DE918405C

DE918405C - Process for the production of pure somatic polysaccharides from microorganisms

Info

Publication number: DE918405C
Application number: DEW10315A
Authority: DE
Inventors: Otto Westphal
Original assignee: Wander AG
Current assignee: Wander AG
Priority date: 1952-01-24
Filing date: 1953-01-08
Publication date: 1954-09-27

Description

Verfahren zur Herstelkung von reinen somatischen Polysacchariden aus Mikroorganismen Es ist bekannt, daß man durch wiederholte fraktionierte Behandlung von gramnegativen Bakterien mit go- bis 9501,im Phenol und anschließend mit Wasser aus dem wäßrigen Extrakt hochantigene somatische Glycoproteide isolieren kann (J. W. Palmer und T. D. Gerlough, Science 92, I55 [I940]; W. T. J. Morgan und S. M. Partridge, Biochem. J.Process for the production of pure somatic polysaccharides Microorganisms It is known that by repeated fractional treatment of gram-negative bacteria with go- to 9501, in phenol and then with water can isolate highly antigenic somatic glycoproteins from the aqueous extract (J. W. Palmer and T.D. Gerlough, Science 92, 155 [1940]; W. T. J. Morgan and S. M. Partridge, Biochem. J.

35, II40 [I94I]). Es ist ferner bekannt, daß man auch durch Behandlung der Bakterien mit Phenol-Wasser-Emulsionen in der Kälte in einer Stufe derartige Glycoproteide extrahieren und nach Entmischung der Emulsionen aus der wäßrigen Phase isolieren kann (0. Westphal, Angew. Chem. 57, 57, I28 [I944]; 62, 27 [I950]). Bei diesen Extraktionsverfahren erhält man Produkte, in denen die spezifischen Bal<terienpolysaccharide jeweils an mehr oder weniger Proteinmaterial gebunden sind.35, II40 [194I]). It is also known that one can also use treatment of bacteria with phenol-water emulsions in the cold in a stage of this kind Extract glycoproteins and after separation of the emulsions from the aqueous phase can isolate (0. Westphal, Angew. Chem. 57, 57, I28 [I944]; 62, 27 [I950]). at This extraction process gives products in which the specific bacterial polysaccharides are each bound to more or less protein material.

Wir haben nun gefunden, daß man nach der Behandlung von Mikroorganismen mit homogenen Phenol-Wasser-Mischungen in der Wärme, anschließender Kühlung und Trennung der Phasen wäßrige Extrakte erhält, welche die proteinfreien spezifischen Polysaccharide in undegradierter Form und praktisch quantitativer Ausbeute enthalten. Zur Terminologie vgl. We have now found that after treating microorganisms with homogeneous phenol-water mixtures in the warm, subsequent cooling and Separation of the phases receives aqueous extracts, which are protein-free specific Contains polysaccharides in undegraded form and practically quantitative yield. For terminology cf.

W. T. J. Morgan und S. M. Partridge, Biochem. J.W. T. J. Morgan and S. M. Partridge, Biochem. J.

34, I69 [I940]; 35, II40 [I94I], Brit. J. exp. Pathol.34, 169 [1940]; 35, II40 [I94I], Brit. J. exp. Pathol.

23, 5I [I942].23, 5I [1942].

Man geht so vor, daß die getrockneten Mikroorganismen oder das feuchte Sediment in Wasser suspendiert und unter Rühren auf erhöhte Temperatur, vorzugsweise 55 bis 68°, gebracht werden. Hinzu gibt man ein etwa gleiches Volumen von auf die gleiche Temperatur vorgewärmtem 75- bis go0lgem Phenol. Es entsteht eine homogene Mischung, welche man während 5 bis 30 Minuten auf die Bakterien einwirken läßt. Anschließend wird gekühlt, wobei die Flüssigkeitsmischung zweiphasig wird und sich nach Zentrifugieren in eine obere wäßrige und eine untere phenolische Phase auftrennt. Die wäßrige Phase wird abgehoben, von gelöstem Phenol durch Dialyse oder Ätherextraktion befreit und unter vermindertem Druck konzentriert. Durch Eingießen in mit Wasser mischbare organische Fällungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Aceton oder Mischungen derselben, vorteilhaft unter Zusatz von Natriumacetat, erhält man eine flockige Fällung, welche die spezifischen somatischen Bakterienpolysaccharide praktisch quantitativ neben Nucleinsäuren enthält. Die Trennung der Polysaccharide von Nucleinsäuren kann durch fraktionierte Fällung mit organischen Mitteln oder durch Elektrophorese durchgeführt werden. One proceeds in such a way that the dried microorganisms or the moist Sediment suspended in water and, with stirring, at an elevated temperature, preferably 55 to 68 °. In addition one gives an approximately equal volume of on the same temperature preheated 75- to go0lgem phenol. The result is a homogeneous one Mix which one during 5 to 30 minutes on the bacteria can act. It is then cooled, whereby the liquid mixture is two-phase is and after centrifugation in an upper aqueous and a lower phenolic Phase separates. The aqueous phase is removed from the dissolved phenol by dialysis or ether extraction freed and concentrated under reduced pressure. By pouring in water-miscible organic precipitants such as methanol, ethanol, acetone or mixtures thereof, advantageously with the addition of sodium acetate, are obtained a flaky precipitate containing the specific bacterial somatic polysaccharides contains practically quantitatively in addition to nucleic acids. The separation of the polysaccharides of nucleic acids can be fractionated by organic means or precipitation can be carried out by electrophoresis.

Nach dem beschriebenen Verfahren kann man die wasserlöslichen Polysaccharide sowohl von gramnegativen wie grampositiven Bakterien aus Pilzen und anderen Mikroorganismen in einer Stufe und mit praktisch quantitativer Ausbeute aus ihren Proteinverbindungen abspalten und isolieren. The water-soluble polysaccharides can be prepared using the method described from both gram-negative and gram-positive bacteria from fungi and other microorganisms in one step and with practically quantitative yield from their protein compounds split off and isolate.

Die erhaltenen Polysaccharide dienen als Impf- und Reizstoff sowie als Zwischenprodukte zu Impf- und Reizstoffen. The polysaccharides obtained serve as a vaccine and irritant as well as intermediate products to vaccines and irritants.

Beispiel 10 g Colibakterien (bezogen auf Trockensubstanz) werden bei 65 bis 68" (Wasserbad) in 350 ccm Wasser suspendiert und unter Rühren mit 350 ccm auf 68° vorgewärmtem go0/,igem Phenol versetzt. Es wird unter Rühren 20 bis 30 Minuten lang bei 65 bis 68° belassen, anschließend mit Eiswasser auf 5 bis 100 gekühlt und zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wird abgehoben und die untere Phenolschicht nochmals bei 68" mit 300 ccm Wasser während weniger Minuten gerührt. Nach erneuter Kühlung und Zentrifugieren werden die wäßrigen Lösungen vereinigt und gegen dest. Wasser dialysiert. Die schwach opaleszierende Innenlösung wird im Vakuum auf 10 bis 15 ccm Volumen eingeengt, von geringen Mengen ungelöster Substanz abzentrifugiert und in die sechs- bis zehnfache Menge Alkohol unter Zusatz von etwas Natriumacetat eingegossen. Die Substanz fällt in weißen Flocken aus, welche mit Alkohol und Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet oder in wenig Wasser aufgenommen und lyophil getrocknet werden. Ausbeute o,8 bis I,3 g (Rohprodukt). Example 10 g coli bacteria (based on dry matter) suspended at 65 to 68 "(water bath) in 350 ccm of water and with stirring at 350 ccm to 68 ° preheated go0 /, phenol added. It becomes 20 bis with stirring Leave at 65 to 68 ° for 30 minutes, then to 5 to 100 with ice water chilled and centrifuged. The upper aqueous phase is lifted off and the lower Phenol layer stirred again at 68 "with 300 ccm of water for a few minutes. After cooling and centrifuging again, the aqueous solutions are combined and against least. Dialyzed water. The slightly opalescent interior solution is im Vacuum reduced to a volume of 10 to 15 ccm, of small amounts of undissolved substance centrifuged and in six to ten times the amount of alcohol with the addition of something Poured sodium acetate. The substance precipitates in white flakes, some with Washed alcohol and acetone and dried in vacuo or taken up in a little water and dried in lyophil. Yield 0.8 to 1.3 g (crude product).

4 g Rohprodukt werden in 200 ccm Wasser gelöst und die Lösung unter Rühren mit 200 ccm Äthanol versetzt. Die Fällung wird abzentrifugiert; sie enthält hauptsächlich Nucleinsäuren (2,I bis 2,3 g) . Die?ilutterlauge wird im Vakuum auf 30 ccm Volumen eingeengt und mit 30 ccm Äthanol versetzt. Die geringe Fällung (IOO bis I50 mg) wird durch Zentrifugieren entfernt. 4 g of crude product are dissolved in 200 ccm of water and the solution under Stirring mixed with 200 ccm of ethanol. The precipitate is centrifuged off; it contains mainly nucleic acids (2.1 to 2.3 g). The? Ilterlauge is on in a vacuum 30 ccm volume reduced and mixed with 30 ccm ethanol. The slight precipitation (IOO up to 150 mg) is removed by centrifugation.

Das Filtrat läßt man in das sechsfache Volumen Alkohol unter Zusatz von etwas Natriumacetat einfließen.The filtrate is added to six times the volume of alcohol pour in some sodium acetate.

Die feinflockige Fällung wird abzentrifugiert und mit Alkohol und Aceton gewaschen oder lyophil getrocknet; sie enthält die Polysaccharide neben etwa 5 01o Nucleinsäure. Ausbeute 1,2 bis I,4g. Durch Wiederholung der Fraktionierung erhält man o,g bis I,I g reine Polysaccharidfraktion, deren Stickstoffgehalt von 0,7 bis I,O 0/, vollständig auf den Gehalt des Präparates an Hexosamin entfällt. Diese Polysaccharidfraktion fällt aus 40zig wäßriger Lösung bei Alkoholkonzentrationen zwischen 78 und 8201o praktisch vollständig aus. Die Substanz bildet mit Wasser schwach opaleszierende Lösungen.The fine flaky precipitate is centrifuged off and mixed with alcohol and Acetone washed or lyophilized; it contains the polysaccharides besides about 5 01o nucleic acid. Yield 1.2 to 1.4g. By repeating the fractionation one receives o, g to I, I g of pure polysaccharide fraction, the nitrogen content of 0.7 to 1.00 /, is entirely due to the hexosamine content of the preparation. This polysaccharide fraction precipitates from 40,000 aqueous solutions at alcohol concentrations between 78 and 8201o practically completely. The substance forms with water slightly opalescent solutions.

Nach der gleichen Vorschrift kann man andere Mikroorganismen mit Phenol-Wasser behandeln und erhält jeweils nach Fraktionierung die reinen, proteinfreien, wasserlöslichen Polysaccharide. According to the same rule, you can use other microorganisms Treat phenol water and after each fractionation it receives the pure, protein-free, water-soluble polysaccharides.

Claims

PATENT CLAIMS: I. Process for the production of pure, somatic, in particular protein-free polysaccharides from microorganisms, characterized in that that one cleaves at an elevated temperature with a homogeneous phenol-water mixture, the reaction mixture obtained is cooled, the layers formed are separated and removed the pure polysaccharides isolated from the aqueous phase.

2. The method according to claim I, characterized in that the Cleavage between 55 and 68 "and for 5 to 30 minutes.