Verfahren zur Spaltung von Nueleinsäuren zu den Nucleosiden. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Spaltung von Nucleinsäuren zu den Nucleo- siden.
P. A. Levene und W. A. Jacobs gelang es 1910 zum ersten Male, die Hefenueleinsäure durch 31/2stündige ammoniakalisehe Hydro lyse im Autoklaven bei 175 bis 180 C zu den Nucleosiden aufzuspalten (Ber. d. Deutschen Chem. Ges., Bd.43, 3154, 1910).
Von P. A. Levene wurden später weitere Versuche durchgeführt, Hefenucleinsäure auf chemischem Wege durch mildere Methoden aufzuspalten. Diese ammoniakalische Hydro lyse im Autoklaven bei tieferer Temperatur (115 C) führte jedoch nur zu den Nucleo- tiden. Zu den gleichen Stoffen führten auch unter verschiedensten Bedingungen durchge führte Spaltungen in alkalischem Milieu. So mit war es bisher auf rein chemischem Wege nicht möglich, Nucleoside befriedigend darzu stellen (Ber. d.
Deutschen Chem. Ges., Bd.l, Jahrg. 71, Abt. A, 1938, Seite 408).
Zu besseren Ergebnissen führten Versuche von H. Bredereek, die Nucleinsäuren einer fer- mentativen Spaltung durch Emulsin bei etwa 30 bis 40 und einem pH von 4,0 bis 5,5 zu unterziehen. Aus 30 g Hefenucleinsäure betrug nach einer Arbeitsdauer von etwa 25 Tagen die Ausbeute an kristallinem Guanosin 5,5 g, worauf Adenosin als Pikrat mit einer Aus beute von 13 bis 15 g Rohprodukt ausgefällt wurde (Deutsche Patentschrift Nr. 649994 und Ber. d.
Deutschen Chem. Ges. 71, 408, 1938). Es wurde nun gefunden, dass eine Spal tung der Nucleinsäuren zu Nucleosiden mit Hilfe von bestimmten niederen Mikroorganis men zu überraschend günstigen Ergebnissen führt und die Ausbeuten an den einzelnen Komponenten wesentlich höher liegen als die mit Enzymzusätzen, wie z. B. Emulsin, erhalte nen Werte.
Gegenstand der Erfindung ist so mit ein Verfahren zur Herstellung von Nucleo- siden durch Spaltung von Nucleinsäuren, wel ches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nu- cleinsäuren unter sterilen Bedingungen mit Hilfe von Mikroorganismen bei mindestens an nähernd der optimalen Temperatur und dem optimalen pH-Wert der betreffenden Mikro organismen gespalten werden.
Es eignen sieh zum Beispiel bestimmte Bakterien aus der Ordnung der Eubacteriales, und zwar gewisse Staphylococeen, wie Staphylococcus (Micro- eoccus) candicans, oder aus der Ordnung Acti- nomycetales und andere, vornehmlich Proac- tionomyceten.
Als Nährstoff ist zum Beispiel Hefeextrakt geeignet, der den reinen Nucleinsäurelösungen nach erfolgter Neutralisation, beispielsweise mit Natriumhydroxyd, in geringer Menge zu gesetzt werden kann. Die Nucleinsäurekonzen- tration kann etwa 3 bis 8 % (auf Lösung be- zogen) betragen. Je nach der gewählten Kon zentration dauert die vollständige Spaltung etwa 14 bis 30 Tage. Das Ende der Spaltung ist daran erkennbar, dass das Substrat stark geliert.
Diese Gallerte wird durch Guanosin- bildung hervorgerufen. Nach Abtrennung des Guanosins mit Hilfe einer Zentrifuge können die andern Spaltprodukte in üblicher Weise gewonnen werden.
Während der Spaltung wird, wie gesagt, dafür Sorge getragen, dass der pH-Wert und die Temperatur wenigstens angenähert den optimalen Werten der verwendeten Mikro organismen entsprechen. Ausserdem werden geeignete Vorkehrungen für eine sterile Ar beitsweise getroffen, damit keine Fremdinfek tionen eintreten, die eine weitgehende Spal tung der Nucleinsäuren bis zu den Basen her vorrufen können. Die zu verarbeitende Nu- cleinsäure bzw. die entsprechenden Lösungen lassen sich beispielsweise mit Dampf sterili sieren.
Die erfindungsgemäss gewonnenen Nucleo- side sind gut zur Herstellung pharmazeuti scher Präparate geeignet. <I>Beispiel:</I> 30 g Nucleinsäure werden unter Zusatz von 10 g Hefeextrakt in 1000 cm33 Leitungs wasser gelöst und der pH-Wert mit Hilfe von Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Nach ausrei chender Sterilisation in strömendem Dampf wird die Lösung mit Proactinomyces ruber sp. beimpft und etwa 10 Tage bei 35 gehal ten.
Nach dieser Zeit ist die Spaltung der Nucleinsäure zu den Nucleosiden vollkommen. Ausbeute: Guanosin = 10,8 g und Adenosin = 7,0 g.
Process for the cleavage of nucleic acids to form nucleosides. The invention relates to a method for cleaving nucleic acids to form the nucleosides.
In 1910, PA Levene and WA Jacobs succeeded for the first time in breaking down yeast maleic acid into nucleosides by ammoniacal hydrolysis for 31/2 hours in an autoclave at 175 to 180 C (Ber. D. Deutsche Chem. Ges., Vol. 43, 3154, 1910 ).
Further attempts were made later by P. A. Levene to break down yeast nucleic acid chemically by milder methods. This ammoniacal hydrolysis in the autoclave at a lower temperature (115 C) only led to the nucleotides. Cleavages in an alkaline environment led to the same substances under a wide variety of conditions. So with it was previously not possible to represent nucleosides satisfactorily by purely chemical means (Ber. D.
Deutsche Chem. Ges., Vol. 1, year 71, section A, 1938, page 408).
Attempts by H. Bredereek to subject the nucleic acids to fermentative cleavage by emulsin at about 30 to 40 and a pH of 4.0 to 5.5 led to better results. From 30 g of yeast nucleic acid, after a working period of about 25 days, the yield of crystalline guanosine was 5.5 g, whereupon adenosine was precipitated as a picrate with a yield of 13 to 15 g of crude product (German Patent No. 649994 and Ber. D.
Deutsche Chem. Ges. 71, 408, 1938). It has now been found that a cleavage of the nucleic acids to nucleosides with the help of certain lower Mikroorganis men leads to surprisingly favorable results and the yields of the individual components are much higher than those with enzyme additives, such. B. Emulsin, get NEN values.
The invention thus relates to a process for the production of nucleosides by cleavage of nucleic acids, which is characterized in that the nucleic acids under sterile conditions with the aid of microorganisms at at least approximately the optimal temperature and the optimal pH the microorganisms concerned are split.
For example, certain bacteria from the order of the Eubacteriales are suitable, specifically certain Staphylococeen, such as Staphylococcus (Microeoccus) candicans, or from the order Actinomycetales and others, primarily processionomycetes.
A suitable nutrient is, for example, yeast extract, which can be added in small amounts to the pure nucleic acid solutions after neutralization, for example with sodium hydroxide. The nucleic acid concentration can be about 3 to 8% (based on solution). Depending on the concentration chosen, complete cleavage takes about 14 to 30 days. The end of the cleavage can be recognized by the fact that the substrate gels strongly.
This jelly is caused by the formation of guanosine. After the guanosine has been separated off with the aid of a centrifuge, the other cleavage products can be obtained in the usual way.
During the cleavage, as mentioned, care is taken that the pH value and the temperature correspond at least approximately to the optimal values of the microorganisms used. In addition, suitable precautions are taken for sterile work so that no foreign infections occur that can cause extensive cleavage of the nucleic acids down to the bases. The nucleic acid to be processed or the corresponding solutions can be sterilized with steam, for example.
The nucleosides obtained according to the invention are well suited for the production of pharmaceutical preparations. <I> Example: </I> 30 g of nucleic acid are dissolved in 1000 cm33 of tap water with the addition of 10 g of yeast extract and the pH is adjusted to 7.5 with the aid of sodium hydroxide solution. After sufficient sterilization in flowing steam, the solution is treated with Proactinomyces ruber sp. inoculated and kept at 35 for about 10 days.
After this time, the cleavage of the nucleic acid to form the nucleosides is complete. Yield: guanosine = 10.8 g and adenosine = 7.0 g.