DE923453C

DE923453C - Method for producing a mixture of streptokinase and streptodornase

Info

Publication number: DE923453C
Application number: DEA15803A
Authority: DE
Inventors: Frank Buonfiglio Ablondi; John Niel Adam Jun
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1951-06-08
Filing date: 1952-05-17
Publication date: 1955-02-14

Description

Verfahren zur Erzeugung einer Mischung von Streptokinase und Streptodornase Die Erfindung betrifft die- Erzeugung von Streptokinase und Streptodornase durch Bakterienwachstum.Method for producing a mixture of streptokinase and streptodornase The invention relates to the production of streptokinase and streptodornase by Bacterial growth.

In den letzten Jahren erlangte der Abbau gewisser Materialien mittels Enzymen beträchtliches Interesse. Unter diesen Enzymen sind die bemerkenswertesten Streptokinase und Streptodornase. Streptokinase wirkt indirekt auf ein Substrat von Fibrin oder Fibrinogen, indem es ein fibrinolytisches Enzym im menschlichen Serum aktiviert, das Fibrin in kleinere Fragmente spalten kann und auf diese Weise rasche Auflösung von Blutgerinnseln und Fibrinexsudaten bewirkt. Streptodornase wirkt direkt auf ein Substrat von Desoxyribonucleoprotein und Desoxyribonucleinsäure, welche die Hauptbestandteile der Zellkerne sind und 3o bis 7o% des Sediments eitriger Exsudate darstellen. Streptodornase spaltet das Nucleoprotein in freie Purinba;sen und Pyrimidinnucleoside und verursacht so einen beträchtlichen Abfall der Viskosität eitriger Exsudate.In recent years, certain materials have been degraded by means of Enzymes of considerable interest. Among these enzymes are the most notable Streptokinase and streptodornase. Streptokinase acts indirectly on a substrate of fibrin or fibrinogen by being a fibrinolytic enzyme in human Activated serum, which can split fibrin into smaller fragments and in this way causes blood clots and fibrin exudates to dissolve rapidly. Strep thorn nose acts directly on a substrate of deoxyribonucleoprotein and deoxyribonucleic acid, which are the main constituents of the cell nuclei and 3o to 7o% of the sediment purulent Present exudates. Streptodornase splits the nucleoprotein into free purine bases and pyrimidine nucleosides, causing a considerable drop in viscosity purulent exudates.

Auf Grund der obengenannten Eigenschaften haben sich Mischungen von Streptokinase und Streptodornase bei der experimentellen Behandlung gewisser Verbrennungen, bei der Drainage eitriger Höhlen, bei der Behandlung chronischer infizierter Knochenabszesse oder Osteomyelitiden, bei der Drainage von Blutgerinnseln aus internen Wunden und bei der Drainage von Verstopfungen der Wirbelsäule, welche bei verschiedenen Arten von Meningitis auftreten, als brauchbar erwiesen. Ganz allgemein sind Mischungen dieser beiden Enzyme nützlich bei der Behandlung von Empyem-en, Hämoth.orax, Hämatomen und chronischen, eitrigen Infektionen.Due to the properties mentioned above, mixtures of Streptokinase and streptodornase in the experimental treatment of certain burns, in the drainage of purulent cavities, in the treatment of chronic infected bone abscesses or osteomyelitis, in the drainage of blood clots from internal wounds and in the drainage of blockages of the spine, which in different types of meningitis have been shown to be useful. Mixtures are very general these two enzymes useful in the treatment of empyem-s, hemoth.orax, hematomas and chronic, purulent infections.

Die Verwendung von Streptodornase und Streptokinase wurde in erster Linie auf experimentelle Prüfungen beschränkt, da diese Verbindungen noch nicht im Handel erhältlich sind. Obwohl über die Verwendung dieser beiden Verbindungen bereits 1933 berichtet wurde, ist vor der Erfindung noch keine wirtschaftliche Methode zur Erzeugung derselben entwickelt worden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Methode zur Erzeugung von Mischungen von Streptokinase und Streptodornase entwickelt, -wodurch diese Enzyme mit ihren vielen günstigen Eigenschaften im wirtschaftlichen Maßstab zur allgemeinen Verwendung hergestellt werden können.The use of streptodornase and streptokinase was made first Line limited to experimental tests as these compounds are still available not are commercially available. Though about using these two compounds was reported as early as 1933, before the invention was not yet an economical method have been developed to produce the same. According to the present invention developed a method for generating mixtures of streptokinase and streptodornase, -which these enzymes with their many beneficial properties in the economic Scale for general use can be manufactured.

Soweit bekannt, besteht die einzige praktische Methode zur Erzeugung von Streptokinase und Streptodornase durch Züchtung bestimmter Stämme von ß hämolytischen Streptococcen in einem geeigneten Nährboden. Die meist verwendeten Streptococcen sind diejenigen der Lancefield-Gruppen A, »human« C und G, wobei der Stamm C bevorzugt ist. Es wurden viele Nährböden versucht, und die Ergebnisse der Kultur in derartigen Nährböden wurden in der Literatur beschrieben. Die Autoren stimmen darin überein, daß die günstigsten Nährböden für die Züchtung von Streptokinase/Streptodornase erzeugenden Organismen wäßrigeMischungen von teilweise hydrolysierten tierischen Eiweißstoffen, z. B. von teilweise hydrolysierten Blutprodukten u. dgl., darstellen. Während die Nährböden, welche hydrölysierte tierische Eiweißstoffe wie die obengenannten enthalten, bei der Erzeugung in kleinem Maßstabe gute Ergebnisse liefern, z. B. bei der Züchtung in 3o-1-Gefäßen, so wurde gefunden, daß derartige Nährböden keine zufriedenstellenden Ergebnisse liefern, wenn in größerem Maßstab gearbeitet wird, z. B. mit Kulturen von 3781. Wenn derartige bekannte Nährböden bei einem Versuch zur Erzeugung von Streptokinase- und Streptodörnasemischungen im großen Maßstab verwendet werden, so -werden entsprechend viel kleinere Mengen der Enzyme durch die Streptococcen gebildet. Da es nur durch wirtschaftliche Erzeugung im großen Maßstab möglich ist, daß die vorteilhaften Eigenschaften von Streptokinase und Streptodornase allgemein zugänglich werden, ist es offensichtlich, daß ein für die Herstellung im großen geeigneter Nährboden einen beträchtlichen technischen Fortschritt darstellen würde.As far as is known, the only practical method of generating it is of streptokinase and streptodornase by cultivating certain strains of ß hemolytic Streptococci in a suitable culture medium. The most widely used streptococci are those of Lancefield groups A, "human" C and G, with strain C being preferred is. Many media have been tried and the results of culture in such media Culture media have been described in the literature. The authors agree that the most favorable culture media for the cultivation of streptokinase / streptodornase organisms producing aqueous mixtures of partially hydrolyzed animal species Proteins, e.g. B. of partially hydrolyzed blood products and the like. While the culture media, which hydrolyzed animal proteins such as those mentioned above contain good results when produced on a small scale, e.g. B. When growing in 3o-1 vessels, it was found that such nutrient media are not deliver satisfactory results when working on a larger scale, z. B. with cultures of 3781. If such known culture media in an experiment for the production of streptokinase and streptodorase mixtures on a large scale are used, then correspondingly much smaller amounts of the enzymes are passed through the streptococci formed. Since it is only through economic production on a large scale It is possible to measure the beneficial properties of streptokinase and streptodornase become widely available, it is evident that one for manufacture represent a considerable technical advance in a large, suitable medium would.

Gemäß der Erfindung wird ein Nährboden verwendet, der für die Züchtung von Streptokinase und Streptodornase.erzeugenden Bakterien im großen geeignet ist und welcher durch Enzyme hydrolysiertes Kasein, Glycin und ein Sulfhydrylreduktionsmittel enthält. Es wurde gefunden, daß es durch die Verwendung derartiger Nährböden möglich ist, Mischungen von Streptokinase und Streptodornase erstmalig im großen herzustellen. Es -wurden viele Züchtungsversuche zur Erzeugung von Mischungen von Streptokinase und Streptodornase unter Verwendung dieser neuen Nährböden in 3781 und selbst 378o 1 fassenden Tanks unter Erzielung sehr befriedigender Ergebnisse durchgeführt.According to the invention, a nutrient medium is used for the cultivation of streptokinase and streptodornase producing bacteria is suitable in large and which is enzyme hydrolyzed casein, glycine and a sulfhydryl reducing agent contains. It has been found that it is possible through the use of such nutrient media is to produce mixtures of streptokinase and streptodornase on a large scale for the first time. There have been many attempts at breeding to produce mixtures of streptokinase and streptodornase using these new media in 3781 and even 378o 1 tank with very satisfactory results.

Das hydrolysierteKasein ist der hauptsächlichste Bestandteil der neuen Nährböden, und es dient zur Lieferung des Grundstickstoffs. Es können handelsübliche, durch Enzyme hydrolysierte Kaseinabbaupräparate verwendet -werden. Diese Präparate werden gewonnen, indem man eine wäßrige Dispersion von Kasein herstellt und dazu zwecks Katalysierung der Hydrolyse Pankreassäfte zugibt. Ins einzelne gehende Verfahren zur Herstellung von durch Enzym hydrolysiertem abgebautem Kasein sind aus der Literatur ersichtlich, z. B. aus den USA.-Patentschriften 248988o und 2 iSo637.The hydrolyzed casein is the main component of the new ones Culture media, and it is used to supply the basic nitrogen. Commercially available, casein breakdown preparations hydrolyzed by enzymes may be used. These preparations are obtained by making an aqueous dispersion of casein and adding it Pancreatic juices are added to catalyze the hydrolysis. Detailed procedures for the preparation of enzyme hydrolyzed degraded casein are from the literature can be seen, e.g. From U.S. Patents 248988o and 2 iSo637.

Obwohl das hydrolysierte Kasein den Hauptbestandteil der neuen Nährböden darstellt, sind auch die beiden anderen Bestandteile, nämlich Glycin und ein organisches Sulfhydrylreduktionsmittel, notwendig. Die Menge des bei der Herstellung des neuen Nährbodens verwendeten Glycins kann in weiten Grenzen variieren, z. B. i bis 35o Gewichtsteile Glycin auf iooo Gewichtsteile abgebautes Kasein. Es wurde gefunden, daß die optimale Menge bei etwa ioo bis Zoo Teilen Glycin auf iooo Teile abgebautes Kasein liegt. Die Menge des in dem Nährboden verwendeten organischen Sulfhydrylreduktionsmittels kann auch in weiten Grenzen variieren, z. B. o,oi bis o,5 Molgewichte (Mole, wenn das Gewicht des abgebauten Kaseins in Gramm ausgedrückt ist) an Sulfhydrylredulctionsmittel je iooo Gewichtsteile abgebautes Kasein. Es wurde gefunden, daß das optimale Mengenverhältnis 0,03 bis 0,07 Molgewicht je iooo Gewichtsteile abgebautes Kasein beträgt. Der Zusatz des reduzierenden Mittels dient dem Zweck, den Nährboden in reduzierter Form zu 'halten, und es kann ein beliebiges der bekannten Sul'fhydrylreduktionsmittel verwendet werden (vgl. z. B. B o r s ook u. a., Journ. of Biological Chemistry, Bd. 117, S. 28I bis 3o8).Although hydrolyzed casein is the main ingredient in the new culture media, the other two ingredients, glycine and an organic sulfhydryl reducing agent, are also necessary. The amount of glycine used in the preparation of the new nutrient medium can vary within wide limits, e.g. B. 1 to 35o parts by weight of glycine per 100 parts by weight of degraded casein. It has been found that the optimal amount is about 100 to 100 parts glycine for every 100 parts degraded casein. The amount of the organic sulfhydryl reducing agent used in the nutrient medium can also vary within wide limits, e.g. B. 0.1 to 0.5 molar weights (moles, if the weight of the degraded casein is expressed in grams) of sulfhydryl reducing agent per 100 parts by weight of degraded casein. It has been found that the optimal quantitative ratio is 0.03 to 0.07 molar weight per 100 parts by weight of degraded casein. The purpose of adding the reducing agent is to keep the nutrient medium in reduced form, and any of the known sulfhydryl reducing agents can be used (cf., for example, B ors ook et al., Journ. Of Biological Chemistry, Vol. 117, pp. 28I to 3o8).

Die Tatsache, daß Nährböden, welche ein durch Enzym hydrolysiertes abgebautes. Kasein, Glycin und ein Sulfhydrylreduktionsmittel enthalten, derartig günstige Ergebnisse liefern, ist überraschend, insbesondere im Hinblick darauf, daß man bereits versucht hatte, Medien von mit Säure hydrolysiertem abgebautem Kasein bei der Erzeugung von Mischungen von Streptokinase und Streptodornase zu verwenden, und man fand, daß diese in den meisten Fällen vollständig unbrauchbar waren. Obwohl die Gründe für die überraschende Überlegenheit der Nährböden nach der Erfindung nicht völlig geklärt sind, ist es möglich, unter Ver-vendü#ig der drei angegebenen Bestandteile Streptokini.se und Streptodornase in industriellem Maßstab mit guter Ausbeute herzustellen.The fact that culture media containing an enzyme hydrolyzed degraded. Casein, glycine and a sulfhydryl reducing agent contain such deliver favorable results is surprising, especially with regard to that one had already attempted media of acid hydrolyzed degraded casein to be used in the production of mixtures of streptokinase and streptodornase, and in most cases these were found to be completely useless. Even though the reasons for the surprising superiority of the nutrient media according to the invention are not fully clarified, it is possible to use the three specified Ingredients Streptokini.se and Streptodornase on an industrial scale with good To produce yield.

Der wichtigste Vorteil der neuen erfindungsgem4.ßen Nährböden ist die vergrößerte Ausbeute, welche man bei der Herstellung im großen erzielt. Bei den neuen erfindungsgemäßenNährböden erhält man im allgemeinen beim Arbeiten in technischem Maßstab, z. B. bei einer Fermentation in einem 378-1-Tank, fast dreimal so große Ausbeuten an Streptokinase pro Volumteil als diejenigen Ausbeuten, welche man mit einem Nährboden erhält, der aus einem tierischen Eiweißpräparat, z. B. aus Bluteiweiß, !hergestellt war. Die Züchtung in Nähr- Böden. welche ein durch Enzym hydrolysiertes abgebautes Kasein, Glycin und ein Sulfhydry 1-reduktionsmittel enthalten, ergibt im allgemeinen bei einem Ansatz in einem 378-1-Tank fast zweimal soviel Streptokinaseaktivitätseinheiten je Volumteil des IVlediums als die Züchtung in Nährböden, «-elche ein tierisches Eiweiß enthalten und in 30-1-Kolben durchgeführt wurden.The most important advantage of the new nutrient media according to the invention is the increased yield obtained in large-scale manufacture. at the new culture media according to the invention are generally obtained when working in technical scale, e.g. B. when fermenting in a 378-1 tank, almost three times as large yields of streptokinase per volume part as those yields which is obtained with a nutrient medium that consists of an animal protein preparation, e.g. B. off Blood protein,! Was produced. Breeding in nutritional Floors. Which an enzyme hydrolyzed degraded casein, glycine and a sulfhydry 1 reducing agent generally makes almost twice when used in a 378-1 tank as many units of streptokinase activity per volume part of the IVledium as the cultivation in nutrient media, "moose contain an animal protein and carried out in 30-1 flasks became.

Obwohl die Vorteile der neuen Nährböden beim Arbeiten im kleinen Maßstab nicht so schnell ersichtlich werden, da Nährböden, welche ein. tierisches Eiweißpräparat enthalten, fast äquivalente Ausbeuten an wirksamem Material pro Einheit Grundstickstoff unter diesen Verhältnissen liefern, besitzen die neuen erfindungsgemäßen Nährböden auch beim Arbeiten im kleinen Maßstab Vorteile. Dies wird aus der folgenden Beschreibung ersichtlich, worin weitere Vorteile der neuen erfindungsgemäßen Nährböden angegeben sind, welche sowohl für das Arbeiten im technischen Maßstab als auch im kleinen Maßstab gelten.Although the advantages of the new culture media when working on a small scale not become apparent so quickly, as breeding grounds, which one. animal protein preparation contain almost equivalent yields of active material per unit of basic nitrogen deliver under these conditions, possess the new nutrient media according to the invention advantages even when working on a small scale. This will be seen from the following description can be seen in which further advantages of the new nutrient media according to the invention are given which are suitable for working on an industrial scale as well as on a small scale Standards apply.

Zusätzlich zu dem Vorteil der höheren Anfangsausbeuten an Enzymen bei Verwendung eines Fermentationsmediums, das abgebautes Kasein enthält, werden noch weitereVorteile erzielt. Beispielsweise kann ein Nährboden, der abgebautes Kasein enthält, leichter hergestellt werden als ein solcher, bei dem tierisches abgebautes Eiweiß, z. B. ein aus Blut hergestellter, verwendet wird. Das abgebaute Kasein ist leichter zu handhaben, zu sterilisieren und zu dispergieren. Hierdurch ergeben sich sehr erhebliche Preissenkungen bei der Herstellung des Nährbodens. Hierzu kommt noch, daß die Kosten für das durch Enzym hydrolysierte abgebaute Kasein selbst im allgemeinen niedriger sind.In addition to the benefit of higher initial enzyme yields when using a fermentation medium that contains degraded casein still other advantages achieved. For example, a nutrient medium that is degraded Contains casein, can be produced more easily than one containing animal degraded protein, e.g. B. one made from blood is used. The dismantled Casein is easier to handle, sterilize and disperse. Through this there are very significant price reductions in the production of the nutrient medium. Add to this the cost of the enzyme hydrolyzed degraded casein themselves are generally lower.

Tierisches abgebautes Eiweiß, welches im Handel erhältlich ist, enthält viele Eiweißsubstanzen, welche annähernd dasselbe Molekulargewicht und dieselbe Konstitution wie die gewünschten Enzyme, Streptokinase und Streptodornase, aufweisen. Diese Eiweißstoffe werden durch dieselben Verfahren ausgefällt, welche für die Ausfällung der gewünschten Enzyme dienen; und sie haben ebenfalls ähnliche elektrophoretische Eigenschaften. Dies vergrößert natürlich die Schwierigkeiten zur Herstellung und Reinigung von Streptokinase und Streptodornase sehr und macht einen größeren Chemikalienaufwand erforderlich. Diese Schwierigkeiten werden noch gesteigert durch die niedrigen Ausbeuten, welche mit einem ein tierisches abgebautes Eiweiß enthaltenden Nährboden erhalten werden. Wie schon angeführt, war es bisher unmöglich, durch die an sich bekannten Reinigungsmethoden ein Produkt von genügender Reinheit für die klinische Verwendung aus einem 378-1-Ansatz herzustellen, wenn ein Nährboden verwendet wurde, der tierisches, z. B. ein aus Blut hergestelltes, abgebautes Eiweiß enthielt.Contains degraded animal protein which is commercially available many protein substances which have approximately the same molecular weight and the same Have constitution like the desired enzymes, streptokinase and streptodornase. These proteins are precipitated by the same processes that are used for precipitation serve the desired enzymes; and they also have similar electrophoretic ones Properties. This, of course, increases the manufacturing difficulties and Cleansing streptokinase and streptodornase very and makes a greater chemical expense necessary. These difficulties are exacerbated by the low yields, which are obtained with a nutrient medium containing an animal degraded protein will. As already mentioned, it was previously impossible to use the known ones Purification methods a product of sufficient purity for clinical use from a 378-1 batch if a culture medium was used that contains animal, z. B. contained a degraded protein made from blood.

In der folgenden Tabelle ist die Reinheit einer Streptokinase wiedergegeben, welche unter äquivalenten Bedingungen einmal aus einem Nährboden mit einem tierischen abgebauten Eiweiß und einmal aus einem Nährboden nach der Erfindung erhalten werden konnte. Das verwendete tierische abgebaute Eiweiß war ein im Handel erhältliches. Präparat, welches v an der Firma Difco Laboratories, Detroit, Michigan, hergestellt und unter dem Namen INTeopeptone verkauft wird. Neopeptone wurde verschiedentlich zur Erzeugung von Streptokinase und Streptodornase als Quelle für den Grundstickstoff sehr empfohlen. Die Reinheit ist in Einheiten Streptokinase pro Gamma Gesamtstickstoff angegeben. Tabelle I Nährboden Reinheit 3o Liter I 378,5 Liter Stand der Technik i2 E/ Gamma ± io E/Gamma rL nach Erfindung ioo E/Gamma ±ioo E/Gamma ± Hieraus wird ersichtlich, daß es nach der vorliegenden Erfindung möglich ist, ein Produkt zu erhalten, das etwa zehnmal reiner ist als ein Produkt, das durch bisher bekannte Verfahren erhalten wurde.The following table shows the purity of a streptokinase which, under equivalent conditions, could be obtained once from a nutrient medium with an animal degraded protein and once from a nutrient medium according to the invention. The animal degraded protein used was a commercially available one. A preparation manufactured by Difco Laboratories, Detroit, Michigan, and sold under the name INTeopeptone. Neopeptone has been recommended on various occasions for the generation of streptokinase and streptodornase as a source of basic nitrogen. The purity is given in units of streptokinase per gamma of total nitrogen. Table I. Breeding ground purity 3o liters I 378.5 liters State of the art i2 E / Gamma ± io E / Gamma rL according to invention ioo E / gamma ± ioo E / gamma ± From this it can be seen that, according to the present invention, it is possible to obtain a product which is about ten times purer than a product obtained by previously known methods.

Zusätzlich zu dem durch Enzym hydrolysierten abgebauten Kasein, 'dem Glycin und dem Sulfhydrylreduktionsmittel können dem Nährboden noch verschiedene andere Bestandteile oft mit Vorteil zugegeben werden. Diese zusätzlichen Mittel sollen im folgenden als wachstumsfördernde Bestandteile bezeichnet werden und umfassen Substanzen, wie Vitamine, anorganische Salze, Aminosäuren und Spurenelemente. In der folgenden Tabelle sind eine Anzahl derartiger Materialien und die oft mit Vorteil verwendeten Mengen derselben angeführt. Tabelle II Wachstums- Gewichtsteile fördernde für je iooo Teile Substanz abgebautes Kasein KH2P04 ........... 8o bis 16o KHC03 ............ 5o bis ioo Uracil . . . . . . . . . . . . . . . o,2 bis o,6 Adeninsulfat . . . . . . . . . o,2 bis o,6 Nicoti.nsäu:re . . . . . . . . o,o2 bis o,o6 Pyridoxin . . . . . . . . . . . 0,03 bis 0,07 Tryptophan . . . . . . . . . . 0,4 bis i,o Calciumpantothenat . . o,i bis 0,3 Thiaminhydrochlorid . o,o5 bis o,i5 Riboflavin . . . . . . . . . . . o,oi bis 0,03 Cystin . . ............ 2 bis 6 Spurenelemente werden im allgemeinen in Form einer Salzmischung zugegeben, um sehr kleine Mengen von Metallionen, wie von Eisen, Magnesium, Kupfer, Zink usw., zu liefern. Oft wurde es als zweckmäßig gefunden, eine Salzmischung aus Salzen der oben angeführten Metalle herzustellen und eine kleine Menge dieser Mischung zu jeder Fermentation zuzugeben. In der folgenden Tabelle ist die Zusammensetzung einer Salzmischung angegeben, welche bei den erfindungsgemäßen Versuchen unter Verwendung von q.o bis i50 ccm pro Kilogramm abgebautes Kasein als zufriedenstellend gefunden wurde. Tabelle III Material: Menge: Mg S O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . i 1,5 kg CU S O4 - 5 H2 O ... . . . . . . . . 0,o5 kg Zn S O4 - 7 H2 O . . . . . . . . . . . 0,05 kg Mn C14 - q. H2 O . . . . . . . . . . . . 0,02 kg Fe S O4 - 7H20 . . . . . . . . . . . 0,05 kg H cl ........ ........... 1,0 1 mit Wasser auffüllen auf .... ioo,o 1 Die folgende Tabelle zeigt Ergebnisse von Wachstumsversuchen mit einem Streptokinase und Streptodornase erzeugenden Stamm von hämolytischen Streptococcen, und zwar zuerst mit einem Nährboden nach der Erfindung und dann mit einem solchen nach dem beschriebenen Stand der Technik. Die beiden Nährböden wurden so angesetzt, daß die Grundstickstoffkonzentration bei beiden dieselbe war und daß in allen Fällen gleiche Mengen der verschiedenen wachstumsfördernden Substanzen vorhanden waren. Die Ergebnisse in der folgenden Tabelle sind für Wachstumsversuche in 3o-I-Behältern und in 378-1-Tanks angegeben. Tabelle IV Erfindung Stand der Technik 301 1 378,51 301 1 37$.51 Bakterienzahl . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 X i09/ccm ig X i09/ccm 32 X zo9/cem 40 X 10"/ccm Streptokinase................. 600 E/ccm ii7o E/ccm 60o E/ecm 430 E/ecm Gesamtausbeute . . . . . . . . . . . . . . . 18 X ios 385 X los _ 18 X ios 150 X Tos Es ergibt sich, daß die Nährböden nach der Erfindung bei den Ansätzen in den 3o-l-Behältern gleich gute Ausbeuten lieferten wie der Nährboden nach dem Stand der Technik. Bei den Ansätzen in den 378-1-Tanks wurden mit dem erstgenannten Nährboden weit bessere Ergebnisse erzielt. Während die Erzeugung von Streptokinase pro Volumeinheit in dem Nährboden nach dem Stand der Technik scharf absank, wenn die Fermentation von den 3o-1-Behältern auf 378-1-Tanks übertragen wurde, wurde die Erzeugung an Streptokinase pro Volumeinheit in einem Nährboden nach der Erfindung fast verdoppelt, wenn die Erzeugung von einem 3o-1-Behälter in einen 378-1-Tank wechselte. Dies ist überraschend im Hinblick darauf, daß die Bakterienzahl bei dem bekannten Nährboden in dem 378-1-Tank mehr als das Doppelte derjenigen bei dem Nährboden nach der Erfindung im 378-1-Ansatz betrug.In addition to the enzyme hydrolyzed degraded casein, glycine and sulfhydryl reducing agent, various other ingredients can often be advantageously added to the nutrient medium. These additional agents are hereinafter referred to as growth-promoting ingredients and include substances such as vitamins, inorganic salts, amino acids and trace elements. The following table lists a number of such materials and the amounts thereof which are often advantageously used. Table II Growth parts by weight promotional for iooo parts each Substance degraded casein KH2P04 ........... 8o to 16o KHC03 ............ 5o to ioo Uracil. . . . . . . . . . . . . . . o, 2 to o, 6 Adenine sulfate. . . . . . . . . o, 2 to o, 6 Nicoti.nsäu: right. . . . . . . . o, o2 to o, o6 Pyridoxine. . . . . . . . . . . 0.03 to 0.07 Tryptophan. . . . . . . . . . 0.4 to i, o Calcium pantothenate. . o, i to 0.3 Thiamine hydrochloride. o, o5 to o, i5 Riboflavin. . . . . . . . . . . o, oi to 0.03 Cystine . . ............ 2 to 6 Trace elements are generally added in the form of a salt mixture to provide very small amounts of metal ions such as iron, magnesium, copper, zinc, etc. It has often been found convenient to prepare a salt mixture from salts of the metals listed above and add a small amount of this mixture to each fermentation. The following table shows the composition of a salt mixture which was found to be satisfactory in the tests according to the invention using qo to 150 ccm per kilogram of degraded casein. Table III Material: Quantity: Mg S O4. . . . . . . . . . . . . . . . . . i 1.5 kg CU S O4 - 5 H2 O .... . . . . . . . 0.05 kg Zn S O4-7 H2 O. . . . . . . . . . . 0.05 kg Mn C14 - q. H2 O. . . . . . . . . . . . 0.02 kg Fe S O4 - 7H20 . . . . . . . . . . . 0.05 kg H cl ........ ........... 1.0 1 fill up with water to .... ioo, o 1 The following table shows the results of growth tests with a streptokinase and streptodornase-producing strain of hemolytic streptococci, first with a nutrient medium according to the invention and then with one according to the prior art described. The two nutrient media were set up in such a way that the basic nitrogen concentration was the same in both and that the same amounts of the various growth-promoting substances were present in all cases. The results in the following table are given for growth experiments in 3o-liter containers and in 378-1 tanks. Table IV Invention prior art 301 1 378.51 301 1 37 $ .51 Bacteria count. . . . . . . . . . . . . . . . . 28 X i09 / ccm ig X i09 / ccm 32 X zo9 / cem 40 X 10 "/ ccm Streptokinase ................. 600 U / ccm ii7o U / ccm 60o U / ecm 430 U / ecm Total yield. . . . . . . . . . . . . . . 18 X ios 385 X los _ 18 X ios 150 X Tos It turns out that the nutrient media according to the invention in the batches in the 30-liter containers gave the same good yields as the nutrient media according to the prior art. With the batches in the 378-1 tanks, far better results were achieved with the first-mentioned culture medium. While the production of streptokinase per unit volume in the nutrient medium according to the prior art fell sharply when the fermentation was transferred from the 3o-1 containers to 378-1 tanks, the production of streptokinase per unit volume in a nutrient medium according to the invention almost doubled when production switched from a 3o-1 tank to a 378-1 tank. This is surprising in view of the fact that the number of bacteria in the known culture medium in the 378-1 tank was more than double that in the culture medium according to the invention in the 378-1 batch.

Die Menge an abgebautem Kasein pro Volumein'heit des Nährbodens kann innerhalb verhältnismäßig weiter Grenzen variiert werden. Wenn man in erster Linie an der Reinheit des Produktes interessiert ist, sind niedrige Konzentrationen des abgebauten Kaseins empfehlenswert, z. B. 2 bis 6 Gewichtsteile abgebautes Kasein für je 300 Vo:lumteile Nährboden. Dies kann von Vorteil sein, wenn man ein Produkt erzeugt, das für intravenöse Injektionen verwendet werden soll. Wenn man andererseits an einer möglichst hohen Gesamtausbeute an Streptokinase pro Einheit verwendeten Grundstickstoffs interessiert ist, sollen verhältnismäßig hohe Konzentrationen an abgebautem Kasein verwendet werden, z. B. io bis 2o Gewichtsteile abgebautes Kasein für je 300 Volumteile Nährboden.The amount of degraded casein per volume unit of the nutrient medium can be varied within relatively wide limits. If one is primarily interested in the purity of the product, low concentrations of the degraded casein are recommended, e.g. B. 2 to 6 parts by weight of degraded casein for every 300 parts by volume of nutrient medium. This can be beneficial in creating a product to be used for intravenous injections. On the other hand, if one is interested in the highest possible total streptokinase yield per unit of base nitrogen used, relatively high concentrations of degraded casein should be used, e.g. B. 10 to 20 parts by weight of degraded casein for every 300 parts by volume of nutrient medium.

Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse verschiedener Wachstumsversuche in 378-1-Tanks, wobei die Menge an abgebautem Kasein variiert wurde. Die Zahlen, welche in der Kolonne Reinheit angegeben sind, stellen die Zahl der Einheiten Streptokinase pro Gamma Stickstoff in dem nicht gereinigten wirksamen Niederschlag dar. Tabelle V Gewichtsteile Einheiten abgebautes ßtrepto- Kasein für Bakterien- kinase pro Reinheit des je 300 Volum- zahl Kubik- Niederschlags teile Nähr- zenti- boden meter 4,0 20 X 109 400 50 E/Gamma 8,7 4o-6o x 1O9 I200 20-40E/Gamma 16,o 8o X i09 2200 5-25 E/Gamma Aus dieser Tabelle wird ersichtlich, daß die optimale Menge an zu verwendendem durch Enzym hydrolysiertem abgebautem Kasein davon abhängt, ob man in erster Linie an einem reinen Produkt oder an einer maximalen Ausbeute interessiert ist.The following table shows the results of various growth tests in 378-1 tanks, with the amount of degraded casein being varied. The numbers given in the Purity column represent the number of units of streptokinase per gamma of nitrogen in the unpurified effective precipitate. Table V Parts by weight units degraded ßrepto- Casein for bacterial kinase per purity des 300 cubic volume of precipitation each share nutritional ground meter 4.0 20 X 1 0 9 400 5 0 E / gamma 8.7 4o-6o x 1O9 I200 20-40E / gamma 16, o 8o X i09 2200 5-25 E / Gamma From this table it can be seen that the optimal amount of enzyme hydrolyzed degraded casein to use depends on whether one is primarily interested in a neat product or in maximum yield.

Eine zweckmäßige Art der Darstellung des Nährbodens wird durch folgende Arbeitsschritte erläutert. Man löst die gewünschte Menge an durch Enzym hydrolysiertem abgebautem Kasein in etwa der fünffachen Gewichtsmenge heißem Wasser; man sterilisiert durch Behandlung im Autoklav oder durch Filtrieren; man fügt sterile Lösungen des erforderlichen Glycins und des Sulfhydrylreduktionsmittels hinzu; ferner fügt man sterileLösungen der wachstumsfördernden Materialien zu; schließlich stellt man den pH-Wert auf etwa 7 bis 8 ein. Der Nährboden ist dann zum Beimpfen fertig. Das oben angegebene Verfahren kann natürlich auch variiert werden; beispielsweise können alle Bestandteile vor der Sterilisation zugegeben werden, wenn der Nährboden durch Filtrieren sterilisiert werden soll. Wenn der Nährboden durch Behandlung im Autoldav sterilisiert werden soll, kann das Glycin vor der Sterilisation zugegeben werden. Wenn die gewonnenen Fermente besonders rein sein sollen, kann es gelegentlich vorteilhaft sein, die Nährböden vor dem Filtrieren auf 2o° oder tiefer zu kühlen; wenn jedoch eine maximale Ausbeute in erster Linie wichtig ist, so ist dies nicht empfehlenswert. Das Impfmaterial wird hergestellt, indem man eine getrocknete Kultur der Bakterien in wenigen Litern eines Nährbodens der oben angegebenen Art suspendiert, der zusätzlich etwa 2o bis 7o Gewichtsteile eines Zuckers pro iooo Teile Grundstickstoff enthält, und daß man die Bakterien bei einer Temperatur von 35 bis 39° etwa 8 Stunden lang wachsen läßt, so daß die Bakterienzahl etwa 2 X zog bis 2 X ioi0 pro Kubikzentimeter beträgt. Zum Beimpfen des Nährbodens wird dann ein solches Volumen dieses Impfmaterials verwendet, daß eine ursprüngliche Bakterienzahl von etwa 6 X 1o7 bis 8 X ios pro Kubikzentimeter vorliegt.The following is an expedient way of representing the nutrient medium Working steps explained. Dissolve the desired amount of enzyme hydrolyzed degraded casein in about five times the weight of hot water; one sterilizes by treatment in the autoclave or by filtration; one adds sterile solutions of the add required glycine and sulfhydryl reducing agent; furthermore one adds sterile solutions of the growth promoting materials; after all, you put the pH to around 7 to 8. The nutrient medium is then ready for inoculation. That above The specified method can of course also be varied; for example can All ingredients are added before sterilization when the culture medium is through Filtration is to be sterilized. If the breeding ground is created by treatment in the Autoldav is to be sterilized, the glycine can be added before sterilization. If the ferments obtained are to be particularly pure, it can occasionally be beneficial be sure to cool the culture media to 20 ° or lower before filtering; but when a maximum yield is primarily important, so this is not recommended. That Inoculum is made by placing a dried culture of the bacteria in suspended a few liters of a nutrient medium of the type specified above, which in addition contains about 2o to 7o parts by weight of a sugar per 1,000 parts of basic nitrogen, and that the bacteria at a temperature of 35 to 39 ° for about 8 hours grows so that the number of bacteria moved about 2X to 2X ioi0 per cubic centimeter amounts to. Such a volume of this inoculation material is then used for inoculating the nutrient medium used that an original bacterial count of about 6 X 1o7 to 8 X ios per Cubic centimeter is present.

Den Bakterien sollen wenigstens während eines Teils ihrer Züchtung große Mengen eines Zuckers zugefügt werden, damit sie maximale Mengen an Streptokinase und Streptodornase erzeugen. Es können fast alle üblichen Zuckerarten verwendet werden, z. B. Rohrzucker und Maltose oder Glukose und Mannose. Es können verschiedene Verfahren zur Zugabe des Zuckers angewandt werden. Das übliche Verfahren besteht darin, daß man die Bakterien in Gegenwart einer sehr kleinen Zuckermenge, z. B. 2o bis ioo Teilen pro iooo Teile abgebautes Kasein, etwa 14 Stunden lang wachsen läßt und dann den Rest des Zuckers allmählich während eines Zeitraumes von etwa 6 bis 8 Stunden zugibt. Die Gesamtmenge an Zucker, welche mit Vorteil zugegeben werden kann, variiert innerhalb verhältnismäßig weiter Grenzen, z. B. von i5oo bis 4ooo Gewichtsteilen pro iooo Teile abgebautes Kasein.The bacteria should at least during part of their cultivation Large amounts of a sugar are added to allow them to achieve maximum levels of streptokinase and produce streptodornase. Almost all common types of sugar can be used be e.g. B. cane sugar and maltose or glucose and mannose. It can be different Procedure for adding the sugar can be used. The usual procedure is in that the bacteria in the presence of a very small amount of sugar, e.g. B. 2o to 100 parts per 100o parts degraded casein, grow for about 14 hours leaves and then the rest of the sugar gradually over a period of about Adds 6 to 8 hours. The total amount of sugar added with advantage can be varied within relatively wide limits, e.g. B. from i5oo to 4,000 parts by weight per 1,000 parts degraded casein.

Nachdem der Nährboden angeimpft wurde, läßt man die Bakterien bei etwa 32 bis q.0° und vorzugsweise bei 36 bis 38° wachsen, bis die Konzentration in Streptokinase mindestens etwa Zoo Einheiten pro Kubikzentimeter beträgt und vorzugsweise so lange, bis die Bakterienzahl ein Maximum erreicht hat. Während dieser Wachstumszeit soll der pH-Wert in dem Bereich von etwa 6,o bis 8,5 gehalten werden. Da der pH-Wert während des Bakterienwachstums und besonders nach dem Beginn der Zugabe großer Zuckermengen dazu neigt, in den sauren Bereich umzuschlagen, ist es notwendig, daß man häufige pH-Bestimmungen durchführt und Alkali zugibt, um das pH innerhalb des Arbeitsbereichs zu halten.After the culture medium has been inoculated, the bacteria are left in grow about 32 to q.0 ° and preferably at 36 to 38 ° until the concentration in streptokinase is at least about zoo units per cubic centimeter, and preferably until the number of bacteria has reached a maximum. During this growing season the pH should be kept in the range of about 6.0 to 8.5. Because the pH during bacterial growth and especially after the start of adding large amounts of sugar tends to turn into the acidic range, it is necessary that one be frequent Make pH determinations and add alkali to keep the pH within the working range to keep.

Die Erfindung soll nun an Hand des folgenden Beispiels näher erläutert werden. Alle Teile bedeuten Gewichtsteile, wenn nichts anderes angegeben ist.The invention will now be explained in more detail using the following example will. All parts are parts by weight, unless stated otherwise.

Beispiel Zu 5o Liter destilliertem Wasser werden 10,i7 kg durch Enzym hydrolysiertes Kasein gegeben. Die Temperatur wird auf ioo° gebracht und bei diesem Punkt gehalten, bis die Lösung des abgebauten Kaseins klar ist. Der Inhalt wird dann rasch auf 15° gekühlt und die gekühlte Lösung durch ein grobes Filtrierpapier filtriert. Es wird eine kleine Menge Toluol als Konservierungsmittel zugegeben und die Lösung q. Tage bei 2° aufbewahrt, wonach sie wieder filtriert wird, um etwaiges unlösliches Material zu entfernen. Zu der Lösung des abgebauten Kaseins werden dann die folgenden Bestandteile zugefügt: 1165 g K H2 P 04 in 8 Liter destilliertem Wasser, 35 g Cystin in etwa 80o ccm io%iger Salzsäure (dies ist die geringste Menge an io%iger Salzsäure, welche erforderlich ist, um eine klare Lösung zu erhalten), 35 g Glycin, gelöst in ioo. ccm destilliertem Wasser, 300 g Dextrose, gelöst in _2 Liter destilliertem Wasser, 3,5 g Uracil, gelöst in i Liter destilliertem Wasser, 3,5 g Adeninsulfat, gelöst in i Liter destilliertem Wasser, 0,35 g Nicotinsäure, gelöst in 35 ccm destilliertem Wasser, o,59 g Pyridoxin, gelöst in 59 ccm destilliertem Wasser, 7,0 g Tryptophan, gelöst in i Liter destilliertem Wasser, 1,75 g Calciumpantothenat, gelöst in 70 ccm destilliertem Wasser, 0,875 g Thiaminhydrochlorid, gelöst in 87,5 ccm destilliertem Wasser, 0,i75 g Riboflavin, gelöst in iooo ccm destilliertem Wasser, 700 ccm einer Salzmischung gemäß Tabelle III, 5565 ccm Thioglycolsäure in ioo ccm destilliertem Wasser, 700 g K H C 0, in 50o ccm destilliertem Wasser. Die Flüssigkeit wird dann auf ein pH von 7,2 eingestellt und durch Filtrieren sterilisiert.EXAMPLE 10.17 kg of casein hydrolyzed by enzyme are added to 50 liters of distilled water. The temperature is brought to 100 ° and held at this point until the solution of the degraded casein is clear. The contents are then rapidly cooled to 15 ° and the cooled solution filtered through a coarse filter paper. A small amount of toluene is added as a preservative and the solution q. Maintained at 2 ° for days after which it is filtered again to remove any insoluble material. The following components are then added to the solution of the degraded casein: 1165 g of K H2 P 04 in 8 liters of distilled water, 35 g of cystine in about 80 ccm of 10% hydrochloric acid (this is the smallest amount of 10% hydrochloric acid required is to get a clear solution), 35 g glycine, dissolved in ioo. ccm of distilled water, 300 g of dextrose, dissolved in _2 liters of distilled water, 3.5 g of uracil, dissolved in 1 liter of distilled water, 3.5 g of adenine sulfate, dissolved in 1 liter of distilled water, 0.35 g of nicotinic acid, dissolved in 35 ccm distilled water, o.59 g pyridoxine, dissolved in 59 ccm distilled water, 7.0 g tryptophan, dissolved in 1 liter distilled water, 1.75 g calcium pantothenate, dissolved in 70 ccm distilled water, 0.875 g thiamine hydrochloride, dissolved in 87 , 5 ccm distilled water, 0.175 g riboflavin, dissolved in 100 ccm distilled water, 700 ccm a salt mixture according to Table III, 5565 ccm thioglycolic acid in 100 ccm distilled water, 700 g KHC 0, in 50o ccm distilled water. The liquid is then adjusted to pH 7.2 and sterilized by filtration.

Der obige sterilisierte Nährboden wird mit i i Litern einer Impflösung, die eine Bakterienzahl von etwa 2o Billionen pro Kubikzentimeter aufweist, geimpft. Man läßt die Bakterien nun bei 37' ohne p,1-Einstellung, Belüftung oder andere Veränderungen 14 Stunden wachsen, und nach Ablauf dieser Zeit werden 320 ccm 5o%ige Dextroselösung zugegeben. Danach wird das pH auf 7,0 eingestellt, indem man in Abständen von 15 Minuten mit 5,o n-Natronlauge versetzt. Das für die Neutralisation erforderliche Volumen Natronlauge wird notiert und 115% dieses Volumens an 5o0/aoiger Dextroselösung nach jeder pH-Einstellung zugegeben. Nach etwa 8 Stunden hört das Bakterienwachstum auf, und der Versuch ist beendet. Zu diesem Zeitpunkt enthält der Nährboden etwa iooo Einheiten Streptokinase pro Kubikzentimeter.The above sterilized culture medium is inoculated with two liters of an inoculation solution containing a bacterial count of about 20 trillion per cubic centimeter. The bacteria are now allowed to grow for 14 hours at 37 ' without p.1 setting, aeration or other changes, and after this time 320 cc of 50% dextrose solution are added. The pH is then adjusted to 7.0 by adding 5.0 n sodium hydroxide solution at 15 minute intervals. The volume of sodium hydroxide solution required for neutralization is noted and 115% of this volume of 50 / ao dextrose solution is added after each pH adjustment. Bacterial growth stops after about 8 hours and the experiment is over. At this point the culture medium contains about 1,000 units of streptokinase per cubic centimeter.

Claims

PATENT CLAIMS: i. Method for producing a mixture of streptokinase and streptodornase by culturing bacteria that produce these enzymes, such as hemolytic streptococci, characterized in that the cultivation in a nutrient medium which is an enzyme hydrolyzed casein, glycine and a sulfhydryl reducing agent contains.

2. The method according to claim i, characterized in; that the cultivation takes place in a nutrient medium consisting of an aqueous solution of 100 to 100 parts by weight of casein hydrolyzed by enzyme per 150,000 parts by volume of water, and 1 to 35o parts, preferably 100 to zoo parts by weight of glycine for every iooo parts by weight of the above Contains enzyme hydrolyzed casein, and further contains o, oi to 0.05 and preferably 0.03 to 0.07 of the molecular weight of sulfhydryl reducing agent for every 100 parts by weight of said enzyme hydrolyzed casein.