DE3608175A1 - EFOMYCIN G, ITS PRODUCTION AND USE AS A PERFORMANCE IN ANIMALS - Google Patents

EFOMYCIN G, ITS PRODUCTION AND USE AS A PERFORMANCE IN ANIMALS

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DE3608175A1
DE3608175A1 DE19863608175 DE3608175A DE3608175A1 DE 3608175 A1 DE3608175 A1 DE 3608175A1 DE 19863608175 DE19863608175 DE 19863608175 DE 3608175 A DE3608175 A DE 3608175A DE 3608175 A1 DE3608175 A1 DE 3608175A1
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Olga Dipl Biol Dr Salcher
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Efomycin G, seine Herstellung und seine Verwendung als Leistungsförderer bei Tieren.The present invention relates to efomycin G, its Manufacturing and its use as a performance enhancer Animals.

  • 1. Es wurde das Efomycin G mit den im folgenden angegebenen chemischen und physikalischen Eigenschaften gefunden:
    • 1. Die Summenformel: C53H86O18
    • 2. Das Massenspektrum (Fast Atom Bombardment) Molmasse + Na⁺: 1033
    • 3. Das 1H-Kernresonanzspektrum, angegeben in Teilen pro Million, gemäß Abb. 1.
      Es wurde in einem AM 300 der Fa. Bruker bei MHz an einer Lösung von Efomycin G in deuteriertem Chloroform mit Tetramethylsilan als innerem Standard aufgenommen.
    • 4. Das 13C-Kernresonanzspektrum, angegeben in Teilen pro Million, gemäß Abb. 2.
      Es wurde in einem AM 300 der Fa. Bruker bei 75,48 MHz an einer Lösung von Efomycin G in deuteriertem Chloroform und deuteriertem Methanol mit Tetramethylsilan als innerem Standard aufgenommen.
    1. Efomycin G with the following chemical and physical properties was found:
    • 1. The empirical formula: C 53 H 86 O 18
    • 2. The mass spectrum (Fast Atom Bombardment) molar mass + Na⁺: 1033
    • 3. The 1 H nuclear magnetic resonance spectrum, given in parts per million, according to FIG. 1.
      It was recorded in an AM 300 from Bruker at MHz on a solution of efomycin G in deuterated chloroform with tetramethylsilane as the internal standard.
    • 4. The 13 C nuclear magnetic resonance spectrum, given in parts per million, according to FIG. 2.
      It was recorded in an AM 300 from Bruker at 75.48 MHz on a solution of efomycin G in deuterated chloroform and deuterated methanol with tetramethylsilane as the internal standard.
  • Die chemischen Verschiebungen der 13C-NMR-Signale von Efomycin G gemäß Abb. 2 betragen im einzelnen:
    • 5. Das UV-Absorptionsmaximum bei 251-254 nm in methanolischer Lösung.
    The chemical shifts of the 13 C-NMR signals of efomycin G according to Fig. 2 are as follows:
    • 5. The UV absorption maximum at 251-254 nm in methanolic solution.
  • 2. Es wurde gefunden, daß man das erfindungsgemäße Efomycin G erhält, wenn man geeignete Mikroorganismen der Familie der Streptomycetaceae in einem Nährmedium welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält unter aeroben Bedingungen kultiviert, das entstandene Gemisch der Efomycin nach üblichen Methoden isoliert und trennt.
    Bei Kenntnis der Eigenschaften des Efomycin G ist es mit Hilfe der üblichen chromatografischen, spektroskopischen und/oder biologischen Nachweisverfahren möglich, geeignete Mikroorganismenstämme auszumachen die Efomycin G produzieren.
    Zur Durchführung des Verfahrens kann insbesondere der Streptomyces Stamm BS 1261 - sowie seine Mutanten und Varianten - Verwendung finden.
    Dieser Stamm gehört zu der Familie Streptomycetaceae, der Gattung Streptomyces aus der grauen Serie der Streptomyceten (Cinereus-Gruppe).
    Der Stamm BS 1261 wurde am 16. 1. 1985 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland unter der Nummer DSM 3200 hinterlegt.
    2. It has been found that the efomycin G according to the invention is obtained if suitable microorganisms from the Streptomycetaceae family are cultivated under aerobic conditions in a nutrient medium which contains assimilable carbon and nitrogen sources and mineral salts, and the resulting mixture of efomycin is isolated and separated by customary methods .
    If the properties of efomycin G are known, it is possible to identify suitable microorganism strains that produce efomycin G using the usual chromatographic, spectroscopic and / or biological detection methods.
    Streptomyces strain BS 1261 - and its mutants and variants - can be used in particular to carry out the method.
    This strain belongs to the Streptomycetaceae family, the genus Streptomyces from the gray series of Streptomycetes (Cinereus group).
    The strain BS 1261 was deposited on January 16, 1985 with the German Collection for Microorganisms (DSM) Grisebachstrasse 8, 3400 Göttingen, Federal Republic of Germany under the number DSM 3200.

Taxonomische Beschreibung des Stamms BS 1261 (DSM 3200)Taxonomic description of the strain BS 1261 (DSM 3200)

Die taxonomische Beschreibung des Stamms BS 1261 erfolgte nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8th, (1974) sowie International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966) und The Prokaryotes 2, 2028-2020 (1981).The taxonomic description of the strain BS 1261 was done according to Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8th, (1974) and International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 (1966) and The Prokaryotes 2, 2028-2020 (1981).

1. Morphologie1. Morphology

Eine gute Sporulation war auf den ISP-Medien Nr. 2, 3, 4, 5, 7 bis 9 zu beobachten. Auf ISP-Medium Nr. 9 mit Ribose als C-Quelle sowie aus ISP-Medium Nr. 1 und 6 wurde überwiegend Substratmyzel gebildet.Good sporulation was on ISP media # 2, # 3, 4, 5, 7 to 9 can be observed. On ISP medium No. 9 with Ribose as a C source and from ISP medium No. 1 and 6 substrate mycelium was predominantly formed.

Luftmyzel (ISP-Medium Nr. 3, 28°C, 7 Tage:Air mycelium (ISP medium No. 3, 28 ° C, 7 days:

Farbe:grau (Cinereus-Typ) Sporenketten:Retinaculum-Apertum-Typ Sporen:Quadratisch bis rechteckig,
1,4-1,8 σm lang und 1,3-1,6 µm breit
glatt (Elektronenmikroskopie).
Color: gray (Cinereus type) spore chains: retinaculum aperture type spores: square to rectangular,
1.4-1.8 σ m long and 1.3-1.6 µm wide
smooth (electron microscopy).

Substratmyzel:Substrate mycelium:

Farbe:braun Color: brown  

2. Angaben zur Physiologie2. Information on physiology

Das Temperaturoptimum liegt bei 28°C (auf ISP-Medium Nr. 2, 5 Tage). Der Stamm wächst nicht bei 4° und 45°C. Melanin wird nicht gebildet. Das Wachstum wird durch die Antibiotika Erythromycin (10 σg), Sulphafurazol (100 µg), Streptomycin (10 σg) und Novobiocin (5 µg) gehemmt (ISP-Medium Nr. 2, 28°C, 2 Tage).The temperature optimum is 28 ° C (on ISP medium No. 2.5 days). The trunk does not grow at 4 ° and 45 ° C. Melanin is not produced. The growth is inhibited by the antibiotics erythromycin (10 σ g), sulphafurazole (100 µg), streptomycin (10 σ g) and novobiocin (5 µg) (ISP medium No. 2, 28 ° C, 2 days).

Die Verwertung von C-Quellen wurde auf Basalagar (ISP-Medium Nr. 9) nach Int. Syst. Bact. 16, 313-340 (1966) überprüft. Für die Negativ-Kontrolle wurde das Wachstum auf Basalagar ohne C-Quelle verglichen. Dabei werden folgende Ergebnisse erhalten:
C-Quelle (10 g/l)Wachstum*)
The utilization of C sources was carried out on basal agar (ISP medium No. 9) according to Int. Syst. Bact. 16, 313-340 (1966). For the negative control, the growth on basal agar without a C source was compared. The following results are obtained:
C source (10 g / l) growth *)

Kontrolle (keine C-Quelle)- D-Glucose+ L-Arabinose+ L-Rhamnose+ D-Fructose+ L-Galactose+ Raffinose+ D-Mannit+ meso-Inosit+ Salicin+ Saccharose+ Ribose+ Mannose+ Maltose+ Mellibiose+ Cellulose- Acetat-Control (no C source) - D-glucose + L-arabinose + L-rhamnose + D-fructose + L-galactose + Raffinose + D-Mannitol + meso-inositol + Salicin + Sucrose + Ribose + Mannose + Maltose + Mellibiosis + Cellulose Acetate-

*) + = Wachstum, - = kein Wachstum. *) + = Growth, - = no growth.  

3. Besonders geeignetes Medium für Wachstum und Sporulation3. Particularly suitable medium for growth and Sporulation ISP 3 (Hafermehl-Agar)ISP 3 (oatmeal agar)

20 g Hafermehl werden in 1000 ml H2O deion. suspendiert und 20 Minuten gekocht. Anschließend wird filtriert, 1 ml Spurenelementlösung für ISP 3 und 18 g Agar zugegeben, und der pH-Wert auf 7,2 eingestellt, und bei 121°C 15-20 Minuten autoklaviert.20 g of oatmeal are in 1000 ml of H 2 O deion. suspended and boiled for 20 minutes. It is then filtered, 1 ml of trace element solution for ISP 3 and 18 g of agar are added, the pH is adjusted to 7.2 and autoclaved at 121 ° C. for 15-20 minutes.

Spurenelementlösung für ISP 3Trace element solution for ISP 3

FeSO4 · 7 H2O  0,1 g MnCl2 · 4 H2O  0,1 g ZnSO4 · 7 H2O  0,1 g H2O deion.100 mlFeSO 4 · 7 H 2 O 0.1 g MnCl 2 · 4 H 2 O 0.1 g ZnSO 4 · 7 H 2 O 0.1 g H 2 O deion. 100 ml

Weitere Medien s. Int. J. Syst. Bact. 16, 313-340 (1966).Further media see Int. J. Syst. Bact. 16, 313-340 (1966).

Der Stamm BS 1261, isoliert aus einer Erdprobe aus Neuseeland, läßt sich aufgrund der morphologischen Daten in die graue Serie der Streptomyceten (Cinereus-Gruppe) einordnen. The strain BS 1261 isolated from an earth sample New Zealand, based on the morphological data in the gray series of Streptomycetes (Cinereus group) classify.  

Taxonomische Bezeichnung: Streptomyces sp.Taxonomic name: Streptomyces sp.

Efomycin G wird erfindungsgemäß durch die Fermentation geeigneter Mikroorganismen, wie dem Streptomycetenstamm BS 1261 oder dessen Mutanten oder Varianten erzeugt.According to the invention, efomycin G is produced by fermentation suitable microorganisms, such as the Streptomycetes strain BS 1261 or its mutants or variants generated.

Das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren kann mit Hilfe fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig-flüssige Nährmedien verwendet.The fermentation process according to the invention can with Help with solid, semi-solid or liquid nutrient media be performed. Aqueous-liquid are preferred Culture media used.

Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt nach allgemein üblichen Methoden, z. B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.The inoculation of the nutrient media is carried out generally usual methods, e.g. B. over inclined tubes or Piston cultures.

Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung im aeroben Submersverfahren in belüfteten Fermentern, z. B. in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.The culture takes place under aerobic conditions and can according to the commonly used methods such as using of shake cultures or of submerged cultures be performed. Cultivation is preferred in the aerobic submerged process in aerated fermenters, e.g. B. in conventional submerged fermentation tanks. It is possible, the fermentation continuously or discontinuously perform. It is preferably discontinuous worked.

Die Kultur wird in Nährmedien durchgeführt, welche bekannterweise zur Kultivierung von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales verwendet werden. Das Nährmedium muß eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, wobei diese Produkte in Form von definierten Einzelbestandteilen, aber auch in Form von komplexen Gemischen, wie sie insbesondere biologische Produkte verschiedenen Ursprungs darstellen, vorliegen können. Als Kohlenstoffquellen kommen alle üblichen Kohlenstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie Stärke oder Dextrine, Disaccharide, wie Maltose oder Lactose, Monosaccharide, wie Glucose oder Xylose, Alkohole, wie Mannit oder Glycerin sowie natürlich vorkommende Gemische, wie Malzextrakt, Melasse oder Molkepulver genannt. Als Stickstoffquellen kommen alle üblichen organischen und anorganischen Stickstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Eiweißstoffe, Eiweißhydrolysate, Aminosäuren, Nucleosidbasen, wie Cytosin oder Uracil sowie Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, lösliche und unlösliche pflanzliche Proteine, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Peptone und Fleischextrakt, stickstoffhaltige Salze wie z. B. Ammoniumsalze und Nitrate, aufgeführt. Die Mineralsalze, welche im Nährmedium enthalten sein sollten, liefern z. B. folgende Ionen:The culture is carried out in nutrient media, which known for the cultivation of microorganisms Order Actinomycetales can be used. The nutrient medium  must have one or more assimilable carbon sources and contain nitrogen sources and mineral salts, these products being in the form of defined Individual components, but also in the form of complex ones Mixtures, such as those of biological products represent different origins. All common carbon sources come as carbon sources in question. For example, carbohydrates in particular polysaccharides, such as starch or dextrins, Disaccharides, such as maltose or lactose, monosaccharides, such as glucose or xylose, alcohols such as mannitol or Glycerin as well as naturally occurring mixtures, such as Malt extract, molasses or whey powder called. As Nitrogen sources come in all the usual organic and inorganic Nitrogen sources in question. For example be protein substances, protein hydrolyzates, amino acids, Nucleoside bases such as cytosine or uracil as well Soybean meal, cottonseed meal, lentil meal, pea meal, soluble and insoluble vegetable proteins, corn steep liquor, Yeast extract, peptones and meat extract, nitrogen-containing salts such as B. ammonium salts and Nitrates. The mineral salts, which in the Nutrient medium should be included, z. B. following Ions:

Mg++, Na⁺, K⁺, Ca++, NH4⁺,
Cl-, SO4 --, PO4 --- und NO3 -
Mg ++ , Na⁺, K⁺, Ca ++ , NH 4 ⁺,
Cl - , SO 4 - , PO 4 --- and NO 3 -

sowie Ionen der üblichen Spurenelemente, wie Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, CO, Ni. Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bzw. das verwendete Wasser nicht ausreichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthalten, ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen. Die Zusammensetzung der Nährmedien kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammensetzung der Nährmedien werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils besonders günstig zur Verfügung stehen. Im allgemeinen enthalten die Nährlösungen vorzugsweise etwa 0,5 bis 8%, insbesondere 0,6 bis 6% Kohlenstoffquellen, vorzugsweise etwa 0,5 bis 4%, insbesondere 0,5 bis 2% Stickstoffquellen und vorzugsweise etwa 0,001 bis 0,5%, insbesondere 0,003 bis 0,3% Mineralsalze.and ions of the usual trace elements, such as Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, CO, Ni. If the carbon or nitrogen sources or the water used is insufficient  contain these salts or trace elements, it is advisable supplement the nutrient medium accordingly. The Composition of the nutrient media can vary widely can be varied. Type and composition of the nutrient media will generally depend on which Components are available particularly cheaply. In general, the nutrient solutions preferably contain about 0.5 to 8%, in particular 0.6 to 6% Carbon sources, preferably about 0.5 to 4%, especially 0.5 to 2% nitrogen sources and preferably about 0.001 to 0.5%, especially 0.003 to 0.3% mineral salts.

Bei der Durchführung des Verfahrens kann es günstig sein, zu Beginn der Kultivierung nur relativ geringe Konzentrationen der löslichen Nährlösungsbestandteile zu verwenden und dann im Laufe der ersten 3 Kultivierungstage durch häufigere Zusätze diese Bestandteile in Form steriler, relativ konzentrierter Lösungen dem Kulturansatz fraktioniert zuzufüttern.When performing the procedure it can be convenient be relatively small at the beginning of cultivation Concentrations of soluble nutrient components to use and then during the first 3 days of cultivation through more frequent additions to these ingredients in the form of sterile, relatively concentrated solutions Feed the culture approach fractionally.

Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa 5 und etwa 10, insbesondere zwischen 6,5 und 8,0 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereichen kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO3 vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säuren, z. B. H2SO4, oder sterile Laugen, z. B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt werden.The pH of the growing cultures should preferably be kept between about 5 and about 10, in particular between 6.5 and 8.0. An excessive drop in pH in the acidic areas can be avoided by adding an organic or inorganic base, preferably CaCO 3 . As usual in fermentation technology, an automatic pH control can also be carried out in which sterile organic or inorganic acids, e.g. B. H 2 SO 4 , or sterile bases, e.g. B. NaOH are injected into the culture solution at intervals.

Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.It is advisable to ensure that the microorganisms sufficient with oxygen and the nutrients in Be brought in contact. This can be done according to the general usual methods such as shaking and stirring.

Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa 24°C und etwa 34°C, vorzugsweise zwischen 26°C und 32°C liegen, besonders bevorzugt liegt sie bei etwa 28°C. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z. B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.The cultivation temperature can be between about 24 ° C and about 34 ° C, preferably between 26 ° C and 32 ° C, it is particularly preferably about 28 ° C. The duration the breeding can be varied widely, z. B. the Composition of the nutrient medium and the breeding temperature play a role. The respective optimal Conditions can be determined by any specialist on the microbiological area can be easily set.

Es hat sich herausgestellt, daß die Menge der sich in der Kulturbrühe anreichernden erfindungsgemäßen Verbindung im allgemeinen ihr Maximum etwa 1 bis 10, vorzugsweise etwa 4 bis 7 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht. Das gewünschte Endprodukt der Fermentation kann mit Hilfe von dünnschichtchromatographischen und hochdruckflüssigkeitschromatographischen Untersuchungen oder biologischen Testverfahren bestimmt werden.It has been found that the amount of in the culture broth enriching the invention Compound generally their maximum about 1 to 10, preferably about 4 to 7 days after the start of breeding reached. The desired end product of the fermentation can be done using thin layer chromatography and high pressure liquid chromatographic investigations or biological test methods can be determined.

Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren üblich sollten Fremdinfektionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation der Nährmedien, Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen können z. B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation verwendet werden, wobei die Temperaturen vorzugsweise bei 100 bis 140°C, insbesondere bei 120 bis 130°C liegen können.As is common in microbiological processes foreign infections of the culture media should be avoided will. To do this, take the usual precautions taken, such as sterilization of the culture media, culture vessels  as well as the air required for ventilation. To Sterilization of the devices can e.g. B. the steam as well as dry sterilization can be used the temperatures preferably at 100 to 140 ° C, can be in particular at 120 to 130 ° C.

Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z. B. flüssige Fette und Öle, wie Öl- Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octadecanol, Siliconöle, Polyoxyethylen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen (z. B. in Mengen bis etwa 1%) zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z. B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.If foam in the undesirable amount during the cultivation arises, the usual chemical Anti-foaming agents, e.g. B. liquid fats and oils, such as oil Water emulsions, paraffins, higher alcohols, such as Octadecanol, silicone oils, polyoxyethylene or Polyoxypropylene compounds (e.g. in amounts up to about 1%) be added. Foam can also be made using the usual mechanical devices (e.g. centrifugal forces use) are dampened or eliminated.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen Methoden isoliert werden. Die Isolierung kann z. B. gemäß den üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren erfolgen. Die isolierten Stoffe können mit Hilfe der genannten Methoden auch feingereinigt werden. Für viele Fälle ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da gegebenenfalls vorhandene geringfügige Verunreinigungen die Wirksamkeit der Verbindungen nicht nachteilig beeinflussen. Bei allen Isolierungs- und Reinigungsoperationen ist darauf zu achten, daß die pH-Werte im neutralen Bereich liegen. Vorzugsweise werden pH-Werte zwischen 7 und 8 eingehalten. Zur Einstellung des pH-Wertes können anorganische und organische Basen verwendet werden, wie Alkalibasen z. B. NaOH, KOH oder organische Amine, wie Triethylamin; anorganische Säuren wie z. B. HCl und organische Säuren wie z. B. Essigsäure.The compound according to the invention can be obtained from the culture medium according to common physical-chemical Methods are isolated. The insulation can e.g. B. according the usual extraction processes, precipitation processes and / or chromatography processes. The Isolated substances can be made using the methods mentioned can also be cleaned. For many cases, however a fine cleaning is not necessary, because if necessary existing minor impurities the effectiveness not adversely affect the connections. At all Isolation and cleaning operations are approaching make sure that the pH values are in the neutral range. PH values between 7 and 8 are preferably maintained. Inorganic ones can be used to adjust the pH  and organic bases are used, such as Alkali bases e.g. B. NaOH, KOH or organic amines, such as Triethylamine; inorganic acids such as B. HCl and organic acids such as B. acetic acid.

Um bei den oben angegebenen Isolierungs- und Reinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung in höchster Konzentration bzw. Reinheit vorliegen, können die üblichen physikalisch- chemischen Methoden z. B. Messen einer charakteristischen Bande im Spektrum oder der Rf-Werte, Bestimmung der antibakteriellen Aktivität usw. herangezogen werden. Diese Methoden können auch verwendet werden, um in Routineverfahren für die Produktion von Efomycin G geeignete Mikroorganismen aufzufinden.In order to find out the fractions in the above-mentioned isolation and cleaning methods in which the compound according to the invention is present in the highest concentration or purity, the usual physico-chemical methods can be used, for. B. measurement of a characteristic band in the spectrum or the R f values, determination of the antibacterial activity, etc. are used. These methods can also be used to find suitable microorganisms in routine procedures for the production of efomycin G.

Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindung kann z. B. im Falle, daß ein flüssiges wäßriges Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden:The isolation and cleaning of the invention Connection can e.g. B. in the event that a liquid aqueous Culture medium is used as follows will:

Da Efomycin G sowohl im Kulturüberstand als auch im Myzel zu finden ist, kann es mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren aus dem Fermentationsansatz isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchgeführt werden. Mit gutem Erfolg läßt sich auch die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) einsetzen. Als Adsorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z. B. Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, z. B. acetyliertes Polyamid, Dextrangele oder modifizierte Dextrangele. Als Laufmittel können die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch verwendet werden, in welchen die erfindungsgemäßen Verbindungen löslich sind. Bevorzugt werden Essigsäureethylester, Chloroform und Methanol oder ihre Gemische (beispielsweise Gemische aus Chloroform und Methanol oder aus Essigsäureethylester und Chloroform) eingesetzt.Since efomycin G is present in both the culture supernatant and the To find mycelium, it can be done with the help of usual Extraction process, precipitation process and / or Chromatography process isolated from the fermentation batch and cleaned if necessary. Chromatography can be carried out in the form of column chromatography will. With good success, too Use high pressure liquid chromatography (HPLC). As Adsorbents can be the usual inorganic or  organic adsorbents are used, such as e.g. B. silica gel, magnesium silicate, activated carbon, cellulose, Cellulose derivatives, synthetic resins such as polyamides, e.g. B. acetylated polyamide, dextran gels or modified Dextran gels. A wide variety of solvents can be used Solvent or solvent mixture used in which the compounds of the invention are soluble. Preferred are ethyl acetate, Chloroform and methanol or their mixtures (e.g. mixtures of chloroform and methanol or from ethyl acetate and chloroform) used.

Bevorzugt werden zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen Chromatographie-Verfahren verwendet, z. B. unspezifische Adsorption an Sorbentien wie Kieselgel oder andererseits Geldiffusionschromatographie. Dies sind die von der Reinigung schlecht wasserlöslicher Naturstoffe her bekannten Methoden.Are preferred for the isolation of the invention Compounds chromatography method used, e.g. B. non-specific adsorption on sorbents such as silica gel or on the other hand gel diffusion chromatography. This are less water-soluble from cleaning Natural products known methods.

Aus ihren Lösungen kann die erfindungsgemäße Verbindung nach den üblichen Methoden, z. B. Verdampfen des Lösungsmittels, Gefriertrocknung usw. erhalten werden.The solutions according to the invention can be obtained from their solutions Connection by the usual methods, e.g. B. Evaporation of the solvent, freeze drying, etc. obtained will.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Mycelium aus der Kulturbrühe, vorzugsweise durch Zentrifugation abgetrennt und mit einem, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel mehrfach, vorzugsweise zweimal extrahiert. Als Lösungsmittel können (C1-C4)-Alkylalkohole, C1-4-Ketone, besonders bevorzugt Aceton verwendet werden. Die wäßrig- organische Lösung wird im Vakuum, z. B. etwa auf ½₀ des Volumens der Kulturbrühe konzentriert und gefriergetrocknet.In a preferred embodiment, the mycelium is separated from the culture broth, preferably by centrifugation, and extracted several times, preferably twice, with a water-miscible solvent. (C 1 -C 4 ) -Alkyl alcohols, C 1 - 4 ketones, particularly preferably acetone, can be used as solvents. The aqueous-organic solution is in vacuo, for. B. concentrated to about ½₀ of the volume of the culture broth and freeze-dried.

Dieses Rohpräparat wird in Wasser suspendiert und die Efomycin G mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Chlorkohlenwasserstoffe wie Chloroform, Ester der Essigsäure oder Ketone extrahiert. Aus diesem Extrakt kann Efomycin G durch übliche chromatographische Methoden, vorzugsweise Chromatographie an Kieselgel, isoliert werden.This raw preparation is suspended in water and the Efomycin G with a water-immiscible Solvents such as B. chlorinated hydrocarbons such as Chloroform, esters of acetic acid or ketones extracted. From this extract, efomycin G can be made through usual chromatographic methods, preferably chromatography on silica gel.

Efomycin G kann auch aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wie z B. Essigester, Methylenchlorid oder Chloroform extrahiert werden.Efomycin G can also pass through from the culture filtrate Extraction with a water-immiscible Solvents such as ethyl acetate, methylene chloride or Chloroform can be extracted.

Es kann außerdem an unspezifische Adsorberharze auf Polystyrolbasis (z. B. Amberlite XAD der Firma Roehm u. Haas oder Lewatit OC 1031 der Firma Bayer) gebunden werden. Die Desorption wird fraktioniert, durch Mischungen aus Wasser und organischen Lösungsmitteln, insbesondere Wasser/Methanol vorgenommen. Die durch Test gegen Staphylococcus aureus 1756 ermittelten aktiven Fraktionen werden unter reduziertem Druck bis zur vollständigen Entfernung des organischen Lösungsmittels bei 30-35°C konzentriert und der Rückstand in ca. ¹/₁₀₀ des Volumens des Kulturfiltrates suspendiert und gefriergetrocknet. It can also affect unspecific adsorber resins Polystyrene base (e.g. Amberlite XAD from the company Roehm u. Haas or Lewatit OC 1031 from Bayer) be bound. The desorption is fractionated by Mixtures of water and organic solvents, especially water / methanol. The through test active against Staphylococcus aureus 1756 Fractions are made under reduced pressure up to complete removal of the organic solvent 30-35 ° C concentrated and the residue in about ¹ / ₁₀₀ of the volume of the culture filtrate suspended and freeze-dried.  

Das Lyophilisat wird erneut in Wasser suspendiert und vorzugsweise mit Essigsäureethylester oder anderen nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln extrahiert. Aus dem Extrakt wird Efomycin G durch übliche chromatographische Methoden, vorzugsweise Chromatographie an Kieselgel, gewonnen.The lyophilisate is resuspended in water and preferably not with ethyl acetate or others extracted with water-miscible solvents. From the Efomycin G is extracted by conventional chromatographic Methods, preferably chromatography on silica gel, won.

Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt eine gute antibakterielle Wirkung vor allem gegen grampositive Keime. Besonders erwähnt werden soll ihre Eignung zur Verhinderung und Heilung der Schweinedysenterie.The connection according to the invention shows a good one antibacterial effect especially against gram-positive germs. Their suitability for prevention should be mentioned in particular and healing of swine dysentery.

Der Wirkstoff wird als Leistungsförderer bei Tieren zur Förderung und Beschleunigung des Wachstums, der Milch- und Wollproduktion, sowie zur Verbesserung der Futterverwertung, der Fleischqualität und zur Verschiebung des Fleisch-Fett-Verhältnisses zugunsten von Fleisch eingesetzt. Der Wirkstoff wird bei Nutz-, Zucht-, Zier- und Hobbytieren verwendet.The active ingredient is used as a performance enhancer in animals to promote and accelerate the growth of Milk and wool production, and to improve Feed utilization, meat quality and Shift in meat-fat ratio in favor of Meat used. The active ingredient is used in Breeding, ornamental and hobby animals used.

Zu den Nutz- und Zuchttieren zählen Säugetiere wie z. B. Rinder, Schweine, Pferde, Schafe, Ziegen, Kaninchen, Hasen, Damwild, Pelztiere wie Nerze, Chinchilla, Geflügel wie z. B. Hühner, Gänse, Enten, Puten, Tauben, Fische wie z. B. Karpfen, Forellen, Lachse, Aale, Schleie, Hechte, Reptilien wie z. B. Schlangen und Krokodile. The livestock and breeding animals include mammals such as B. Cattle, pigs, horses, sheep, goats, rabbits, Rabbits, fallow deer, fur animals such as mink, chinchilla, poultry such as B. chickens, geese, ducks, turkeys, pigeons, fish like e.g. B. carp, trout, salmon, eels, tench, pike, Reptiles such as B. snakes and crocodiles.  

Zu den Zier- und Hobbytieren zählen Säuretiere wie Hunde und Katzen, Vögel wie Papageien, Kanarienvögel, Fische wie Zier- und Aquarienfische z. B. Goldfische.Ornamental and hobby animals include acidic animals such as dogs and cats, birds like parrots, canaries, fish like Ornamental and aquarium fish e.g. B. Goldfish.

Der Wirkstoff wird unabhängig vom Geschlecht der Tiere während allen Leistungsphasen der Tiere eingesetzt. Bevorzugt wird der Wirkstoff während der intensiven Leistungsphase eingesetzt. Die intensive Leistungsphase dauert je nach Tierart von einem Monat bis zu 10 Jahren.The active ingredient is independent of the sex of the animals used during all performance phases of the animals. The active ingredient is preferred during the intensive Service phase used. The intense The performance phase lasts one month depending on the animal species up to 10 years.

Die Menge des Wirkstoffes, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften des Wirkstoffes weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0,001 bis 500 mg/kg insbesondere 0,01 bis 5 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die passende Menge des Wirkstoffs sowie die passende Dauer der Verabreichung hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, der Leistungsphase, dem Gesundheitszustand und der Art der Haltung und Fütterung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.The amount of active ingredient that the animals achieve the desired effect is administered, because of the favorable properties of the active ingredient largely varied will. It is preferably about 0.001 to 500 mg / kg in particular 0.01 to 5 mg / kg body weight per Day. The right amount of the active ingredient and the right one Duration of administration depend in particular on the type the age, the gender, the performance phase, the State of health and the way of keeping and feeding the Animals from and are easily closed by any specialist determine.

Der Wirkstoff wird den Tieren nach den üblichen Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art, dem Verhalten und dem Gesundheitszustand der Tiere ab.The active ingredient is used in animals according to the usual methods administered. The mode of administration depends in particular on the nature, behavior and health of the Animals off.

Der Wirkstoff kann einmalig verabreicht werden. Der Wirkstoff kann aber auch während der ganzen oder während eines Teils der Leistungsphase temporär oder kontinuierlich verabreicht werden. The active substance can be administered once. The Active ingredient can also be used throughout or during part of the service phase temporarily or continuously be administered.  

Bei kontinuierlicher Verabreichung kann die Anwendung ein- oder mehrmals täglich in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen erfolgen.With continuous administration, the application can or several times a day in regular or irregular Intervals.

Die Verabreichung erfolgt oral in dafür geeigneten Formulierungen oder in reiner Form.It is administered orally in suitable formulations or in pure form.

Der Wirkstoff kann in den Formulierungen allein oder in Mischung mit anderen leistungsfördernden Wirkstoffen, Vitaminen, Nicht-Protein-Verbindungen, Farbstoffen, Antioxidantien, Aromastoffen, Emulgatoren, Fließhilfsstoffen, Konservierungs- und Preßhilfsstoffen vorliegen.The active ingredient can be used alone or in the formulations in a mixture with other performance-enhancing active ingredients, Vitamins, non-protein compounds, dyes, Antioxidants, flavors, emulsifiers, flow aids, Preservatives and pressing aids are available.

Andere leistungsfördernde Wirkstoffe sind: z. B. Antibiotika wie Tylosin, Virginiamycin und Monensin. Mineralische Futtermittel sind z. B. Dicalciumphosphat, Magnesiumoxid, Natriumchlorid.Other performance-enhancing active ingredients are: e.g. B. antibiotics such as tylosin, virginiamycin and Monensin. Mineral feeds are e.g. B. Dicalcium phosphate, magnesium oxide, sodium chloride.

Spurenelement-Verbindungen sind z. B. Eisenfumarat, Natriumjodid, Kobaltchlorid, Kupfersulfat, Zinkoxid.
Vitamine sind z. B. Vitamin A, Vitamin D3, Vitamin E, B-Vitamine, Vitamin C.
Nicht-Protein-Verbindungen sind z. B. Biuret, Harnstoff,
Farbstoffe sind z. B. Carotinoide wie Citranaxanthin, Zeaxanthin, Capsanthin.
Antioxidantien sind z. B. Aethoxyquin, Butylhydroxy- Toluol.
Aromastoffe sind z. B. Vanillin.
Emulgatoren sind z. B. Ester der Milchsäure, Lecithin,
Fließhilfsstoffe sind z. B. Natriumstearat, Calciumstearat.
Konservierungsstoffe sind z. B. Zitronensäure, Propionsäure.
Preßhilfsstoffe sind z. B. Ligninsulfonate, Celluloseether.
Trace element compounds are e.g. B. iron fumarate, sodium iodide, cobalt chloride, copper sulfate, zinc oxide.
Vitamins are e.g. B. Vitamin A, Vitamin D 3 , Vitamin E, B Vitamins, Vitamin C.
Non-protein compounds are e.g. B. biuret, urea,
Dyes are e.g. B. carotenoids such as citranaxanthin, zeaxanthin, capsanthin.
Antioxidants are e.g. B. ethoxyquin, butylhydroxy-toluene.
Flavorings are e.g. B. Vanillin.
Emulsifiers are e.g. B. esters of lactic acid, lecithin,
Flow aids are e.g. B. sodium stearate, calcium stearate.
Preservatives are e.g. B. citric acid, propionic acid.
Pressing aids are e.g. B. lignin sulfonates, cellulose ethers.

Die Verabreichung der Wirkstoffe kann auch zusammen mit dem Futter und/oder dem Trinkwasser erfolgen.The active ingredients can also be administered together with the feed and / or the drinking water.

Zum Futter zählen Einzelfuttermittel pflanzlicher Herkunft wie Heu, Rüben, Getreidenebenprodukte, Einzelfuttermittel tierischer Herkunft wie Fleisch, Fette, Milchprodukte, Knochenmehl, Fischprodukte, die Einzelfuttermittel wie Vitamine, Proteine, Aminosäure z. B. DL-Methionin, Salze wie Kalk und Kochsalz. Zum Futter zählen auch Ergänzungs-, Fertig- und Mischfuttermittel. Diese enthalten Einzelfuttermittel in einer Zusammensetzung die eine ausgewogene Ernährung hinsichtlich der Energie- und Proteinversorgung sowie der Versorgung mit Vitaminen, Mineralsalzen und Spurenelementen sicherstellen.Feed includes plant-based feed Origin such as hay, beets, grain by-products, feed materials of animal origin such as meat, fats, dairy products, Bone meal, fish products, feed materials such as vitamins, proteins, amino acid z. B. DL-methionine, Salts like lime and table salt. Food also counts Complementary, finished and compound feed. These contain Single feed in a composition one balanced nutrition with regard to energy and protein supply as well as the supply of vitamins, mineral salts and ensure trace elements.

Die Konzentration des Wirkstoffs im Futter beträgt normalerweise etwa 0,01-500 ppm, bevorzugt 0,1-50 ppm.The concentration of the active ingredient in the feed is normally about 0.01-500 ppm, preferably 0.1-50 ppm.

Der Wirkstoff kann als solcher oder in Form von Prämixen oder Futterkonzentraten dem Futter zugesetzt werden.The active ingredient can be used as such or in the form of premixes or feed concentrates are added to the feed.

Beispiel für die Zusammensetzung eines Futters für Rinder, das den erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält:Example of the composition of a feed for cattle, which contains the active ingredient according to the invention:

69,95% Futtergetreideschrot, 10% gemahlene Maiskolben, 8% Sojabohnenmehl, 5% Alfalfameh, 5% Melasse, 0,6% Harnstoff, 0,5% Calciumphosphat, 0,5% Calciumcarbonat, 0,3% Kochsalz, 0,07% Vitamin A und D2-Prämix, 0,05% Vitamin E-Prämix, und 0,03% Spurenelement-Prämix.69.95% feed grain meal, 10% ground corn on the cob, 8% soybean meal, 5% alfalfameh, 5% molasses, 0.6% urea, 0.5% calcium phosphate, 0.5% calcium carbonate, 0.3% table salt, 0.07 % Vitamin A and D 2 premix, 0.05% vitamin E premix, and 0.03% trace element premix.

Zu dieser Mischung wird Wirkstoff Prämix, der 1-800 g Wirkstoff pro kg enthält, zugegeben.Active ingredient premix, the 1-800 g Contains active ingredient per kg added.

Es ist nicht unbedingt erforderlich, gereinigtes und isoliertes Efomycin G zu verwenden. Es ist auch möglich, das bei seiner Herstellung anfallende Gemisch oder sogar die anfallende Kulturbrühe oder das Mycelium ohne Reinigung, gegebenenfalls nach Trocknung, einzusetzen. Für viele Zwecke ist es auch ausreichend, Rohformen des erfindungsgemäßen Wirkstoffs und seiner Gemische ohne vorherige Feinreinigung einzusetzen.It is not absolutely necessary to have cleaned and to use isolated efomycin G. It is also possible, the mixture obtained in its manufacture or even the resulting culture broth or the mycelium without cleaning, if necessary after drying. For many purposes, it is also sufficient Raw forms of the active ingredient according to the invention and its Use mixtures without prior fine cleaning.

Die Herstellung und biologische Wirkung der neuen erfindungsgemäßen Verbindung kann durch die folgenden Beispiele erläutert werden:The production and biological effects of the new The compound of the invention can be obtained by the following Examples are explained:

Beispiel 1Example 1 Herstellung des InoculumsProduction of the inoculum

Zellen von Streptomyces sp. BS 1261 (DSM 3200) wurden aus einem Schrägröhrchen in 1000 ml Erlenmeyer-Kolben übertragen, die je 150 ml folgender steriler Nährlösung enthielten:Streptomyces sp. BS 1261 (DSM 3200) from a slant tube in 1000 ml Erlenmeyer flasks transferred, each 150 ml of the following sterile nutrient solution contained:

CASO® der Firma Merck, Darmstadt, der Zusammensetzung:CASO® from Merck, Darmstadt, the composition:

Pepton aus Casein15 g Pepton aus Sojamehl5 g Glucose2,5 g NaCl5 g Wasserad 1000 mlPeptone from casein 15 g Soy flour peptone 5 g Glucose 2.5 g NaCl5 g Water spout 1000 ml

Die Kolben wurden 3 Tage bei 28°C mit 250 Kpm auf der rotierenden Süttelmaschine inkubiert. 2 Kolben der resultierenden Kultur wurden vereinigt und dienten als Inoculum für einen 30 l Fermenter, der 20 l obiger, steriler Nährlösung, versetzt mit 20 ml SAG 5693 (Union Carbide), enthielt.The flasks were at 250 Kpm at 28 ° C for 3 days incubating machine. 2 pistons of resulting culture were combined and served as Inoculum for a 30 l fermenter, the 20 l above, sterile nutrient solution, mixed with 20 ml SAG 5693 (Union Carbides).

Die Fermentation wurde bei 28°C mit einer Belüftungsrate von 10 l/min (0,5 VVM) Luft und einem Überlagerungsdruck von 0,5 bar durchgeführt. Die Drehzahl des Blattrührers betrug 300 Upm. Nach 48 Stunden diente die so gewonnene Kultur als Inoculum für die Tankfermentation. The fermentation was at 28 ° C with an aeration rate of 10 l / min (0.5 VVM) air and a superimposition pressure of 0.5 bar. The speed of the blade stirrer was 300 rpm. After 48 hours, the so obtained served Culture as an inoculum for tank fermentation.  

Beispiel 2Example 2 TankfermentationTank fermentation

Mit 20 Litern des nach Beispiel 1 hergestellten Inoculums wurde ein 300 l Kessel beimpft, der 200 l steriles Nährmedium folgender Zusammensetzung enthielt:With 20 liters of the inoculum prepared according to Example 1 a 300 l kettle was inoculated, the 200 l sterile The nutrient medium contained the following composition:

Magermilchpulver10 g Hefeautolysat1,5 g Dextrin40 g D-Glucose5 g SAG 5693 (Union Carbide)1 ml Wasserad 1000 mlSkimmed milk powder 10 g Yeast autolysate 1.5 g Dextrin 40 g D-glucose 5 g SAG 5693 (Union Carbide) 1 ml Water spout 1000 ml

Der pH-Wert des Mediums lag nach Sterilisation bei 6,6. Die Fermentation wurde bei 28°C mit einer Drehzahl des Blattrührers von 100 Upm, einer Belüftungsrate von 100 l/min (0,5 VVM) Luft und einem Überlagerungsdruck von 1,0 bar durchgeführt, bis nach 3-5 Tagen Efomycin G nachgewiesen werden konnte. The pH of the medium after sterilization was 6.6. The fermentation was at 28 ° C at a speed of Blade stirrer of 100 rpm, an aeration rate of 100 l / min (0.5 VVM) air and a superimposed pressure of 1.0 bar carried out until after 3-5 days efomycin G could be demonstrated.  

Beispiel 3Example 3

Die gemäß Beispiel 2 erhaltene Kulturbrühe einer 200-Liter- Fermentation wird bei pH 7-7,5 mit 200-250 l/h in einem Westfalia-Separator separiert. Das Mycel wird mit dem doppelten Volumen Aceton 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert. Der Rückstand wird erneut mit dem doppelten Volumen Aceton gerührt und zentrifugiert. Die vereinigten Zentrifugate werden mit reduziertem Druck bei 40°C Badtemperatur konzentriert. Das Konzentrat wird mit 10 Liter Wasser versetzt und dreimal mit je 10 Liter Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen trocknete man über Natriumsulfat, filtrierte und engte unter reduziertem Druck bei max. 40° Badtemperatur auf 3 Liter ein. Das Konzentrat ließ man in ca. 30 Liter Leichtbenzin unter Rühren einfließen. Der Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum bei 40°C getrocknet. Ausbeute: 61 g gelbliches Pulver.The culture broth obtained according to Example 2 of a 200 liter Fermentation is carried out at pH 7-7.5 with 200-250 l / h separated by a Westfalia separator. The mycelium comes with double the volume of acetone for 30 minutes at room temperature stirred and centrifuged. The backlog will reappear stirred with twice the volume of acetone and centrifuged. The combined centrifugates are reduced Pressure concentrated at 40 ° C bath temperature. The The concentrate is mixed with 10 liters of water and three times extracted with 10 liters of dichloromethane each. The United organic phases were dried over sodium sulfate, filtered and constricted under reduced pressure at max. 40 ° bath temperature to 3 liters. The concentrate dropped one in about 30 liters of light petrol with stirring. The precipitate was filtered off and in vacuo dried at 40 ° C. Yield: 61 g of yellowish powder.

Beispiel 4Example 4

Efomycin G isolierte man aus dem nach Beispiel 3 gewonnenen Rohprodukt durch präparierte Flüssigchromatografie.Efomycin G was isolated from that obtained according to Example 3 Crude product through prepared liquid chromatography.

Parameter:Parameter:

Fließmittel A:
5 mM Citronensäure : Acetonitril = 6 : 4
Fließmittel B:
5 mM Citronensäure : Acetonitril = 4 : 6
Gradient:
nach 3 Minuten isokratischem Lauf mit Fließmittel A : B = 4 : 1 linearer Gradient in 1 von A : B = 4 : 1 auf A : B = 1 : 9
Superplasticizer A:
5 mM citric acid: acetonitrile = 6: 4
Superplasticizer B:
5 mM citric acid: acetonitrile = 4: 6
Gradient:
after 3 minutes of isocratic run with solvent A: B = 4: 1 linear gradient in 1 from A: B = 4: 1 to A: B = 1: 9

Fließrate:20 ml/min Detektion:UV 254 nm Säule:21,6 × 250 mm stationäre Phase:Zorbax® C8 8 µm
(DuPont)
Flow rate: 20 ml / min Detection: UV 254 nm Column: 21.6 × 250 mm stationary phase: Zorbax® C8 8 µm
(DuPont)

Pro Trennung wurden ca. 30 mg des nach Beispiel 3 gewonnenen Rohproduktes gelöst in je 2 ml Tetrahydrofuran/Wasser = 2/1 eingesetzt. Das Säulenelnat wurde fraktioniert aufgefangen und einer analytischen Hochdruckflüssigchromatographie gemäß folgender Parameter unterworfen.Approx. 30 mg of that according to Example 3 obtained crude product dissolved in 2 ml each Tetrahydrofuran / water = 2/1 used. The Pillar Senate was collected fractionally and an analytical High pressure liquid chromatography according to the following Subject to parameters.

Fließmittel A:5 mM Citronensäure
0,1 M CaClO4 Fließmittel B:Acetonitril Gradient:linear 52-75% B
in 18 Minuten Fließrate:1,5 ml/Min. Detektion:UV 254 nm Stationäre Phase:Nucleosil® 10C18 Säule:4,6 × 250 ml
Solvent A: 5 mM citric acid
0.1 M CaClO 4 eluent B: acetonitrile gradient: linear 52-75% B
in 18 minutes flow rate: 1.5 ml / min. Detection: UV 254 nm Stationary phase: Nucleosil® 10C18 column: 4.6 × 250 ml

Fraktionen, die reines Efomycin G enthielten, wurden vereinigt und unter reduziertem Druck bei 40°C Badtemperatur auf ¹/₃ des Anfangsvolumens eingeengt. Das als farbloser Niederschlag anfallende Efomycin G wurde abfiltriert und im Hochvakuum bei 40°C getrocknet. Ausbeute: 5 mg Efomycin G; Reinheit nach HPLC besser als 85%. Fractions containing pure efomycin G were made combined and under reduced pressure at 40 ° C bath temperature concentrated to ¹ / ₃ of the initial volume. That as Colorless precipitate resulting efomycin G was filtered off and dried in a high vacuum at 40 ° C. Yield: 5 mg efomycin G; Purity better than HPLC 85%.  

Beispiel A:Example A:

Einem Hammel, der pro Tag 650 g grob gemahlenes Schaf- Fertigfutter und 250 g Trockengrün Cobs erhielt, wurde Pansenflüssigkeit durch eine Pansenfistel entnommen. Das Fertigfutter wurde über einen Futterautomaten in 12 gleiche Portionen in zweistündlichem Abstand und die Cobs in 2 gleichen Portionen um 8.30 und 16.15 Uhr verabreicht. Die Pansenflüssigkeit wurde unmittelbar nach der Gewinnung folgender Behandlung unterworfen: 2,5 ml des Panseninokulums wurden in einem mit Kohlendioxid begasten Reagenzröhrchen von 13 ml Volumen vorgelegt, das darüber hinaus folgende Zusätze enthielt:A mutton that feeds 650 g of coarsely ground sheep Ready feed and 250 g of dry green cobs was obtained Rumen fluid removed through a rumen fistula. The The finished feed was fed through an automatic feeder in 12 equal portions every two hours and the Cobs in 2 equal portions at 8.30 a.m. and 4.15 p.m. administered. The rumen fluid became immediately after subject to the following treatment: 2.5 ml of the rumeninoculum were in one with carbon dioxide fumigated test tubes of 13 ml volume which also contained the following additions:

100 mgfein gemahlenes Schaf-Fertigfutter   7,5 mlPufferlösung   0,5 mleiner Lösung mit bzw. ohne Efomycin G100 mg fine ground sheep's feed 7.5 ml buffer solution 0.5 ml solution with or without efomycin G

Die Zusammensetzung der Pufferlösung, welche vor Anfang des Versuches mit Kohlendioxid gesättigt wurde, war wie folgt:The composition of the buffer solution, which before starting of the trial saturated with carbon dioxide was like follows:

Na2HPO4 4,61 g per Liter Wasser NaHCO312,25 g per Liter Wasser NaCl 0,59 g per Liter Wasser KCl 0,71 g per Liter Wasser MgCl2 0,32 g per Liter Wasser CaCl2 0,13 g per Liter WasserNa 2 HPO 4 4.61 g per liter water NaHCO 3 12.25 g per liter water NaCl 0.59 g per liter water KCl 0.71 g per liter water MgCl 2 0.32 g per liter water CaCl 2 0.13 g per liter of water

In diese Mischung wurde 0,5 ml einer Lösung, die die gewünschte Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen in 5%igem wäßrigem Ethanol enthielt, gegeben. Danach betrug das totale Volumen der Fermentationsmischung 10,5 ml. Jedes Reagenzröhrchen wurde mit einem Bunsen- Stopfen verschlossen und bei 39°C bebrütet. Nach 2, 4, 6 und 8 Stunden wurden die Ansätze von Hand geschüttelt. Nach 24stündiger Bebrütung wurde 1,0 ml der Fermentationsflüssigkeit aus den Ansätzen entnommen und in ein Eppendorf-Gefäß pipettiert, das 0,2 ml 10%ige Phosphorsäure (enthaltend 5,7 σmol 2-Methylvaleriansäure) enthielt. Die Proben wurden bei 11 000 g zentrifugiert und aus dem Überstand die flüchtigen Fettsäurekonzentrationen gaschromatographisch bestimmt.0.5 ml of a solution which contained the desired amount of the compounds according to the invention in 5% strength aqueous ethanol was added to this mixture. The total volume of the fermentation mixture was then 10.5 ml. Each test tube was closed with a Bunsen stopper and incubated at 39 ° C. After 2, 4, 6 and 8 hours, the batches were shaken by hand. After incubation for 24 hours, 1.0 ml of the fermentation liquid was removed from the batches and pipetted into an Eppendorf tube containing 0.2 ml of 10% phosphoric acid (containing 5.7 σ mol 2-methylvaleric acid). The samples were centrifuged at 11,000 g and the volatile fatty acid concentrations were determined by gas chromatography from the supernatant.

Es wurde bei jedem Versuch das Verhältnis Essigsäure zu Propionsäure bestimmt. Der bei den Negativkontrollen erhaltene Wert wurde mit 100 angesetzt und die Abweichungen im Verhältnis dazu angegeben. Je mehr Propionsäure gebildet wurde, um so niedriger liegt das Verhältnis Essigsäure zu Propionsäure und um so kleiner wird die Verhältniszahl im Vergleich zur Kontrolle (niedrige Verhältniszahl = verringertes Essigsäure/Propionsäure- Verhältnis = verbesserte Futterverwertung).The ratio of acetic acid was increased in each experiment Determined propionic acid. The one in the negative controls value obtained was set at 100 and the deviations stated in relation to it. The more propionic acid was formed, the lower the ratio Acetic acid to propionic acid and the smaller the Ratio compared to control (low Ratio = reduced acetic acid / propionic acid Ratio = improved feed conversion).

Zusätzlich werden bei jedem Versuch die Konzentrationen der Gesamtfettsäuren im Vergleich zur Kontrolle (= 100) angegeben. In addition, the concentrations in each experiment of total fatty acids compared to the control (= 100) specified.  

Tabelle table

Claims (9)

1. Efomycin G, das durch die folgenden chemischen und physikalischen Eigenschaften charakterisiert ist:
  • 1. Die Summenformel: C53H86O18
  • 2. Das Massenspektrum (Fast Atom Bombardment) Molmasse + Na⁺: 1033
  • 3. Das 1H-Kernresonanzspektrum, angegeben in Teilen pro Million, gemäß Abb. 1.
    Es wurde in einem AM 300 der Fa. Bruker bei MHz an einer Lösung von Efomycin G in deuteriertem Chloroform mit Tetramethylsilan als innerem Standard aufgenommen.
  • 4. Das ¹³C-Kernresonanzspektrum, angegeben in Teilen pro Million, gemäß Abb. 2.
    Es wurde in einem AM 300 der Fa. Bruker bei 75,48 MHz an einer Lösung von Efomycin G in deuteriertem Chloroform und deuteriertem Methanol mit Tetramethylsilan als innerem Standard aufgenommen.
1. Efomycin G, which is characterized by the following chemical and physical properties:
  • 1. The empirical formula: C 53 H 86 O 18
  • 2. The mass spectrum (Fast Atom Bombardment) molar mass + Na⁺: 1033
  • 3. The 1 H nuclear magnetic resonance spectrum, given in parts per million, according to FIG. 1.
    It was recorded in an AM 300 from Bruker at MHz on a solution of efomycin G in deuterated chloroform with tetramethylsilane as the internal standard.
  • 4. The 13 C nuclear magnetic resonance spectrum, given in parts per million, according to FIG. 2.
    It was recorded in an AM 300 from Bruker at 75.48 MHz on a solution of efomycin G in deuterated chloroform and deuterated methanol with tetramethylsilane as the internal standard.
Die chemischen Verschiebungen der CC-NMR-Signale von Efomycin G gemäß Abb. 2 betragen im einzelnen: The chemical shifts of the CC-NMR signals of efomycin G according to Fig. 2 are as follows: (angegeben sind ppm-Werte relativ zu Tetramethylsilan bei 0 ppm)
  • 5. Das UV-Absorptionsmaximum bei 251-254 nm in methanolischer Lösung.
(ppm values are given relative to tetramethylsilane at 0 ppm)
  • 5. The UV absorption maximum at 251-254 nm in methanolic solution.
2. Verfahren zur Herstellung von Efomycin G, dadurch gekennzeichnet, daß man geeignete Mikroorganismen der Familie der Streptomycetaceae in einem Nährmedium welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält unter aeroben Bedingungen kultiviert, das entstandene Gemisch der Efomycine nach üblichen Methoden isoliert und Efomycin G davon abtrennt.2. Process for the preparation of efomycin G, characterized, that suitable microorganisms of the family of Streptomycetaceae in a nutrient medium Assimilable sources of carbon and nitrogen as well as contains mineral salts under aerobic Cultivated conditions, the resulting mixture of Efomycine isolated by usual methods and Efomycin G separates from it. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mit dem Stamm BS 1261 (entsprechend DSM Nr. 3200) durchgeführt wird. 3. The method according to claim 2, characterized in that that it is with the strain BS 1261 (according to DSM No. 3200).   4. Verwendung von Efomycin G als Leistungsförderer bei Tieren.4. Use of efomycin G as a performance enhancer Animals. 5. Mittel zur Leistungsförderung von Tieren, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Efomycin G.5. means for promoting performance of animals, marked by containing efomycin G. 6. Tierfutter, Trinkwasser für Tiere, Zusätze für Tierfutter und Trinkwasser für Tiere, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Efomycin G.6. Animal feed, drinking water for animals, additives for Animal feed and drinking water for animals, labeled by containing efomycin G. 7. Verfahren zur Herstellung von Mitteln zur Leistungsförderung von Tieren, dadurch gekennzeichnet, daß man Efomycine G mit Streck und/oder Verdünnungsmitteln vermischt.7. Process for the preparation of agents for Performance promotion of animals, characterized, that Efomycine G with stretch and / or Diluents mixed.
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