DE69936381T2

DE69936381T2 - Verwendung von einem protein kinase hemmer wie z.b. genistein bei der behandlung von diabetischer retinopathie

Info

Publication number: DE69936381T2
Application number: DE69936381T
Authority: DE
Inventors: Jr. Eugene Phoenix DE JUAN
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1998-03-13
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2019-03-13
Also published as: JP2010168389A; WO1999045920A2; EP1061913B1; WO1999045920A3; EP1061913A2; CA2321560C; CA2321560A1; EP1806135A3; JP2002506028A; ATE365550T1; AU756515B2; AU3001999A; DE69936381D1; EP1806135A2

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Medikament für die vorbeugende und therapeutische Behandlung von diabetischer Retinopathie.
Hintergrund der Erfindung
Mehr als 14 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten haben Diabetes. Alle Personen mit Diabetes tragen das Risiko retinaler Komplikationen. Jedoch sehen sich Personen mit einem Diabetes vom Typ I, das heißt, einem insulinabhängigen Diabetes, einem höheren Risiko einer Schädigung des Sehvermögens gegenüber als Personen mit einem Diabetes vom Typ II, das heißt, einem nicht insulinabhängigen Diabetes.
Anfänglich führt der hohe Glucosespiegel im Blut bei Menschen mit Diabetes zu einer Vermehrung der Wachstumsfaktoren in ihren Augen. Dieser Zustand ist als das „Stadium der prädiabetischen Retinopathie" bekannt und kann zur Retinopathie führen, wenn er nicht vorbeugend behandelt wird.
Retinopathie wird die Mehrzahl der Menschen mit Diabetes in einem gewissen Ausmaß im Lauf ihres Lebens befallen (Anonym, MMWR 42(19): 191–195 (1993)). Sie ist heutzutage die führende Ursache von Blindheit bei Amerikanern im Alter von 20 bis 74 und es wird erwartet, dass sie das Sehvermögen von etwa einem Drittel der Personen mit Diabetes in den Vereinigten Staaten beeinträchtigt. In jedem Jahr treten in den Vereinigten Staaten nicht weniger als 40.000 neue Fälle von Blindheit unter den Menschen mit Diabetes auf (CDC, unveröffentlichte Daten, 1993). Menschen mit Diabetes werden 25-mal häufiger infolge von Retinopathie blind als die Normalbevölkerung.
Diabetische Retinopathie hat zwei Stadien – ein nicht proliferatives Stadium, das üblicherweise zuerst auftritt, und ein proliferatives Stadium. Das nicht proliferative Stadium, das auch als „diabetische Hintergrund-Retinopathie" bezeichnet wird, wird durch eine Verdickung der Basalmembran, Verlust von retinalen Perizyten, mikrovaskuläre Abnormitäten, intraretinale Mikroaneurysmata, retinale Hämorrhagien (auch als „Punkt- und Fleck"-Blutungen bekannt), retinales Ödem, insbesondere diabetisches Makulaödem, Kapillarverschluss, der mit retinaler Ischämie oder schlechter retinaler Perfusion (das heißt, schlechte Gefäßentwicklung) verbunden ist, und weiche und harte Exsudate charakterisiert. Das proliferative Stadium, das schätzungsweise 700.000 Amerikaner betrifft, (Chen et al., J. Miss. State Med. Assoc. 36(7): 201–208 (1995)) wird von Neovaskularisation und fibrovaskulärem Wachstum (das heißt, Vernarbung, die Glia- und Faserelemente einbezieht) aus der Retina oder dem Sehnerv über die innere Oberfläche der Retina oder den blinden Fleck hinaus oder in den Glaskörper hinein gekennzeichnet.
Das proliferative Stadium kann zu Rubeosis oder neovaskulärem Glaukom führen. Ein Makulaödem kann in jedem der beiden Stadien auftreten und es bildet zusammen mit Komplikationen der retinalen Neovaskularisation die beiden Hauptprobleme der Retina, die zu den Schädigungen des Sehvermögens, die mit Diabetes zusammenhängen, führen.
Obwohl die pathologischen Stadien der diabetischen Retinopathie gut beschrieben sind, werden die molekularen Vorgänge, die der diabetischen Retinopathie zugrunde liegen, schlecht verstanden. Dies ist zum Teil auf die Tatsache, dass die Krankheit abhängig von einem bestimmten Individuum zehn bis dreißig Jahre lang fortschreitet, zurückzuführen.
Engmaschige Kontrollen von Glycämie und Hochdruck sowie ophthalmologische Untersuchungen scheinen von Vorteil zum Verhindern der Erkrankung zu sein. Aktuell besteht die Behandlung in regelmäßiger Beobachtung durch einen Augenarzt, Laserphotokoagulation und Vitrektomie.
Patienten mit schwerer bis sehr schwerer nicht proliferativer Retinopathie und Patienten, die ein hohes Risiko für eine proliferative Retinopathie tragen oder die bereits eine frühe oder fortgeschrittene proliferative Retinopathie haben, werden mit gestreuter oder panretinaler Photokoagulation behandelt. Panretinale Photokoagulation umfasst 1.500–2.500 Laserverbrennungen, die einen Durchmesser von 500 μ haben, im mittelperipheren und peripheren Teil der Retina (Murphy (1995), oben).
Der am besten dokumentierte biochemische Mechanismus für die Entwicklung von mikrovaskulären Komplikationen von Diabetes ist der Sorbitweg. Im Sorbitweg katalysiert das Enzym Aldosereduktase die Umwandlung von Glucose zu Sorbit und von Galactose zu Galactitol. Aldosereduktase hat eine geringe Substrataffinität für Glucose. Dementsprechend ist der Weg inaktiv, wenn die Glucosekonzentrationen normal sind. Bei Hyperglycämie wird der Sorbitweg aktiv. Die Aktivierung des Sorbitwegs ist zum Beispiel für die retinalen Perizyten, die kein Insulin für das Eindringen von Glucose brauchen, wichtig. In ähnlicher Weise scheinen retinale Kapillarzellen erhebliche Mengen von Aldosereduktase zu enthalten (Ferris, Hospital Practice___: 79–89 (1993)).
In Anbetracht der Prävalenz der diabetischen Retinopathie verbleibt ein Bedarf nach einer wirksamen prophylaktischen und therapeutischen Behandlung der diabetischen Retinopathie. Dementsprechend ist es eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum prophylaktischen und therapeutischen Behandeln von diabetischer Retinopathie, einschließlich der Behandlung im Stadium der prädiabetischen Retinopathie, im Stadium der nicht proliferativen diabetischen Retinopathie und im Stadium der proliferativen diabetischen Retinopathie, bereitzustellen. Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der ausführlichen Beschreibung, die hier vorgelegt wird, ersichtlich werden.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Medikament für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von diabetischer Retinopathie, einschließlich der Behandlung im Stadium der prädiabetischen Retinopathie, im Stadium der nicht proliferativen diabetischen Retinopathie und im Stadium der proliferativen diabetischen Retinopathie, gerichtet. Das Verfahren umfasst die Verabreichung eines Hemmstoffs des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs. Vorzugsweise ist der Hemmstoff des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs eine Verbindung der Formel:
wobei V, W und X ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Alkoxy, Halogen, einem Ester, einem Ether, einer Carbonsäuregruppe, einem pharmazeutisch annehmbaren Salz einer Carbonsäuregruppe und -SR, worin R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist, und wobei Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel, C(OH) und C=O und wobei Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und C(O)OR₁, wobei R₁ ein Alkyl ist. Vorzugsweise ist Alkoxy ein C₁-C₆-Alkoxy. Vorzugsweise ist Halogen Fluor, Chlor oder Brom. Vorzugsweise ist Ester ein C₁-C₆-Ester. Vorzugsweise ist Ether ein C₁-C₆-Ether. Vorzugsweise umfassen die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Carbonsäuregruppe Natrium- und Kaliumsalze. Vorzugsweise sind die Alkylgruppen C₁-C₆-Alkylgruppen. Wünschenswerterweise ist der Hemmstoff des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs Genistein.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung gründet sich auf die Entdeckung, dass die Phosphorylierung von Tyrosin in den frühen Stadien der nicht ischämischen, mikrovaskulären, diabetischen Retinopathie gesteigert ist und dass ein Hemmstoff des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs, besonders Genistein, beim Verhindern der diabetischen Retinopathie wirksam ist. Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Medikament für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von diabetischer Retinopathie, einschließlich der Behandlung im Stadium der prädiabetischen Retinopathie, im Stadium der nicht proliferativen diabetischen Retinopathie und im Stadium der proliferativen diabetischen Retinopathie, bereit. Mit „prophylaktisch" ist der vollständige oder teilweise Schutz vor diabetischer Retinopathie, besonders vor diabetischem Makulaödem, gemeint. Mit „therapeutisch" ist die Besserung von diabetischer Retinopathie selbst und der vollständige oder teilweise Schutz vor weiterer diabetischer Retinopathie gemeint. In diesem Zusammen hang ist das vorliegende Medikament auch bei der Behandlung eines Ödems der Netzhaut, das zum Beispiel mit einer Nachstar- oder Laserkapsulotomie (Irvine-Gass-Syndrom), einer Uveitis, einem Venenast- oder Zentralvenenverschluss, einer topischen Verwendung von Adrenalin, schwerem Hochdruck, Strahlenretinopathie, perifovealer Teleangiektasie und Retinitis pigmentosa verbunden ist, nützlich.
Das Medikament umfasst einen Hemmstoff des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs in einer Menge, die ausreicht, die Retina prophylaktisch oder therapeutisch auf Retinopathie zu behandeln. Protein-Tyrosin-Kinasen sind in den U.S. Patenten 5.593.997 und 5.710.173 beschrieben. Xia et al. (J. Clin. Invest. 98(9): 2018–2026 (November 1996)) beschreiben die Wirkungen des vaskulären Endothel-Wachstumsfaktors (VEGF) auf Proteinkinase C (PKC) und ihre Isoformen in Endothelzellen, die aus dem Makrogefäßsystem von Rinderaorta stammen und in Kultur gehalten werden, und auch die Wirkung von VEGF auf das Wachstum solcher Endothelzellen.
Vorzugsweise ist der PTK-Hemmstoff Genistein (5,7-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on) oder ein pharmazeutisch annehmbares, den Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionsweg hemmendes Analogon oder Propharmakon davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz von einem der vorhergehenden. Folglich kann der PTK-Hemmstoff eine Verbindung der folgenden Formel sein:
wobei V, W und X ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Alkoxy, Halogen, einem Ester, einem Ether, einer Carbonsäuregruppe, einem pharmazeutisch annehmbaren Salz einer Carbonsäuregruppe und -SR, worin R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist, und wobei Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel, C(OH) und C=O und wobei Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und C(O)OR₁, wobei R, ein Alkyl ist. Vorzugsweise ist Alkoxy ein C₁-C₆-Alkoxy. Vorzugsweise ist Halogen Fluor, Chlor oder Brom. Vorzugsweise ist Ester ein C₁-C₆-Ester. Vorzugsweise ist Ether ein C₁-C₆-Ether. Vorzugsweise umfassen die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Carbonsäuregruppe Natrium- und Kaliumsalze. Vorzugsweise sind die Alkylgruppen C₁-C₆-Alkylgruppen. Wünschenswerterweise ist der Hemmstoff des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs Genistein.
Das Propharmakon kann jedes pharmazeutisch annehmbare Propharmakon von Genistein, ein den Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionsweg hemmendes Analogon von Genistein oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz von einem der vorhergehenden sein. Ein durchschnittlicher Fachmann wird jedoch verstehen, dass das Propharmakon ein solches, das in oder um die Retina zu einem aktiven PTK-Hemmstoff umgewandelt werden kann, sein muss. Ein bevorzugtes Propharmakon ist ein Propharmakon, das die Lipidlöslichkeit von Genistein erhöht, ein den Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionsweg hemmendes Analogon von Genistein oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz von einem der vorhergehenden. Ein Propharmakon ist ein solches, bei dem eines oder mehrere von V, W und X unabhängig voneinander mit einem Ester wie zum Beispiel Pivalinsäure derivatisiert ist/sind.
Verbindungen der obigen Formel sind verbreitet kommerziell erhältlich. Zum Beispiel ist Genistein von LC Laboratories (Woburn, MA) erhältlich. Diejenigen Verbindungen, die nicht kommerziell erhältlich sind, können leicht unter Verwendung von Methoden der organischen Synthese, die im Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden.
Ob ein bestimmtes Analogon, Propharmakon oder pharmazeutisch annehmbares Salz einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung Retinopathie prophylaktisch oder therapeutisch behandeln kann oder nicht, kann durch seine Wirkung im Rattenmodell, das im Beispiel 1 verwendet wird, festgestellt werden. Alternativ können Analoga, Propharmaka und pharmazeutisch annehmbare Salze von Hemmstoffen des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs in vitro durch Studien der Zellproliferation des Endothels und in anderen Modellen der diabetischen Retinopathie wie zum Beispiel Streptozotocin untersucht werden.
Zusätzlich kann Farbdopplerbildgebung eingesetzt werden, um die Wirkung eines Arzneimittels in der Pathologie des Auges zu beurteilen (Valli et al., Ophthalmologica 209(13): 115–121 (1995)). Farbdopplerbildgebung ist ein neuer Fortschritt in der Sonographie und erlaubt ein gleichzeitiges zweidimensionales Darstellen von Strukturen und die Beurteilung des Blutflusses. Folglich kann eine Retinopathie unter Einsatz einer solchen Technologie untersucht werden.
Der PTK-Hemmstoff kann, wenn gewünscht, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung an eine geeignete Matrix wie zum Beispiel eine polymere Matrix gebunden werden. Jedes aus einer großen Auswahl von Polymeren kann im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, vorausgesetzt, dass das Polymer biologisch annehmbar ist, wenn die an Polymer gebundene Verbindung in vivo verwendet werden soll (siehe zum Beispiel U.S. Patente Nr. 5.384.333 und 5.164.188).
Ein Vorteil von Genistein ist, dass es sehr sicher und wirksam ist. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass Genistein, wenn Genistein „Zucker diabetic fatty" Ratten (Eigenname einer Zuchtlinie) oral verabreicht wurde, bei Dosierungen im Bereich von 75 mg/kg/Tag bis 300 mg/kg/Tag über einen Zeitraum von sechs Monaten für die Retina nicht toxisch war, wie durch Elektroretinographie gemessen wurde. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die orale Verabreichung von Genistein keine Wirkung auf die Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht für männliche und weibliche Ratten hat. Es wurde auch keine Wirkung von oral verabreichtem Genistein im Hinblick auf das Gewicht der Ovarien und des Uterus bei weiblichen Ratten festgestellt.
Der PTK-Hemmstoff, der vorzugsweise Genistein, ein den Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionsweg hemmendes Analogon von Genistein, ein den Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionsweg hemmendes Propharmakon von Genistein oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz von einem der vorhergehenden ist, kann gemäß der vorliegenden Erfindung über jeden geeigneten Weg verabreicht werden. Geeignete Verabreichungswege beinhalten systemisch, wie zum Beispiel oral oder durch Injektion, topisch, intraokulär, periokulär (zum Beispiel Sub-Tenon), subkonjunktival, subretinal, suprachoroidal und retrobulbär. Die Art und Weise, auf die der PTK-Hemmstoff verabreicht wird, ist teilweise davon abhängig, ob die Behandlung der Retinopathie prophylaktisch oder therapeutisch ist. Die Art und Weise, auf die der PTK-Hemmstoff zur therapeutischen Behandlung von Retinopathie verabreicht wird, ist teilweise von der Ursache der Retinopathie abhängig.
Zum Beispiel kann, wenn Diabetes die führende Ursache der Retinopathie ist, der PTK-Hemmstoff prophylaktisch verabreicht werden, sobald das prädiabetische Stadium der Retinopathie erkannt wird. Zur prophylaktischen Behandlung einer Retinopathie, die auf Diabetes zurückzuführen sein kann, wird der PTK-Hemmstoff vorzugsweise systemisch, zum Beispiel oral oder durch Injektion, verabreicht. Zur therapeutischen Behandlung der nicht proliferativen diabetischen Retinopathie kann der PTK-Hemmstoff systemisch, zum Beispiel oral oder durch Injektion, oder intraokulär verabreicht werden. Eine proliferative diabetische Retinopathie kann therapeutisch durch die Verabreichung des PTK-Hemmstoffs zum Beispiel intraokulär, topisch, subkonjunktival oder periokulär (zum Beispiel Sub-Tenon) behandelt werden. Der PTK-Hemmstoff wird vorzugsweise intraokulär, topisch, subkonjunktival oder periokulär (zum Beispiel Sub-Tenon) zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung der Retinopathie vor, während oder nach der chirurgischen Entfernung von Narbengewebe, das während der Neovaskularisation im proliferativen diabetischen Stadium gebildet wurde, aus einem Auge verabreicht. Ein intraokuläres Gerät/Implantat wie zum Beispiel Vitrasert^TM, das biologisch abbaubar und biologisch absorbierbar ist, kann verwendet werden, um eine anhaltende Freisetzung des PTK-Hemmstoffs zu erreichen.
Der PTK-Hemmstoff wird vorzugsweise so früh wie möglich, nachdem festgestellt wurde, dass ein Tier wie zum Beispiel ein Säuger, speziell ein Mensch, ein Risiko für Retinopathie trägt (prophylaktische Behandlung) oder begonnen hat, eine Retinopathie zu entwickeln (therapeutische Behandlung), verabreicht. Die Behandlung wird teilweise von dem jeweiligen PTK-Hemmstoff, der verwendet wird, der verabreichten Menge des PTK-Hemmstoffs, dem Verabreichungsweg und der Ursache und dem Ausmaß, falls vorhanden, der festgestellten Retinopathie abhängen.
Ein Fachmann wird verstehen, dass geeignete Methoden der Verabreichung eines PTK-Hemmstoffs, der in der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, zur Verfügung stehen.
Obwohl mehr als ein Weg verwendet werden kann, um einen bestimmten PTK-Hemmstoff zu applizieren, kann ein bestimmter Weg eine direktere und wirksamere Reaktion als ein anderer Weg bieten. Dementsprechend sind die beschriebenen Verabreichungswege lediglich beispielhaft.
Die Dosis, die einem Tier, besonders einem Menschen gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, sollte ausreichend sein, um die gewünschte Reaktion in dem Tier in einem angemessenen zeitlichen Rahmen zu bewirken. Ein Fachmann wird verstehen, dass die Dosierung von einer Reihe von Faktoren abhängen wird, einschließlich der Stärke des jeweiligen PTK-Hemmstoffs, der eingesetzt wird, des Alters, der Art, des Zustands oder des Stadiums der Erkrankung und des Körpergewichts des Tiers und auch des Umfangs der Retina, der dabei ist, von der Retinopathie betroffen zu werden oder tatsächlich von der Retinopathie betroffen ist. Die Höhe der Dosis wird auch durch den Weg, die Zeitvorgabe und die Häufigkeit der Verabreichung und auch durch das Vorliegen, die Art und das Ausmaß jeglicher Nebenwirkungen, welche die Verabreichung eines bestimmten PTK-Hemmstoffs und die gewünschte physiologische Wirkung begleiten können, bestimmt werden. Ein durchschnittlicher Fachmann wird verstehen, dass verschiedene Zustände oder Stadien der Erkrankung, insbesondere chronische Zustände oder Stadien der Erkrankung eine verlängerte Behandlung, die mehrfache Verabreichungen mit sich bringt, erfordern können.
Geeignete Dosierungen und Therapiepläne können durch herkömmliche Verfahren zur Bereichsfindung, die durchschnittlichen Fachleuten bekannt sind, festgelegt werden. Im Allgemeinen wird die Behandlung mit niedrigeren Dosierungen, die niedriger als die optimale Dosis der Verbindung sind, eingeleitet. Danach wird die Dosierung in kleinen Schritten gesteigert, bis die optimale Wirkung unter den gegebenen Umständen erreicht ist. Das vorliegende erfinderische Verfahren wird normalerweise mit der Verabreichung von 1 mg/kg/Tag bis 100 mg/kg/Tag, vorzugsweise von 15 mg/kg/Tag bis 50 mg/kg/Tag einhergehen, wenn systemisch verabreicht wird. Intraokuläre Applikation wird üblicherweise mit einer Verabreichung von insgesamt 0,1 mg bis insgesamt 5 mg, vorzugsweise von insgesamt 0,5 mg bis insgesamt 1 mg einhergehen. Eine bevorzugte Konzentration für die topische Applikation beträgt 100 μM.
Zusammensetzungen zur Verwendung im vorliegenden erfinderischen Verfahren umfassen vorzugsweise einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine Menge des PTK-Hemmstoffs, die ausreicht, um eine Retinopathie prophylaktisch oder therapeutisch zu behandeln. Der Träger kann ein jeder von denen, die herkömmlich verwendet werden, sein und wird nur durch chemisch-physikalische Gesichtspunkte wie zum Beispiel Löslichkeit und Fehlen von Reaktionsfähigkeit mit der Verbindung und vom Verabreichungsweg limitiert. Ein durchschnittlicher Fachmann wird verstehen, dass der PTK-Hemmstoff zusätzlich zu den im Folgenden beschriebenen, pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von polymeren Zusammensetzungen, Einschlussverbindungen wie zum Beispiel Cyclodextrin-Einschlussverbindungen, Liposomen, Mikrosphären, Mikrokapseln und Ähnlichen (siehe zum Beispiel U.S. Patente Nr. 4.997.652, 5.185.152 und 5.718.922) formuliert werden kann.
Der PTK-Hemmstoff kann als pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz formuliert werden. Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen zur Verwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung beinhalten diejenigen, die von Mineralsäuren, wie zum Beispiel von Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Metaphosphorsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure, und von organischen Säuren, wie zum Beispiel von Weinsäure, Ethansäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Glycolsäure, Gluconsäure, Bernsteinsäure und von Arylsulfonsäuren, wie zum von Beispiel p-Toluolsulfonsäure, abgeleitet sind.
Die hier beschriebenen, pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträger, zum Beispiel Vehikel, Hilfsstoffe, Träger oder Streckmittel sind Fachleuten gut bekannt und der Öffentlichkeit leicht zugänglich. Es wird bevorzugt, dass der pharmazeutisch annehmbare Träger ein solcher, der gegenüber dem PTK-Hemmstoff chemisch inert ist, und ein solcher, der unter Gebrauchsbedingungen keine schädlichen Nebenwirkungen oder Toxizität aufweist, ist.
Die Wahl des Streckmittels wird teilweise durch den jeweiligen PTK-Hemmstoff und auch durch die jeweilige Methode, die verwendet wird, um die Zusammensetzung zu verabreichen, bestimmt werden. Folglich gibt es eine Vielzahl geeigneter Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Die folgenden Formulierungen sind lediglich beispielhaft.
Unter den Formulierungen, die gemäß dem vorliegenden erfinderischen Verfahren bevorzugt werden, sind injizierbare Formulierungen. Die Anforderungen an pharmazeutisch wirksame Träger für injizierbare Zusammensetzungen sind durchschnittlichen Fachleuten gut bekannt (siehe Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA., Banker and Chalmers, Hrsg., Seiten 238–250 (1982), und ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4. Auflage, Seiten 622–630 (1986)). Es wird bevorzugt, dass solche injizierbaren Zusammensetzungen intramuskulär, intravenös oder intraperitoneal verabreicht werden.
Topische Formulierungen sind Fachleuten gut bekannt. Solche Formulierungen sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung für die Applikation auf die Haut geeignet. Die Verwendung von Pflastern, Filmen für die Hornhaut (siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 5.185.152) und ophthalmologischen Lösungen (siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 5.710.182) und Salben, zum Beispiel Augentropfen, ist auch in den Fähigkeiten im Fachgebiet enthalten.
Formulierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können (a) aus flüssigen Lösungen wie zum Beispiel einer wirksamen Menge der Verbindung, die in Lösungsmitteln wie zum Beispiel in Wasser, Salzlösung oder Orangensaft gelöst ist, (b) aus Kapseln, Beuteln, Tabletten, Lutschtabletten und Pastillen, die alle eine vorher festgelegte Menge des Wirkstoffs als Feststoffe oder Granula enthalten, (c) aus Pulvern, (d) aus Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit und (e) aus geeigneten Emulsionen bestehen. Flüssige Formulierungen können Lösungsmittel wie zum Beispiel Wasser und Alkohole, zum Beispiel Ethanol, Benzylalkohol und die Polyethylenalkohole entweder mit oder ohne Zugabe von pharmazeutisch annehmbarem Tensid, Stellmittel oder Emulgator beinhalten. Kapselformen können vom üblichen Gelatinetyp, der zum Beispiel Tenside, Gleitmittel und inerte Füllstoffe wie zum Beispiel Lactose, Saccharose, Calciumphosphat und Maisstärke enthält, mit hartem oder weichem Mantel sein. Tablettenfor men können eines oder mehrere aus Lactose, Saccharose, Mannit, Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure, mikrokristalliner Cellulose, Akazie, Gelatine, Guarmehl, kolloidalem Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Talk, Magnesiumstearat, Calciumstearat, Zinkstearat, Stearinsäure und anderen Arzneistoffträgern, Farbstoffen, Verdünnungsmitteln, Puffern, Aufschlussmitteln, Befeuchtungsmitteln, Konservierungsmitteln, Aromastoffen und pharmakologisch kompatiblen Hilfsstoffen beinhalten. Lutschtablettenformen können den Wirkstoff in einem Aroma, üblicherweise Saccharose und Akazie oder Tragantumfassen, ebenso wie Pastillen, die den Wirkstoff in einem inerten Grundstoff wie zum Beispiel Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Akazie umfassen, Emulsionen, Gele, und Ähnliche, die zusätzlich zum Wirkstoff solche Hilfsmittel, die im Fachgebiet bekannt sind, enthalten.
Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, beinhalten wässrige und nicht wässrige, isotone, sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Substanzen, die dafür sorgen, dass die Formulierung isoton mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers ist, enthalten können, und wässrige und nicht wässrige, sterile Suspensionen, die Stellmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsstoffe beinhalten können. Der Hemmstoff kann in einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel in einem pharmazeutischen Träger wie zum Beispiel einer sterilen Flüssigkeit oder einem Gemisch von Flüssigkeiten einschließlich Wasser, Salzlösung, wässriger Dextrose und verwandten Zuckerlösungen, eines Alkohols wie zum Beispiel Ethanol, Isopropanol oder Hexadecylalkohol, Glycolen wie zum Beispiel Propylenglycol oder Polyethylenglycol, Dimethylsulfoxid, Glycerinketalen wie zum Beispiel 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol, Ether wie zum Beispiel Poly(ethylenglycol) 400, eines Öls, einer Fettsäure, eines Fettsäureesters oder Fettsäureglycerids oder eines acetylierten Fettsäureglycerids mit oder ohne Zugabe von einem pharmazeutisch annehmbaren Tensid wie zum Beispiel von einer Seife oder einem Detergens, von einem Stellmittel wie zum Beispiel von Pektin, Carbomeren, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Carboxymethylcellulose, oder von Emulgatoren oder von anderen pharmazeutischen Hilfsstoffen verabreicht werden. Öle, die in parenteralen Formulierungen verwendet werden können, umfassen Petroleum, tierische, pflanzliche oder synthetische Öle. Spezielle Beispiele von Ölen beinhalten Erdnuss, Sojabohne, Sesam, Baumwollsamen, Mais, Olive, Petrolatum und Mineral.
Zur Verwendung in parenteralen Formulierungen geeignete Fettsäuren umfassen Ölsäure, Stearinsäure und Isostearinsäure. Ethyloleat und Isopropylmyristat sind Beispiele von geeigneten Fettsäureestern.
Zur Verwendung in parenteralen Formulierungen geeignete Seifen umfassen Fett-Alkalimetalle, Ammonium- und Triethanolaminsalze und geeignete Detergentien umfassen (a) kationische Detergentien wie zum Beispiel Dimethyl-dialkyl-ammoniumhalogenide und Alkylpyridinium-halogenide, (b) anionische Detergentien wie zum Beispiel Alkyl-, Aryl- und Olefinsulfonate, Alkyl-, Olefin-, Ether- und Monoglyceridsulfate und Sulfosuccinate, (c) nicht ionische Detergentien wie zum Beispiel Fett-Aminoxide, Fettsäure-Alkanolamide und Polyoxyethylen-polypropylen-Copolymere, (d) amphotere Detergentien wie zum Beispiel Alkyl-p-aminopropionate und 2-Alkyl-imidazolin quartäre Ammoniumsalze und (e) Gemische davon.
Die parenteralen Formulierungen werden üblicherweise von etwa 0,5 bis etwa 25 % (nach Gewicht) des Wirkstoffs in Lösung enthalten. Es können Konservierungsmittel und Puffer eingesetzt werden. Um eine Reizung an der Injektionsstelle zu minimieren oder auszuschalten, können solche Zusammensetzungen ein oder mehrere nicht ionische Tenside, die ein hydrophil-lipophiles Gleichgewicht (HLB) von etwa 12 bis etwa 17 haben, enthalten.
Die Menge des Tensids in solchen Formulierungen wird üblicherweise im Bereich von etwa 5 bis etwa 15 % (nach Gewicht) liegen. Geeignete Tenside umfassen Polyethylensorbitan Fettsäureester wie zum Beispiel Sorbitan-Monooleat und Addukte mit einem hohen Molekulargewicht von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, gebildet durch die Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol. Die parenteralen Formulierungen können in abgedichteten Behältern mit einer Dosis oder mehreren Dosen, wie zum Beispiel Ampullen und Fläschchen angeboten werden und können in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, wobei sie nur die Zugabe des sterilen, flüssigen Hilfsstoffs, zum Beispiel Wasser zur Injektion, unmittelbar vor der Verwendung benötigen. Unvorbereitete Lösungen und Suspensionen zur Injektion können aus sterilen Pulvern, Granula und Tabletten der vorher beschriebenen Art hergestellt werden.
Solche Zusammensetzungen können als intraokuläre Formulierungen, Retard-Formulierungen oder -hilfsmittel (siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 5.378.475) formuliert werden. Zum Beispiel können Gelatine, Chondroitinsulfat, ein Polyphosphoester wie zum Beispiel Bis-2-hydroxyethyl-terephthalat (BHET), oder eine Poly-Milch-Glycolsäure (in unterschiedlichen Verhältnissen) verwendet werden, um Retard-Formulierungen zu formulieren. Implantate (siehe zum Beispiel U.S. Patente Nr. 5.443.505, 4.853.224 und 4.997.652), Vorrichtungen (siehe zum Beispiel U.S. Patente Nr. 5.554.187, 4.863.457, 5.098.443 und 5.725.493) wie zum Beispiel eine implantierbare Vorrichtung, zum Beispiel ein mechanisches Reservoir, eine intraokuläre Vorrichtung oder eine extraokuläre Vorrichtung mit einem intraokulären Kanal (zum Beispiel 100 μ – 1 mm im Durchmesser) oder ein Implantat oder eine Vorrichtung, die eine polymere Zusammensetzung wie oben beschrieben umfasst, können verwendet werden.
Das vorliegende erfinderische Verfahren kann auch die gemeinsame Verabreichung mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen umfassen. Mit „gemeinsamer Verabreichung" ist eine Verabreichung vor, gleichzeitig mit, zum Beispiel in Kombination mit dem PTK-Hemmstoff in derselben Formulierung oder in getrennten Formulierungen, oder nach der Verabreichung eines PTK-Hemmstoffs wie oben beschrieben gemeint. Zum Beispiel können Corticosteroide, zum Beispiel Prednison, Methylprednisolon, Dexamethason oder Triamcinolonacetonid oder nicht corticosteroidale antiinflammatorische Verbindungen wie zum Beispiel Ibuprofen oder Flubiprofen gemeinsam verabreicht werden. In ähnlicher Weise können Vitamine und Mineralien, zum Beispiel Zink, Antioxidantien, zum Beispiel Carotinoide (wie zum Beispiel ein Xanthophyll-Carotinoid wie Zeaxanthin oder Lutein) und Mikronährstoffe gemeinsam verabreicht werden. Darüber hinaus können andere Arten von Hemmstoffen des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs, die natürliche Hemmstoffe der Protein-Tyrosin-Kinase wie Quercetin, Lavendustin A, Erbstatin und Herbimycin A und synthetische Hemmstoffe der Protein-Tyrosin-Kinase wie Tyrphostine (zum Beispiel AG490, AG17, AG213 (RG50864), AG18, AG82, AG494, AG825, AG879, AG 1112, AG 1296, AG 1478, AG 126, RG 13022, RG 14620 und AG555), Dihydroxy- und Dimethoxybenzyliden-malonsäuredinitril, Analoga von Lavendustin A (zum Beispiel AG814 und AG957), Chinazoline (zum Beispiel AG1478), 4,5-Dianilinophthalimide und Thiazolidindione beinhalten, gemeinsam mit Genistein oder einem Analogon, einem Propharmakon oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon verabreicht werden (siehe Levitzki et al., Science 267: 1782–1788 (1995) und Cunningham et al., Anti-Cancer Drug Design 7: 365–384 (1992)). In diesem Zusammenhang beinhalten möglicherweise nützliche Derivate von Genistein diejenigen, die in Mazurek et al., U.S. Patent Nr. 5.637.703 dargelegt wurden. Es können neutralisierende Proteine für Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel ein monoklonaler Antikörper, der für einen gegebenen Wachstumsfaktor, zum Beispiel VEGF spezifisch ist (siehe Aiello et al., PNAS USA 92: 10457–10461 (1995) für ein Beispiel), oder Phosphotyrosin (Dhar et al., Mol. Pharmacol. 37: 519–525 (1990)) gemeinsam verabreicht werden. Andere verschiedene Verbindungen, die gemeinsam verabreicht werden können, umfassen Hemmstoffe der Proteinkinase C (siehe zum Beispiel U.S. Patente 5.719.175 und 5.710.145), Cytokin-Modulatoren, einen für Endothelzellen spezifischen Hemmstoff der Proliferation, zum Beispiel Thrombospondine, einen für Endothelzellen spezifischen, hemmenden Wachstumsfaktor, zum Beispiel TNFα, ein antiproliferatives Peptid, zum Beispiel SPARC und Proliferin-ähnliche Peptide, einen Antagonisten des Glutamatrezeptors, Aminoguanidin, einen ACE-Hemmer („angiotensin-converting-enzyme inhibitor"), zum Beispiel Angiotensin II, Calciumkanalblocker, ψ-Tectorigenin, ST638, Somatostatin-Analoga, zum Beispiel SMS 201–995, Monosialogangliosid GM1, Ticlopidin, neurotrophe Wachstumsfaktoren, Methyl-2,5-dihydroxycinnamat, einen Hemmstoff der Angiogenese, zum Beispiel rekombinantes EPO, einen oralen hypoglycämischen Wirkstoff aus der Gruppe der Sulfonylharnstoffe, zum Beispiel Gliclazid (nicht insulinabhängiger Diabetes), ST638 (Asahi et al., FEBS Letter 309: 10–14 (1992)), Thalidomid, Nicardipinhydrochlorid, Aspirin, Piceatannol, Staurosporin, Adriamycin, Epiderstatin, (+)- Aeroplysinin-1, Phenazocin, Halogenmethyl-ketone, antilipämische Wirkstoffe, zum Beispiel Etofibrat, Chlorpromazin und Sphingosine, Hemmstoffe der Aldosereduktase, wie zum Beispiel Tolrestat, SPR-10, Sorbinil oder Sauerstoff, und Retinolsäure und Analoga davon (Burke et al., Drugs of the Future 17(2): 119–131 (1992) und Tomlinson et al., Pharmac. Ther. 54: 151–194 (1992)). Selenoindole (2-Thioindole) und verwandte Disul fid-Selenide wie diejenigen, die in Dobrusin et al., U.S. Patent Nr. 5.464.961, beschrieben sind, sind nützliche Hemmstoffe der Protein-Tyrosin-Kinase. Diejenigen Patienten, die eine systemische Flüssigkeitsretention, wie zum Beispiel eine, die auf eine kardiovaskuläre oder renale Erkrankung und auf einen schweren systemischen Hochdruck zurückzuführen ist, aufweisen, können zusätzlich mit Diurese, Dialyse, Herzmedikamenten und antihypertensiven Wirkstoffen behandelt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt, dass die Phosphorylierung von Tyrosin in den frühen Stadien der nicht ischämischen, mikrovaskulären, diabetischen Retinopathie gesteigert ist und dass Genistein eine solche Phosphorylierung von Tyrosin hemmt.
Es wurden sechs Paare von Wurfgeschwistern von Zucker-Ratten beschafft (Genetic Models, Inc., Indianapolis, IN), das heißt, sechs männliche „Zucker diabetic fatty" Ratten (Eigenname einer Zuchtlinie) (ZDF, fa/fa), die sich nicht mehr vermehrten („retired breeder") und sechs männliche magere Zucker-Ratten (fa/+), die sich nicht mehr vermehrten. Die Zucker diabetic fatty Ratte entwickelt eine mikrovaskuläre Retinopathie, die mit einer Verdickung der Basalmembranen der Kapillaren in der Retina, dem Verlust von Perizyten, kapillärer Hyperzellularität und vermehrten Kontaktstellen zwischen den Zellen einhergeht (Danis et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34: 2367–2371 (1993) und Dosso et al., Diabetologia 33: 137–144 (1990)). Die mikrovaskulären Veränderungen, von denen bekannt ist, dass sie in den Zucker diabetic fatty Ratten auftreten, sind mit den erhöhten Spiegeln des VEGF und des aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktors (PDGF) und mit der Aktivierung von PTK-Reaktionswegen, besonders von Reaktionswegen, die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3-K) und von Mitogen aktivierte Proteinkinase (MAPK) einbeziehen, verbunden. Jedes Paar der Wurfgeschwister war zwischen sechs und sieben Monate alt. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) zur Verwendung von Tieren in der ophthalmologischen und das Sehvermögen betreffenden Forschung behandelt. Der durchschnittliche Glucosewert im Blut lag über 500 mg/dl für die Zucker diabetic fatty Ratten und 120 mg/dl für die mageren Kontrollratten, wie mittels des Glucoseoxidasetests zum Todeszeitpunkt gemessen wurde (Danis et al., (1993), oben).
Nach einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (40 mg/kg) und Xylazin (4 mg/kg) wurde Genistein (LC Laboratories, Woburn, MA), das in DMSO bei einer Konzentration von 10 mg/ml verdünnt worden war, intraperitoneal in die Zucker diabetic fatty Ratte und in die magere Ratte (nicht behandelte Gruppe) mit einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht injiziert. Nach zwei Stunden wurde die Injektion wiederholt.
Vierundzwanzig Stunden später wurden die Tiere durch eine intrakardiale Injektion von Pentobarbital getötet. Dann wurde 1 mM Natriumorthovanadat in das Rattenauge injiziert, um die Phosphataseaktivität zu hemmen, das Auge wurde enukleiert und das vor- dere Segment wurde abgetrennt. Der Glaskörper wurde mit einer Pinzette entfernt und die Retina wurde von dem retinalen, pigmentierten Epithel/der Choroidea abgelöst und scharf vom Sehnerv getrennt. Das retinale Gewebe wurde in ein Röhrchen mit 125 μl eiskalten Lysepuffer (150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 0,1 % SDS, 50 mM Tris, 100 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,3 μg/ml EDTA, 0,7 μg/ml Pepstatin A, 0,5 μg/ml Leupeptin, 1 mM Natriumorthovanadat und 50 μM Natriumfluorid) eingebracht. Das retinale Gewebe wurde mit einem Glashomogenisator homogenisiert und dann wurden gleiche Mengen von 2x SDS Probenpuffer (160 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4 % SDS, 30 % Glycerin, 5 B β-Mercaptoethanol, 10 mM Dithiothreitol, 0,01 % Bromphenolblau) zugegeben. Das Homogenat der Retina wurde bei 95°C 5 min lang gekocht und 10 min lang bei 13.000 Upm zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und bei –80°C aufbewahrt. Diese Gesamtproben der Retinae wurden zur Gelelektrophorese und zur Western-Immunoblot-Untersuchung verwendet.
Die Proteinkonzentrationen wurden mit der Pierce BCA Methode gemessen. Die Gesamtproteinprofile zeigten, dass die Retina der Zucker diabetic fatty Ratte eine im Vergleich mit den mageren Kontrollen stärker gefärbte Bande von 67 kDa aufwies. Eine Behandlung mit Genisten verringerte die Intensität der Färbung der Bande von 67 kDa in der Zucker diabetic fatty Ratte. Andere Banden in den Gesamtproteinprofilen erschienen ungeachtet der Behandlung mit Genistein unverändert zu sein.
Antikörper gegen Phosphotyrosin (PY 20; Verdünnung 1:500; Transduction Laboratories, Lexington, KY), Antikörper gegen PCNA (Verdünnung 1:200), Antikörper gegen von Mitogen aktivierte Proteinkinase (Verdünnung 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), Antikörper gegen Phosphatidylinositol-3-Kinase (Verdünnung 1:500; Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY) wurden als primäre Antikörper in der Western-Immunoblot-Untersuchung verwendet. Mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugier- ter anti-Maus-IgG-Antikörper oder anti-Kaninchen-IgG-Antikörper von der Ziege (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Avidin-HRP (Bio-Rad) wurde verwendet, um die biotinylierten molekularen Marker zu erfassen.
Die Proben des Gewebes der Retina wurden zu Immunpräzipitationspuffer (1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EGTA, 0,2 mM Natriumvanadat, 0,2 mM PMSF, 0,5 % NP-40) gegeben und homogenisiert. Nach einer 10 Minuten langen Zentrifugation bei 8.000 Upm bei 4°C erhielt man den Überstand. Die Proteinkonzentrationen wurden mit der Pierce BCA Methode gemessen. Dann wurden 20 μg von mit Agarose konjugiertem Antikörper gegen Phosphotyrosin (PY 20; Transduction Laboratories) zu jedem Milligramm des retinalen Homogenats gegeben. Die retinalen Homogenate wurden über Nacht unter Schütteln mit dem mit Agarose konjugierten Antikörper gegen Phosphotyrosin bei 4°C inkubiert. Pellets wurden durch Zentrifugation gesammelt (10 Minuten bei 8.000 Upm) und dreimal mit dem Lysepuffer gewaschen. Die Pellets wurden in 150 μl 1x SDS Probenpuffer pro Milligramm des retinalen Homogenats resuspendiert und bei 95°C 5 min lang gekocht. Diese immunpräzipitierten Proben wurden für die Gelelektrophorese verwendet.
Gleiche Proteinmengen der retinalen Proben wurden bei konstanten 200 V 35 min lang auf Minigelen (Bio-Rad) mit Gradienten von 4–20 % unter Verwendung einer Protean-II-Apparatur von Bio-Rad elektrophoretisiert. Gleichzeitig mit den Proben ließ man einen weiten Bereich umspannende, biotinylierte (6,5–200 kDa) und vorgefärbte (18,5– 106 kDa) Proteinmarker für Molekulargewichte (Bio-Rad) laufen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele entweder zur Proteinfärbung mit dem Farbstoff Coomassie-Brillant-Blau oder für die Western-Immunoblot-Untersuchung weiterverarbeitet. Nach der Gelelektrophorese wurden die Gele in 45 % Methanol und 10 % Ethansäure in wässriger Lösung 30 min lang fixiert. Dann wurden sie kurz in gesättigte Pikrinsäure getaucht und mit 0,25 % wässrigem Coomassie-Brillant-Blau (R-250) mindestens 2 Stunden lang gefärbt. Die Gele wurden in 10 % Ethansäurelösung entfärbt. Die Prozedur wurde drei Mal wiederholt.
Für die Western-Immunoblot-Untersuchung wurden die Gele unter Verwendung einer trans-blot-SD-Apparatur (Bio-Radelektrisch auf Nitrocellulosemembranen (Coster Scientific Corp. Cambridge, MA) übertragen. Die Membranen zum Nachweis von Tyrosin-phosphorylierten Proteinen wurden mit 3 % Rinderserumalbumin in mit Tris gepufterter Salzlösung (TBS; 20 mM Tris und 150 mM NaCl, pH 7,5) eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen zum Nachweis anderer Proteine wurden mit 2 % getrockneter Magermilch (Bio-Rad) in TBS 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde jede Membran mit der primären Antikörperlösung über Nacht bei 4°C inkubiert. Dann wurden die Membranen mit TBS gewaschen und mit HRPkonjugierten anti-Maus-IgG von der Ratte (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) oder mit anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Bio-Rad, Verdünnung 1:1.000) und Avidin-HRP (Bio-Rad, Verdünnung 1:10.000) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer abschließenden Reihe von Spülungen mit TBS, das 0,2 % Tween 20 enthielt, und mit TBS allein ließ man die Membranen mit verbesserten Chemilumineszenzreagenzien (ECL) zur Immundetektion (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL) regieren und belichtete sie auf Röntgenfilm. Jede Western-Immunoblot-Untersuchung wurde mindestens dreimal wiederholt.
Insgesamt waren die Tyrosin-phosphorylierten Proteine in der diabetischen Retina im Vergleich zu den mageren Kontrollen bei 50, 66, 97 und 116 kDa vermehrt. Mit Genistein behandelte, diabetische Ratten zeigten im Vergleich mit der nicht behandelten Gruppe bei jedem Molekulargewicht eine verminderte Färbung.
Die Western-Immunoblot-Untersuchung von immunpräzipitierten Tyrosinphosphorylierten Proteinen zeigte die im Vergleich mit mageren Kontrollen gesteigerte Tyrosin-Phosphorylierung von PI3-K bei 85 kDa in den diabetischen Ratten. Die Tyrosinphosphorylierte, gefärbte Bande von PI3-K wurde nach Behandlung mit Genistein abgeschwächt, besonders bei der diabetischen Ratte.
Die Tyrosin-phosphorylierte MAPK bei 44 kDa war in den diabetischen Ratten im Vergleich zu den mageren Kontrollen erhöht. Ähnlich wie bei der PI3-K wurde der Spiegel der MAPK in der behandelten Gruppe im Vergleich mit der nicht behandelten Gruppe auch abgesenkt.
Zwei Paare von Ratten wurden für die immunhistochemische Analyse von PCNA in der Retina verwendet. Unter tiefer Anästhesie mit Ketamin und Xylazin wurden die vier Ratten transkardial mit 0,1 M mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS; pH 7,4), die 1 mM Orthovanadat enthielt, perfundiert, gefolgt von einer Perfusion von 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M PBS zur Fixierung. Die Augen wurden dann entfernt und 30 min lang in derselben Fixierlösung eingetaucht. Die vorderen Segment wurden entfernt und die hinteren Segmente wurden in eine von 5 % bis 15 % abgestufte Saccharoselösung eingebracht und über Nacht in einer 20%igen Saccharoselösung inkubiert. Nach der Kryoprotektion wurden die Augen in „O.C.T. Compound" (Einbettmedium, Miles, Inc., Elkhart, IN) und in Isopentan mit Trockeneis eingefroren. Die hinteren Segmente wurde in Schnitte von 8 μm geschnitten.
Die Schnitte wurden mit 3 % Peroxid behandelt, um die intrinsische Peroxidase zu blockieren, und mit 2 % normalem Pferdeserum 20 min lang inkubiert. Nach dreimaligem Spülen in 0,1 M PBS wurden die Schnitte über Nacht bei 4°C mit Antikörper gegen PCNA (Verdünnung 1:1.000) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Schnitte in 0,1 M PBS gespült und mit biotinyliertem anti-Maus-IgG-Antikörper (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA; Verdünnung 1:500) 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit Peroxid-markiertem Streptavidin (Kirkegaad & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD; Verdünnung 1:500) inkubiert. Die Schnitte wurden mit einer Lösung von 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) behandelt, um eine Visualisierung zu ermöglichen. Jeder Satz von Schnitten wurde zur selben Zeit untersucht und es wurden drei verschiedene Sets untersucht. Nach Einbetten mit geliertem Glycerin (7 % Gelatine, 54 % Glycerin, 0,7 % Phenol) wurden Mikrophotographien mittels Nomarski-Optik (Carl Zeiss, Thornwood, NY) angefertigt.
In der Retina der Zucker diabetic fatty Ratte war der Spiegel von PCNA bei 36 kDa im Vergleich mit den mageren Ratten erhöht. Genistein verminderte diesen Anstieg im Vergleich zur nicht behandelten Gruppe, obwohl das Niveau der mageren Kontrollen nicht erreicht wurde.
Im Vergleich zu den mageren Kontrollen wurde bei den Zucker diabetic fatty Ratten eine starke, positive Immunreaktion in den Zellkernen in den Nervenfasern und den inneren und äußeren Kernschichten beobachtet. In den diabetischen Ratten, die mit Genistein behandelt worden waren, wurden jedoch weniger immunpositive Zellen nachgewiesen. Eine Inkubation der Retina von der diabetischen Ratte mit IgG der nicht immunen Maus anstatt mit Antikörper gegen PCNA zeigte keine Immunreaktion.
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Genistein erhöhte Spiegel von Phosphotyrosin insgesamt absenkte und erhöhte Spiegel von phosphorylierten PI3-K, MAPK und PCNA (was ein Zeichen dafür ist, dass die Zellen zur Replikation vorbereitet sind) in der Retina der diabetischen Ratte absenkte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Genistein die Aktivierung der PTK-Reaktionswege in der Retina von diabetischen Tieren mit Veränderung, die noch nicht sichtbar sind, hemmen kann, so dass die diabetische Retinopathie verhindert werden kann.

Claims

Verwendung eines Hemmstoffs des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs, wobei besagter Hemmstoff (i) eine Verbindung der Formel:
wobei V, W und X ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkoxy, Hydroxyl, Halogen, einem Ester, einem Ether, einer Carbonsäuregruppe, einem pharmazeutisch annehmbaren Salz einer Carbonsäuregruppe und -SR, worin R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist, wobei Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel, C(OH) und C=O und wobei Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und C(O)OR₁, wobei R₁ ein Alkyl ist, (ii) ein Protein-Tyrosin-Kinase hemmendes Propharmakon davon, worin eines oder mehrere von V, W und X unabhängig voneinander mit einem Ester wie zum Beispiel Pivalinsäure derivatisiert ist/sind, oder (iii) ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist, zur Herstellung eines Medikaments zum prophylaktischen oder therapeutischen Behandeln eines Tieres auf diabetische Retinopathie.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Halogengruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluor, Chlor und Brom.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Ester der besagten Verbindung ein C₁-C₆-Ester ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Ether der besagten Verbindung ein C₁-C₆-Ether ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das besagte pharmazeutisch annehmbare Salz einer Carbonsäuregruppe der besagten Verbindung ein Natriumsalz oder ein Kaliumsalz ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Alkylgruppen der besagten Verbindung C₁-C₆-Alkylgruppen sind und die Alkoxygruppe eine C₁-C₆-Alkoxygruppe ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der besagte Hemmstoff des Protein-Tyrosin-Kinase-Reaktionswegs Genistein ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Medikament systemisch zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament in einer Menge von 1 mg/kg/Tag bis 100 mg/kg/Tag zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Medikament in einer Menge von 15 mg/kg/Tag bis 50 mg/kg/Tag zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament oral oder mittels Injektion zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament im Stadium der prädiabetischen Retinopathie zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament im Stadium der nichtproliferativen diabetischen Retinopathie zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 13 zum Verhindern eines diabetischen Makulaödems.
Verwendung nach Anspruch 13 zum Behandeln eines diabetischen Makulaödems.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament im proliferativen diabetischen Stadium zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Medikament vor, während oder nach der chirurgischen Entfernung von Narbengewebe, das während der Neovaskularisation im proliferativen diabetischen Stadium gebildet wurde, aus einem Auge zu verabreichen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das Medikament topisch, subkonjunktival, retrobulbär, periokulär, subretinal, suprachoroidal oder intraokulär zu verabreichen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–7 und 18, wobei das Medikament in einer Menge von insgesamt 0,1 mg bis insgesamt 5 mg intraokulär zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Medikament in einer Menge von insgesamt 0,5 mg bis insgesamt 1 mg intraokulär zu verabreichen ist.