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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

Tag der Anmeldung: 27. November 1952 Bekanntgemacht am 16. August 1956Registration date: November 27, 1952. Advertised on August 16, 1956

DEUTSCHES PATENTAMTGERMAN PATENT OFFICE

Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer wertvoller antibiotischer Verbindungen und insbesondere die Herstellung solcher Verbindungen durch Züchtung geeigneter Mikroorganismen, die Konzentration der Kulturflüssigkeiten, die Gewinnung von Lösungen der Rohprodukte daraus, die Reinigung dieser rohen Lösungen und die Isolierung der reinen antibiotischen Verbindungen sowie ihrer Salze mit Basen und Säuren aus diesen Lösungen. Die neuen antibiotischen Verbindungen werden im folgenden mit dem Sammelbegriff »Amphomycin« bezeichnet werden. Dieser Ausdruck soll nicht nur für eine einzelne antibiotische Verbindung benutzt werden, sondern auch für eine Reihe nahe verwandter Verbindungen, die in ähnlicher Weise durch Züchtung von Mikroorganismen gewonnen werden und die während ihrer Isolierung und Reinigung etwa das gleiche Verhalten zeigen.The invention relates to the preparation of new useful antibiotic compounds and in particular the production of such compounds by cultivating suitable microorganisms, the concentration of the Culture liquids, the extraction of solutions of the raw products from them, the purification of these raw products Solutions and the isolation of the pure antibiotic compounds as well as their salts with bases and acids from these solutions. The new antibiotic compounds are used in the following with the collective term "Amphomycin" are designated. This term is not intended to apply only to an individual antibiotic Connection, but also for a number of closely related connections that are similar in Way can be obtained by culturing microorganisms and those during their isolation and purification show roughly the same behavior.

In den letzten Jahren ist eine Reihe von Stoffwechselprodukten, die bei der Züchtung von Bakterien und Schimmelpilzen auftreten und die, wie gefundenIn recent years a number of metabolic products are involved in the breeding of bacteria and molds occur and which are found as

' 609 579/472'609 579/472

B 23108 IVa/30 hB 23108 IVa / 30 h

wurde, wertvolle therapeutische Eigenschaften aufweisen, isoliert worden. Solche Stoffe sind z. B. Penicillin, Streptomycin, Gramicidin, Tyrocidin, Bacitracin, Subtilin, Streptothricin, Aureomycin und andere. Einige von diesen Antibiotika haben sich als außerordentlich wirksam gegen pathogene Mikroorganismen erwiesen. Andere dagegen fanden trotz hoher antibiotischer Wirksamkeit wegen ihrer erheblichen Giftigkeit keine praktische Anwendung.has been isolated to have valuable therapeutic properties. Such substances are z. B. Penicillin, streptomycin, gramicidin, tyrocidin, bacitracin, subtilin, streptothricin, aureomycin and other. Some of these antibiotics have been found to be extremely effective against pathogenic microorganisms proven. Others, however, found despite high antibiotic effectiveness because of their considerable Toxicity no practical application.

to Penicillin ist als ein besonders wertvoller Vertreter dieser Antibiotika bekannt. Es gehört zu der Klasse von Antibiotika, die vor allem gegen grampositive Bakterien wirksam sind. Es weist jedoch einige Mangel und Fehler auf, die die Suche nach anderen Antibiotika dieser- Art zweckmäßig erscheinen lassen. ■ .to penicillin is known as a particularly valuable representative of these antibiotics. It belongs to the class of antibiotics, which are mainly effective against gram-positive bacteria. It does, however, have some Deficiencies and errors that make the search for other antibiotics of this kind expedient leave. ■.

Die Erfindung betrifft nun die Herstellung hochwirksamer antibiotischer Verbindungen, die besonders in der Therapie von durch grampositive pathogene Mikroorganismen hervorgerufenen Infektionen Verwendung finden und die als »Amphomycin« bezeichnet werden sollen. Sie. werden gemäß vorliegender Erfindung durch Züchtung eines bestimmten Streptomycesstammes, nämlich Streptomyces BL-456789, in einer wäßrigen kohlenhydrathaltigen Nährflüssigkeit im submersen Verfahren unter Luftdurchleitung, bis die Nährflüssigkeit eine erhebliche antibakterielle Wirksamkeit aufweist, worauf dann das erzeugte Amphomycin von der Gärflüssigkeit abgetrennt wird, gewonnen. The invention now relates to the production of highly effective antibiotic compounds, particularly Use in the therapy of infections caused by gram-positive pathogenic microorganisms and which are to be referred to as "amphomycin". She. are in accordance with the present invention by cultivating a certain Streptomyces strain, namely Streptomyces BL-456789, in a aqueous nutrient liquid containing carbohydrates in the submerged process with air passage until the Nutrient fluid has a significant antibacterial activity, whereupon the amphomycin produced is separated from the fermentation liquid, obtained.

Ferner wurde gemäß vorliegender Erfindung eine Reihe von Maßnahmen und Verfahrensstufen gefunden, die die Gewinnung eines hochwirksamen reinen Amphomycins ermöglichen. So können die rohen Amphomycinlösungen leicht durch Aktivkohle entfärbt werden. Das Amphomycin selbst läßt sich aus der Nährlösung in guter Ausbeute unter stark sauren Bedingungen mit organischen Lösungsmitteln extrahieren, die mit Wasser nicht mischbar sind. Es wird aus seinen wäßrigen Lösungen durch Einstellung des p_H auf einen Wert von etwa 3 bis 4 ausgefällt. Verunreinigungen lassen sich aus seinen stark sauren, wäßrigen Lösungen durch Extraktion mit Methyliso-' butylketon und Amylazetat abtrennen. Amphomycin selbst kann aus einer stark sauren Lösung in Butanol durch Behandlung mit Wasser bei einem höheren p_H als 4 extrahiert werden. Auch aus seinen Lösungen in mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln läßt es sich in wäßrige Lösung überführen, wobei das p_H dieser Lösungen höher als 6 sein soll. Es kann durch Bildung geeigneter unlöslicher Derivate seiner basischen oder auch seiner sauren funktioneilen Gruppen aus seinen Lösungen gefällt werden.Furthermore, according to the present invention, a number of measures and process steps have been found which enable a highly effective pure amphomycin to be obtained. The crude amphomycin solutions can easily be decolorized with activated charcoal. The amphomycin itself can be extracted from the nutrient solution in good yield under strongly acidic conditions using organic solvents which are immiscible with water. It is precipitated from its aqueous solutions by adjusting the p _H to a value of about 3 to. 4 Impurities can be removed from its strongly acidic, aqueous solutions by extraction with methyl isobutyl ketone and amyl acetate. Amphomycin itself may be made of a strong acid solution in butanol are extracted as 4 by treatment with water at a higher p _H. Also from its solutions in water-immiscible organic solvents, it can be converted in aqueous solution, wherein the p _H to be higher than these solutions. 6 It can be precipitated from its solutions by forming suitable insoluble derivatives of its basic or also its acidic functional groups.

Die neu gefundenen antibiotischen Verbindungen, die z. B. das Wachstum von B.mycoides, B.aureus, M. tetragenus, Staph.aureus und B.subtüis wirksam zu hemmen vermögen, stellen amphotere Stoffe dar, die fähig sind, mit Säuren und Metallen Salze zu bilden. Sie sind ,in Wasser löslich und zeigen im p_H-Bereich von 3 bis 4 die geringste Wasserlöslichkeit. Sie sind in Säureform und als Salze leicht in Methanol löslich, lösen sich dagegen in höheren Alkoholen nur in der Säureform. Sie lassen sich aus ihren wäßrigen Lösungen bei einem p_H von 2 mit Butanol und Pentanol ~ ■ extrahieren, nicht aber mit Methylisobutylketon, Benzol, Äther, Äthylazetat oder Amylazetat. Sie geben mit Ammoniumhydroxyd und Reineckes Salz feste antibakterielle Derivate und zeigen Ultraviolettabsorption zwischen 210 und 230 μ. Im Ninhydrin-, Sakaguchi-, Molisch- und Ehrlich-Pauly-Test reagieren sie negativ. In wäßriger Lösung sind sie in einem p_H-Bereich von 2 bis 10 mindestens für 10 Tage stabil.The newly found antibiotic compounds used e.g. B. able to effectively inhibit the growth of B. mycoides, B. aureus, M. ttragus, Staph.aureus and B.subtüis are amphoteric substances that are capable of forming salts with acids and metals. They are soluble in water and exhibit p _H range 3-4 the lowest water solubility. They are readily soluble in methanol in acid form and as salts, but only dissolve in the acid form in higher alcohols. They can be extracted from aqueous solutions at a p _H 2 with butanol and pentanol ~ ■ but not with methyl isobutyl ketone, benzene, ether, ethyl acetate or amyl acetate. With ammonium hydroxide and Reinecke's salt, they give solid antibacterial derivatives and show ultraviolet absorption between 210 and 230 μ. They react negatively in the ninhydrin, Sakaguchi, Molisch and Ehrlich-Pauly tests. In aqueous solution, they are in a p _H range 2-10 for 10 days at least stable.

Die neuen antibiotischen Verbindungen bilden sich während der unter ganz bestimmten, genau einzuhaltenden Bedingungen erfolgenden Züchtung eines bisher noch nicht beschriebenen Streptomycesstammes, der, wie oben erwähnt, vorläufig Streptomyces BL-456786 genannt werden: soll und der folgende Eigenschaften aufweist:The new antibiotic compounds are formed during the under very specific, exactly to be adhered to Conditions for breeding a Streptomyces strain not yet described, which, as mentioned above, shall be provisionally named Streptomyces BL-456786: and the following Features:

Streptomyces BL-456786 gehört zu der Gruppe von Mikroorganismen, die allgemein als Genus Streptomyces bezeichnet wird. Das gebildete Myzel zeigt verzweigte Hyphen. Die jüngeren Hyphen sind grampositiv, ältere zeigen wechselnde Gramfärbbarkeit. Sie bilden Konidienketten mit Konidien von kugel- oder eiförmiger Gestalt und einer Größe von 1 bis 1,2 μ zu 1,6 bis 1,8 μ. Streptomyces BL-456786 belongs to the group of microorganisms commonly referred to as the genus Streptomyces. The mycelium formed shows branched hyphae. The younger hyphae are gram-positive, the older ones show varying gram stainability. They form chains of conidia with conidia of spherical or egg-shaped shape and a size of 1 to 1.2 μ to 1.6 to 1.8 μ.

Mäßiges bis gutes Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar bei 30⁰C, wobei ein gelbbraunes, sich in der Kulturflüssigkeit ausbreitendes Pigment gebildet wird.Moderate to good growth on glucose-asparagine agar at 30 ^° C., with a yellow-brown pigment being formed that spreads in the culture liquid.

Auf Kartoffel-Dextrose-Agar bilden sich bei zweiwöchiger Züchtung bei 24⁰ dünne, faltige Kulturen. Die Bildung von Lufthyphen und Konidien wird jedoch gehemmt.On potato dextrose agar, cultivated for two weeks at 24 ^0, thin, wrinkled cultures form. However, the formation of aerial hyphae and conidia is inhibited.

Die Erzeugung von Amphomycin soll natürlich nicht auf diesen bestimmten Mikroorganismus oder auf Mikroorganismen, die die obenerwähnten Eigenschaften besitzen, beschränkt sein. Diese Angaben dienen lediglich zur beispielsweisen Kennzeichnung geeigneter Mikroorganismen. Man kann natürlich auch Mutanten dieser Mikroorganismen verwenden, wie sie z. B. durch Röntgen- und Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Stickstoffsenfgas und anderen mutierenden Mitteln erzeugt werden.'The production of amphomycin is not intended to be due to that particular microorganism or of course be limited to microorganisms which have the properties mentioned above. This information serve only for example to identify suitable microorganisms. Of course you can too Use mutants of these microorganisms, as z. B. by X-ray and ultraviolet radiation, Treatment with nitrogen mustard gas and other mutating agents. '

Amphomycin weist nur eine geringe Toxizität und, ebenso wie Penicillin, eine hohe Aktivität vor allem gegen grampositive Bakterien auf. Es stellt daher ein wertvolles therapeutisches Mittel für die Human- und Veterinärmedizin dar. Vor Penicillin zeichnet es sich dadurch aus, daß es durch Penicillinase nicht inaktiviert wird und auch gegen penicillinresistente Stämme, die durch Penicillin nicht beeinflußt werden,' hoch wirksam ist sowie bei gegenüber Penicillin empfindlichen Patienten keine Sensibilisierung hervorruft. Es wird ferner weder durch Wärme noch durch Wasser zersetzt bzw. unwirksam gemacht.Amphomycin has low toxicity and, like penicillin, especially high activity against gram-positive bacteria. It therefore represents a valuable therapeutic agent for both human and human Veterinary medicine. Before penicillin, it is distinguished by the fact that it is not inactivated by penicillinase and also against penicillin-resistant strains that are not influenced by penicillin, ' is highly effective and does not cause sensitization in penicillin-sensitive patients. Furthermore, it is neither decomposed nor rendered ineffective by heat or water.

In vitro Untersuchungen mit Amphomycin haben gezeigt, daß es, wie gesagt, gegen grampositive Bakterien, wie Staphylococcus aureus, Bacillus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides und Micrococcus tetragenus, äußerst wirksam ist. Die folgende Tabelle zeigt die hohe antibiotische Wirksamkeit von zwei festen Präparaten, die aus der Kulturflüssigkeit gewonnen wurden:In vitro studies with amphomycin have shown that it is, as I said, against gram-positive Bacteria such as Staphylococcus aureus, Bacillus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides and Micrococcus ttragus, is extremely effective. The following table shows the high antibiotic effectiveness of two solid preparations obtained from the culture fluid:

«09 579/472«09 579/472

B 23108 IVa/30 hB 23108 IVa / 30 h

Amphomycin-Spektrum im Plattentest (5 mg festes Antibiotikum im ecm)Amphomycin spectrum in the plate test (5 mg solid antibiotic in the ecm)

MikroorganismusMicroorganism

Bodenheimer Organismus. ο οBodenheim organism. ο ο

Proteus X ig ο οProteus X ig ο ο

Sh. Sonnei ο οSh. Sonnei ο ο

S. enteritidis ο οS. enteritidis ο ο

S. paratyphi A ο οS. paratyphi A ο ο

S. pullorum ο οS. pullorum ο ο

A. aerogenes ο οA. aerogenes ο ο

P. fluorescens ο οP. fluorescens ο ο

V. cholerae ο οV. cholerae ο ο

Neisseria spp ο οNeisseria spp ο ο

AIc. fecalis ο οAIc. fecalis ο ο

Pr. vulgaris ο οPr. Vulgaris ο ο

B. mycoides. 15 17B. mycoides. 15 17

B. cereus 15 14B. cereus 15 14

S. marcescens ο οS. marcescens ο ο

M. tetragenus 14 14M. ttragus 14 14

S. Flexneri ο οS. Flexneri ο ο

S. dysenteriae ο οS. dysenteriae ο ο

C. albicans Nr. 520 ο οC. albicans No. 520 ο ο

Staph. aureus 14 13Staph. aureus 14 13

E. typhosa ο οE. typhosa ο ο

E. coli ο οE. coli ο ο

S. paratyphi B ο οS. paratyphi B ο ο

K. pneumoniae ο οK. pneumoniae ο ο

Ps. aeruginosa ο οPs. Aeruginosa ο ο

S. gallinarum ο οS. gallinarum ο ο

B. anthracis ο οB. anthracis ο ο

B. subtilis 16 11B. subtilis 16 11

Die Prüfung von Amphomycin auf sein antibakterielles Spektrum wird in folgender Weise durchgeführt:The testing of amphomycin for its antibacterial spectrum is carried out in the following way:

Etwa 30 ecm steriler Kulturfiüssigkeit, gewonnen aus einem Herzaufguß (Handelsprodukt »Difco«), werden mit 2 °/₀ Agar versetzt, um den Aufguß zu verfestigen. Die Flüssigkeit wird dann in eine sterile Petrischale von etwa 9 cm Durchmesser gegeben und erstarren gelassen. Dann wird in dem erhaltenen Nährboden mit einem sterilen Spatel eine Vertiefung von 8 mm Weite und 40 mm Länge erzeugt. Der Boden dieser Vertiefung wird mit einem oder zwei Tropfen geschmolzenem Agar verschlossen. Darauf wird mit Hilfe einer kleinen Platinöse ein Impfstrich von der Wand der Petrischale her gegen den Rand der Vertiefung gezogen, wobei eine Nährbouillonkultur der jeweils zu prüfenden Bakterien, die zuvor 24 Stunden lang bei 37⁰ bebrütet worden war, für die Beimpfung verwendet wird. Die Vertiefung wird darauf mit einer wäßrigen Lösung des Antibiotikums, die 5 mg Antibiotikum in ι ecm enthält, gefüllt und die Petrischale 18 bis 24 Stunden lang bei 37⁰ bebrütet. Die Hemmungszone wird dann auf einer Linie ausgemessen, die vom Rande der Vertiefung bis zu der Stelle geführt wird, an der Wachstum des betreffenden Mikroorganismus einsetzt. .About 30 cc of sterile Kulturfiüssigkeit, obtained from a Herzaufguß (commercial product "Difco") are mixed with 2 ° / ₀ agar to solidify the infusion. The liquid is then placed in a sterile Petri dish about 9 cm in diameter and allowed to solidify. A sterile spatula is then used to create a depression 8 mm wide and 40 mm long in the nutrient medium obtained. The bottom of this well is sealed with a drop or two of melted agar. Thereupon an inoculation line is drawn from the wall of the Petri dish forth against the edge of the depression by means of a small platinum loop, wherein a Nährbouillonkultur is the respectively used to be tested bacteria which had been previously incubated at 37 ⁰ for 24 hours, for the inoculation. The well is it contains an aqueous solution of the antibiotic, the antibiotic in 5 mg ι ecm filled and the petri dish incubated at 37 ⁰ for 18 to 24 hours. The zone of inhibition is then measured on a line running from the edge of the depression to the point at which the microorganism in question begins to grow. .

Im folgenden sei die Diffusionsplattenmethode zur Bestimmung der Aktivität von Amphomycin näher beschrieben:The following describes the diffusion plate method for determining the activity of amphomycin described:

Hemmungszone in mmInhibition zone in mm

FesteFestivals

Substanzsubstance

Nr. 20No. 20

FesteFestivals

Substanzsubstance

Nr. NährbodenNo breeding ground

Ein geeigneter Nährboden kann z. B. hergestellt werden, indem eine Mischung von 1,5 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextrakt, 6 g Pepton und 15 g Agar in 11 destilliertem Wasser suspendiert wird, wobei der p_H-Wert zum Schluß 8 betragen soll. Man läßt die Suspension dann 5 Minuten stehen, rührt, bis eine völlig gleichförmige Suspension erhalten wird, und erhitzt diese vorsichtig unter Rühren. Die Suspension wird dann so lange gekocht, bis völlige Lösung eingetreten ist. Der Nährboden wird dann bei 121° sterilisiert; Dauer 15 Minuten.A suitable nutrient medium can be, for. For example, be prepared by reacting a mixture of 1.5 g beef extract, 3 g yeast extract, 6 g of peptone and 15 g agar is suspended in 11 distilled water, whereby the _pH value should be at the end. 8 The suspension is then left to stand for 5 minutes, stirred until a completely uniform suspension is obtained, and this is carefully heated with stirring. The suspension is then boiled until it is completely dissolved. The culture medium is then sterilized at 121 °; Duration 15 minutes.

ImpfkulturVaccination culture

Als Testorganismus wird Bacillus subtilis A.T.C.C. 6633 verwendet. Eine Sporensuspension, die etwa 50 Millionen sichtbare Sporen im ecm enthält, wird. dem geschmolzenen und auf 53⁰ abgekühlten Testagar in einer solchen Menge zugesetzt, daß die endgültige Impfkultur eine Konzentration von 2% aufweist.Bacillus subtilis ATCC 6633 is used as the test organism. A spore suspension that contains approximately 50 million visible spores in the ecm will. added to the melted ^{test agar and cooled to 53 0} in such an amount that the final inoculum has a concentration of 2%.

Herstellung der Platten :Manufacture of the panels:

Je 21 ecm steriler Testagar werden in waagerecht stehende sterile Petrischalen gegeben und erstarren gelassen. 4 ecm der oben beschriebenen Impfkultur werden dann gleichmäßig über die Oberfläche der Grundschicht verteilt. Darauf wird der Nährboden auf Zimmertemperatur abgekühlt, und aus nichtrostendem Stahl bestehende Testplatten werden auf den Nährboden aufgesetzt.21 ecm of sterile test agar are placed horizontally given standing sterile Petri dishes and allowed to solidify. 4 ecm of the above-described inoculum are then evenly distributed over the surface of the base coat. This becomes the breeding ground cooled to room temperature and test panels made of stainless steel are placed on put on the culture medium.

PufferlösungBuffer solution

Eine Phosphatpufferlösung mit einem p_H von 8 wird für die Herstellung der verschiedenen Verdünnungen verwendet. Die Pufferlosung wird erhalten, indem 95 ecm einer molaren Kaliumdiphosphatlösung mit 5 ecm einer molaren Kaliummonophosphatlösung gemischt und die Mischung mit destilliertem Wasser auf ein Zehntel ihres Volumens verdünnt wird. Der p_H-Wert der Pufferlösung muß potentiometrisch nachgeprüft und, falls notwendig, durch Zusatz der einen oder anderen molaren Kaliumphosphatlösung genau auf ein p_H von 8 eingestellt werden. Schwankungen im Pj₁-Wert oder in der Konzentration der Pufferlösung üben einen deutlichen Einfluß auf die Größe der Hemmungszone aus. Die Pufferlösung braucht nicht sterilisiert zu werden. Die molaren Stammlösungen werden durch Zusatz von Chloroform oder Toluol konserviert. Die Pufferlösungen selbst werden täglich frisch hergestellt.A phosphate buffer solution with a p _H of 8 is used for the preparation of the various dilutions. The buffer solution is obtained by mixing 95 ecm of a molar potassium diphosphate solution with 5 ecm of a molar potassium monophosphate solution and diluting the mixture to a tenth of its volume with distilled water. The _pH value of the buffer solution must be verified potentiometrically and, if necessary, be accurately adjusted to a p _H of 8 by the addition of one or another molar potassium phosphate solution. Fluctuations in the Pj ₁ value or in the concentration of the buffer solution have a clear influence on the size of the inhibition zone. The buffer solution does not need to be sterilized. The molar stock solutions are preserved by adding chloroform or toluene. The buffer solutions themselves are freshly prepared every day.

Prüfung auf antibiotische WirksamkeitTesting for antibiotic effectiveness

Unbekannte Muster werden gegebenenfalls mit der Phosphatpufferlösung vom p_H 8 verdünnt. Drei Vertiefungen in jeder Platte dienen zur Aufnahme von drei Mustern der gleichen Verdünnung. Nach Bebrütung bei 32⁰ wird der Durchmesser der Hemmungszonen gemessen und das Mittel der erhaltenen Werte bestimmt.Unknown samples are optionally diluted with the phosphate buffer solution of p _H. 8 Three wells in each plate hold three samples of the same dilution. After incubation at 32 ^° , the diameter of the zones of inhibition is measured and the mean of the values obtained is determined.

Amphomycin unterscheidet sich von Endomycin dadurch, daß es in vitro keinerlei Aktivität gegen Trichophyton mentagrophytes, einen pathogenen Pilz, besitzt. Zur Prüfung werden 25 ecm eines sterilenAmphomycin differs from endomycin in that it has no in vitro activity against Trichophyton mentagrophytes, a pathogenic fungus. 25 ecm of a sterile

609 579/Φ72609 579 / Φ72

B 23108 IVa/30 hB 23108 IVa / 30 h

Nährbodens aus 2 °/₀ Dextrose, ι °/₀ Neopepton und 2 °/₀ Agar, dessen p_H auf 5,6 bis 5,8 eingestellt ist, in eine Petrischale gegeben und erstarren gelassen. Eine wäßrige Suspension von Trichophyton-mentagrophytes-Sporen, erhalten von einem schräg erstarrten Agarnährboden, wird über die Oberfläche des oben beschriebenen Nährbodens verteilt, sogenannte Stahlpenicylinder werden auf die Nährbodenoberfläche aufgesetzt, und die Petrischalen werden bei 30⁰ 24 Stunden lang bebrütet. Eine wäßrige Lösung, die 10 mg des zu untersuchenden Antibiotikums im ecm enthält, wird in die Zylinder gefüllt, worauf die Petrischalen erneut 48 Stunden lang bebrütet werden. Der Durchmesser der Hemmungszone um jeden Zylinder herum wird dann gemessen und das Mittel von mindestens drei Zonen genommen. Die folgenden Resultate wurden erhalten:, The p _H is the culture medium of 2 ° / ₀ dextrose, ι ° / ₀ neopeptone and 2 ° / ₀ agar adjusted to 5.6 to 5.8 to a Petri dish and allowed to solidify. An aqueous suspension of Trichophyton mentagrophytes spores, obtained from an agar medium solidified at an angle, is spread over the surface of the above-described culture medium, so-called steel penicylinders are placed on the culture medium surface, and the Petri dishes are ^{incubated at 30 ° for} 24 hours. An aqueous solution containing 10 mg of the antibiotic to be examined in the ecm is filled into the cylinder, whereupon the Petri dishes are incubated again for 48 hours. The diameter of the zone of inhibition around each cylinder is then measured and the mean of at least three zones is taken. The following results were obtained:

Antibiotikumantibiotic Hemmungszone
in mmInhibition zone
in mm Amphomycinposten Nr. 5
Endomycin
Amphomycinposten Nr. 1 Amphomycin Item No. 5
Endomycin
Amphomycin Item No. 1 keine
24
keinenone
24
none

Gemäß vorliegender Erfindung besteht das Verfahren der Züchtung dieser neuen und bisher unbekannten Streptomycesform, nämlich von Streptomyces BL-456786, darin, daß dieser Mikroorganismus bei etwa 24 bis 30⁰ und unter submersen aeroben Bedingungen und Rühren auf Nährböden gezüchtet wird, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle, das Wachstum fördernde Stoffe, Mineralsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumnitrat, und gegebenenfalls eine Puffersubstanz, wie Calciumkarbonat, enthält.According to the present invention, the method of cultivating this new and hitherto unknown form of Streptomyces, namely Streptomyces BL-456786, is that this microorganism is grown at about 24 to 30 ⁰ and under submerged aerobic conditions and agitation on nutrient media which have a carbon and a nitrogen source, growth promoting substances, mineral salts such as sodium chloride, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium nitrate, and optionally a buffer substance such as calcium carbonate.

Als Kohlenstoffquelle für den Nährboden kommen unter anderem in Frage gewöhnliche Stärke, lösliche Stärke, Rohrzucker, Glukose, Maltose, Dextrose, Glycerin, Galaktose, Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fruktose, Laktose, Inulin, Dextrin.As a source of carbon for the culture medium, common starch, soluble starch, among others, come into question Starch, cane sugar, glucose, maltose, dextrose, glycerin, galactose, xylose, arabinose, rhamnose, Fructose, lactose, inulin, dextrin.

Diese Kohlenstoffquellen können dem Nährboden in reiner Form oder in Form von Konzentraten zugesetzt werden. Die Menge, die zwecks Erzeugung bester Ausbeuten an antibiotischen Verbindungen zugesetzt wird, kann in beträchtlichen Grenzen schwanken und z. B. zwischen 0,5 und 5 Gewichtsprozent vom Gesamtgewicht des Nährbodens betragen.These carbon sources can be added to the nutrient medium in pure form or in the form of concentrates will. The amount used to produce the best yields of antibiotic compounds is added, can vary within considerable limits and z. B. between 0.5 and 5 percent by weight of the total weight of the nutrient medium.

Ergebnisse von Prüfungen in vivoResults of in vivo tests

Amphomycin
Partie Nr.Amphomycin
Lot no. Hemmungszone
in mm
(Plattentest)Inhibition zone
in mm
(Plate test) Verdünnung 1 -.4 Dilution 1 - 4 Akute LD₅₀
bei der MausAcute LD ₅₀
at the mouse CD₅₀ bei der Maus
Lp.CD ₅₀ for the mouse
Lp. Chronische
Toxizität bei
Mäusen im
Verlaufe vonChronic
Toxicity at
Mice in
Run from 23,123.1 i. v., mg/kgi. v., mg / kg mg/kgmg / kg 5 Wochen5 weeks ohne Verdünnungwithout dilution 27,027.0 mg/kg ■mg / kg ■ 77th 26,026.0 1,81.8 >i5o> i5o 88th 28,928.9 Verdünnung 1:64Dilution 1:64 —- 0,680.68 > 150> 150 1717th 21,721.7 > 215> 215 2,22.2 Verdünnung 1:16Dilution 1:16 2828 25,025.0 46 bis 11646 to 116 0,570.57 50 bis 10050 to 100 Penicillinpenicillin etwa 20about 20

Geeignete Quellen für Stickstoff und gleichzeitig für eine Reihe von das Wachstum fördernden Stoffen stellen eine große Anzahl von Stoffen dar, wie Aminosäuren, hydrolysiertes und nicht hydrolysiertes Kasein, Molken oder Molkenkonzentrate, Weizenweichwasser, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Fleischextrakte, Leberkuchen, Harnstoff, Nitrate, Ammoniumverbindungen, Rückstände von der Getreidevergärung zu Alkohol, Maisweichwasser, säurehydrolysiertes Maisgluten, säurehydrolysiertes Weizengluten, Pepton, Schlachtabfälle, Brauereihefe, Baumwollsamenmehl, Laktalbumin, Trypton.Suitable sources of nitrogen and, at the same time, of a number of substances that promote growth represent a large number of substances, such as amino acids, hydrolyzed and non-hydrolyzed casein, Whey or whey concentrates, wheat soft water, fish meal, soybean meal, meat extracts, liver cake, Urea, nitrates, ammonium compounds, residues from the fermentation of grain to alcohol, Corn softened water, acid hydrolyzed corn gluten, acid hydrolyzed wheat gluten, peptone, slaughterhouse waste, Brewer's yeast, cottonseed meal, lactalbumin, tryptone.

Diese eiweißhaltigen Zusätze brauchen nicht im hochgereinigten Zustand zugesetzt zu werden; vielmehr können weniger reine Produkte, die häufig das Wachstum fördernde Stoffe und beträchtliche Mengen an mineralischen Nährstoffen enthalten, für diesen Zweck benutzt werden. Es ist wegen des Vorliegens vieler dieser stickstoffhaltigen Stoffe im nicht gereinigten Zustand nicht möglich, genaue Mengenangaben bezüglich ihres Zusatzes zu machen. In den meisten Fällen genügt ein Zusatz von 0,1 bis 5 Gewichtsprozent, berechnet auf in dem betreffenden Material enthaltene Trockensubstanz, zu dem Nährboden.These protein-containing additives do not need to be added in a highly purified state; much more can be less pure products, which are often growth-promoting substances and in considerable quantities of mineral nutrients can be used for this purpose. It's because of the presence Many of these nitrogenous substances are not possible in the uncleaned state, exact quantities to make regarding their addition. In most cases, an addition of 0.1 to 5 percent by weight is sufficient, calculated on the dry matter contained in the material concerned, to the nutrient medium.

Der p_H-Wert der Gärflüssigkeit soll zu Beginn der Vergärung 7 bis 7,2 betragen. Die zweckmäßigste Gärtemperatur liegt bei etwa 26 bis 28⁰. Maximalausbeuten an antibiotischer Substanz werden, je nach dem angewandten Züchtungsverfahren und Nährboden, gewöhnlich innerhalb von 2 bis 7 Tagen erhalten.The _pH value of the fermentation liquor should be at the beginning of fermentation 7 to 7.2. The most suitable fermentation temperature is around 26 to 28 ^° . Maximum yields of antibiotic substance are usually obtained within 2 to 7 days, depending on the cultivation method used and the nutrient medium.

Nach beendetem Wachstum wird das Myzel von der Kulturflüssigkeit, die nun das antibiotisch wirksame Amphomycin enthält, getrennt. Dieses wird daraus durch Extraktion mit geeigneten organischen Lösungsmitteln oder durch Ausfällung beim isoelektrischen Punkt oder auf andere für die Gewinnung von Antibiotika gebräuchliche Weise gewonnen. Das so erhaltene neue Antibiotikum Amphomycin besitzt wertvolle und nur ihm eigene Eigenschaften, die es von allen bekannten und bisher beschriebenen Antibiotika unterscheiden.After growth has ended, the mycelium is removed from the culture fluid, which is now the antibiotically effective Contains amphomycin, separately. This is made from it by extraction with suitable organic Solvents or by precipitation at the isoelectric point or on others for the recovery of Antibiotics Common Ways Obtained. The new antibiotic thus obtained has amphomycin Valuable and unique properties that distinguish it from all known and previously described antibiotics differentiate.

Wie Penicillin, so wirkt auch Amphomycin in vivo sowohl wie in vitro und zeigt eine bemerkenswerte chemotherapeutische Wirksamkeit gegen experimentelle Infektionen bei Mäusen. Die folgende Tabelle gibt das Ergebnis solcher Versuche sowie von Versuchen zur Toxizitätsbestimmung wieder:Like penicillin, amphomycin is both effective in vivo and in vitro and has a remarkable effect chemotherapeutic efficacy against experimental infections in mice. The following table gives the result of such experiments as well as experiments to determine toxicity again:

579/472579/472

B 23108 IVaI30hB 23108 IVaI30h

Der Ausdruck »CD_&0« bedeutet die minimale Dosis curativa bei intraperitonealer Verabreichung von Amphomycin, die erforderlich ist, um 50% einer Gruppe von Mäusen, denen intraperitoneal 100 bis 1000 LD₆₀-Gaben von Diplococcus pneumoniae injiziert wurde, zu heilen, d. h. am Leben zu erhalten. Dabei würde jede LD₆₀-Gabe für sich gegeben ausreichen, um 50% der so infizierten Mäuse zu töten. Die Infektion wird sofort nach Verabreichung der ersten Gabe des zu prüfenden Antibiotikums gesetzt. Das Antibiotikum selbst wird in zwei gleichen Gaben mit einem Zwischenraum von etwa 18 Stunden verabfolgt. Die Tiere werden 4 Tage lang beobachtet, und die Todesfälle in jeder Gruppe werden als Prozente aller Tiere einer jeden Gruppe berechnet. Die Prozentzahlen der Todesfälle werden dann in »probit«·- Werte umgewandelt, und diese werden dann als Logarithmus der Dosis in mg pro kg Gewicht der Maus graphisch dargestellt. Der Punkt, an dem sich die »Probit^-5-Linie und die günstigste Linie, die durch die Versuchspunkte gelegt werden kann, schneiden, gibt die Konzentration des Arzneimittels an, durch die die Hälfte der Tiere unter den Versuchsbedingungen gegen die gesetzte Infektion geschützt wird. Der Antilogarithmus dieses Ausdruckes wird CD₅₀-Wert genannt.The term "CD _{& 0} " means the minimum dose of curativa intraperitoneally administered amphomycin required _{to cure 50% of a group of mice intraperitoneally injected with 100 to 1000 LD 60} doses of Diplococcus pneumoniae, ie alive to obtain. Each LD ₆₀ dose given would be sufficient to kill 50% of the mice infected in this way. The infection is set immediately after the first dose of the antibiotic to be tested has been administered. The antibiotic itself is given in two equal doses about 18 hours apart. The animals are observed for 4 days and the deaths in each group are calculated as the percentage of all animals in each group. The percentages of deaths are then converted into "probit" values, and these are then plotted as the logarithm of the dose in mg per kg of mouse weight. The point at which the »probit ^ -5 line and the most favorable line that can be laid through the test points intersect indicates the concentration of the drug by which half of the animals protected against the infection set under the test conditions will. The antilogarithm of this expression is called the CD ₅₀ value.

Amphomycin besitzt seine geringste Löslichkeit in Wasser bei einem p_H von 3,3 bis 3,6. Unterhalb oder oberhalb dieses p_H-Bereiches ist es jedoch sehr stark wasserlöslich. Es ist leicht löslich in Methanol, und zwar sowohl in Säureform als auch in Salzform,Amphomycin has its lowest solubility in water at p _H 3.3 to 3.6. Below or above this p _H -region it is very highly water soluble, however. It is easily soluble in methanol, both in acid form and in salt form,

. während es, wie oben bereits ausgeführt, in höheren Alkoholen nur in der Säureform löslich ist. Aus wäßriger Lösung wird es bei einem p_H-Wert von 2 durch Butanol und Amylalkohol extrahiert, nicht aber durch Methylisobutylketon oder Amylazetat. Aus seiner sauren Butanollösung geht es bei einem p_H-Wert über 3 oder 4 wieder in die wäßrige Phase über.. while, as already stated above, it is only soluble in the acid form in higher alcohols. From aqueous solution, it is extracted at a _pH value of 2 by butanol and amyl alcohol, amyl acetate or methyl isobutyl ketone but not through. From its acidic butanol it comes at a _pH value above 3 or 4 back into the aqueous phase.

Saure Lösungen des Amphomycin in Butanol können durch Aktivkohle entfärbt werden, und die Säureform des Antibiotikums kann durch Zusatz nicht polarer Lösungsmittel, wie Äthylazetat, Äther u. dgl., daraus gefällt werden.Acid solutions of amphomycin in butanol can be decolorized by activated charcoal, and the The acid form of the antibiotic can be obtained by adding non-polar solvents such as ethyl acetate or ether and the like, to be felled from it.

Eine 5- bis 20%ige wäßrige Lösung der Säureform des Amphomycins gibt bei der Einstellung des p_H-Wertes der Lösung mit Alkali auf 3,4 bis 3,5 einen reichlichen Niederschlag. Der Niederschlag geht wieder in Lösung, wenn der p_H-Wert erhöht oder erniedrigt wird.A 5 to 20% aqueous solution of the acid form of the Amphomycins are in adjusting the p _H -value of the solution with alkali to 3.4 to 3.5 a copious precipitate. The precipitate goes into solution again if the _pH value is increased or decreased.

Unlösliche Derivate der basischen Gruppen des Amphomycins sind hergestellt worden.· So erhält man bei der Behandlung der Lösung des Natriumsalzes des Amphomycins in Wasser mit Reineckes Salz einen Niederschlag des wirksamen Reineckates des Amphomycin in guter Ausbeute, jedoch erst, wenn der p_H-Wert der Lösung auf 2 bis 3 herabgesetzt wird. Das Antibiotikum kann daraus leicht wiedergewonnen werden, indem das Reineckat in Aceton gelöst und Ammoniumhydroxyd zu dieser Lösung zugesetzt wird, wobei das wirksame Ammoniumsalz des Amphomycin ausgefällt wird. Das Reineckat konnte bisher noch nicht in kristalliner Form erhalten werden. Ein öliges Pikrat ließ sich in ähnlicher Weise gewinnen.Insoluble derivatives of the basic groups of the Amphomycins have been made. · Is thus obtained in the treatment of the solution of the sodium salt of Amphomycins in water with Reinecke salt a precipitate of the active Reineckates of amphomycin in good yield, but only when the _pH value of the Solution is reduced to 2 to 3. The antibiotic can easily be recovered therefrom by dissolving the pure sugar in acetone and adding ammonium hydroxide to this solution, whereby the active ammonium salt of amphomycin is precipitated. The pure sugar could not yet be obtained in crystalline form. An oily picrate could be obtained in a similar way.

Amphomycin ist in wäßriger Lösung stabil. Solche wäßrigen Lösungen zeigen bei einem p_H von 2, 7 oder 10 bei zehntägiger Lagerung bei Zimmertemperatur kein Nachlassen der Wirksamkeit. Festes Amphomycin ist bei Zimmertemperatur praktisch unbegrenzt haltbar.Amphomycin is stable in aqueous solution. Such aqueous solutions show at a p _H of 2, 7 or 10 days of storage at ten at room temperature, no decrease in the activity. Solid amphomycin can be kept practically indefinitely at room temperature.

Das reinste bisher gewonnene Amphomycin zeigt Ultraviolettabsorption nur zwischen 210 und 230 μ und reagiert negativ im Ninhydrin-, Sakaguchi-, Molisch- und Ehrlich-Pauly-Test. Amphomycin enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff. Die gewonnenen Produkte sind weiße oder fast weiße nicht kristalline Pulver. Sie geben eine positive Biuretreaktion. Das durch Hydrolyse mit 6 n-Salzsäure während 24 Stunden bei ioo° erhaltene Spaltprodukt reagiert im Ninhydrintest positiv. Papierchromatographische Untersuchung des Hydrolysates läßt das Vorliegen mehrerer verschiedener im Ninhydrintest positiv reagierender Verbindungen erkennen. The purest amphomycin obtained to date shows ultraviolet absorption only between 210 and 230 μ and reacts negatively in the ninhydrin, Sakaguchi, Molisch and Ehrlich-Pauly tests. Amphomycin contains carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen. The products obtained are white or almost white non-crystalline powders. They give a positive biuret reaction. The cleavage product obtained by hydrolysis with 6N hydrochloric acid for 24 hours at 100 ° reacts positively in the ninhydrin test. Examination of the hydrolyzate by paper chromatography reveals the presence of several different compounds which react positively in the ninhydrin test.

Diese Eigenschaften des Amphomycin ermöglichen es, dieses Antibiotikum von anderen Antibiotika zu unterscheiden, die durch Aktinomyceten erzeugt werden.These properties of amphomycin make it possible to distinguish this antibiotic from other antibiotics too differentiate that are produced by actinomycetes.

■ Von den Aktinomycetenantibiotika, die saure Eigenschaften aufweisen, sind Antimycin, Actinorhodin und die Streptomycesantibiotika X-206, X-464 und X-537 stickstofffreie Verbindungen ohne basische Eigenschaften. Die freie Säure dieser Verbindungen ist löslich in nicht polaren Lösungsmitteln, wie Äther, Benzol u. dgl., während Amphomycin darin unlöslich ist.■ Of the actinomycete antibiotics that have acidic properties are antimycin, actinorhodin and the Streptomyces antibiotics X-206, X-464 and X-537 nitrogen-free compounds without basic Properties. The free acid of these compounds is soluble in non-polar solvents, such as ether, Benzene and the like, while amphomycin is insoluble therein.

Litmocidin und Rhodomycetin sind gefärbte Pigmente, während die hochwirksamen Amphomycinpräparate weiße Pulver darstellen.Litmocidin and rhodomycetin are colored pigments, while the highly potent amphomycin preparations represent white powder.

Von den sauren, stickstoffhaltigen oder amphoteren Actinomycetenantibiotika läßt sich Borrelidin bei saurem p_H durch Benzol extrahieren, Amphomycin dagegen nicht. Borrelidin hat, im Vergleich zu Amphomycin, auch nur ein sehr beschränktes antibakterielles Spektrum. Endomycin und Musarin in Form der freien Säuren sind in Wasser unlöslich, während Amphomycin bei p_H 2 eine Löslichkeit in Wasser aufweist, die 5 °/₀ übersteigt. Amphomycin unterscheidet sich von Aureomycin und Terramycin besonders dadurch, daß es im Bereich von 220 bis 400 μ keine Ultraviolettabsorption aufweist.Of the acidic nitrogen-containing or amphoteric Actinomycetenantibiotika to borrelidin amphomycin however, can not be at acidic p _H by benzene extract. Compared to amphomycin, borrelidin also only has a very limited antibacterial spectrum. Endomycin and Musarin in the form of the free acids are insoluble in water, while amphomycin has a solubility in water at _pH 2, 5 ° / ₀ exceeds. Amphomycin differs from aureomycin and terramycin in particular in that it has no ultraviolet absorption in the range from 220 to 400 μ.

Die Gewinnung des Amphomycin und seiner Salze sei in den folgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne die Erfindung jedoch hierauf zu beschränken. The production of amphomycin and its salts is explained in more detail in the following working examples explained without, however, restricting the invention thereto.

Beispiel 1
Herstellung des antibiotischen Wirkstoffesexample 1
Production of the antibiotic active ingredient

in Schüttelkulturenin shaking cultures

Zur Gewinnung kleiner Mengen an Amphomycin wird die Züchtung in Flaschen durchgeführt, wobei die Kulturen geschüttelt und dem Luftzutritt ausgesetzt sind. Die Flaschen sind durch einen Wattestopfen vor dem Zutritt von Verunreinigungen geschützt. Der Streptomycesstamm BL-456786 wirdTo obtain small amounts of amphomycin, cultivation is carried out in bottles, whereby the cultures are shaken and exposed to air. The bottles are through a cotton plug protected from the ingress of impurities. Streptomyces strain BL-456786 becomes

60'J 579/47260'J 579/472

B 23108 IVa/30hB 23108 IVa / 30h

in einer geeigneten Nährflüssigkeit im submersen Verfahren gezüchtet, Wobei Rühren und Belüftung der Kultur dadurch bewirkt werden, daß die Kulturflaschen in eine hin ..und her gehende Schüttelvorrichtung eingespannt werden, die für ein gründliches Versprühen, Verspritzen und Vermischen der Kulturflüssigkeit in und mit der sauerstoffhaltigen Atmosphäre.Sorge trägt; So werden z. B. je 500 ecm einer Kulturflüssigkeit, die 1% Sojabohnenmehl, I % wasserfreie Dextrose, 0,5 % Natriumchlorid, 0,05 °/o lösliche Schlempebestandteile, 0,1 °/₀ Kalziumkarbonat enthält, in ,Vierliterflaschen gefüllt und sterilisiert. Nach Sterilisation im Autoklav wird die Nährflüssigkeit mit etwa 1 Volumprozent einer trüben wäßrigen Suspension von Sporen von im schräg gestellten Agarröhrchen gezüchteten BL-456786 beimpft. Der P₁₁-Wert der Kulturflüssigkeit zu Beginn der Bebrütung ist 7 bis 7,2. Der Flascheninhalt wird dann bei 26' bis 28⁰ 120 Stunden lang bebrütet, wobei die Flaschen kräftig geschüttelt werden, und zwar mit 130 Schüttelbewegungen in der Minute und einem horizontalen Hub von etwa 3,2 cm. Nach dieser Bebrütungszeit enthält; die Flüssigkeit antibiotische Verbindungen von folgender Wirksamkeit. Die Wirksamkeit wird dabei ausgedrückt in mm des Durchmessers der Hemmungszone bei den angegebenen Verdünnungen: unverdünnt 29,2 mm, vierfach verdünnt , 26,2 mm. Die Hemmwirkung wurde dabei nach der oben näher beschriebenen Diffusionsplattenmethode bestimmt. Der p_H-Wert der Kulturflüssigkeit betrug gegen Ende der Bebrütung 7,8.cultured in a suitable nutrient liquid in the submerged process, whereby stirring and aeration of the culture are effected by clamping the culture flasks in a reciprocating shaking device, which is used for thorough spraying, spraying and mixing of the culture liquid in and with the oxygen-containing one Atmosphere. Care bears; So z. B. 500 cc contains a culture liquid containing 1% soybean meal, I% anhydrous dextrose, 0.5% sodium chloride, 0.05 ° / o soluble Schlempebestandteile, 0.1 ° / ₀ calcium carbonate filled in, four-liter bottles and sterilized. After sterilization in the autoclave, the nutrient liquid is inoculated with about 1 percent by volume of a cloudy aqueous suspension of spores from BL-456786 grown in an inclined agar tube. The P ₁₁ value of the culture liquid at the beginning of the incubation is 7 to 7.2. The bottle contents are then incubated at 26 'to 28 ⁰ 120 hours wherein the bottles are shaken vigorously, namely cm with 130 shaking movements per minute and a horizontal stroke of about 3.2. After this incubation period contains; the liquid antibiotic compounds of the following effectiveness. The effectiveness is expressed in mm of the diameter of the inhibition zone at the specified dilutions: undiluted 29.2 mm, diluted four times, 26.2 mm. The inhibitory effect was determined using the diffusion plate method described in more detail above. The _pH value of the culture liquid was towards the end of incubation 7.8.

Beispiel 2
Herstellung einer Impf lösung im VersuchsbetriebExample 2
Production of an inoculation solution on a trial basis

Für die großtechnische Gewinnung von Amphömycin benötigt man eine Impflösung, die in folgender Weise gewonnen wird: Eine Nährlösung, die in 2500 ecm i°/o Sojabohnenmehl,- 1% wasserfreie Dextrose, 0,5% Natriumchlorid,. 0,05% lösliche Schlempebestandteile und 0,1 % Kalziumkarbonat enthält, wird in eine Zehnliterflasche gefüllt und bei 118 bis 120° während einer Stunde dampfsterilisiert.For the large-scale production of amphömycin one needs an inoculation solution, which in the following way is obtained: A nutrient solution, which in 2500 ecm i ° / o soybean meal, - 1% anhydrous dextrose, 0.5% sodium chloride ,. Contains 0.05% soluble sludge components and 0.1% calcium carbonate, is filled into a ten liter bottle and steam sterilized at 118 to 120 ° for one hour.

Nach dem Erkalten wird die Nährlösung mit etwa 0,5 Volumprozent einer trüben, wäßrigen Suspension von Sporen von im schräg gestellten Agarröhrchen gezüchtetem Streptomyces BL-456786 beimpft. Der Flascheninhalt wird dann 72 bis 96 Stunden lang bei 26 bis 28⁰ bebrütet, wobei die Flasche auf einer hin und her gehenden Schüttelvorrichtung kräftig geschüttelt wird. Aus dieser Flasche wird- dann die Streptomyces BL-456 786 enthaltende Impf lösung unter völlig aseptischen Bedingungen in den Gärtank übergeführt. After cooling, the nutrient solution is inoculated with about 0.5 percent by volume of a cloudy, aqueous suspension of spores from Streptomyces BL-456786 grown in an inclined agar tube. The bottle contents are then incubated for 72 to 96 hours at 26 to 28 ^0, the bottle is shaken vigorously on a reciprocating shaker. The inoculation solution containing Streptomyces BL-456 786 is then transferred from this bottle into the fermentation tank under completely aseptic conditions.

Beispiel 3
Großtechnische Produktion von AmphömycinExample 3
Large-scale production of amphomycin

■ Amphömycin kann großtechnisch nach dem submersen oder Tiefenkulturverfahren gewonnen werden. Feststehende Gärbottiche, die mit geeigneten Rühr- und Belüftungsvorrichtungen versehen sind, haben sich für diesen Zweck als brauchbar erwiesen. Eine wäßrige Nährlösung,' die in 5675 1 57 kg Sojabohnenmehl, 57 kg Dextrose und 28 kg Kalziumkarbonat enthält, wird in einem senkrechten, 7500 1 fassenden stählernen Gärbottich, der,mit Glas ausgekleidet und mit einem Wassermantel zur Regelung der Temperatur versehen ist, hergestellt. Dieser Gärbottich weist außerdem einen ankerartigen Rührer und einen zweiarmigen Plattensprinlder auf, beide aus nichtrostendem Stahl bestehend. Die Nährflüssigkeit wird mit Dampf unter Druck sterilisiert und abgekühlt. Sie weist dann einen p_H-Wert von 6,98 auf und wird, darauf mit 15 Volumprozent einer 48 Stunden alten Kultur beimpft, die in einem ähnlichen Gärbottich vorher mit der im Beispiel 2 beschriebenen Impflösung beimpft worden war. Die erhaltene Kulturlösung wird dann im 7500-l-Gärbottich 50 Stunden lang bei 28° bebrütet. Während der Bebrütung wird der Rührer mit etwa 90 Umdrehungen in der Minute umlaufen gelassen und sterile Luft in einer Menge von etwa 0,284 ^{m3 m} der Minute in die Kulturflüssigkeit ein-, geleitet. Die Bestimmung des p_H-Wertes am Ende der Bebrütungsperiode ergibt ein p_H von 7,6. Die Aktivität der Nährflüssigkeit, bestimmt nach der oben beschriebenen Diffusionsplattenmethode, ergibt eine Hemmungszone mit einem Durchmesser von 18,7 mm im unverdünnten Zustand und von 14 mm bei vierfacher Verdünnung des ursprünglichen Volumens.■ Amphömycin can be obtained on an industrial scale using the submerged or deep culture method. Fixed fermentation vats fitted with suitable stirring and ventilation devices have proven useful for this purpose. An aqueous nutrient solution, which contains 57 kg of soybean meal, 57 kg of dextrose and 28 kg of calcium carbonate in 5675, is prepared in a vertical, 7500 l steel fermentation vat, which is lined with glass and provided with a water jacket to regulate the temperature . This fermentation tub also has an anchor-type stirrer and a two-armed plate sprinkler, both made of stainless steel. The nutrient liquid is sterilized with steam under pressure and cooled. It then has a _pH value of 6.98 and is, on seeded with 15 percent by volume of a 48 hour old culture that had been inoculated in a similar fermentation vat before with the procedure described in Example 2 inoculum. The culture solution obtained is then incubated in a 7500 l fermentation vat for 50 hours at 28 °. During the incubation, the stirrer is allowed to rotate at about 90 revolutions per minute and sterile air is introduced into the culture ^{liquid in an amount of about 0.284 m3 per minute.} The determination of the p _H -value at the end of the incubation period, resulting in a p _H of 7.6. The activity of the nutrient fluid, determined by the diffusion plate method described above, results in an inhibition zone with a diameter of 18.7 mm in the undiluted state and of 14 mm when the original volume is diluted four times.

Die Isolierung und Reindarstellung von festem Amphömycin von dieser Kulturflüssigkeit wird in den folgenden Beispielen beschrieben.The isolation and preparation of solid amphomycin from this culture fluid is carried out in the the following examples.

Example 4

Isolierung und Reinigung
Extraktion der KulturflüssigkeitIsolation and purification
Extraction of the culture liquid

Die Verfahrensprodukte werden auf ihre antibiotische Wirksamkeit nach der Zylinderplattentestmethode geprüft, wobei die Hemmungszone in mm gemessen wird. Lösungen derselben werden in verschiedenen Verdünnungeil geprüft und so miteinander verglichen.The products of the process are tested for their antibiotic effectiveness according to the cylinder plate test method tested, the inhibition zone being measured in mm. Solutions of the same are found in different Dilution part checked and thus compared with each other.

30 1 der filtrierten Kulturlösung werden mit Salzsäure auf p_H 1,95 angesäuert und durch eine Schicht Diatomeenerde filtriert, wobei eine klare Lösung erhalten wird. Das klare Filtrat wird 15 Minuten lang mit 15 1 n-Butanol gerührt. Danach werden die beiden Phasen voneinander' getrennt. Diese Extraktion wird mit weiteren 481 Kulturflüssigkeit wiederholt, und die Butanolextrakte (insgesamt 40 1) werden mit 10 1 mit Salzsäure auf ein p_H von 2 angesäuertem Wasser gewaschen. Das Butanol wird dann mit 10 1 Wasser gerührt und die Mischung auf ein p_H von 6,4 eingestellt. Der wäßrige Extrakt wird ■ nach 30 Minuten langem Rühren entfernt, im Vakuum konzentriert und durch Sublimation aus dem gefrorenen Zustand (lyophil) getrocknet. Ausbeute 20,2 g eines braunen Pulvers. Wiederholt man die oben beschriebene Butanolextraktion, so erhält man nach ähnlicher Aufarbeitung zusätzlich 6,6 g eines braunen Pulvers. .30 1 of the filtered culture solution is acidified with hydrochloric acid to p _H 1.95 filtered through a pad of diatomaceous earth to give a clear solution is obtained. The clear filtrate is stirred with 15 liters of n-butanol for 15 minutes. Then the two phases are separated from each other. This extraction is repeated with a further 481 of culture liquid, and the butanol extracts (40 1) are washed with 10 1 with hydrochloric acid to a p _H of 2 acidified water. The butanol is then stirred with 10 1 water and the mixture to a p _H of 6.4 adjusted. The aqueous extract is removed after stirring for 30 minutes, concentrated in vacuo and dried from the frozen state (lyophil) by sublimation. Yield 20.2 g of a brown powder. If the butanol extraction described above is repeated, an additional 6.6 g of a brown powder is obtained after a similar work-up. .

■609 579/Φ72■ 609 579 / Φ72

B 23108 IVa/30 h ηB 23108 IVa / 30 h η

. Die Prüfung auf antibiotische Wirksamkeit nach dem Diffusionsplattentest ergab folgendes Resultat: . The test for antibiotic effectiveness after the diffusion plate test gave the following result:

Geprüftes MaterialTested material

UnverdünntUndiluted

Verdünnt 1:4Diluted 1: 4

Ausgangskulturflüssigkeit Starting culture fluid

klare Kulturflüssigkeit clear culture liquid

extrahierte Kulturflüssigkeitextracted culture fluid

die ersten 30 1 the first 30 1

die zweiten 48 1 the second 48 1

saures Waschwasser acidic wash water

erster wäßriger Extrakt (10 1) first aqueous extract (10 1)

zweiter wäßriger Extrakt second aqueous extract

feste Bestandteile des ersten Extraktes konzentriert auf 1 mg/ccm:solid components of the first extract concentrated to 1 mg / ccm:

Festprodukt Nr. 7 Solid product no.7

feste Bestandteile des zweiten Extraktes konzentriert auf 1 mg/ccm:solid components of the second extract concentrated to 1 mg / ccm:

Festprodukt Nr. 8 , Solid product no.8,

24,2 mm
25,2 mm24.2 mm
25.2 mm

14.8 mm
10,4 mm14.8 mm
10.4 mm

keine Hemmung
30,0 mm
26,0 mmno inhibition
30.0 mm
26.0 mm

26,0 mm26.0 mm

28.9 mm28.9 mm

20.0 mm
20,4 mm20.0 mm
20.4 mm

keine Hemmung
keine Hemmungno inhibition
no inhibition

28,2 mm28.2 mm

23.1 mm23.1 mm

23,1 mm
27,0 mm23.1 mm
27.0 mm

Example 5

Isolierung des Wirkstoffes
20Isolation of the active ingredient
20th

Der Wirkstoff kann auch wie folgt isoliert werden: 2930 1 nicht filtrierte Kulturflüssigkeit werden auf einen p_H-Wert von 2,3 eingestellt und mit 1175 1 n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird abgetrennt und mit 150 1 angesäuertem Wasser (p_H 2) gewaschen. Der Extrakt wird dann mit 150 1 Wasser gemischt, mit Natronlauge auf ein p_H von 7,3 bis 7,4 eingestellt und die wäßrige Schicht abgetrennt. Der extrahierte Butylalkohol wird erneut, diesmal mit 75 1 Wasser gemischt, mit Natronlauge auf ein p_H von 7,3 bis 7,4 eingestellt und die wäßrige Schicht wiederum abgetrennt. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden darauf erneut der gleichen Behandlung unterworfen, nämlich einer Extraktion mit n-Butanol bei einem p_H von 2 und einer Extraktion mit Wasser bei einem p_H von 7,3 bis 7,4. Dabei erhält man schließlich 12,1 1 eines angereicherten wäßrigen Extraktes, der, nach dem Zerstäubungsverfahren getrocknet, 480 g des rohen Natriumsalzes des Amphomycins ergibt.The active ingredient may also be isolated as follows: 1 2930 not filtered culture liquid is adjusted to a _pH value of 2.3 and extracted with 1175 1 of n-butanol. The butanol extract is separated off and washed with 150 l of acidified water (p _H 2). The extract is then mixed with 150 1 of water, adjusted with sodium hydroxide to a p _H 7.3 to 7.4 and the aqueous layer separated. The extracted butyl alcohol is again, this time mixed with 75 1 of water, adjusted with sodium hydroxide to a p _H 7.3 to 7.4, and again the aqueous layer separated. The combined aqueous extracts are subjected to it again to the same treatment, namely, extraction with n-butanol at a p _H of 2 and an extraction with water at p _H 7.3 to 7.4. This finally gives 12.1 l of an enriched aqueous extract which, dried by the atomization process, gives 480 g of the crude sodium salt of amphomycin.

Example 6

Klärung mit Aktivkohle und Ausfällung eines
Rohproduktes mit LösungsmittelnClarification with activated charcoal and precipitation of one
Raw product with solvents

20 g rohes Natriumsalz des Amphomycins, wie es nach Beispiel 5 erhältlich ist, werden in 500 ecm Wasser gelöst, der p_H-Wert der Lösung wird mit Phosphorsäure auf 2 eingestellt, und die saure Lösung wird mit 300 ecm n-Butanol extrahiert. Man erhält einen dunkelbraunen Extrakt. Die abgetrennte Butanolschicht wird durch Diatomeenerde filtriert, um Spuren von nicht gelöstem Wasser zu entfernen, und wird mit 20 g Aktivkohle 30 Minuten lang gerührt. Die Kohle wird dann abfiltriert und die hellgelbe Butanollösung im Vakuum auf ein Volumen von 100 ecm eingedampft. Dieses Konzentrat wird zu 2000 ecm Äthylazetat hinzugesetzt, wobei ein reichlicher Niederschlag von Amphomycin erhalten wird, der abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute 3,4 g eines leicht kremfarbenen festen Produktes, das folgende antibiotische Wirksamkeit im Diffusionsplattentest zeigt:20 g of crude sodium salt of the Amphomycins, as obtainable according to Example 5 are dissolved in 500 cc of water, the _pH value of the solution is adjusted with phosphoric acid to 2, and the acidic solution is extracted with 300 cc of n-butanol. A dark brown extract is obtained. The separated butanol layer is filtered through diatomaceous earth to remove traces of undissolved water and is stirred with 20 g of activated charcoal for 30 minutes. The charcoal is then filtered off and the light yellow butanol solution is evaporated to a volume of 100 ecm in vacuo. This concentrate is added to 2000 ecm of ethyl acetate, whereby a copious precipitate of amphomycin is obtained, which is filtered off, washed with acetone and dried. Yield 3.4 g of a slightly cream-colored solid product that shows the following antibiotic activity in the diffusion plate test:

Zu prüfendes MaterialMaterial to be tested

UnverdünntUndiluted

VerdünntDiluted

1:41: 4

1:161:16

20 g Ausgangsmaterial 1 mg im ecm ..
3>4 S gereinigtes Produkt 1 mg im ecm20 g starting material 1 mg in the ecm ..
3> 4 S purified product 1 mg in the ecm

23,1 mm
23,0 mm23.1 mm
23.0 mm

2i,i mm
27,0 mm2i, i mm
27.0 mm

15,8 mm
18,0 mm15.8 mm
18.0 mm

Beispiel 7
Isoelektrische FällungExample 7
Isoelectric precipitation

10 g Amphomycin, erhalten nach Beispiel 6 durch Butanolextraktion, Behandlung mit Aktivkohle und Fällung mit Äthylazetat, werden in 100 ecm Wasser gelöst. Man erhält bei einem p_H von 2,2 eine klare Lösung. Diese Lösung wird mit verdünnter Natronlauge auf ein p_H von 3,4 eingestellt. Dabei fällt ein viskoser öliger Niederschlag aus. Die Mutterlauge wird durch Dekantieren abgetrennt, mit Natronlauge auf ein p_H von 6,6 eingestellt und lyophil getrocknet. Ausbeute 4,55 g eines Produktes A. Der ölige Niederschlag wird in Wasser gelöst, ebenfalls auf ein p_H von 6,6 eingestellt und lyophil getrocknet, wobei 5,68 g eines Produktes B erhalten werden. Die antibiotische Wirksamkeit dieser Stoffe im Vergleich zum Ausgangsmaterial wurde im Diffusionsplattentest bestimmt. 10 g of amphomycin, obtained according to Example 6 by butanol extraction, treatment with activated charcoal and precipitation with ethyl acetate, are dissolved in 100 ecm of water. A clear solution is obtained at a p _H of 2.2. This solution is adjusted with dilute sodium hydroxide to a p _H of 3.4. A viscous oily precipitate separates out. The mother liquor is separated by decantation, adjusted with sodium hydroxide to a p _H of 6.6 and lyophilic dried. Yield 4.55 g of product A. The oily precipitate is dissolved in water, also adjusted to a p _H of 6.6 and lyophil-dried to give 5.68 g of product B are obtained. The antibiotic effectiveness of these substances in comparison to the starting material was determined in the diffusion plate test.

Zu prüfendes MaterialMaterial to be tested

Verdünnung
1:16dilution
1:16

1:641:64

Ausgangsmaterial 1 mg im ecm
nicht ausgefälltes Produkt A ...
ausgefälltes Produkt B Starting material 1 mg in the ecm
non-precipitated product A ...
precipitated product B

29,0 mm
26,7 mm
29,0 mm29.0 mm
26.7 mm
29.0 mm

23,7 mm
21,0 mm
24,0 mm23.7 mm
21.0 mm
24.0 mm

14,7 mm
11,0 mm
17,0 mm14.7 mm
11.0 mm
17.0 mm

609 579/472609 579/472

B 23108 IVa/30 hB 23108 IVa / 30 h

Examples

Reinigung mit Reineckes Salz
25 g des Natriumsalzes des Amphomycins werden in 100 ecm Wasser gelöst und mit Phosphorsäure auf ein p_H von 2 angesäuert. Die Lösung wird dann mit ecm n-Butanol extrahiert. Der feuchte Butanolextrakt wird während einer halben Stunde mit 25 g Aktivkohle gerührt und nitriert. Das Filtrat wird mit ecm Wasser bei einem p_H von 7 extrahiert. Die abgetrennte wäßrige Schicht wird im Vakuum etwas konzentriert, um darin vorhandenes Butanol zu entfernen, und mit Phosphorsäure auf ein p_H von 1,9 eingestellt. 25 g Reineckes Salz werden in 200 ecm Wasser gelöst. Die Lösung wird auf ein p_H von 1,9 eingestellt und zu der Amphomycinlösung zugesetzt. Dabei fällt ein Niederschlag aus, der nach Stehenlassen über Nacht im Eisschrank abfiltriert wird. Der Niederschlag wird erneut in Wasser gelöst, indem das p_H der Lösung auf 7 eingestellt wird, und wird aus der erhaltenen Lösung durch Ansäuern auf einen p_H-Wert von 2 wieder ausgefällt. Das so umgefällte Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, in ecm Aceton gelöst und filtriert. Zusatz von 11 Aceton- und konzentriertem Ammoniak bis zu einem p_H von 7,5 fällt das Ammoniumsalz des Amphomycins, das gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute 12,4 g. Die Prüfung auf antibiotische Wirksamkeit im Diffusionsplattentest ergab folgendes Resultat:Cleaning with Reineckes salt
25 g of the sodium salt of Amphomycins are dissolved in 100 cc of water and acidified with phosphoric acid to a p _H of the second The solution is then extracted with ecm n-butanol. The moist butanol extract is stirred with 25 g of activated charcoal and nitrated for half an hour. The filtrate is extracted with ECM water at a p _H of the seventh The separated aqueous layer is concentrated somewhat in vacuo to set existing in butanol to be removed, and with phosphoric acid to a p _H of 1.9. 25 g of Reineckes salt are dissolved in 200 ecm of water. The solution is adjusted to a p _H of 1.9 and added to the Amphomycinlösung. A precipitate separates out, which is filtered off after leaving to stand overnight in the refrigerator. The precipitate is redissolved in water by the p _H of the solution is adjusted to 7, and is precipitated from the resulting solution by acidification to a _pH value of 2 again. The product which has been reprecipitated in this way is filtered off, washed with water, dissolved in ecm acetone and filtered. Addition of 11 acetone and concentrated ammonia up to a p _H of 7.5, the ammonium salt of the Amphomycins, the washed and dried coat. Yield 12.4g. The test for antibiotic effectiveness in the diffusion plate test gave the following result:

¹O
Zu prüfendes Material ¹ O
Material to be tested 1:161:16 Verdünnung
ι :Ö4dilution
ι: Ö4 1:2561: 256 Ausgangsmaterial 1 mg/ccm
²⁰ Endprodukt 1 mg/ccm Starting material 1 mg / cc
²⁰ final product 1 mg / cc 25,3 mm
26,0 mm25.3 mm
26.0 mm 20,7 mm
21,8 mm20.7 mm
21.8 mm 16,0 mm
17,5 mm16.0 mm
17.5 mm

Wie oben erwähnt, sind wäßrige Lösungen von Amphomycin während mehrerer Tage beständig und zeigen keinen Wirkungsabfall. Lösungen dieser Art können daher mit Erfolg als Desinfektionsmittel und Antiseptika Verwendung finden.As mentioned above, aqueous solutions of amphomycin are stable for several days and show no decrease in effectiveness. Solutions of this type can therefore be used as disinfectants and with success Find antiseptics use.

Claims

PATENT CLAIMS:

■ i. Process for the production and extraction of an antibiotic compound or their salts, characterized in that a Streptomyces strain BL-456786 in an aqueous Carbohydrate nutrient solution, expediently under submerged conditions and with aeration Is grown until the nutrient solution has significant antibacterial effectiveness, especially has against gram-positive microorganisms, whereupon the antibiotic compound Amphomycin or its salts are isolated from the nutrient solution.

2. Embodiment I of the process according to claim, characterized in that the culturing at a temperature of about 24 to 30 ⁰ is performed for a period of 2 to 7 days, and suitably at a p _H from 7 to 7.8.

3. Embodiment of the method according to claim ι and 2, characterized in that for Obtaining Amphomycin The crude amphomycin solutions are decolorized with activated charcoal.

4. embodiment of the method according to claim ι to 3, characterized in that the amphomycin from its aqueous solutions with a water-immiscible organic solvent under strongly acidic conditions, conveniently .from with n-butanol or pentanol at a p _H about 2, is extracted.

5. Embodiment of the method according to claim ι to 4, characterized in that Amphomycin from its aqueous solution through

Adjusting the p _H -value of between 3 and
expediently to 3.4 to 3.5, is precipitated.

6. Embodiment of the method according to claim ι to 5, characterized in that amphomycin from its strongly acidic solutions in water-immiscible organic solvents, in particular from its solutions in butanol, with water at a p _H value exceeding 4, preferably at one p _H from 7.3 to 7.4.

7. embodiment of the method according to claim ι to 6, characterized in that impurities of strongly acidic aqueous amphomycin solutions with methyl isobutyl ketone or amyl acetate extracted and removed.

8. embodiment of the method according to claim ι to 7, characterized in that amphomycin from its solutions by reaction of its basic or acidic groups with them Groups reacting with the formation of insoluble derivatives, such as with Reineckes salt, is felled.

9. embodiment of the method according to claim ι to 8, characterized in that amphomycin from its solutions in the form of the free acid by adding non-polar solvents, how ethyl acetate, ether, is precipitated.

The method of claim 8, characterized in that a solution of an alkali salt of Amphomycins and is set by Reinecke salt to a _pH value 2 to 3, wherein the reineckate of Amphomycins 10. fails embodiment.

11 embodiment of the method according to claim 10, characterized in that from a solution of the Reineckates amphomycin by adding ammonia, suitably up to a p _H of 7.5, the ammonium salt of amphomycin is precipitated.