DE828250C

DE828250C - Process for the production of nucleic acid from yeast or yeast-like microorganisms

Info

Publication number: DE828250C
Application number: DEP4776A
Authority: DE
Inventors: Dr Kurt Holle; Dr Otto Hummel; Dr Heinrich Kirchhoff
Original assignee: Zellsloff Fabrik Waldhof AG
Current assignee: Zellsloff Fabrik Waldhof AG
Priority date: 1948-10-02
Filing date: 1948-10-02
Publication date: 1952-01-17

Description

Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsäure aus Hefe oder hefeähnlichen Mikroorganismen Es ist bekannt, Nucleinsäure aus Hefe mit Hilfe von Natronlauge oder Kochsalzlösungen durch Spaltung der Protein-Nucleinsäure-Verbindungen zu gewinnen. Eine Extraktion mit Natronlauge wurde beschrieben in dem Buch: rMethoden der Fermentforschungu von Bamann und Myrbäck, Bd. 1, Verlag Hirzel, Leipzig 1941.Process for the recovery of nucleic acid from yeast or yeast-like acids Microorganisms It is known to extract nucleic acid from yeast with the help of caustic soda or saline solutions by cleaving the protein-nucleic acid connections. Extraction with sodium hydroxide solution has been described in the book: rMethods of Ferment Researchu von Bamann and Myrbäck, Vol. 1, Verlag Hirzel, Leipzig 1941.

Nach diesen Verfahren, für welche bis heute mit Erfolg nur lebende oder frische abgetötete Hefe verwendet wurde, gehen die Nucleinsäuren in Lösung und können aus dieser durch Ansäuern gefällt werden. Die Ausbeuten betrugen höchstens etwa 2,4 bis 4°%0 Nucleinsäure, bezogen auf Hefetrockensubstanz. Bei Verlängerung der Extraktionsdauer ließ sich die Ausbeute nicht steigern, da hierbei die Gefahr einer Spaltung der Nucleinsäure durch die lange Erhitzung gegeben war. Daneben wurden auch Verfahren bekannt, wonach man aus der Hefe zunächst die Nucleinsäure in der Form ihres Eisensalzes oder eines anderen Schwermetallsalzes abschied, dieses mit wäßriger Natriumacetatlösung auslaugte, vom abgeschiedenen Eisenhydroxyd absaugte und aus dem Filtrat die Nucleinsäure mit Salzsäure unter Zusatz von Alkohol fällte (Deutsche Patentschrift 448 947).According to these procedures, for which until today only living ones have been successful or fresh killed yeast was used, the nucleic acids go into solution and can be precipitated from this by acidification. The yields were at most about 2.4 to 4% 0 nucleic acid, based on yeast dry matter. In the event of an extension the extraction time could not increase the yield, since this is the risk a cleavage of the nucleic acid was given by the long heating. Next to it were also known method, according to which the nucleic acid in the yeast is first Form of their iron salt or another heavy metal salt parted with this Leached aqueous sodium acetate solution, sucked off the separated iron hydroxide and the nucleic acid was precipitated from the filtrate with hydrochloric acid with the addition of alcohol (German patent specification 448 947).

Zur Erhöhung der Nucleinsäureausbeute gegenüber der Extraktion mit Chemikalien schlug man ebenfalls vor, auf biologischem Wege, und zwar mit Hilfe von Bakterien, eineSpaltung derNucleinproteide in Protein und Ribonucleinsäure zu bewirken. Nach diesen Verfahren konnte bis zu 5,6°%o Nucleinsäure, bezogen auf Hefetrockensubstanz, gewonnen werden.To increase the nucleic acid yield compared to extraction with Chemicals were also suggested, biologically, with help of bacteria, a cleavage of the nucleic proteins into protein and ribonucleic acid cause. According to this method, up to 5.6% o nucleic acid, based on yeast dry matter, be won.

Das Verfahren gemäß der Erfindung bezweckt sowohl bei der Nucleinsäuregewinnung auf chemischem Wege als auch bei den biologischen Verfahren eine weitere relative Steigerung der Ausbeute, und zwar wird diese dadurch erreicht, daß die trockene Ausgangshefe vor der Extraktion mit einer Kolloidmühle oder sonstigen mechanischen Mitteln unter Zellengröße gemahlen wird.The method according to the invention is aimed at both nucleic acid recovery on chemical Ways as well as biological processes further relative increase in yield, which is achieved by that the dry starting yeast prior to extraction with a colloid mill or other mechanical means is milled below cell size.

Es ergeben sich, ohne Änderung der Extraktionsbedingungen, Nucleinsäureausbeuten, die bei keinem der bis heute bekanntgewordenen Verfahren erreicht werden können und den tatsächlichen Nucleinsäuregehalt der extrahierten Hefe im wesentlichen entsprechen dürften. Dies wird darauf zurückzuführen sein, daß nach der unter schonenden Bedingungen bewirkten Zellwandzerstörung die Nucleinsäure dem Extraktionsmittel bzw. den Wirkstoffen der Bakterien wesentlich leichter zugänglich ist, ohne durch das Mahlen selbst verändert oder zerstört zu werden. Besonders für die Erfassung der im Zellkern konzentrierten Nucleinsäure dürfte die Vorbehandlung von besonderer Bedeutung sein. Es ist erforderlich, größten Wert auf schonende Bedingungen während des Mahlprozesses zu legen und niedrige Temperaturen einzuhalten. Ein derartiges Aufschließen bzw. Mahlen von Trockenhefe gemäß Erfindung kann z. B. in einer Schwingmühle erreicht werden.Without changing the extraction conditions, nucleic acid yields which cannot be achieved with any of the processes known to date and substantially match the actual nucleic acid content of the extracted yeast should. This will be due to the fact that after the under mild conditions cell wall destruction caused the nucleic acid to the extractant or the active ingredients the bacteria is much more accessible without being altered by the grinding itself or to be destroyed. Especially for the detection of those concentrated in the cell nucleus Nucleic acid is believed to be of particular importance to the pretreatment. It is necessary, to put great emphasis on gentle conditions during the grinding process and low Temperatures to be observed. Such a disintegration or grinding of dry yeast according to the invention can, for. B. can be achieved in a vibrating mill.

Zur Verbesserung einer Lipoidextraktion war ein vorheriges Zerreiben der Trockenhefe mit Quarzsand schon vorgeschlagen worden. Aber diese Arbeitsweise gestaltete sich besonders schwierig, und die Verbesserung war nicht erheblich. Auch die Kugelmühle eignete sich nicht gut zur mechanischen Zellenzerstörung, da zu starke lokale Überhitzungen auftraten (Zeitschrift für Untersuchung der Lebensmittel 194,3, S. .f97). Für die Nucleinsäuregewinnung wurden diese Verfahren bis heute noch nicht in Vorschlag gebracht.Pre-trituration was used to improve lipoid extraction the dry yeast with quartz sand has already been proposed. But this way of working It turned out to be particularly difficult and the improvement was not substantial. Even the ball mill was not suitable for mechanical cell destruction because it was too strong local overheating occurred (Journal for the Study of Food 194.3, P. F97). To date, these methods have not been used for nucleic acid recovery brought into proposal.

Beispiele 20 g Trockenhefe mit einem Trockengehalt von 92,45°/0 einem Stickstoffgehalt von 8,86°/o und einem Phosphorgehalt von 2,1°%0 (P), bezogen auf atro Hefe, wird gemäß der Erfindung unter Zellengröße gemahlen und außerdem nach bekannter Methode ungemahlen, in je zwei Ansätzen auf biologischem Wege, d. h. mit Bakterien, extrahiert.Examples 20 g of dry yeast with a dry content of 92.45% Nitrogen content of 8.86% and a phosphorus content of 2.1% 0 (P), based on dry yeast, according to the invention, is ground below cell size and also after known method unground, in two batches by biological means, d. H. with Bacteria, extracted.

Die bakterielle Extraktion erfolgt in nachstehender Weise: 20 g Hefe werden, mit 200 ccm Wasser versetzt, auf PH = 7 gebracht, im Dampftopf in einem Abstand von 24 Stunden zweimal sterilisiert, mit dem Bakterium geimpft und 24 Stunden bei etwa 37 bis 40- im Brutschrank stehengelassen. -Nach dem Abzentrifugieren der Hefe wird zweimal ausgewaschen. Aus dem Zentrifugat und Waschwasser wird nach dem Abkühlen auf 5` die Nucleinsäure bei pH = 3 ausgefällt, abzentrifugiert und mit verdünnter H Cl gewaschen. Nach dem Überspülen in ein kleines Becherglas mit Meth0-alkohol wird sie sodann bei 1o5= konstant getrocknet.The bacterial extraction is carried out in the following way: 20 g yeast are mixed with 200 ccm of water, brought to pH = 7, in a steam pot in one Sterilized twice 24 hours apart, inoculated with the bacterium and 24 hours at about 37 to 40- left in the incubator. -After centrifuging the Yeast is washed out twice. After the centrifugate and wash water Cooling to 5` the nucleic acid precipitated at pH = 3, centrifuged and with washed dilute H Cl. After rinsing into a small beaker with meth0 alcohol it is then dried at 1o5 = constant.

Um eine Vergleichsmöglichkeit für die Reinheit und die Zusammensetzung der Nucleinsäure zu haben, wird schließlich jeweils noch der Stickstoff- und Phosphorgehalt und das Verhältnis \ : P bestimmt.To be able to compare the purity and the composition To have the nucleic acid, the nitrogen and phosphorus content will eventually be added and the ratio \: P is determined.

Es ergeben sich folgende Werte Nucleinsäure bakteriell extrahiert gemahlen ungemahlen bezog. '! o o °/o bezog. 0 0 Einwaage /o N /o P N ' P Einwaage /o o P N ' P I 7,I4 12,77 5,98 2,11:1 4,97 12,48 5,85 2,13:1 2 6,88 I2,3 5,95 2,()7:1 3,34 17,8 7.98 2,21:1 Die Versuche zeigen den günstigen Einfluß der Zellwandzerstörung durch Mahlen der Hefe unter Zellengröße, z. B. in einer Schwingmühle.The following values result Nucleic acid extracted bacterially ground unground related. '! oo ° / o related. 0 0 Weighing / o N / o PN 'P Weighing / oo PN' P I 7, I4 12.77 5.98 2.11: 1 4.97 12.48 5.85 2.13: 1 2 6.88 I2.3 5.95 2. ( ) 7: 1 3.34 17.8 7.98 2.21: 1 The experiments show the beneficial effect of cell wall destruction by grinding the yeast below the cell size, e.g. B. in a vibrating mill.

Eine Erhöhung der Nucleinsäureausbeute um 1,2 bis 1,8°/o ergibt sich ebenfalls beim vorherigen Mahlen der Trockenhefe vor einer Extraktion mit Chemikalien, z. B. Natronlauge oder Kochsalz.The nucleic acid yield is increased by 1.2 to 1.8% also with the previous grinding of the dry yeast before an extraction with chemicals, z. B. caustic soda or table salt.

Claims

PATnxTAxsPRUCIi: Process for the production of nucleic acid from yeast or yeast-like mushrooms by extraction with chemicals or on biological Paths with the help of bacteria, characterized in that the dry starting yeast before extraction with a colloid mill or other mechanical means Cell size is counted.