DE9218127U1 - Partikulärer Biokomplex und diesen enthaltendes natürliches Immuntherapeutikum - Google Patents
Partikulärer Biokomplex und diesen enthaltendes natürliches ImmuntherapeutikumInfo
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Description
Die Erfindung betrifft einen partikulären Biokomplex (BK), sowie ein diesen enthaltendes natürliches
Immuntherapeutikum, das Glykoproteine, Zytokine und eine nützliche kurzkettige RNA
einschließt.
Der BK soll in wäßriger Lösung oder als Lyophilisat in der Human- und Veterinärmedizin für therapeutische,
diagnostische und prophylaktische Zwecke eingesetzt oder als Ausgangssubstrat für die
Gewinnung der einzelnen, hochwirksamen Biofaktoren genutzt werden.
Es wurde bereits vorgeschlagen (DD 228 793), aus aviären, embryonalen, kultivierten oder aus permanenten,
durch virale bzw. biochemische Stimuli angeregten Zellen zellulär-partikuläre Resistenzfaktoren
zu gewinnen.
Weiterhin wurde ein Verfahren zur Gewinnung von zellulär-partikulären Resistenzfaktoren aus Vertebratenzellen
vorgeschlagen (DD 283 330), deren wesentlicher Bestandteil aus etwa 50 nm großen,
sphärischen Partikeln besteht. Diese Partikel stellen das Substrat eines physiologischen Abwehrsystems
der Zelle dar, das unterhalb der Funktionsebene des phylogenetisch jüngeren Immunsystems
wirkt.
Aus den zellulär-partikulären Resistenzfaktoren beider Verfahren konnten durch Anreicherung Präparate
hergestellt werden, die die Möglichkeit eröffneten, für begrenzte Anwendungsfälle zur Behandlung
von Virusinfektionen und Tumorerkrankungen eingesetzt zu werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Präparat zu entwickeln, das in der Human- und/oder
Veterinärmedizin zur Therapie, Prophylaxe und Diagnose von Tumor- und/oder Viruserkrankungen
eingesetzt oder als Ausgangssubstrat für die Gewinnung einzelner hochwirksamer Biofaktoren
(z.B. Zytokine) genutzt werden kann.
Es wurde gefunden, daß ein partikulärer Biokomplex (BK), der aus natürlichen hochwirksamen
Substanzen besteht und aus Vertebratenzellen gewonnen werden kann, die gestellten Anforderungen
erfüllt. Der BK besteht ausschließlich aus im elektronenmikroskopischem Bild im Negativkontrastverfahren
darstellbaren sphärischen oder nur geringgradig pleomorphen im Mittel etwa 50 nm großen "vollen" oder "leeren" Partikeln und weiteren im Mittel etwa 9 nm großen sphärischen
und/oder pleomorphen in der Regel "leeren" Ringen.
.2
In der Ultrazentrifuge zeigen sich diese bevorzugt in zwei unterschiedlichen Dichtebereichen in
Zucker- oder CsCI-Lösungen und zwar eine "leichte" (ein Zellmembranäquivalent um 1,1 ... g/cm3)
und eine "schwere" (ein Äquivalent zwischen Zellkembestandteilen und Ribosomen um 1,3 ... g/cm3)
was "leeren" und "vollen" 50-nm-Partikeln entspricht, 9-nm-Ringe verteilen sich auf "schwere Bereiehe".
Der BK repräsentiert Zytokine (GM-CSF) und das natürliche Interspezies-Antigen (NIA) in komplexer
Verbindung mit RNA.
Der BK stellt sich nach Auflösung der ultrastrukturell erkennbaren Komplexität im wesentlichen aus
Glykoprotein bzw. Proteinen um 50 und 190 kD sowie um 30, 44, 48, 54 und 61 kD bestehend dar.
Der BK wird durch Zusatz von gepufferter physiologischer Kochsalzlösung auf einen Gesamtproteingehalt
zwischen 80 und 300 &mgr;g/ml und auf eine RiV-Partikelmenge von 1 bis 10 Millionen/ml eingestellt.
Es führt bei adulten, nichtträchtigen Mäusen nach intramuskulärer Injektion von 0,2 ml zu einer signifikanten
Erhöhung der peripheren neutrophilen Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten.
Zur Erläuterung der Wirkungsweise des BK soll folgende Hypothese dienen.
Der BK ist ein Sekretionsprodukt der Zelle als Streßantwort der Einzelzelle, ermöglicht dieser aus
dem sozialen Verband der Gewebszellen funktionell auszuscheiden: durch schrittweise Aufgabe
der Spezialleistung für den Organismus, durch Übergang zur Einzellebensweise mittels Selbstversorgung
mit Zytokinen und Zelloberflächenrezeptoren zur Selbstversorgung mit einfachen Stoffen
und Befreiung vom Zwang der sozialen Ortsbindung im Organismus. Das stoffliche Äquivalent dieses
Vorganges ist die zelluläre Erzeugung von BK, das morphologische Äquivalent: ein Reaktionsmuster in Vertebratenzellen (RiV). Diese Reaktion ist weitgehend speziesunspezifisch, allen Tieren
und Menschen innewohnend, endet in der Regel mit Zytolyse der betroffenen Zelle, wobei durch Freiwerden
von BK eine ständig erneuerte Immunreaktion gegen nlA erhalten wird und dadurch ein hoher
Antikörperspiegel gegen RiV-Zelloberflächenrezeptoren entsteht. Da RiV vor allem bei pathologischer
Realisierung von zellulären Informationen (Viren, Onkogene) induziert wird, repräsentiert die Immunreaktion
gegen RiV einen in der Evolution alten Abwehrvorgang gegen den der Einzelzelle Nutzen
bringenden, den Gesamtorganismus störenden Vorgang. Physiologischerweise bedarf es nicht des
ärztlichen Eingriffes in dieses Wechselspiel.
Im pathologischen Fall reicht der Antikörperspiegel gegen nlA nicht aus, die zur "Asozialität" strebende
Zelle zu neutralisieren, sondern die nichtphysiologischen Realisierungen von zellulären Informationen
führen zu Virus- oder Tumorerkrankungen.
Es wurde gefunden, daß von nlA-Antikörpem besetzte Zellmembranen und Zytoplasmabezirke die
Tumorzellen vom Stoffwechsel isolieren, diese starke Zeichen der Schädigung aufweisen sowie von
Fibroblasten mit geordneten Kollagenfaserbündeln eingeschlossen und zur Regression gebracht werden.
Die therapeutische Applikation von BK bedingte mit der GM-CSF-Komponente die Stimulierung
der Fibrozyten. Bei Virusinfektionen wurde durch die nlA-Antikörper die infizierte Zelle blockiert und
damit die intrazelluläre Virusreplikation behindert. Die "gesunde" Feinabstimmung im Organismus:
Zellstreß, RiV, Zytokinabgabe (u.a. GM-CSF)1 nlA-Antikörper-lnduktion bedingt Resistenz gegen
Tumor- und Viruserkrankungen. Es wurde gefunden, daß das physikalische Phänomen "Druck" der
spezifische Reiz für Fibrozyten ist, die bei nlA-Antikörperblockade der Tumorzelloberflächen (Hemmung
der extrazellulären proteolytischen Aktivität) ihrer physiologischen Funktion entsprechend
(Begrenzung und Einengung der druckauslösenden Tumorzellwucherung durch Umwandlung in Kollagenbündel
produzierende Fibroblasten) wirksam werden - zusätzlich stimuliert durch GM-CSF. Es
wurde gefunden, daß die oben genannte "gesunde" Feinabstimmung drei Reaktionsaspekte umfaßt:
1. die Reagibilität von Zellen zur Ausbildung von RiV; 2. die Fähigkeit des Immunsystems auf nlA zu
antworten und 3. die Reagibilität der Fibrozyten auf GM-CSF und/oder "Druck" (im Sinne einer Hypo-
oder Hyperreagibilität). Bei der Hyporeagibilität werden Tier bzw. Mensch bevorzugt von bösartigen
Tumoren befallen, bei Hyperreagibilität von Erkrankungen, die mit verstärkter Proliferation von Fibroblasten
bevorzugt im perikapillären Raum verbunden sind, wie es z.B. bei folgender von uns erkannter
Aktionskette deutlich ist: kurzzeitiger Bluthochdruck in Herzmuskelkapillaren, RiV im Kapillarendothel
ist: "Druck"- und GM-CSF-Reiz auf perikapilläre Fibrozyten, Proliferation von Fibroblasten mit
perikapillären Kollagenfaserbündeln, erschwerter Sauerstoffdiffusionsweg, erzwungener Hypertonus,
Druck auf Kapillarendothel usw. Es wurde gefunden, daß RiV bzw. BK eine zentrale biologische
Stelle im animalen und humanen Organismus einnehmen und daß ihre ärztliche Nutzung durch eine
Reihe von Verfahren möglich ist. Der BK ist beständig gegen organische Lösungsmittel wie Chloroform
und Ether, sowie gegen Ultraschall, und wird weiterhin gekennzeichnet seine hohe Dichte (1,30 bis
1,36 g/crr\3) in der Gradientenzentrifugation in Zucker und Cäsiumchlorid mit der Ultrazentrifuge und
durch die Eigenschaft des "natürlichen" Interspeziesantigens.
Der BK wird aus geeignetem Material fürZellkulturen, wie Embryonen, Feten oder Wirbeltieren bzw.
aus deren Gewebe, Organen oder Tumoren, aus denen begrenzt oder unbegrenzt wachsende Zellkulturen
hergestellt werden können, gewonnen. Diese Zellkulturen werden durch Kultivierung oder gezielten
Einsatz biologischer, wie protrahierter Kultivierung, chemischer, wie Glucoseunterversorung, oder physikalischer
Mittel, wie die Wahl einer Temperatur außerhalb des physiologischen Bereichs, zur Bildung
des partikulären Zellkomplexes stimuliert. Aus der Kulturflüssigkeit werden die Zellsedimente unter
weitgehender Zellerhaltung gewonnen. Danach wird eine Zelldestruktion unter Erhaltung des BK durchgeführt.
Der BK wird durch fraktionierte Zentrifugation, Ultrazentrifugation und durch Extraktion mit vorzugsweise
Chloroform oder Ether oder durch fraktionierte Fällungsverfahren und/oder andere Stofftrennungsverfahren
abgetrennt. Dieser Schritt wird durch Sichtkontrolle unter dem Elektronenmikroskop
im Negativkontrastverfahren begleitet.
Das Endziel des Herstellungsverfahrens von BK ist, eine wasserklare, gepufferte Lösung (Gesamteiweißgehalt
< 0,875 mg/ml) zu erhalten, deren elektronenmikroskopisches Bild im Negativkontrastverfahren
ausschließlich aus sphärischen oder nur geringgradig pleomorphen im Mittel etwa 50 nm großen "vollen" und "leeren" Partikeln sowie weiteren im Mittel etwa 9 nm großen sphärisehen
oder pleomorphen in der Regel "leeren" Partikeln repräsentiert wird.
Das Herstellungsverfahren besteht aus folgenden Schritten:
• Suche, Prüfung und Auswahl der Ausgangsspender für Zellkulturen, wie Embryonen, Feten oder
Tiere bzw. deren Gewebe, Organe oder Tumore;
• Herstellung von begrenzt oder unbegrenzt wachsenden Zellkulturen;
• Stimulierung der Zellkulturen durch die Art und Weise der Kultivierung oder gezielter Einsatz
biologischer, chemischer oder physikalischer Mittel;
• Gewinnung der Zellsedimente je nach Kultivierungsbedingungen unter weitgehender Zellerhaltung ohne
Zusatz das Endprodukt belastender Stoffe;
· Zelldestruktion unter alleiniger Erhaltung von BK;
• Durchführung fraktionierter Zentrifugation, Ultrazentrifugation und Extraktion unter Sichtkontrolle
mit dem Elektronenmikroskop im Negativkontrastverfahren;
· oder alternativ Durchführung von fraktionierten Fällungsverfahren und/oder anderer Stofftrennungsverfahren;
• Prüfung auf Identität und Unschädlichkeit.
Die Kontinuität und extreme Dimension massenhafter Zellkultivierung setzt eine ökonomische Bereitstellung
der Ausgangsspender voraus, die bekannter, veterinärmedizinisch kontrollierter Herkunft
sein müssen. Bevorzugt kommen in Betracht: Nieren neugeborener Kälber, Nieren von Schweinefeten,
Embryonen von Enten oder Hühnern, bereits etablierte oder von Ausgangsspendem etablierte, begrenzt
oder unbegrenzt wachsende Zellinien, Blut von Vögeln und Säugern einschließlich des Menschen.
Das kompakte biologische Material wird mechanisch oder fermentativ in eine Suspension von Einzelzellen
überführt, die für Monolayer- (stationär oder Roller-) kulturen oder Suspensionenskulturen genutzt
werden, ebenso wie die bereits etablierten, begrenzt oder unbegrenzt wachsenden Zellinien.
heparinisiertes Blut - insbesondere von akut antigenstimulierten Organismen - wird in toto in Rollerkulturen
verbracht.
Folgende Verfahren zur intrazellulären Erzeugung von BK sind verwendbar:
Selektion von Zellen auf BK-Bildung, protrahierte Zellkultivierung, Einsatz in der Regel geringgradiger
unphysiologischer Medien, Haltungsbedingungen, z.B. Temperatur, Zusatz physikalischer, chemischer
oder biologischer Stimuli oder nichtzytopathogener, für den Zielorganismus nichtpathogener
Viren.
Mit der Zellsedimentierung beginnt die Stofftrennung. In der ersten Stufe werden die Zellen von dem
Medium getrennt. Das vor der Zellsedimentation benutzte Medium sollte weitgehend eiweißfrei oder
-arm sein. Zur Lösung der Zellen von ihrer Haftung werden mechanische bzw. physikalische Methoden
bevorzugt, letztlich wird das Zellsediment durch Zentrifugation gewonnen.
Die zweite Stufe der Stofftrennung, Trennung des BK von den übrigen Zellbestandteilen, beginnt mit
der Zelldestruktion mittels Gefrier/Tau-Zyklen, Ultraschallbehandlung, der Verwendung von Detergentien
oder mechanischer Methoden. Die Kontrolle der gelungenen vollständigen Freisetzung des BK aus ZeII-vakuolen
geschieht mit dem Elektronenmikroskop im Negativkontrastverfahren. Anschließend erfolgt
die Abtrennung von größeren Zelldetritus (Zellkern- und Zytoplasmabestandteile) durch Zentrifugation und
Gewinnung des Überstandes, der den BK enthält.
Nach der Stofftrennung verblieben kleine bis mittelgroße Zellbestandteile (Reste von Mitochondrien,
vom RER, von Zeil- und Kemmembranen, Myelinfiguren u.a.) in Lösung. Eine fraktionierte Lösungsmittel-
und Ultrazentrifugationsbehandlung schließt die Stofftrennung mit der Reindarstellung von BK
im letzten Sediment nach Ultrazentrifugation ab. Die Resuspension von BK-Sediment erfolgt mit anorganischen
Phosphatpuffer. Alternativ kann eine fraktionierte Fällung, z.B. mit PEG 6000, durchgeführt
werden.
Die Prüfung auf Identität umfaßt folgende Mindestanforderungen:
• Unter dem Elektronenmikroskop sind ausschließlich die Partikel des BK erkennbar;
· PAGE: charakteristische Muster;
• ELISA: quantifizierbare Reaktion gegen Antikörper mit typischen Kurvenverlauf,
• Prüfung auf Unschädlichkeit:
Zellkultur: Fehlen zytotoxischer und zelltransformierter Anzeichen
• Tierversuch: Gesundes Überleben neugeborener und ausgewachsener Mäuse 4 Wochen post
Injektionen u.a. (entsprechend den gesetzlichen Bestimmungen)
Der BK und das nIT weisen gegenüber bekannten Präparaten z.B. Zytokinen, die meistens auf
gentechnischem Wege hergestellt werden, einen bedeutenden Vorteil auf.
Bei den bekannten Präparaten ist die Haltbarkeit sehr begrenzt (nur kurzzeitige Lagerung bei 80 0C).
Durch die komplexe Bindung z.B. des GM-CSF mit dem nIA kann die Aufbewahrung im normalen Kühlschrank
erfolgen und das Präparat ist über Jahre einsetzbar.
Bei der Anwendung von rekombinanten GM-CSF wird dieses im Körper sehr schnell abgebaut, während
der Biokomplex durch die komplexe Bindung z.B. des nativen GM-CSF an das nIA sehr viel langsamer
abgebaut wird.
Ausführungsbeispiele
1. BK-Herstellung aus Kälbernieren
Spendertier: Neugeborenes, bis zu 8 Stunden altes, ungetränktes klinisch gesundes Kalb. Herkunft
des Spendertieres: tierärztlich kontrollierter, den veterinärhygienischen Anforderungen entsprechender
insbesondere leukose- und BSE- (bovine spongiforme Enzephalopathie) freier Rinderbestand.
Nierengewinnung: Anästhesie des Tieres; Freilegung der A. carotis, ihre Eröffnung und Herbeiführung
des Todes durch vollständiges Entbluten; Blutproben zur mikrobiologischen Untersuchung; Eröffnung
der Bauchhöhle durch Sagittalschnitt; sterile Präparation und Entnahme der Nieren bei Unversehrtheit
der Nierenkapsel; pathologisch-anatomische Inspektion des Situs: sofortige Weiterverwendung der
Nieren oder Aufbewahrung in steriler Phosphatpufferlösung (PBS) bzw. Zeilerhaltungsmedium (EM) auf
Hanks-Basis bei Kühlschranktemperatur.
Zellgewinnung: Entferung der Nierenkapsel; mechanische Zerkleinerung des Nierenrindengewebes unter
strengen aseptischen Bedingungen; Verbringen der Nierenfragmente in 300-ml-Weithals-Erienmeyerkolben;
Gewichtsbestimmung des Nierengewebes; Waschung der Nierenfragmente; Fragmenteauf-Schluß
mit Hilfe von 150 bis 250 ml einer 0,25%igen Trypsin-Hankslösung bei 37 0C (bei Lösung-Gewebs-Verhältnis
1:2); Trypsination auf Magnetrührwerk; Zeit der Vortrypsination: 10 min; Verwerfen
(Vortrypsinat) nach 2 min unter Erhalt des abgesetzten Sedimentes der Gewebs-fragmente; Haupttrypsination
bei 37 0C auf Rührwerk; Sedimentation der Gewebefragmente innerhalb von 2 min; Gewinnung
der Zellsuspension durch Abgießen der zellhaltigen Trypsinlösung über ein Sieb; Wiederholung
der Haupttrypsination bis zum vollständigen Aufschluß aller Gewebsfragmente; Sedimentation der
suspendierten Nierenzellen bei 1.500 U/min in einer Laborzentrifuge mit 50-ml-Zentrifugenröhrchen; Abschalten
der Zentrifuge bereits bei Erreichen der angegebenen Drehzahl; Dekantieren und Verwerfen
des Überstandes; Aufschlämmung des Zellsedimentes in Zellanzüchtungsmedium (AZM): Homogenisierung
der Zellsedimente mit 20 ml AZM/Zentrifugenröhrchen, 12 bis 16 ml Zellsuspension mit 5 I AZM
vermischt; bakteriologische Prüfung der Zellsuspensionen nach Vorschrift; Zellaussaat in 5-l-Steilbrustflaschen
mit jeweils 300 ml Zellsuspension.
ZeIIkultivierung: Lagerung der mit Zellsuspension versehenen Flaschen in horizontaler Position in
einer Rollereinrichtung; Bebrütung bei 37 0C; Konfluenz des Zellrasens nach fünf- bis siebentägiger
Bebrütung:
1. Primärkultur: Wechsel des AZM durch EM; tägliche mikroskopische Kontrolle der Zellkultur;
durch prolongierte Kultivierung Anregung der Zellen zur RIV/BK-Bildung; mögliche erfolgreiche
Kultivierungsdauer für die RIV/BK-Produktion bis zu 14 Tagen; immunfluoreszenzmikroskopische
Kontrolle des RIV-Status durch Anti-RIV-Serum.
2. Sekundärkultur: Abgießen des AZM; Abtrypsinieren des Zellrasen; Gewinnung des Zellsediments;
Resuspension der Zellen in AZM; Zellaussaat in 5-l-Steilbrustflaschen mit jeweils 300 ml
Zellsuspension zur Erzeugung einer Sekundärkultur; Prüfung der Zellsedimente auf mikrobiologische
Kontamination (Viren, Mykoplasmen, Bakterien, Pilze).
RIV-Zellgewinnung: Abgießen des Zellkulturüberstandes; Auffüllen von 30 bis 50 ml PBS pro Gewebekulturflasche;
Abfrieren der RIV-haltigen Kulturzellen von der Glasoberfläche im Kältebad (Spiritus
mit Trockeneis durch langsames Drehen der Flaschen; sterile Gewinnung der gefrorenen Zellen;
sofortige Weiterverarbeitung bzw. Lagerung bei -80 0C.
RIV/BK-Präparation: Destruktion der RIV-haltigen Zellen durch mehrmalige Gefrier-Auftau-Zyklen
und/oder Ultraschall; Homogenisieren der Zellbestandteile auf einem Magnetrührwerk für eine Stunde
im Eisbad; Trennung der groben ZeIIbestandteile durch niedertourige Zentrifugation bei 4 0C;
Sedimentation von RIV/BK aus dem erhaltenen Überstand durch Ultrazentrifugation bei 20 000 U/min
und 4 0C für 2 Stunden; Resuspension des festen Ultrasedimentes in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung;
Homogenisieren des Sedimentes auf einem Magnetrührwerk für eine Stunde im Eisbad;
Entfernung der restlichen gröberen Bestandteile durch Zentrifugation bei 8 000 u/min; Ausschütteln des
Überstandes mit 20 % Chloroform für 5 min, niedertourige Zentrifugation und Gewinnung des RIV/BK-haltigen
Überstandes; Aufbewahren des RIV/BK-Präparates im Kühlschrank.
• Prüfung auf mikrobiologische Kontamination (s.o.);
· Gesamtproteinbestimmung nach Lowry und Ciocalteus zur Einstellung der Präparategebrauchsverdünnung;
• Elektronenmikroskopie im Negativkontrastverfahren (Phosphorwolframsäure):
Nach Betrachtung von 3 Objektträgemetzen bei mindestens 40 OOOfacher Vergrößerung unter Benutzung
der Lupe keine Hinweise auf Fragmente von mikrowellen Organismen oder von Zellbestandteilen
(außer RIV/BK), notwendiger Nachweis: ausschließliches Erkennen von in Gruppen auftretenden
charakteristischen Partikeln: 1. ringförmige 9-nm-Partikel, 2. sphärische bis pleomorphe 30- bis
60-nm-Partikel teils "leer", teils 1VoII";
· Cäsiumchlorid-Dichtegradient in der Ultrazentrifuge: Darstellung von 9-nm-Partikeln und "vollen"
30- bis 60-nm-Partikeln bei 1,3 g/ml und "leeren" 30- bis 60-nm-Partikeln bei 1,1 g/ml;
• SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese: Darstellung folgender Protein/Glykoproteinbanden in den
Bereichen: 190 bis 200 kD, 65 bis 67 kD, 50 bis 52 kD, 46 bis 48 kD und 28 bis 32 kD,
• Enzym-linked-immuno-sorbent-assay (ELISA): Typischer Verlauf der Extinktionskurve mit RV-positiven
Humanseren in exponentiellen Verdünnungsbereichen von 1:10 bis 1:1 000 und RIV/BK in Verdünnung
von 1:1 000: hohes Plateau mit steilem Abfall.
· Erste Unschädlichkeitsprüfung an neugeborenen Mäusen: randomisierte Auswahl von mindestens
10 Versuchs- und Kontrolltieren aus verschiedenen Würfen; dreimalige intramuskuläre Applikation
von 0,02 ml des RIV/BK an drei aufeinanderfolgenden Tagen an die Versuchsmäuse; Beobachtungszeitraum: 4 Wochen; Ergebnis: normales bzw. begünstigtes Gedeihen der Tiere im Beobachtungszeitraum; bei Auftreten klinischer Normabweichungen Versuchswiederholung.
• Nach Abschluß der Prüfungen: Konfektionierung in gebrauchsfertigen Quantitäten (Ampullen in
Mengen von je 1 ml).
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2. RIV/BK-Herstellung aus embryonierten Hühnereiern
Herkunft der befruchteten Eier aus Zuchtbetrieben mit Prüf Zertifikat auf Freisein von für den Menschen
bedeutsamen Krankheitserregern.
Bebrütung der Hühnereier in Brutlage 8 bis 12 Tage; Gewinnung der embryonalen Zellen: sterile Öffnung
der Eischale; Entnahme des Embryos; Entfernung des Kopfes und der Extremitäten; mechanische
Zerkleinerung des Restembryos; Zellaufschluß durch Trypsinbehandlung; Einstellung der Zellzahl auf
1 Million Zellen/ml Anzuchtmedium; sinngemäß Fortführung der weiteren Behandlung der Zellen wie
bei vorhergehendem Beispiel.
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3. Definition des natürlichen Immuntherapeutikums (nlT)
Entnahme von BK aus der Konserve (-80 0C); Auftauen im Wasserbad bei Zimmertemperatur; Herstellung
von Verdünnungsreihen einer Probe mit gepufferter isotonischer Kochsalzlösung von: unverdünnt,
1:5, 1:10, 1:50.
Proteinbestimmungen der Verdünnungsstufen nach Lowry; Messung der Extinktionen bei Wellenlängen
von 750 nm; Bestimmung des Proteingehaltes durch Vergleich mit Rinderalbuminstandard; Ergebnis:
bei Verdünnung 1:5 Proteinkonzentration 90 ug/ml.
Elektronenmikroskopische Untersuchungen; Auftropfen der hergestellten Lösungen auf jeweils zwei
befilmte Objektträgernetze; Kontrastierung mit Phosphorwolframsäure; Ergebnis: optimale Befunderhebung
bei Verdünnungsstufe 1:5; alle untersuchten Gesichtsfelder von kleinen (4 bis 6) und größeren
(6 bis 20) Gruppen von RIV Partikeln oder ihren Zerfallsprodukten ausgefüllt.
Wirksamkeitsprüfung; intramuskuläre Applikationen von jeweils 0,2 ml der Verdünnungsstufen an jeweils
fünf adulten, nichtragenden Mäusen an zwei aufeinanderfolgenden Tagen; tägliche Bestimmung
der Anzahl der peripheren weißen Zellen pro rnnv* und Differenzialblutbilder bis zum sechsten Tag nach
Applikation; Ergebnis: 1:5 Erhöhung der weißen Blutzellen nach Applikation z.B. von 13.250 auf 20.600
Zellen pro mm^ bei drei von fünf Tieren;
Differenzialblutbild; Neutrophylie und Monozytose.
Gesamtergebnis: BK-Präparat (1 Teil) in gepufferter isotonischer Kochsalzlösung (4 Teile) entspricht nlT.
4. Behandlung der Papillomatosen bzw. der aus diesem entstehenden Karzinomen
Patient, geboren 1959, im April 1980 an Larynxpapillomatose erkrankt; Behandlung an einer Universitäts-HNO-Klinik;
am 01.09.1981 Larynxpapillom operativ entfernt, am 02.10.1981: ausgedehnte tumoröse Wucherungen
im Bereich des linken Stimmbandes bis in die Luftröhre hinein; am 14.11 bis 29.11.1981 Behandlungskur
mit nlT: in 3tägigen Abständen 5 ml intramuskulär; gute Verträglichkeit, keine Neben-Wirkungen;
Kontrollen: am 03.12.1981 und 12.01.1982: sehr geringe Gewebsstörungen, aber keine sichere Papillomatose
nachgewiesen; vom 09.02. bis 25.02.1982 Behandlungskur mit nlT: in 3 tägigen Abständen
5 ml intramuskulär; gute Verträglichkeit, keine Nebenwirkungen; drei weitere Behandlungskurven (wie oben), beginnend am 13.01.1982, am 06.07.1982 und am
19.07.1982;
bei 11 Kontrollen (entsprechend den von 1981 und 1982) bis zum Jahre 1991 Feststellung des sich
normalisierenden Kehlkopfes;
Patient 1991 völlig gesund (selbst ohne die üblichen banalen Infektionen).
Postscriptum: seit dem 14. Lebensjahr des Patienten gleichzeitig bestehende Penispapillomatose
(etwa 10 Herde von Durchmessern im Millimeterbereich am Präputim); nach der zweiten Behandlungskur
vollständige Rückbildung ohne Rezidiv.
Patientin, 55 Jahre, seit Kindheit Behandlung in einer Universitäts-HNO-Klinik wegen Larynxpaillomatose;
Anlage eines Tracheostomas (Luftröhrenschnitt) wegen Atemnot; histologisch: Papillomatose mit
Präkanzerose; Behandlungskur mit nlT: 5mal 5 ml Gesamtdosis; völlige Rückbildung des Tumorgewebes;
Verschließung des Tracheostomas (20 Jahre nach Anlage!) Atmung jetzt per via naturalis;
Patientin völlig geheilt.
Patient, geboren 1905, am 06.09.1973 wegen Hamblasenpapillom in einer urologischen Klinik operiert;
Rezidive operiert am: 12.12.1973,29.07.1975, 12.02.1976,28.05.1976,09.08.1976, 15.11.1976,
28.06.1978, 31.10.1978, 15.01.1979, 10.09.1979, 21.11.1979; bei letztem Eingriff'Transitionalzell-Karzimon
Grad 1" festgestellt; Rezidive operiert am: 04.02.1981, 10.09.1981; jetzt histologische Dia
gnose: "Urothelkarzinom"; vom 23.09.1981 bis 05.10.1981 und vom 16.10.1981 bis 26.10.1981 Behandlungskuren
mit nIT: in dreitägigen Abständen jeweils 5 ml intramuskulär; auffällige Besserung
des Allgemeinbefindens, keine Nebenwirkungen;
vom 13.01. bis 02.02.1982 eine weitere identische Kur; anschließend Probeexzision von Hamblasengewebe;
histologische Diagnose: "kein Anhalt für Tumor"; am 20.04.1982 ebenfalls Probeexzision;
histologische Diagnose: oberflächliche Anteile eines Urothelkarzinoms mit starker entzündlicher
Infiltration; am 24.08.1982 Zytoskopie: Kein Anhalt für Tumor; am 17.05.1983 Tod durch Linksherzversagen
(unabhängig vom Tumorieiden).
Pathologisch-anatomische Diagnose mit Hilfe von histologischen Serienschnitten: kein Papillom
oder Karzinom nachweisbar.
Die Erfindung betrifft einen partikulären Biokomplex (BK) aus natürlichen hochwirksamen Substanzen
und ein diesen enthaltendes natürliches Immuntherapeutikum.
Der BK wird nach Zellkulturzüchtung aus Vertebratenzellen isoliert und gegen Tumor- und Virusinfektionen
eingesetzt. Der BK kann weiterhin als Ausgangssubstrat für die Herstellung von monoklonalen
Antikörpern, Zytokine und kurzkettigen biologisch wirksamer RNA eingesetzt werden.
Claims (2)
1. Partikulärer Biokomplex (BK), bestehend aus natürlichen, hochwirksamen Substanzen wie aus
den natürlichen Interspeziesantigenen (nlA), Zytokinen (z.B. GM-CSF) und kurzkettiger RNA,
deren elektronenmikroskopisches Bild im Negativkontrastverfahren ausschließlich aus spärischen
oder nur geringgradig pleomorphen etwa 50 nm großen "vollen" oder "leeren" Partikeln und weiteren
etwa 9 nm großen spärischen und/oder pleomorphen in der Regel "leeren" Partikeln repräsentiert
wird, der aus Vertebratenzellen gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß aus geeignetem
biologischem Material für Zellkulturen, wie Embryonen, Feten oder Wirbeltieren bzw. deren Geweben,
Organen oder Tumoren, begrenzt oder unbegrenzt wachsende Zellkulturen hergestellt werden,
diese durch die Art der Kultivierung oder gezielten Einsatz biologischer, wie protrahierter Kultivierung,
chemischer, wie Glucoseunterversorgung, oder physikalischer Mittel, wie die Wahl einer
Temperatur außerhalb des physiologischen Bereiches, zur Bildung des partikulären Biokomplexes
stimuliert und aus der Kulturflüssigkeit die Zellsedimente unter weitgehender Zellerhaltung gewonnen
werden, eine Zelldestruktion unter Erhaltung des BK durchgeführt und der BK durch fraktionierte
Zentrifugation, Ultrazentrifugation und Extraktion mit vorzugsweise Chloroform oder Ether oder
durch fraktionierte Fällungsverfahren und/oder andere Stofftrennungsverfahren (unter Sichtkontrolle
mit dem Elektronenmikroskop im Negativkontrastverfahren) abgetrennt wird.
2. Natürliches Immuntherapeutikum zur Behandlung von Virus- und Tumorerkrankungen in der
Human- und Veterinärmedizin, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff den partikulären
Biokomplex nach Anspruch 1, vorzugsweise in wäßriger Lösung oder in lyophilisierter Form enthält.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE9218127U DE9218127U1 (de) | 1992-03-24 | 1992-03-24 | Partikulärer Biokomplex und diesen enthaltendes natürliches Immuntherapeutikum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE9218127U DE9218127U1 (de) | 1992-03-24 | 1992-03-24 | Partikulärer Biokomplex und diesen enthaltendes natürliches Immuntherapeutikum |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE9218127U1 true DE9218127U1 (de) | 1993-11-04 |
Family
ID=6887769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE9218127U Expired - Lifetime DE9218127U1 (de) | 1992-03-24 | 1992-03-24 | Partikulärer Biokomplex und diesen enthaltendes natürliches Immuntherapeutikum |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE9218127U1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0702955A1 (de) | 1994-09-20 | 1996-03-27 | Solisch, Peter, dr.med.habil. | Arzneimittel zur Therapie von AIDS |
| EP0889053A2 (de) * | 1997-06-27 | 1999-01-07 | Solisch, Peter, dr.med.habil. | Verwendungen von BK-RiV-Präparaten, Verfahren zu deren Herstellung sowie darin enthaltene Proteine |
-
1992
- 1992-03-24 DE DE9218127U patent/DE9218127U1/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0702955A1 (de) | 1994-09-20 | 1996-03-27 | Solisch, Peter, dr.med.habil. | Arzneimittel zur Therapie von AIDS |
| DE4435352A1 (de) * | 1994-09-20 | 1996-03-28 | Peter Dr Med Habil Solisch | Arzneimittel zur Therapie von Aids |
| DE4435352C2 (de) * | 1994-09-20 | 1998-05-20 | Peter Dr Med Habil Solisch | Verwendung eines Arzneimittels zur Therapie von Aids |
| EP0889053A2 (de) * | 1997-06-27 | 1999-01-07 | Solisch, Peter, dr.med.habil. | Verwendungen von BK-RiV-Präparaten, Verfahren zu deren Herstellung sowie darin enthaltene Proteine |
| EP0889053A3 (de) * | 1997-06-27 | 1999-03-31 | Solisch, Peter, dr.med.habil. | Verwendungen von BK-RiV-Präparaten, Verfahren zu deren Herstellung sowie darin enthaltene Proteine |
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