke og faktisk vende infektionen og derved fremkalde den ønskede reaktion og således hindre dyret i at komme til at lide af nogen af de følge-sygdomme, der er knyttet til infektion med FeLV. Nedenfor skal det vises, at anvendelsen af de her omhandlede 25 vacciner tillader, at alle disse fremgangsmåder kan benyttes med held.

Eksempel 1

Vaccination af katte med levende celler inficeret med 30 FeLV tilvejebringer høje titere i blodet hos disse dyr af antistoffer mod antigener knyttet til FeLV. Når høje doser af celler indgives, holder dette virus sig fast i blodet, selv om ingen sygdomssymptomer manifesterer sig. Med lavere doser af celler inficeret med virus med lavere inficerende 35 evne fjernes alle spor af virus dog atter fra blodet i løbet af en måned, og der opretholdes høje antistoftitere, 143437 8

O

der således beskytter dyret effektivt mod en efterfølgende infektion med dette virus.

Enkeltlagskulturer af kattefoster-fiberkløvnings-qeller dyrkes efter konventionelle metoder. Cellerne in-5 ficeres kronisk med FeLV af kendte undergrupper A, B og C.

De inficerede celler dyrkes i tilstrækkelig tid til at tillade denne virus vidtgående replikation. Derefter udvindes de, suspenderes i puffer ved kendt cellekoncentration, sammenpakkes ved centrifugering og injiceres subcutant.

]_q Dyrene overvåges hver eneste måned til konstatering af antistoffer overfor katteleukæmivirus-cellemembrananti-gen. Ved undersøgelsesperiodens afslutning aflives dyrene, og deres væv analyseres ved de nedenfor beskrevne fremgangsmåder med henblik på konstateringen af tilstedeværel-sen af levende virus.

a) Prøver fra mange forskellige væv undersøges i elektronmikroskop for tilstedeværelsen af sygelige viruspartikler.

b) Væv fra dyrene dyrkes i nærværelse af uinficerede 2Q monolagsceller i 28 dage. Derefter undersøges de med elektronmikroskop og ved immunofluorescens for at konstatere tilstedeværelsen af viruspartikler og virusantigen. Resultaterne af immunisering med levende inficerede celler er anført i nedenstående tabel.

143637 9

TI I <D O > -H

in in •η a a tn o o + + i i

3 Ή U

H 4J U

•H 3 tU

β tn

C

<u — tn ro μ ro <—I <1) CD H ro ro <U Λ Ti cn cr> cu i to i i

Θ.-Η C M

tn μ«β to r-ih tu · p (d g +J Sh ^ ' t n tu

Ti n) +* C iH tn 0 Λ « O r-t U Λ Λ O Ή X! 44 ft 1 9 ί -p *H 5*1

•H 4-) S-t P rH

C C (U Λ 0) in (ti -P S -3 g Oj-h o vo cs oo <U 4-) Φ o +> cn <n o •n' <U(d H 3 4-> M4 Η N N +> Ai co +1 2

H (U 4-1 4J (ti C

o o (0 tn x o

O Μ tH

ni cn tn

gi (C C

H tu o a 1 C tn

Puh M O 3 3 ή tu u cj S æ

M 4-J i—I

tji H + +

M4J (U

(U Ti O « CQ Λ

Ti C

S <U <U + + + 3 > Ti t n 3 O < < < < 3 « a u

•H tu 4J

> a λ <

W tO

[X| (X|

ot co Γ' XX

o o o o X

(1) Η Η Η Η H

(d

0) 4J X X X X

P 3 O) P <C (N Γ- tT ”0* O 3

Ή i—1 (U

>44 f-4 (I <J < <tj C tu 5o H W W 31 h u ih a a a a x x

X

143437 ίο o

Alle katte immuniseret med levende inficerede celler udvikler derefter høje titere af antistoffer mod FeLV.

Når høje doser af celler injiceres, vedvarer tilstedeværelsen af virus i vævene i 6 til 12 måneder, selv om der 5 ikke er klare symptomer på sygdom. I modsætning hertil indebærer immunisering med lavere doser af celler også udviklingen af høje antistoftitere; men intet virus kan konstateres hos disse dyr efter en periode på 1 til 3 måneder.

Denne oplysning henfører til de to sidste eksempler i ta-10 bel X, hvori lave doser af levende inficerede celler 7 (4 x 10 celler) anvendes til at immunisere katte. Ingen virus isoleres fra kattene ved necropsi, skønt der findes titere på 202 henholdsvis 248 med hensyn til antistoffer overfor FeLV cellemembranantigener.

15 Hastigheden for udviklingen af antistoffer og deres forbliven i blodet fremgår af tegningens fig. 1. Dyr inji- 9 ceres med 2 x 10 FEA-celler, og niveauet for antistoffer i blodet overvåges hver eneste måned. Det kan ses, at en maksimum-antistoftiter opnås i løbet af 3 måneder, og 20 at denne holder sig på et højt niveau i et tidsrum på ud over 12 måneder. Det er derfor muligt ved udvælgelse af dosen af celler, der injiceres, at immunisere katte med levende celler inficeret med FeLV og derved fremkalde udviklingen af niveauer af anti-katteleukæmivirus-antistof-25 fer i blodbanen. Således som det skal påvises nedenfor, er sådanne niveauer af antistof i stand til at beskytte en kat mod efterfølgende infektion med dette virus.

Eksempel 2 30 Katte vaccineret med en virus omfattende levende cel ler indeholdende FeLV er i stand til at modstå infektion, når de udsættes for en høj dosis af virulent virus.

Tre katte, hvis sera til at begynde med ikke indeholder konstaterbart antistof, podes hver især subcutanøst 7 35 med 3 x 10 levende kattelymphoblastoidceller, der er kronisk inficerede med FeLV, med lav infektionsevne overfor katte og kattevævskultur. Fra kattene udtages hver måned serumprøver, og resultaterne af immunofluorescensantistof- 11 143437 o prøve for anti-FeLV-antistof gennemføres med de i tegningens fig. 2 viste resultater.

Antistoftiteren stiger i løbet af den første måned til et gennemsnit på 256, og alle katte når dette anti- 5 stofniveau. En måned efter podningen udsættes kattene for 6 injektion med 10 inficerende enheder af stammen FeLV5 virus, der er kendt for at være stærkt leukæmogenisk og pa-togenisk i katte. Tre måneder efter denne udsættelse aflives kattene og necropseres. De følgende undersøgelser 10 demonstrerer, at der ikke er tilbageværende virale infektioner hidrørende fra denne udsættelse.

1. Der findes ingen patologiske eller histologiske abnormaliteter.

2. Der findes ingen virus ved elektronmikroskopisk un- 15 dersøgelse af benmarv eller luftrørsvæv.

3. Plasma fra udsatte katte benyttes til at pode kulturer af kattefostermonolagsceller, og der konstateres ingen virus i kulturen.

4 . Benmarvsceller dyrkes sammen med kattef ostermono’'- 20 lagsceller, men der kan ikke konstateres infektion med virus.

Lignende, men uvaccinerede katte udsættes også for samme dosis af infektiøs FeLV. De dræbes og necropseres til samme tid som de vaccinerede katte, og de samme prø-25 ver anvendes til konstatering af virus. Der konstateres imidlertid viruspartikler i alle prøver, der udtages fra disse katte. Tilstedeværelsen af levende viruspartikler vil efter passende tid føre til symptomer på de særlige sygdomme, som forvoldes af FeLV-infektion. Vaccination af 30 katte med levende celler indeholdende FeLV med lav infektionsevne frembringer derfor hos disse katte en immunitet mod efterfølgende infektion med virulent FeLV.

Eksempel 3 35 Katte kan behandles med en vaccine, i hvilken de virusholdige celler er dræbt ved behandling med paraform-aldehyd.

143437 12

O

g I 1 ml af Hank's opløsning suspenderes 2 x 10 kat-telymphoblastoidceller kronisk inficeret med FeLV med lav infektionsevne. Hertil sættes 9 ml 1%'s paraformaldehyd langsomt, medens blandingen omrøres på et isbad. Cellerne 5 holdes i paraformaldehyd ved 4°C i en time og vaskes derpå 1 Hank's opløsning. Der fremstilles aliquot-dele, som hver 7 især indeholder 6 x 10 celler i 1 ml opløsning.

Katte uden konstaterbare FeLV-antistoffer i deres serum injiceres subcutanøst med en aliquot mængde inde-10 holdende de således som ovenfor beskrevet fremstillede dræbte celler. Hver måned tappes de for blod til serumprøver., og heri bestemmes anti-FeLV-antistoftiteren med de i tegningens fig. 3 viste resultater.

Der opnås høje antistoftitere i løbet af tre måneder 15 efter vaccination, og denne titer holder sig i 3-4 måneder, til hvilket tidspunkt dyrene dræbes. Den samme teknik som beskrevet i eksempel 1 til konstatering af viruspartikler anvendes på serumprøverne fra alle dyr, og der konstateres i intet tilfælde viruspartikler.

20 En høj antistoftiter således som vist i eksempel 2 til beskyttelse af katte mod infektion med levende FeLV kan således stimuleres hos katte ved vaccination med virus indeholdende celler dræbt ved behandling med paraformaldehyd .

25 Eksempel 3 illustrerer således et forsøg, ved hvil- 7 ket 6 x 10 inaktiverede med FeLV podede celler benyttes til at vaccinere katte. Af fig. 3 kan det ses, at denne dosis tillader dyrene at opretholde et anti-FOCMA antistofniveau, der er tilstrækkelig til at yde beskyttelse 30 mod FeLV. Når dyrene aflives 6 måneder efter, konstateres ingen virus.

En dosisenhed på 6 x 10 celler giver den i fig. 3 illustrerede beskyttelse, og ud fra denne oplysning kan det forudses, at en 1000 foldig nedgang i podemængde (alt-35 så til 6 x 10^ celler) vil tilvejebringe en nedgang i titer og ikke yde beskyttelse. På grundlag af fig. 3 menes, at et lavere doseringsniveau, dvs. uden for intervallets 143437 13

O

undergrænse, ikke vil yde fuldstændig beskyttelse, eller at en eventuel beskyttelse vil være rent perifer.

Foreløbige forsøg under anvendelse af levende podede celler i dosisenhedsintervallet fra 10^ til 10^ celler har 5 ikke ført til frembringelse af de fornødne titere med hensyn til anti-FOCMA antistof.

Eksempel 4

Dyr med en begyndelsestiter af anti-FaLV-antistof 10 på 4 kan udvikle en høj antistoftiter efter immunisering med inaktiverede inficerede celler. Begyndelsesantistoftiteren kan eventuelt være fremkommet som resultat af en naturlig infektion eller fås ud fra en tidligere immunisering,således som beskrevet i eksempel 2.

15 Et dyr med en begyndelsesantistoftiter på 4 injiceres med en vaccine fremstillet ud fra inficerede kattefoster-fibroblastceller, der er inaktiveret med formaldehyd og acetylethylenimin (AEIj . Cellerne dyrkes i monolag oq in- 8 ficeres og udvindes således som ovenfor beskrevet. 3 x 10 20 celler suspenderes i 100 ml 0,05%'s formaldehyd i 1 dag ved 22°C. Cellerne vaskes igen to gange i puffer og gensus-penderesi 200 ml 0,05%'s AEI i 1 dag ved 22°c. Cellerne vas-kes igen og gensuspenderes i 20 ml puffer, hvortil er sat 2 ml 20%'s natriumthiosulfat. Cellerne gensuspenderes i 4 ml 25 puffer, og 0,5 ml af suspensionen injiceres subcutanøst i dyret.

Dyret har en ved forudgående podning tilvejebragt antistoftiter på 4. Indenfor en måned er antistoftiteren 32, og denne titer holdes eller bevares i 3 måneder. Til 30 afslutningen af denne periode er intet virus konstateret i dyret ved hjælp af elektronmikroskopi eller immunofluores-cens på udtagne blodprøver således som ovenfor beskrevet.

Det er derfor muligt at igangsætte en stærk sekundær reaktion i et dyr med en antistoftiter på 4 ved injektion af 35 inficerede celler, der er inaktiveret ved hjælp af formaldehyd og AEI. De ved sådan immunisering opnåede antistoftitere er i stand til at beskytte et dyr mod efterfølgende infektion med FeLV, og disse antistofniveauer opretholdes eller bevares i et anseligt tidsrum.

O

14 U3437

Eksempel 5

Immunisering, som er i stand til at fremkalde beskyttelsesfilere af anti-FeLV-antistof, opnås ved injektion af inficerede kattefosterceller dræbt ved behandling med 5 formaldehyd. Kattefosterfibroblastceller dyrkes i monolagskultur, inficeres og udvindes således som ovenfor beskrevet. Cellesuspensionen sættes til tyve gange sit rumfang af 1/100 formaldehyd og opbevares ved +4°C i en uge. Cellerne centrifugeres ved 5.000 omdrejninger pr. mi-10 nut, vaskes og gensuspenderes i Alserver's opløsning. I denne form kan cellerne opbevares ved -20°C i to måneder.

Cellerne fortyndes, og 1,5 x 10^ celler pr. dyr injiceres subcutanøst i voksne kønsmodne katte. Der opnås en topantistoftiter på 16 i løbet af en måneds immunise-15 riiig. Det er nedenfor vist, at dyr med denne antistof ti ter er i stand til med held at modstå en infektion med levende virus under opbydelse af en sekundær reaktion. Hertil kommer, at intet spor af virus eller virusantigen kan konstateres ved mikroskopi på vævene fra dyr immuniseret ved 20 denne fremgangsmåde.

Eksempel 6

Det foreliggende eksempel gennemføres til afprøvning af infektionsevnen hos virus, som overføres fra den 25 ene generation til den næste ved dyrkningen af celler under fremgangsmåden ifølge opfindelsen. De anvendte celler er feline lymphoblastoidceller af linien FL74. Disse er dyrket kontinuerligt i flere år i laboratoriet som stationære suspensionskulturer. Celletætheden holdes mellem 5 x 10“* 30 og 2 x 104 pr. ml, og cellerne anvendes til immunisering, når de har sidstnævnte koncentration. Feline embryoceller dyrkes i monolagskulturer således som beskrevet af O. Jar-rett m.fl. i J.gen.Virol. 29, side 169-175 (1973) .

Efter gennemføring af virusdyrkning som anført i de 35 foregående eksempler renses viruset for celler, og viruset benyttes til at pode katte til bedømmelse af infektionsevnen hos sådanne virusstammer hidrørende fra dyrk- 143437 15

O

ning på feline embryoceller sammenlignet med en stamme af FeLV, der vides at være stærkt infektiøs og pathogen overfor katte.

Der fremstilles præparater, hvori 1 ml indeholder 5 100 gange, 10 gange henholdsvis 1 gang viruskoncentrationen fra vævskulturens væskeoverfase. Disse præparater podes på henholdsvis 6, 6 og 5 katte ved subcutanøs injektion af 1 ml. Kattene undersøges serologisk før podning og 1, 2, 4, 8 og 11 uger efter.

10 Før podning har 5 katte fra hver af grupperne in gen antistoftiter over for FOCMA, og ingen af disse viser noget respons under forsøget. En kat fra den første gruppe har en titer på 8 før podning, og under forsøget stiger denne kats antistofniveau jævnt, til det når en top på 64 i uge 11.

15 En kat fra den tredje gruppe har også en titer før podning, nemlig på 2. Også denne kats antistofniveau stiger efter podning til 64 i uge 11.

To katte fra hver gruppe aflives og undersøges ved uge 8, og resten aflives og undersøges ved uge 11. Ingen af 20 de undersøgte katte viser nogen hematologisk eller patho-logisk abnormitet. Der findes intet virus hos nogen af kattene, hverken ved undersøgelse i elektronmikroskop, ved kulturafprøvning eller ved interferensprøve.

Disse resultater indicerer, at det for FL74 celler 25 rensede virus har en meget lav eller slet ingen infektionsevne over for katte. Dette påvises både ved manglen på serologisk respons og fraværelsen af konstaterbart virus i vævene. Stigningen i antistoftiter hos de to ovennævnte katte, der udviser antistofniveau før podning, kan re-30 præsentere et sekundært respons. Dette kan hidrøre fra et lavt infektionsniveau fra podemediet, som derpå ophæves eller modvirkes, eller fra små mængder celleoverfladeantigen indeholdt som forurening i det rensede viruspræparat.

Infektionsevnen hos det 100 gange koncentrerede vi-35 ruspræparat afprøves på dyrkede feline embryoceller og sammenlignes med virus af stammen FeLV-1. FL74 virusstam- 2 16

O

143437 stammens titer viser sig at være 10 infektiøse enheder pr. ml. Da kun meget lidt infektionsevne går tabt under rensningen, regner man med at mængden af virus i det oprinde-lige kulturmedium også er ca. 10 internationale enheder 5 pr. ml. Til sammenligning hermed kan anføres, at den af- 7 prøvede FeLV-1 virusstammes titer er 10 internationale enheder pr. ml. Det er tidligere konstateret, at F174 celler frembringer ca. 10 gange flere partikler end feline embryoceller inficeret med FeLV-1. Resultaterne indicerer 10 derfor, at den specifikke infektionsevne hos FL74 virus er ca. 10 ® af infektionsevnen hos FeLV-1.

. Ovenstående forsøg viser således, at det ikke er selve viruset, der er virksomt.