DE69933939T2

DE69933939T2 - Hitzestabile xylanasen

Info

Publication number: DE69933939T2
Application number: DE69933939T
Authority: DE
Inventors: L. Wing Ottawa SUNG; S. Jeffrey Ottawa TOLAN
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1998-11-16
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2019-11-17
Also published as: AU1145100A; AU775311C; AU775311B2; DE69933939D1; DE69933939T3; EP1131447B2; ATE344837T1; EP1131447B1; CA2385245C; WO2000029587A1; DK1131447T3; DK1131447T4; WO2000029587A8; CA2385245A1; EP1131447A1

Description

Die Erfindung betrifft thermostabile Xylanase-Enzyme. Spezieller ist die Erfindung auf thermostabile Xylanase-Enzyme, die hohe Aktivität bei oder nahe bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur aufweisen, und deren Verwendung bei Futterpelletier-Anwendungen gerichtet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Natürliche Xylanase-Enzyme, wie jene des Pilzes Trichoderma reesei, sind zu Tierfutter hinzugesetzt worden, um die Effizienz der Verdauung und Assimilation von Nährstoffen zu erhöhen. Während des Verdauens von Futterkörnern, wie Weizen und Gerste, erhöhen Nicht-Stärke-Polysaccharide, einschließlich Xylan, die Viskosität des Nahrungsbreis in Abwesenheit von zugesetzten exogenen Enzymen. Dies interferiert mit der Diffusion der Verdauungsenzyme zu dem Futter und der nachfolgenden Assimilation der Nährstoffe. Der hochgradig viskose Nahrungsbrei erhöht das Auftreten von klebrigen Faeces, welche die Wahrscheinlichkeit von Erkrankungen erhöhen und Ablaufprobleme hinsichtlich der Ausscheidungen verursachen. Die Zugabe von Xylanase zu Futter baut das Xylan ab und verringert die Viskosität des Nahrungsbreis, wodurch dazu beigetragen wird, diese Probleme zu lindern. Xylanase erzeugt eine Kostenersparnis, indem die Effizienz der Futterumwandlung erhöht wird. Xylanase kann das Verhältnis von verzehrtem Futter zu Gewichtszunahme um 5–15% verringern (Viveros, A., Brenes, A., Pizarro, M., und Castano, M., 1994, Animal Feed Sci. Technol. 48:237–251).
Xylanase-Enzyme, die für Futter verwendet werden, sind typischerweise wässrige Lösungen von aktivem Protein, Stabilisatoren, Konservierungsmitteln und anderen Zusätzen. Die Enzyme werden typischerweise auf das Futter in einer Konzentration von 100-2000 ml pro Tonne Futter gesprüht. Alternativ kann körnchenförmige oder pulverisierte Xylanase verwendet werden. Wird das Futter einmal von dem Tier als Nahrung aufgenommen, wirkt das Enzym auf Xylan, wenn das Futter verzehrt und im Darm verdaut wird. Schließlich wird die Xylanase, ein Proteinmolekül, durch die Verdauungsenzyme (Proteasen) zu Aminosäuren wie ein jegliches Protein im Futter hydrolysiert.
Tierfutter-Präparate werden zunehmend bei hohen Temperaturen zur Sterilisation gegen schädliche Bakterien, beispielsweise Salmonella, pelletiert. Die Futterpelletierung wird ausgeführt, indem die Futterfeststoffe mit 100 bis 140°C heißem Dampf erwärmt und diese durch eine(n) Extruder/Pelletierschnecke geleitet werden, um Futterpellets zu bilden, die dann in einem Vorratsbunker abkühlen. Die typische Zeitspanne, die benötigt wird, um das Material durch das System zu leiten, beträgt 30 min. Wie in diesem Fachgebiet bekannt ist, können höhere Temperaturen mit kürzeren Pelletierzeiten und niedrigere Temperaturen mit längeren Pelletierzeiten verwendet werden, vorausgesetzt, dass die notwendigen Feuchtigkeitskonzentrationen erhalten werden. Die resultierende Gesamttemperatur innerhalb der Feststoffe vor, während und nach der Pelletbildung erreicht ungefähr 70–95°C für bis zu 30 min. Es ist wünschenswert, die Xylanase während des Futterpelletierprozesses zuzusetzen. Dieses würde den Futter-Formulierungsexperten den zusätzlichen Schritt ersparen, flüssige Xylanase zuzusetzen, welcher unbequem ist und mikrobielle Verunreinigungen in das Futter einführen kann. Die Option einer Zugabe von fester Xylanase als ein separater Schritt ist ebenfalls nicht wünschenswert, da die Feststoffe nicht gleichmäßig gemischt werden würden. Marquardt und Bedford (1997, Enzymes in Poultry and Swine Nutrition, Marquardt, R.R., und Han, Z., Hrsg., S. 129–138) geben an, dass, obgleich gegenwärtig verfügbare Enzyme für eine Verwendung als Futterzusätze nützlich sind, neue Enzyme, die hohe Aktivität und Beständigkeit gegenüber einer Wärmebehandlung zeigen, ebenfalls erwünscht sind; sie merken jedoch an, dass Enzyme, die diese Eigenschaften zeigen, nicht zur Verfügung stehen.
Xylanasen der Familie 11 (welche auch als Familie G-Xylanasen bezeichnet werden) haben aufgrund ihrer geringen Größe und hohen Aktivität mehrere Eigenschaften, die für Futteranwendungen geeignet sind. Ein Beispiel einer moderate Temperatur-Familie 11-Xylanase ist TrX, die aus Trichoderma reesei erhalten wird. Moderate Temperatur-Xylanasen sind bewährte Futterzusatz-Enzyme mit Temperatur- und pH-Optima, die mit den physiologischen Bedingungen im Verdauungssystem von Tieren verträglich sind. Diese Enzyme können jedoch die hohe Temperatur des Pelletierprozesses nicht aushalten und werden während dieses Schritts inaktiv.
Xylanasen aus Hochtemperatur-Mikroorganismen (z.B. einem Thermophilen), beispielsweise Thermomonospora fusca-Xylanase (welche als TfX, also eine Familie 11-Xylanase, bezeichnet wird), sind für die Futterpelletierung ebenfalls in Betracht gezogen worden. Die Thermostabilität von solchen Enzymen ist ausreichend, um die Pelletiertemperaturen auszuhalten. Jedoch weisen thermophile Xylanasen optimale Aktivität bei hohen Temperaturen (70–80°C) auf und mehrere von diesen Enzymen haben ein hohes pH-Optimum von 7–9. Wenn sie in das Verdauungssystem eines Tiers mit einer physiologischen Temperatur um 40°C (z.B. Geflügel: 43°C, eine ähnliche Temperatur wird innerhalb von Schweinen festgestellt) und einem pH von 3–5 im Nahrungsbrei eingebracht werden, funktionieren diese Enzyme nur schlecht.
Familie 11-Xylanasen sind durch Protein-Engineering modifiziert worden, um die Eigenschaften dieser Enzyme für industrielle Anwendungen zu verbessern. Diese Modifikationen sind auf die Erhöhung der Temperatur- und pH-Optima zusammen mit der Thermostabilität von diesen Enzymen für bestimmte Anwendungen gerichtet gewesen. Beispielsweise ist US 5,405,769 (WO 94/24270) auf eine ortsspezifische Mutagenese von Bacillus circulans-Xylanase (BcX) für die Verbesserung der Thermostabilität dieses Enzyms gerichtet. Die offenbarten Modifizierungen betreffen die Bildung von intermolekularen und intramolekularen Disulfid-Bindungen inner halb von BcX und diese Modifizierungen führten zu erhöhter Thermostabilität. Es wurde beispielsweise eine Verbesserung der Thermostabilität von bis zu 6°C bei der Hinzufügung einer einzelnen Disulfid-Bindung und bis zu 10°C bei zwei Disulfid-Bindungen beobachtet. Andere Modifizierungen umfassten das Verknüpfen der N- und C-Termini, was die Thermostabilität um 6°C erhöhte, oder N-terminale Mutationen, die die Thermostabilität um 2°C erhöhten. Jedoch waren bei allen der obigen Modifizierungen die resultierenden Enzyme entweder weniger aktiv (bis zu 45% weniger aktiv) oder zeigten eine Zunahme der Temperatur- und pH-Optima. Als solche sind diese Enzyme für Futterpelletier-Anwendungen nicht geeignet.
US 5,759,840 offenbart auch Modifizierungen an BcX und Trichoderma reesei-Xylanase (TrX), um die Thermostabilität zu erhöhen, während zugleich die Temperatur- und pH-Optima dieser Enzyme steigen. Wieder würden diese Xylanasen für Futterpelletier-Anwendungen nicht geeignet sein.
Die obigen Ergebnisse stimmen überein mit anderen Berichten, die feststellen, dass Disulfid-Bindungen nicht zu den Thermostabilisierungsmechanismen gehören, die durch thermophile Enzyme eingesetzt werden (Cowan, D.A., 1995, Essays Biochem. 29:193–207), da das Disulfid bei Temperaturen über 80°C zu Dehydroalanin und Thiocystein gespalten werden kann. Dementsprechend ist die Erhöhung der Stabilität eines Enzyms unter Verwendung von Disulfid-Bindungen auf niedrigere Temperaturbereiche beschränkt. Die Disulfid-Bindung wird dementsprechend nicht empfohlen, um die Stabilität des Enzyms bei hohen Temperaturen zu verbessern (Gupta, M.N., 1991, Biotech. Applied Biochem. 14:1–11; Cowan, D.A., 1995, Essays Biochem. 29:193–207).
Keines der obigen Dokumente wendet sich an Verfahren zur Herstellung von Xylanase-Enzymen unter Verwendung von herkömmlichen Screening-Techniken oder durch Modifizieren von Xylanase-Enzymen, die die Eigenschaften von höherer Temperaturbeständigkeit zeigen, während optimale Leistungseigenschaften unter Bedingungen von physiologischem pH und physiologischer Temperatur beibehalten werden.
Über eine Verbesserung bei der Thermostabilität von Trichoderma reesei-Xylanase II wurde von Paloheimo et al. berichtet (Paloheimo, M., Mantyla, A., Vehmaanpera, J., Hakola, S., Lantto, R., Lahtinen, T., Parkkinen, E., Fagerstrom, R., und Suominen, P., 1997, in Carbohydrases from Trichoderma reesei and Other Microorganisms, S. 255–264). Von den fünf charakterisierten Mutanten behielt die am meisten verbesserte Mutante (Glutaminsäure-38-TrX) 50% der Aktivität bei 57°C nach 9 min bei, verglichen mit 7 min bei dem TrX-Wildtyp. Arase et al. (Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y., und Okada, H., 1993, FEBS Lett. 316:123–127) beschreiben mehrere Modifizierungen, um die Thermostabilität einer Bacillus pumilis-Xylanase (BpX) zu verbessern, jedoch wurden nach einer Inkubation dieser Enzyme bei einer Temperatur von 57°C für 20 min nur bis zu 40% der restlichen Enzymaktivität beibehalten. Obgleich in diesen beiden Studien die Auswirkungen einer erhöhten Thermostabilität auf die pH- und Temperaturoptima der Enzyme nicht bestimmt wurden, zeigen diese Enzyme für Futterpelletier-Anwendungen inadäquate Thermostabilität.
Trotz eines breiten Spektrums an Erfahrungen beim Screenen, Testen und Modifizieren von Xylanase-Enzymen gibt es keine Berichte über Xylanasen, die die Kombination von Eigenschaften, die für Futterpelletier-Anwendungen benötigt werden, zeigen: hohe Thermostabilität mit optimaler Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur. Es sind weder natürliche Xylanasen selektiert worden, noch ist irgendeine Mutationsmethodik für die Familie 11-Xylanasen entwickelt worden, um die Thermostabilität von Xylanase-Enzymen zu erhöhen ohne eine jegliche Veränderung bei den Temperatur- und pH-Optima und ohne einen begleitenden Verlust der spezifischen Aktivität des Enzyms. Solche selektierten natürlichen Xylanasen oder Xylanasen, die unter Verwendung von Mutationsmethodiken hergestellt worden sind, würden den Vorteil einer Verbesserung der Futterverdaubarkeit und Verarbeitung beim Pelletieren bieten.
Die Erfindung ist darauf gerichtet, Xylanase-Enzyme zu erhalten, die die Eigenschaft erhöhter Thermostabilität zeigen, während die pH- und Temperaturoptima, die typischerweise unter physiologischen Bedingungen gefunden werden, beibehalten werden.
Es ist ein Gegenstand der Erfindung, Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
Das obige Ziel wird erreicht durch die Kombinationen von Merkmalen der Hauptansprüche; die Unteransprüche offenbaren weitere vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft thermostabile Xylanase-Enzyme. Spezieller ist die Erfindung auf thermostabile Xylanase-Enzyme, die hohe Aktivität bei oder nahe bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigen, und die Verwendung dieser Xylanase-Enzyme bei Futterpelletier-Anwendungen gerichtet.
Gemäß der Erfindung wird eine isolierte Xylanase der Familie 11 bereitgestellt, umfassend mindestens eine intramolekulare Disulfid-Bindung und eine basische Aminosäure in Position 162 (Trichoderma reesei-Xylanase II-Nummerierung) oder deren Äquivalent, wobei diese Position aufgrund eines Sequenz-Alignments (auf Homologie basierende gegenseitige Ausrichtung von Sequenzen) der genannten isolierten Xylanase gegenüber der Trichoderma reesei-Xylanase II-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:16 definiert ist, bestimmt wird, wobei die isolierte Xylanase wenigstens 40% der optimalen Aktivität von ungefähr pH 3,5 bis ungefähr pH 6,0 und von ungefähr 40 bis ungefähr 60°C und nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C, 80°C oder 90°C in Gegenwart von 40% Glycerol; einem 30- oder 60-minütigen Vorinkubationsschritt bei 62,5°C in Abwesenheit eines Stabilisators; oder einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C oder 68°C in Abwesenheit eines Stabilisators wenigstens 30% der optimalen Aktivität zeigt. Die basische Aminosäure wird aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Arginin und Histidin ausgewählt. Die basische Aminosäure ist vorzugsweise Histidin.
Die modifizierte Xylanase der Erfindung umfasst wenigstens eine Disulfid-Brücke. Die modifizierte Xylanase umfasst vorzugsweise eine oder zwei Disulfid-Brücken.
Die Erfindung ist auf eine isolierte Xylanase der Familie 11 gerichtet. Darüber hinaus betrifft diese Erfindung eine isolierte Xylanase, wobei die Familie 11-Xylanase aus Trichoderma stammt.
Die Erfindung ist auch auf die isolierte Xylanase, wie oben definiert, gerichtet, wobei die Xylanase aus der Gruppe bestehend aus TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 und TrX-162H-DS4 ausgewählt wird.
Diese Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Gewinnen einer Xylanase der Familie 11, welches umfasst:

i) Auswählen eines Organismus, der Xylanase-Aktivität exprimiert, und Gewinnen der Xylanase aus dem Organismus;
ii) Feststellen, ob die Xylanase wenigstens 40% der optimalen Aktivität von pH 3,5 bis pH 6,0 und von 40 bis 60°C zeigt; und
iii) Feststellen, ob die Xylanase eine Xylanase der Familie 11 ist und ob die Xylanase nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C, 80°C oder 90°C in Gegenwart von 40% Glycerol; einem 60-minütigen Vorinkubationsschritt bei 62,5°C in Abwesenheit eines Stabilisators oder einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C oder 68°C in Abwesenheit eines Stabilisators wenigstens 30% der optimalen Aktivität zeigt;
iv) Feststellen, ob die Xylanase eine basische Aminosäure in Position 162 (Trichoderma reesei-Xylanase II-Nummerierung), wobei diese Position aufgrund eines Sequenz-Alignments (auf Homologie basierende gegenseitige Ausrichtung von Sequenzen) der genannten isolierten Xylanase gegenüber der Trichoderma reesei-Xylanase II-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:16 definiert ist, bestimmt wird, und eine intramolekulare Disulfid-Bindung aufweist; und
v) Aufbewahren der Xylanase, die diese Eigenschaften zeigt.

Schritt i) des obigen Verfahrens kann auch umfassen, die Xylanase teilweise zu reinigen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Tierfutter, wobei das Verfahren ein Aufbringen der isolierten, modifizierten Familie 11-Xylanase, wie oben definiert, auf das Tierfutter, um eine Xylanase-Tierfutter-Kombination zu erzeugen, und ein Hitzesterilisieren der Xylanase-Tierfutter-Kombination umfasst. Das Tierfutter ist vorzugsweise ein Geflügel- oder Schweinefutter.
Die Erfindung betrifft auch eine isolierte Familie 11-Xylanase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie wenigstens eine intramolekulare Disulfid-Bindung und eine basische Aminosäure in Position 162 (Trichoderma reesei-Xylanase II-Nummerierung) oder deren Äquivalent, wobei diese Position aufgrund eines Sequenz-Alignments (auf Homologie basierende gegenseitige Ausrichtung von Sequenzen) der genannten isolierten Xylanase gegenüber der Trichoderma reesei-Xylanase II-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:16 definiert ist, bestimmt wird, umfasst, wobei die Xylanase nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C, 80°C oder 90°C in Gegenwart von 40% Glycerol; einem 30- oder 60-minütigen Vorinkubationsschritt bei 62,5°C in Abwesenheit eines Stabilisators oder einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C oder 68°C in Abwesenheit eines Stabilisators wenigstens 30% der optimalen Aktivität zeigt.
Die Erfindung ist darauf gerichtet, Xylanase-Enzyme zu erhalten, die pH- und Temperaturoptima zeigen, die innerhalb des Nahrungsbreis eines Tiers gefunden werden, während das Xylanase-Molekül zur gleichen Zeit Thermostabilität zeigt und dementsprechend Verfahrensschritten, die mit dem Sterilisieren und Herstellen von pelletiertem Futter verbunden sind, widerstehen kann. Der Stand der Technik offenbart, thermostabile Enzyme entweder durch Selektion von nativen Enzymen oder durch Gentechnologie zu erhalten; jedoch zeigen diese Enzyme keine physiologischen pH- und Temperaturoptima. Der Stand der Technik offenbart auch Xylanase-Enzyme, die optimale Enzymaktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigen; diese Enzyme sind jedoch nicht thermisch stabil. Darüber hinaus gibt es im Stand der Technik nichts, was nahe legen würde, dass native Xylanase-Enzyme oder dass Xylanase-Enzyme modifiziert werden können, wie hier offenbart, um Xylanase-Enzyme zu erhalten, die hohe Temperaturtoleranz, die für ein Futterpelletieren geeignet ist, zeigen und optimale enzymatische Aktivität bei oder nahe bei physiologischen Bedingungen bewahren.
Diese Zusammenfassung der Erfindung beschreibt nicht notwendigerweise alle notwendigen Merkmale der Erfindung, sondern dass die Erfindung vielmehr auch in einer Unterkombination der beschriebenen Merkmale liegen kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Diese und andere Merkmale der Erfindung werden besser ersichtlich aus der folgenden Beschreibung, in welcher auf die beigefügten Zeichnungen verwiesen wird, in denen:
1 das Alignment einer Mehrzahl von Aminosäuresequenzen von Familie 11-Xylanasen zeigt. Die Aminosäuren, die wenigstens 80% der aufgelisteten Familie 11-Xylanasen gemein sind, sind fett gedruckt angegeben. Die Reste, die allen Familie 11-Xylanasen gemein sind, sind unterstrichen. Bacillus pumilus (Bp); Clostridium acetobutylicum P262 XynB (Ca); Clostridium stercorarium (Cs); Ruminococcus flavefaciens (Rf); Trichoderma reesei-XynII (Tr2); Trichoderma viride (Tv); Trichoderma harzianum (Th); Schizophyllum commune-Xylanase A (Sc); Aspergillus niger var. awamori (An); Aspergillus tubigensis (At); Trichoderma reesei-Xynl (Tr1); Streptomyces sp. No. 36a (Ss); Streptomyces lividans-Xylanase B (S1B); Streptomyces lividans-Xln C (S1C); Thermomonospora fusca-TfxA (Tf); Bacillus circulans (Bc); Bacillus subtilis (Bs).
2 zeigt die synthetischen Oligonukleotide für die Konstruktion einer Gensequenz, die die Trichoderma-Xylanase kodiert, in dem Plasmid pTrX (SEQ ID NO:18).
3 zeigt die Auswirkung der Inkubationszeit auf die restliche Enzymaktivität von mutierter TrX, TrX-DS1, TrX-162H, TrX-162H-DS1 und TrX-162H-DS4 bei 62,5°C. Die Daten sind in Bezug auf jene, die bei 0 min beobachtet werden, normalisiert.
4 zeigt die Auswirkung von Temperaturen auf die restliche Enzymaktivität von mehreren der modifizierten Xylanasen der Erfindung. 4(a) zeigt die restliche Enzymaktivität von TrX, TrX-DS1, TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 und TrX-162H-DS4 in Natriumcitrat-Puffer bei einer 30-minütigen Inkubation. 4(b) zeigt die Auswirkung von Temperaturen auf die restliche Enzymaktivität der Mutante TrX-DS8. Für die 4(a) und (b) sind die Daten in Bezug auf jene, die bei 48°C beobachtet werden, normalisiert. Die T₅₀, welche die Inkubationstemperatur ist, welche das Aufrechterhalten von 50% restlicher Aktivität nach 30 min erlaubt, wurde für jede mutierte TrX bestimmt.
5 zeigt die Auswirkung von Temperaturen auf die restliche Enzymaktivität von mutierter TrX, Trx-DS1 und TrX-162H-DS1 in 40% Glycerol bei einer 30-minütigen Inkubation. Die Daten sind in Bezug auf jene, die bei 50°C beobachtet werden, normalisiert.
6 zeigt die Auswirkung der Inkubationszeit auf die restliche Enzymaktivität von TrX-162H-DS1 in 40% Glycerol bei 90°C. Die Daten sind in Bezug auf jene, die bei 0 min beobachtet werden, normalisiert.
7 zeigt die Auswirkung der Temperatur auf die Freisetzung von Xylose im Rahmen einer 30-minütigen Hydrolyse von löslichem Xylan durch TrX, TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 und TrX-162H-DS4 bei pH 4,5. Die Daten sind in Bezug auf jene, die bei dem Temperaturoptimum beobachtet werden, normalisiert.
8 zeigt die Auswirkung des pH auf die Freisetzung von Xylose im Rahmen einer 7-minütigen Hydrolyse von löslichem Xylan durch TrX, TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 und TrX-162H-DS4 bei 40°C. Die Daten sind in Bezug auf jene, die bei dem pH-Optimum beobachtet werden, normalisiert.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die Erfindung betrifft thermostabile Xylanase-Enzyme und deren Verwendung als Futterzusätze. Spezieller ist die Erfindung auf thermostabile Xylanase-Enzyme, die gute Thermostabilität zeigen und hohe Aktivität bei oder nahe bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigen, gerichtet.
Die folgende Beschreibung ist lediglich beispielhaft jene einer bevorzugten Ausführungsform und ohne Einschränkung hinsichtlich der Kombination von Merkmalen, die erforderlich sind, um die Erfindung in die Praxis umzusetzen.
Mit physiologischem pH und physiologischer Temperatur ist der Temperatur- und pH-Bereich gemeint, der mit dem Verdauungsssystem innerhalb eines Tiers, beispielsweise Geflü gel und Schweine, jedoch nicht darauf beschränkt, verträglich ist. Ein geeigneter physiologischer Temperaturbereich erstreckt sich beispielsweise von ungefähr 35 bis ungefähr 60°C; dieser Bereich erstreckt sich mehr bevorzugt von ungefähr 40 bis ungefähr 50°C. In ähnlicher Weise erstreckt sich ein geeigneter physiologischer pH-Bereich von ungefähr pH 3,0 bis ungefähr 7,0; dieser Bereich erstreckt sich vorzugsweise von ungefähr pH 3,5 bis ungefähr 6,0. Die Zeit, die für die Verdauung von Futter innerhalb des Darms eines Tieres benötigt wird, variiert von Tier zu Tier. Beispielsweise benötigt in Schweinen die Verdauung von Futter ungefähr 2 bis ungefähr 4 h, während sie bei Geflügel bis zu ungefähr 12 h beträgt.
Mit hoher Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur ist gemeint, dass das Enzym wenigstens 40% von seiner optimalen Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigt. Der optimale pH- und Temperaturbereich kann außerhalb des physiologischen Bereichs liegen, vorausgesetzt, dass das Enzym wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität innerhalb des physiologischen Bereichs, beispielsweise von ungefähr 40 bis ungefähr 50°C und bei einem pH von ungefähr 3,5 bis ungefähr 6, zeigt. Die Beispiele 4 und 5 beschreiben die Bestimmung eines geeigneten Xylanase-Enzyms, das diese Eigenschaften zeigt.
„Thermostabil" oder „Thermostabilität", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Eigenschaft eines Enzyms. Ein Enzym wird als thermostabil angesehen, wenn es wenigstens eine der folgenden Eigenschaften zeigt:

1) das Enzym zeigt wenigstens 30% seiner optimalen Aktivität nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C, 80°C oder 90°C bei pH 5,0 in Gegenwart eines stabilisierenden Mittels, wie 40% Glycerol. Das Enzym zeigt vorzugsweise wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C in Glycerol, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 (5);
2) das Enzym zeigt 30% seiner optimalen Aktivität nach einem 30- oder 60-minütigen Vorinkubationsschritt bei 62,5°C in Abwesenheit eines Stabilisators. Das Enzym zeigt vorzugsweise wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität nach einer 30-minütigen Vorinkubation, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 und TrX-162H-DS4 (3);
3) das Enzym zeigt wenigstens 30% seiner optimalen Aktivität nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C in Abwesenheit eines Stabilisators. Das Enzym zeigt vorzugsweise wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität nach dem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 und TrX-162H-DS4 (4); oder
4) das Enzym zeigt wenigstens 30% seiner optimalen Aktivität nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 68°C in Abwesenheit eines Stabilisators. Das Enzym zeigt vorzugsweise wenigstens 40% seiner optimalen Aktivität nach dem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 68°C, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 und TrX-162H-DS4 (4).

In jedem der obigen Fälle wird die optimale Aktivität des Enzyms bei einem optimalen pH und einer optimalen Temperatur für jenes Enzym in Gegenwart oder in Abwesenheit von Stabilisator, wie erforderlich, bestimmt.
Mit „TrX-Nummerierung" ist die Nummerierung gemeint, die mit der Position von Aminosäuren basierend auf der Aminosäuresequenz von TrX (XynII – Tabelle 1; Tr2 1) assoziiert ist. Wie nachfolgend offenbart und wie bei Durchsicht von 1 offensichtlich ist, weisen Familie 11-Xylanasen ein substantielles Ausmaß an Sequenzhomologie auf. Dementsprechend können, indem die Aminosäuren gegenseitig basierend auf Homologie ausgerichtet werden („Alignment"), um die Sequenzähnlichkeit zwischen Xylanase-Enzymen zu optimieren, und durch Verwendung der Aminosäure-Nummerierung von TrX als Grundlage für die Nummerierung die Positionen von Aminosäuren innerhalb von anderen Xylanase-Enzymen bezogen auf TrX bestimmt werden.
Mit modifizierter Xylanase ist die Veränderung eines Xylanase-Moleküls unter Verwendung von Techniken, die einem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, gemeint. Diese Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf ortsgerichtete Mutagenese, Kassetten-Mutagenese, Konstruktion von synthetischen Oligonukleotiden, Klonierung und andere Techniken der Gentechnologie. Veränderungen eines Xylanase-Enzyms, um eine modifizierte Xylanase herzustellen, können auch entstehen als ein Ergebnis einer Anwendung von Techniken, die darauf gerichtet sind, Mutationen innerhalb von nativen oder gentechnologisch modifizierten Xylanasen zu induzieren über die Zugabe von bekannten chemischen Mutagenen, UV-Exposition oder andere Behandlungen, die dafür bekannt sind, eine Mutagenese innerhalb von Wirtsorganismen, die eine Xylanase von Interesse exprimieren, zu induzieren. Solche Techniken sind innerhalb dieses Fachgebiets wohlbekannt.
Tabelle 1 listet die Familie 11-Xylanasen, die frei von Cellulase-Aktivität sind, auf. Diese Enzyme weisen gemeinsam umfassende Aminosäuresequenzähnlichkeit auf und besitzen Aminosäuren, die der Familie 11 gemein sind, beispielsweise zwei Glutaminsäure (E)-Reste, die als die essentiellen katalytischen Reste dienen, die Aminosäuren 86 und 177 (bei Verwendung der TrX-Nummerierung). Strukturvergleiche von mehreren Familie 11-Xylanasen über Röntgenkristallographie zeigen an, dass diese Familie 11-Xylanasen von bakterieller oder pilzlicher Herkunft die gleiche generelle molekulare Struktur aufweisen (siehe beispielsweise US 5,405,769 ; Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y., und Okada, H., 1993, FEBS Lett. 316:123–127). Die meisten der Familie 11-Xylanasen, die bislang identifiziert worden sind, sind mesophil und haben eine geringe Molekülmasse (20 kDa).
TABELLE 1: Familie 11-Xylanasen
Es wird als innerhalb des Umfangs der Erfindung angesehen, dass Xylanasen, einschließlich Familie 11-Xylanasen, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf Trichoderma reesei-Xylanase II, Trichoderma reesei-Xylanase I, Trichoderma viride-Xylanase, Streptomyces lividans-Xylanase B und Streptomyces lividans-Xylanase C, modifiziert werden können, indem der allgemeinen Strategie und Methodik, wie sie hier erläutert werden, gefolgt wird. Es wird ebenfalls als innerhalb des Umfangs der Erfindung angesehen, dass Nicht-Familie 11-Xylanasen ebenfalls modifiziert werden können, indem den allgemeinen Prinzipien, wie sie hier beschrie ben werden, gefolgt wird, um ein Xylanase-Enzym zu erhalten, das thermostabil ist und hohe Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigt.
Darüber hinaus können auch native Xylanasen durch Verwendung von Standard-Screening-Protokollen, um Enzyme zu identifizieren, die die Eigenschaften von erhöhter Thermostabilität zeigen, wobei sie dennoch hohe Aktivität bei physiologischer Temperatur und physiologischem pH beibehalten, erhalten werden. Solche Protokolle umfassen:

• Auswählen eines gewünschten Organismus, beispielsweise eines Thermophilen;
• Extrahieren oder Gewinnen der Xylanase aus dem Organismus und teilweises Reinigen des Enzyms, sofern gewünscht; und
• Charakterisieren des extrahierten Enzyms, um zu bestimmen, ob das Enzym thermostabil, wie oben definiert, (in Gegenwart oder Abwesenheit eines stabilisierenden Mittels, wie Glycerol) ist, Bestimmen der pH- und Temperaturoptima der Enzyme und Bestimmen der Aktivität des Enzyms bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur.

Jegliche Enzyme, die unter Verwendung des obigen Protokolls identifiziert wurden, die Thermostabilität und hohe Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigen, können als Tierfutter verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch modifizierte Xylanase-Enzyme, die erhöhte Thermostabilität zeigen, während sie hohe Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur beibehalten. Beispielsweise und ohne die Erfindung in irgend einer Weise beschränken zu wollen, wird eine modifizierte Trichoderma reesei-Xylanase (TrX) offenbart, die erhöhte Thermostabilität zeigt, während pH- und Temperaturoptima bei oder nahe dem physiologischen Bereich beibehalten werden. Es wurden zwei Modifizierungen in der TrX kombiniert, um eine neue Xylanase (TrX-162H-DS1) zu erhalten. Die erste Modifizierung umfasst eine doppelte Mutation, um zwei Cysteine für die Bildung einer einzelnen Disulfid-Bindung zu erzeugen. Eine solche Modifizierung ist für Bacillus circulans-Xylanase (C100/C148; BcX-Aminosäurenummerierung) in US 5,405,769 beschrieben worden. Diese Mutation verleiht jedoch nur eine geringfügige Zunahme der Fähigkeit des Enzyms, hohen Temperatur zu widerstehen (siehe TrX-DS1, 3–5), und diese Modifizierung ist nicht adäquat, um ein Enzym herzustellen, das in der Lage ist, hohe Temperaturen, die mit dem Pelletierprozess verbunden sind, zu überleben. Wenn diese Mutation mit einer zweiten Mutation wie durch die Lehren dieser Erfindung, welche die Substitution einer basischen Aminosäure, wie Histidin (H), anstelle von Glutamin (Q) an Position 162 umfassen, kombiniert wird, zeigt die resultierende, in Kombination mutierte Xylanase die gewünschten Eigenschaften von Thermostabilität (TrX-162H-DS1; siehe 5 und 6) und mehr als 40% der optimalen Aktivität bei physiologischem pH (8) und physiologischer Temperatur (7).
Eine andere mutierte Xylanase im Rahmen der Erfindung, TrX-162H-DS4, unterscheidet sich von TrX-162H-DS1 dadurch, dass sie ein zusätzliches Disulfid (108/158, d.h. zwischen den Positionen 108 und 158) aufweist. Diese Art von doppelter Disulfid-Mutante ist zuvor für die Xylanase von Bacillus circulans beschrieben worden (C98/C152, 100/148; BcX-Aminosäurenummerierung; Wakarchuck et al., 1994, Protein Engineering, 7:1379–1386). Die BcX-Mutante umfasst keine äquivalente basische Aminosäure (z.B. H für Q an Position 162)-Substitution, wie hier offenbart. Die mutierte TrX-162H-DS4 zeigt eine dramatische Zunahme der Thermostabilität (siehe 4(a)) mit einer Zunahme der T₅₀ von TrX-162H-DS4 von 14°C. Dies stellt eine Verbesserung gegenüber der Doppel-Disulfid-BcX-Mutante des Standes der Technik, die eine Zunahme der T₅₀ von 10°C zeigt, dar, wodurch der Beitrag der Q162H-Mutation bei den Disulfid-Mutanten von TrX gezeigt wird.
Die Erfindung betrifft auch zusätzliche Mutationen, von denen festgestellt worden ist, dass sie wirksam sind bei der Herstellung einer Xylanase, die Thermostabilität und ein wünschenswertes pH-Profil aufweist. Ein Beispiel für solche Mutationen kann in TrX-DS8 gefunden werden, ist aber nicht darauf beschränkt. TrX-DS8 umfasst die für N1-TX13 aufgelisteten Mutationen, wie in US 5,759,840 offenbart, nämlich N10H, Y27M und N29L, und umfasst auch N44D, Q125A, I129E, Q162H und eine Disulfid-Bindung zwischen den Positionen 110 und 154. Trx-DS8 zeigt die Eigenschaft von Thermostabilität (4(b)), eines pH-Profils, welches parallel zu jenem von TrX-162-DS1 verläuft, und mehr als 40% der optimalen Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur.
Über isolierte Xylanase-Enzyme, welche die Substitution von H anstelle von Q an Position 162 umfassen (bezeichnet als Q162H), ist in US 5,759,840 berichtet worden; jedoch zeigten diese Mutanten keine Verbesserung bei der Thermostabilität oder anderen Eigenschaften gegenüber natürlicher TrX. Jedoch wurden durch Kombinieren dieser beiden Modifizierungen mehrere neue Xylanasen (TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 und TrX-162H-DS4) mit verbesserter Thermostabilität erhalten. Diese Eigenschaft wurde mit jeder der Mutationen allein nicht beobachtet. Darüber hinaus zeigen diese modifizierten Xylanasen hohe Aktivität bei oder nahe bei physiologischer Temperatur und physiologischem pH. Diese Mutationen werden auch in TrX-DS8 gefunden, die ebenfalls verbesserte Thermostabilität und hohe Aktivität bei oder nahe bei physiologischen Bedingungen zeigt.
Indem den Verfahren der Erfindung gefolgt wird, können neue Xylanase-Enzyme erhalten werden, die viel geeigneter für Futterpelletier-Anwendungen sind als Enzyme, die gegenwärtig zur Verfügung stehen. Ähnliche Modifizierungen können bei anderen Familie 11-Xylanasen vorgenommen werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Xylanase-Enzyme, die aus Trichoderma, Streptomyces und Schizophyllum erhalten werden. Es liegt jedoch auch innerhalb des Umfangs der Erfindung, dass andere Xylanase-Enzyme zusätzlich zu Familie 11-Xylanasen modifiziert werden können, wie hier offenbart, um Xylanasen zu erhalten, die ther mostabil sind und hohe Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur zeigen. Darüber hinaus liegt es innerhalb des Umfangs der Erfindung, dass native Xylanase-Enzyme mit den Eigenschaften von Thermostabilität und hoher Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur erhalten werden können, indem Screening-Protokollen, die eine Selektion sowohl hinsichtlich Thermostabilität als auch hoher Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur vornehmen, gefolgt wird.
Bei einer Verwendung kann die Formulierung des Futterenzyms die Thermostabilität des Enzyms verbessern, da eine Adsorption in das Futter die Stabilität verbessert, wenn das Enzym in Kontakt mit dessen Substrat gebracht wird. Dementsprechend wurden bei der Bestimmung der Thermostabilität der Xylanasen der Erfindung Xylanasen in Gegenwart und Abwesenheit von stabilisierenden Mitteln, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf Glycerol, charakterisiert. Fisk und Simpson (1993) haben berichtet, dass 40% Glycerol die Temperaturtoleranz von Wildtyp-TrX um weniger als +10°C erhöhte; dies ist jedoch viel weniger Stabilität als bei den Enzymen der Erfindung. Die durch Kombination mutierten Xylanasen der Erfindung können eine Inkubation in Puffer bei einer höheren Temperatur (59–69°C) verglichen mit natürlicher Xylanase (55°C; siehe auch 3 und 4) tolerieren. In Gegenwart von 40% Glycerol können die Kombinationsmutanten einen substantiellen Teil ihrer Aktivität bei 70 bis 90°C bewahren (siehe 5), während die natürliche Xylanase bei diesen Temperaturen vollständig inaktiviert wird.
Eine der Modifizierungen an der durch Kombination mutierten Xylanase, wie hier vorgeschlagen, ist die Substitution der Aminosäure 162 (TrX-Nummerierung basierend auf Tr2 in 1; welche für TrX Glutamin ist) durch die basische Aminosäure Histidin (bezeichnet als Q162H). Es wird jedoch als innerhalb des Umfangs der Erfindung angesehen, dass andere Aminosäuren an dieser Position ebenfalls durch Substitution eingeführt werden können. Die substituierte Aminosäure ist vorzugsweise basisch (positiv geladen), beispielsweise Lysin (Q162K) oder Arginin (Q162R). Es ist hier beobachtet worden, dass die Substitution an der Position 162 oder deren Äquivalent in anderen Familie 11-Xylanasen durch eine basische Aminosäure, wie Histidin, die Thermostabilität eines Xylanase-Enzyms, das wenigstens eine intramolekulare Disulfid-Bindung umfasst, stark verbessern kann. Es ist wichtig, dass hier auch beobachtet worden ist, dass diese Substitution an Position 162 nicht nur die Thermostabilität erhöht, sondern auch die Temperatur- und pH-Profile und die spezifische Aktivität der modifizierten Xylanase nicht signifikant verändert.
Der Histidin-162-Rest (TrX-Nummerierung) in der Kombinationsmutante wird an der entsprechenden Position in mehreren natürlichen Familie 11-Xylanasen gefunden, wie jenen aus Trichoderma harzianum, Aspergillus niger, var. awamori, Aspergillus tubigensis, Thermomonospora fusca, Bacillus circulans und Bacillus subtilis. In ähnlicher Weise umfasst Clostridium acetobutylicum ein Lysin an dieser äquivalenten Position. Jedoch werden alle von diesen Xylanasen mit der Ausnahme der Thermomonospora fusca-Xylanase durch mesophile Wirte produ ziert und zeigen geringe Thermostabilität. Als ein Ergebnis gibt es keinen Hinweis darauf, eine jegliche vorteilhafte Wirkung auf die Thermostabilität durch das Vorhandensein eines basischen Aminosäurerests an dieser Position zu vermuten. Bei der Thermomonospora fusca-Xylanase ist gezeigt worden, dass die N-terminale Sequenz (1–29), die von der Stelle der Erfindung entfernt liegt, zur Thermostabilität beiträgt, und es gibt keinen Hinweis, zu vermuten, dass Thermostabilität mit einem Histidin an dieser äquivalenten Position (d.h. TrX 162) assoziiert sein könnte.
Diese Erfindung ist auch auf Xylanasen gerichtet, die wenigstens eine Modifizierung umfassen, die zu erhöhter Thermostabilität führt, während hohe Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur beibehalten wird. Beispielsweise weist native Schizophyllum commune-Xylanase eine Disulfid-Bindung an den Positionen 110/154 (TrX-Nummerierung) auf. Dieses Enzym zeigt jedoch geringe Thermostabilität. Dementsprechend kann dieses Enzym modifiziert werden unter Verwendung der Verfahren der Erfindung, um eine basische Aminosäure, entweder Histidin, Arginin oder Lysin, anstelle des natürlich vorkommenden Leucins an Position 200 von Schizophyllum commune (welche äquivalent zu Position 162 bei Verwendung der TrX-Nummerierung ist; siehe 1; Sc) durch Substitution einzuführen. Dementsprechend kann erhöhte Thermostabilität durch eine Ein-Schritt-Modifizierung erzielt werden.
Als ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung angesehen werden Kombinationsmutanten, welche sowohl eine intramolekulare Disulfid-Bindung als auch eine basische Aminosäure-Substitution, wie oben erläutert, umfassen. Die intramolekulare Disulfid-Bindung kann entstehen als Ergebnis einer Mutation an einem oder mehreren spezifischen Resten, beispielsweise (anhand der TrX-Nummerierung):

• den Resten -110/-154; beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS1 oder Trx-DS8;
• den Resten -108/-158; beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS2 oder
• den Resten -108/-158, -110/-154; beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TrX-162H-DS4.

Auch als innerhalb des Umfangs der Erfindung angesehen werden Modifizierungen von thermostabilen Xylanasen, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf TfX. Diese Modifizierungen halten die Thermostabilität des nativen Enzyms aufrecht, verändern aber die pH- und Temperaturoptima, so dass sie hohe Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur, die normalerweise mit dem Enzym nicht verbunden ist, zeigen.
TABELLE 2: Modifizierte Xylanasen
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter veranschaulicht werden. Es versteht sich jedoch, dass diese Beispiele allein Veranschaulichungszwecken dienen und nicht verwendet werden sollten, um den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiele:
Beispiel 1: Konstruktion der mutierten Trichoderma reesei-Xylanasen
Grundlegende in vitro-DNA-Rekombinationsmethoden, wie Plasmid-Präparation, Restriktionsenzymverdau, Polymerasekettenreaktion, Oligonukleotid-Phosphorylierung, Ligation, Transformation und DNA-Hybridisierung wurden ausgeführt gemäß wohl etablierten Protokollen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet geläufig sind (Sung, W.L., Yao, F.-L., Zahab, D.M., und Narang, S.A. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:561–565) oder wie durch den Hersteller der Enzyme oder des Kits empfohlen. Die Puffer für viele Enzyme sind als Teil eines Kits geliefert worden oder hergestellt worden, indem den Anweisungen der Hersteller gefolgt wurde. Restriktionsenzyme, T4-Polynukleotidkinase und T4-DNA-Ligase wurden von New England BioLabs LTD, Mississauga, Ont., erworben. Ein Vorläufer-Plasmid, pXYbc, ist zuvor hergestellt und veröffentlicht worden (Sung, W. L., Luk, C.K., Zahab, D.M., und Wakarchuk, W. (1993) Protein Expression Purif. 4:200–206; US 5,405,769 ). Es wurde ein üblicherweise verwendeter E. coli-Stamm, HB101 (clonetech Lab., Palo Alto, CA) als Transformations- und Expressionswirt für alle Genkonstrukte verwendet. Birkenholz-Xylan wurde von Sigma (St. Louis, Mo.) erworben. Hydroxybenzoesäurehydrazid (HBAH) wurde von Aldrich erworben. Oligonukleotide wurden mittels eines Applied Biosystem DNA-Synthetisiergeräts, Modell 380B, hergestellt. Xylanase-Assays sind in einem abgedeckten zirkulierenden Wasserbad (Haake Typ F4391) mit einer Schwankung von "0,1°C ausgeführt worden. Die Temperatur des Wasserbads wurde mit einem Thermoelement bestätigt.
A. Konstruktion des Vorläufer-Plasmids pTrX
Das Vorläufer-Plasmid pTrX für alle nachfolgenden Mutationen ist veröffentlicht (Sung et al., 1995). Dieses Plasmid ist von einem pUC119-Plasmid mittels einer synthetischen Nukleotidsequenz, welche eine Trichoderma reesei-Xylanase kodiert, die inseriert wurde, abgeleitet (2). Eine Expression dieser Xylanase und von anderen mutierten Xylanasen, die nachfolgend beschrieben werden, erfolgt unter der Kontrolle des lac-Promotors des pUC-Plasmids. Der gesamte Zusammenbau des Gens erforderte zwei Stufen, anfänglich für die (92-190)-Region, dann gefolgt durch die (1-92)-Region. Das Protokoll für die Konstruktion dieses Gens ist Routine und identisch mit der veröffentlichten Standardprozedur für viele andere Gene. Es erforderte eine enzymatische Phosphorylierung von überlappenden synthetischen Oligonukleotiden, die Xylanase kodieren. Dem folgte deren Ligation in ein geeignet geschnittenes pUC119-Plasmid.
Anfänglich wurden zehn überlappende Oligonukleotide:
XyTv-101, SEQ ID NO:28
XyTv-102, SEQ ID NO:29
TrX-103, SEQ ID NO:30
XyTv-104, SEQ ID NO:31
XyTv-105, SEQ ID NO:32
XyTv-106, SEQ ID NO:33
XyTv-107, SEQ ID NO:34
TrX-108, SEQ ID NO:35
XyTv-109, SEQ ID NO:22
XyTv-110, SEQ ID NO:36
welche die TrX(92-190)-Sequenz kodieren (2), mit einer Kodonverwendungshäufigkeit, welche jene von E. coli nachahmte (Chen et al., 1982), gestaltet. Die kohäsiven Sall- und BglII-Enden von zwei terminalen Oligonukleotiden ermöglichten die enzymatische Ligation der zehn Fragmente an das linearisierte Plasmid pXYbc. Die zehn Oligonukleotide (50 pmol, 1 l für jedes), welche die TrX(92-190) kodierten, wurden in einer Mischung, enthaltend 10X-Standard-Kinasepuffer (0,4 l), 1 mM ATP (4 l), T4-DNA-Kinase (5 Einheiten) und Wasser (3 l), phosphoryliert. Die Phosphorylierungsreaktion wurde 1 h bei 37°C ausgeführt. Die Lösungen wurden dann zusammengegeben und 10 min auf 70°C erwärmt. Nachdem sie langsam auf Raumtemperatur abgekühlt worden waren, wurden die vereinigten Lösungen zu einer Mischung von 4 mM ATP (3,5 l), EcoR1-HindIII-linearisiertem Plasmid pUC119 (0,1 pmol) und T4-DNA-Ligase (3,5 l) zugegeben und bei 12°C 20 h inkubiert. Aliquots der Ligationsmischung wurden verwendet, um E. coli HB101 in YT-Platten (8 g Hefeextrakt, 5 g Bakto-Trypton, 5 g NaCl, 15 g Agar in 1 l Wasser), welche Ampicillin (100 mg/l) enthielten, zu transformieren.
Für die Herstellung einer Hybridisierungssonde wurde eines der Oligonukleotide XyTv-110 (10 pmol, 1 l) mittels ³²P-ATP (10 pmol, 3 l) in T4-DNA-Kinase (1 l), 10X Kinasepuffer (1 l) und Wasser (4 l) bei 37°C 1 h phosphoryliert.
Transformanten wurden zufällig für eine Hybridisierungsanalyse ausgewählt. Kolonien wurden auf Nylonfiltern auf YT-Platten mit Ampicillin über Nacht kultiviert. Sie wurden dann mit 0,5 N NaOH – 1,5 M NaCl denaturiert (10 min) und mit 0,5 N Tris-HCl (pH 7,0) – 1,5 M NaCl neutralisiert (10 min). Nach Bestrahlen durch UV von 254 nm für 8 min wurden die Filter mit 6X SSC – 0,05% Triton X-100 30 min gewaschen. Zellrückstände wurden vollständig abgekratzt. Nach weiteren 30 min in frischer Lösung wurden die doppelt erstellten Filter individuell in separate Mischungen von 6X SSC – 1% Dextransulfat – 0,05% Triton X-100 – 1X Denhardt's-Hybridisierungsfluid transferiert. Die ³²P-markierte Sonde wurde zu dem Filter hinzugegeben. Nach 16 h bei 45°C wurde der Filter zweimal mit 6X SSC – 0,05% Triton X-100 bei Raumtemperatur 5 min und dann bei 65°C 30 min gewaschen. Positiv hybridisierte Klone mit dem intermediären Plasmid pBcX.TrX wurden durch autoradiographische Analyse identifiziert.
Das obige Protokoll, welches eine enzymatische Phosphorylierung von synthetischen überlappenden Oligonukleotiden und eine Ligation in ein linearisiertes Plasmid umfasst, ist erneut bei dem Zusammenbau der TrX(1-92)-Region und bei der Kassetten-Mutagenese für die nachfolgende Erzeugung von anderen Mutantenreihen, die in dieser Erfindung beschrieben werden, verwendet worden.
Für den Zusammenbau der TrX(1-92)-Region, um das Trichoderma-Volllängen-Gen zu vervollständigen, wurde das intermediäre Plasmid pBcX.TrX durch NheI- und KpnI-Endonukleasen linearisiert, um das DNA-Insert für BcX(1-83) freizusetzen. Mit kohäsiven NheI- und KpnI-Enden wurden acht überlappende Oligonukleotide:
TrX-1, SEQ ID NO:37
XyTv-2, SEQ ID NO:38
TrX-3, SEQ ID NO:39
XyTv-4, SEQ ID NO:40
XyTv-5, SEQ ID NO:41
TrX-6, SEQ ID NO:42
XyTv-7, SEQ ID NO:43
TrX-8, SEQ ID NO:44,
welche die veröffentlichte TrX(1-91)-Sequenz kodierten, in das linearisierte Plasmid pBcX.TrX (2) mittels des oben beschriebenen Protokolls ligiert. Das neue Plasmid pTrX beherbergte dementsprechend ein synthetisches TrX-Gen (SEQ ID NO: 18).
Alle mutierten Xylanasen, die nachfolgend beschrieben werden, sind über die Methode der Kassetten-Mutagenese, wie oben beschrieben, konstruiert worden. Das Protokoll für die Kassetten-Mutagenese war identisch zu jenem für den Genzusammenbau, das oben vollständig beschrieben wurde. Eine solche Kassetten-Mutagenese umfasste (i) eine enzymatische Phosphorylierung von überlappenden synthetischen Oligonukleotiden, (ii) deren Ligation mit dem linearisierten Plasmid, (iii) eine Transformation der kompetenten E. coli-HB101-Zellen damit, (iv) eine Identifizierung der mutierten Transformanten über eine Hybridisierung mit dem markierten Oligonukleotid als Sonde und (v) eine Bestätigung der Mutation durch Didesoxynukleotid-Sequenzierung.
B. Konstruktion des Plasmids pTrX-DS1
Die mutierte TrX-DS1 (SEQ ID NOs: 54, 55) war identisch mit TrX mit einer kovalenten Disulfid-Bindung zwischen den Resten –110 und 154. Dies wurde bewerkstelligt durch zwei einzelne Mutationen, d.h. eine Umwandlung von beiden Resten Serin-110 und Asparagin-154 zu Cystein. Nach einer Expression der mutierten Xylanase werden diese beiden Cysteinreste eine Disulfid-Bindung ausbilden. Die Konstruktion des Plasmids pTrX-DS1 erfolgte durch Ligation der folgenden überlappenden phosphorylierten Oligonukleotide:
TX-110C SEQ ID NO:19,
TX-110C-2 SEQ ID NO:20,
TX-103b SEQ ID NO:21,
XyTv-109 SEQ ID NO:22,
TX-108b SEQ ID NO:23,
TX-154C SEQ ID NO:24,
TX-154C-2 SEQ ID NO:25,
in ein durch KasI/AvrII linearisiertes pTrX-Plasmid in einer Kassetten-Mutagenese, wie nachfolgend gezeigt.
C. Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS1
Die mutierte TrX-162H-DS1 (SEQ ID NO: 56) war identisch mit TrX-DS1 mit einer einzelnen Mutation von Glutamin-162 zu Histidin. Die Konstruktion des Plasmids pTrX-162D-DS1 erfolgte durch Ligation der Oligonukleotide:
TX-162H-3 SEQ ID NO: 26 und
TX-162H-4 SEQ ID NO: 27
in das durch SphI/AvrII linearisierte pTrX-DS1-Plasmid in einer Kassetten-Mutagenese, wie nachfolgend gezeigt.
D. Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS2
Die mutierte TrX-162H-DS2 (SEQ ID NOs: 57, 58) war identisch zu TrX, aber mit einer kovalenten Disulfid-Bindung zwischen den Resten -108 und -158 und einer Mutation von Glutamin-162 zu Histidin. Das 108/110-Disulfid erforderte zwei einzelne Mutationen, d.h. eine Umwandlung von beiden Resten Valin-108 und Alanin-158 zu Cystein. Nach Expression der mutierten Xylanase werden diese beiden Cysteinreste eine Disulfid-Bindung bilden. Die Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS2 erfolgte durch Ligation der folgenden überlappenden phosphorylierten Oligonukleotide:
TX-108C SEQ ID NO:45,
TX-108C-2 SEQ ID NO:46,
TX-103b SEQ ID NO:21,
XyTv-109 SEQ ID NO:22,
TX-108b SEQ ID NO:23,
TX-158C-162H SEQ ID NO:47 und
TX-158C-162H-2 SEQ ID NO:48
in das mit KasI/AvrII linearisierte pTrX-Plasmid in einer Kassetten-Mutagenese, wie nachfolgend gezeigt.
E. Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS4
Die mutierte TrX-162H-DS4 (SEQ ID NOs: 59,60) war identisch mit TrX, aber mit zwei kovalenten Disulfid-Bindungen 108/158 und 110/154 und einer Mutation von Glutamin-162 zu Histidin. Die beiden Disulfide erforderten vier einzelne Mutationen, d.h. eine Umwandlung der Reste Valin-108, Serin-110, Asparagin-154 und Alanin-158 zu Cystein. Nach Expression der mutierten Xylanase werden diese vier Cysteinreste zwei Disulfid-Bindungen ausbilden. Die Konstruktion des Plasmids pTrX-162H-DS4 erfolgte durch Ligation der folgenden überlappenden phosphorylierten Oligonukleotide:
TX-108C-110C SEQ ID NO:49,
TX-108C-110C-2 SEQ ID NO:50,
TX-103b SEQ ID NO:21,
XyTv-109 SEQ ID NO:22,
TX-108b SEQ ID NO:23,
TX-154C-158C-162H SEQ ID NO:51 und
TX-154C-158C-162H-2 SEQ ID NO:52
in das mit KasI/AvrII linearisierte pTrX-Plasmid in einer Kassetten-Mutagenese, wie nachfolgend gezeigt.
F. Konstruktion von TrX-DS8
Die mutierte TrX-DS8 wurde hergestellt unter Verwendung von analogen Verfahren zu jenen, die oben in den Abschnitten A bis E für die Herstellung von modifizierten Xylanasen erläutert worden sind. TrX-DS8 umfasst die Mutationen, die in N1-TX13, wie in US 5,759,840 offenbart, gefunden werden. Diese Mutationen sind N10H, Y27M und N29L. Zusätzlich umfasst TrX-DS8 die folgenden Mutationen: N44D, Q125A, I129E, Q162H und eine Disulfid-Bindung zwischen den Positionen 110 und 154. Die Konstruktion des Plasmids pTrX-DS8 erfolgte durch Ligation von überlappenden phosphorylierten Oligonukleotiden, wie oben beschrieben.
TrX-DS8 zeigt die Eigenschaft von Thermostabilität (4a), ein pH-Profil, welches parallel zu jenem von TrX-162-DS1 verläuft, und mehr als 40% der optimalen Aktivität bei physiologischem pH und physiologischer Temperatur.
Beispiel 2: Charakterisierung von mutierten Xylanasen
A. Herstellung von Xylanasen
Die Kulturbedingungen waren identisch zu dem wohl etablierten Protokoll, das für andere durch E. coli exprimierte Xylanasen beschrieben worden ist. 5 ml eines Übernachtkultur-Inokulums in 2YT-Medium (16 g Hefeextrakt, 10 g Bakto-Trypton, 5 g NaCl, 1 l Wasser), enthaltend Ampicillin (100 mg/l) wurden zu 2YT-Medium (1 l) mit Ampicillin zugegeben. Die Kulturen wurden unter Schütteln (200 Upm) bei 37°C kultiviert. Nach 16 h wurden Zellen geerntet.
B. Reinigung von unterschiedlichen Disulfid-Bindungen enthaltenden mutierten Xylanasen
Aus Zellen wurden Proteinproben hergestellt, indem zuerst ein Extrakt der Zellen durch Vermahlen von 10 g der Zellpaste mit 25 g Aluminiumoxid-Pulver hergestellt wurde. Nach dem Vermahlen zu einer glatten Mischung wurden geringe Mengen (5 ml) von eiskaltem Puffer A (10 mM Natriumacetat, pH 5,5, für BcX-Mutanten) oder Puffer B (10 mM Natriumacetat, pH 4,6, für TX-Mutanten) zugegeben und die Mischung zwischen den Zugaben kräftig vermahlen. Das Aluminiumoxid und die Zellrückstände wurden durch Zentrifugation der Mischung bei 8000 × g für 30 min entfernt.
Der Rohextrakt wurde bei 60°C 15 min erwärmt und zentrifugiert, um eine große Menge des Niederschlags zu entfernen. Der Überstand wurde auf pH 4,6 angesäuert, bei –20°C über Nacht eingefroren, aufgetaut und zentrifugiert, um mehr Niederschlag zu entfernen.
Nach der obigen Vorbehandlung wurde der Zellextrakt einer Säulenchromatographie unterzogen und wurde auf eine Kationenaustauschersäule mit S-Sepharose fast flow, 50 ml-Bettvolumen (Kabi-Pharmacia, Kanada), die in Puffer A äquilibriert worden war, gepumpt. Die Xylanase wurde mit 300 ml eines linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in Puffer A mit einer Flussrate von 3 ml/min eluiert. Die Xylanase eluiert bei 100 bis 150 ml des Gradienten. Die Fraktionen werden mittels SDS-PAGE überprüft und jene Fraktionen, die die Hauptmenge der Xylanase aufweisen, wurden vereinigt und durch Ultrafiltration unter Verwendung von Membranen mit einem Molekulargewichtsausschluss von 3000 Dalton (Amicon YM3) aufkonzentriert. Das aufkonzentrierte Material (5 ml) wurde dann auf eine 1,5 cm × 85 cm-TSK-HW50S-Gelfiltrationssäule, die in 50 mM Ammoniumacetat, pH 6, äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Xylanase eluierte bei einem Volumen von 90 bis 100 ml. Diese Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und die Peaks als reine Xylanase vereinigt. Das Protein wurde unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten bei 280 nm quantifiziert.
C. Standardassay für die Messung von enzymatischer Aktivität
Der quantitative Assay bestimmte die Anzahl von reduzierenden Zuckerenden, die ausgehend von löslichem Xylan erzeugt werden. Das Substrat für diesen Assay war die Fraktion von Birkenholz-Xylan, die sich in Wasser ausgehend von einer 5%-igen Suspension von Birkenholz-Xylan (Sigma Chemical Co.) löste. Nach Entfernen der unlöslichen Fraktion wurde der Überstand gefriergetrocknet und in einem Exsiccator aufbewahrt. Die Messung der spezifischen Aktivität wurde, wie folgt, ausgeführt. Reaktionsmischungen, enthaltend 100 l 30 mg/ml Xylan, zuvor verdünnt in Assaypuffer (50 mM Natriumcitrat, pH 5,5 oder das pH-Optimum der getesteten Xylanase), 150 l Assaypuffer, 50 l in Assaypuffer verdünntes Enzym, wurden bei 40°C inkubiert. Nach verschiedenen Zeitabständen wurden 50 1-Anteile entfernt und die Reaktion wurde durch Verdünnen in 1 ml 5 mM NaOH gestoppt. Die Menge an reduzierenden Zuckern wurde mit dem Hydroxybenzoesäurehydrazid-Reagens (HBAH) (Lever, 1972, Analytical Biochem. 47:273–279) bestimmt. Eine Einheit von Enzymaktivität wurde als jene Menge definiert, die 1 Mol reduzierenden Zucker in 1 min bei 40°C erzeugte.
Für den Vergleich zwischen mutierten Xylanasen und der Wildtyp-Xylanase (TABELLE 3) wurden die spezifischen Aktivitäten einer Xylanase umgewandelt in die relative Aktivität, die als Prozentsatz verglichen mit der spezifischen Aktivität der natürlichen Xylanase berechnet wird. TABELLE 3. Relative Aktivität von TrX-Xylanasen

* Die spezifische Aktivität der natürlichen TrX (770 E/mg) wurde zu 100% normalisiert.

Wie aus Tabelle 3 ersehen werden kann, sind verglichen mit den natürlichen Xylanasen die spezifischen enzymatischen Aktivitäten der mutierten Xylanasen bei 40°C nicht signifikant verändert worden.
Beispiel 3: Thermostabilität von mutierten Xylanasen
Dies war ein Test der Toleranz von Xylanasen gegenüber einer Inkubation bei einer festgelegten Temperatur ohne jegliches Substrat. Die Xylanase (150 g/ml) in Assaypuffer (50 mM Natriumcitrat) wurde bei einer festgelegten Temperatur oder eine festgelegte Zeitspanne inkubiert. Aliquots wurden auf Raumtemperatur (ungefähr 20°C) abgekühlt, die restliche enzymatische Aktivität aller Proben wurde mittels des HBAH-Assays bei 40°C bestimmt, wie in Beispiel 2C angegeben.
(A) Auswirkung der Inkubationslänge
Die Auswirkung der Länge der Inkubation auf die Aktivität von Xylanase-Proben wurde bei 62,5°C bei pH 5,5 bestimmt (3). Aliquots wurden nach 0, 5, 10, 20, 30, 40 und 60 min für die Bestimmung von restlicher Aktivität entfernt. Die restliche Enzymaktivität bei 0 min wurde zu 100% normalisiert.
Nach 5 min Inkubation hatten die Wildtyp-TrX und die Q162H-Mutante TrX-162H ( US 5,759,840 ) nahezu die gesamte restliche Aktivität verloren, während die Mutante TrX-DS1 mit einer Disulfid-Bindung 60% ihrer restlichen Aktivität bewahrte. Nach 20 min bewahrte sie jedoch nur noch 20% ihrer Aktivität und hatte nach 40 min alle Aktivität verloren. Im Gegensatz dazu zeigte die Mutante TrX-162H-DS1 mit der zusätzlichen Mutation von Q162H überlegene Thermostabilität, indem ungefähr 87% von deren restlicher Aktivität nach 20 min, 78% nach 40 min und 68% nach 60 min beibehalten wurden. Die Mutante TrX-162H-DS4 mit beiden 108/158- und 110/154-Disulfid-Bindungen behielt 84% Aktivität nach 60 min bei.
(B) Auswirkung von Inkubationstemperaturen auf die restliche Aktivität von mutierter TrX.
Die Thermostabilität von mutierten TrX-Enzymen wurde auch bestimmt anhand der Toleranz von unterschiedlichen Inkubationstemperaturen. Proben von Xylanasen wurden in 50 mM Natriumcitrat-Puffer (pH 5,5) bei unterschiedlichen Temperaturen (48, 52, 56, 60, 64, 68, 70 und 72°C) 30 min inkubiert. Die restliche Enzymaktivität der Proben wurde bestimmt, wobei die restliche Aktivität bei 48°C zu 100% normalisiert wurde (siehe 4(a) und 4(b)). Die T₅₀, welche die Inkubationstemperatur, welche die Aufrechterhaltung von 50% restlicher Aktivität nach 30 min erlaubt, ist, wurde für jede mutierte TrX bestimmt.
Ohne auf irgendeine Theorie festgelegt werden zu wollen, zeigt die höhere T₅₀ von TrX-162H-DS1 (65°C) gegenüber TrX-DS1 (61°C) die Verbesserung der Thermostabilität durch die Mutation Q162H in den Disulfid-Mutanten. Die doppelte Disulfid-Mutante TrX-162H-DS4 zeigte ebenfalls hohe Stabilität mit einer T₅₀-Zunahme von +14°C gegenüber der natürlichen TrX. Ein Vergleich der T₅₀ von TrX-162H-DS1 (65°C) und TrX-162H-DS2 (59°C) zeigt an, dass das 110/154-Disulfid in TrX-162H-DS1 zu der letztgenannten mehr Thermostabilität als das 108/158-Disulfid beiträgt. TrX-DS8 zeigte ebenfalls hohe Thermostabilität mit einer T₅₀-Zunahme von +16°C bei Vergleich mit natürlicher TrX.
(C) Effektive Inkubationstemperatur
In dem folgenden Beispiel wurde eine Modelluntersuchung der Auswirkung der Enzymformulierung auf die Thermostabilität der Kombinationsmutante in Gegenwart eines Zusatzstoffs, Glycerol, ausgeführt. Die unmodifizierte TrX und die mutierten TrX-Xylanasen wurden 30 min bei 20, 50, 60, 70, 80 und 90°C in einem Puffer (pH 5,0) mit 40% Glycerol inkubiert. Die restliche Aktivität wurde durch den HBAH-Assay bestimmt. Die restliche Enzymaktivität bei 0 min wurde zu 100% normalisiert (5).
Bei 50°C behielten alle TiX-Proben ihre enzymatische Aktivität bei. Bei 60°C behielt die Wildtyp-TrX 75% von ihrer Aktivität bei, während TrX-DS1 und TrX-162H-DS1 80 bzw. 100% beibehielten (5). Bei 70°C behielten TrX-DS1 und TrX-162H-DS1 10 bzw. 98% bei. Nach 90 min behielt die Letztgenannte 65% der restlichen Aktivität bei.
(D) Auswirkung der Inkubationsdauer auf die restliche Aktivität von TrX-162H-DS1 bei 90°C
Eine Probe von TrX-162H-DS1 in 40% Glycerol und Puffer wurden in einem abgedeckten zirkulierenden Wasserbad (Haake Typ F4391, mit einer Schwankung von 0,1°C) bei 90°C inkubiert. Die Temperatur des Wasserbads wurde mit einem Thermoelement bestätigt. Aliquots wurden nach 0, 5, 10 und 30 min für eine Bestimmung der restlichen Aktivität entfernt. Die restliche Enzymaktivität bei 0 min wurde zu 100% normalisiert.
Nach 5, 10 und 30 min behielt TrX-162H-DS1 90, 85 bzw. 65% der restlichen Aktivität bei (6).
Beispiel 4: Temperatur-/Aktivitätsprofil von mutierten Xylanasen
Dies war ein Test hinsichtlich der Auswirkung von unterschiedlichen Temperaturen auf die enzymatische Aktivität der Xylanase bei der Hydrolyse von löslichem Xylan. Die Vorgehensweise war identisch zu dem Standardassay (Beispiel 2 C) mit Veränderungen bei der Inkubationstemperatur und -dauer. Die Enzyme (1,5 μg/ml) und lösliche Xylanase in 50 mM Natriumcitrat-Puffer, pH 4,5, wurden gemischt und in einem zirkulierenden Wasserbad bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Nach 30 min wurde die Menge von reduzierenden Zuckern, die aus Xylan freigesetzt worden waren, durch HBAH bestimmt und wurde als relative Aktivität mit dem Wert beim Temperaturoptimum als 100% berechnet.
Die Auswirkung von Temperatur auf die Hydrolyse von Xylan wurde in 7 gezeigt. Die natürliche TrX, die TrX-DS1-, TrX-162H-DS1-, TrX-162H-DS2- und TrX-162H-DS4-Enzyme hatten allesamt das gleiche Temperatur-/Aktivitätsprofil und der einzige Unterschied besteht in der größeren Aktivität (80%) bei der Mutante TrX-162H-DS4 verglichen mit den anderen (45%) bei 60°C. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die Disulfid-Mutation zusammen mit der Q162H-Mutation wenig oder gar keine Auswirkung auf die optimale Temperatur (50°C) von TrX hat. Zusätzlich zeigen alle der in der Figur gezeigten Enzyme wenigstens 40% von deren optimaler Aktivität von ungefähr 40°C bis ungefähr 50°C, was für Futterpelletier-Anwendungen geeignet ist.
Beispiel 5: pH-/Aktivitätsprofil von mutierten Xylanasen
Dies war ein Test hinsichtlich der Auswirkung von unterschiedlichen pH-Werten auf die enzymatische Aktivität der Xylanase bei der Hydrolyse von löslichem Xylan bei der ungefähren physiologischen Temperatur von Nahrungsbrei.
Die Vorgehensweise war identisch zu dem Standardassay (Beispiel 2 C) mit Veränderungen bei der Inkubationstemperatur und -dauer. Die Trichoderma-Enzyme natürliche TrX und mutierte TrX (30 μg/ml) und lösliches Xylan in 50 mM Natriumcitrat-Puffern mit pH 3–8 wurden zusammen bei 40°C 7 min inkubiert. Die Menge an reduzierenden Zuckern, die aus dem Xylan freigesetzt wurden, wurde durch HBAH bestimmt und wurde als relative Aktivität mit dem Wert beim pH-Optimum als 100% berechnet.
Das Profil der Auswirkung des pH auf die enzymatische Aktivität von TrX, TrX-162H-DS1 und TrX-162H-DS2 (8) ist ähnlich, wodurch wenig oder gar keine Auswirkung der Mutationen (Disulfid-Bindungsbildung und Q162H) auf das pH-Optimum angezeigt wird. Das pH-Profil für TrX-DS8 war diesen modifizierten Xylanasen ebenfalls ähnlich (Daten nicht gezeigt). Alle der in der Figur gezeigten Enzyme zeigen wenigstens 40% ihrer optimalen Aktivität von ungefähr pH 3,5 bis ungefähr pH 6, was für Futterpelletier-Anwendungen geeignet ist.
Die doppelte Disulfid-Mutante TrX-162H-DS4 unterschied sich, indem sie bei dem pH-Bereich über 6 eine geringfügig höhere Aktivität zeigte. Bei dem sauren pH von 4–6 bewahrten TrX, TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2 und TrX-162H-DS4 wenigstens 75% der optimalen Aktivität.
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Xylanase der Familie 11, umfassend mindestens eine intramolekulare Disulfid-Bindung und eine basische Aminosäure in Position 162 (Trichoderma reesei-Xylanase II-Nummerierung) oder deren Äquivalent, wobei diese Position aufgrund eines Sequenz-Alignments der genannten isolierten Xylanase gegenüber der Trichoderma reesei-Xylanase II-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:16 definiert ist, bestimmt wird, wobei die isolierte Xylanase wenigstens 40% restliche Aktivität von pH 3,5 bis pH 6,0 und von 40 bis 60°C und nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C, 80°C oder 90°C in Gegenwart von 40% Glycerol; einem 30- oder 60-minütigen Vorinkubationsschritt bei 62,5°C in Abwesenheit von Glycerol; oder einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C oder 68°C in Abwesenheit von Glycerol wenigstens 30% restliche Aktivität zeigt.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 1, wobei die basische Aminosäure aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Arginin und Histidin ausgewählt wird.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 2, wobei die basische Aminosäure Histidin ist.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 1, welche zwei Disulfid-Brücken umfasst.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 1, welche aus der Gruppe bestehend aus TrX-162H-DS1, TrX-162H-DS2, TrX-162H-DS4 und TrX-DS8 ausgewählt wird.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 5, wobei die Xylanase TrX-162H-DS1 ist.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 5, wobei die Xylanase TrX-162H-DS2 ist.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 5, wobei die Xylanase TrX-162H-DS4 ist.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 5, wobei die Xylanase TrX-DS8 ist.
Verfahren zum Gewinnen einer Xylanase der Familie 11, welches umfasst: i) Auswählen eines Organismus, der Xylanase-Aktivität exprimiert, und Gewinnen der Xylanase aus dem Organismus; ii) Feststellen, ob die Xylanase wenigstens 40% restliche Aktivität von pH 3,5 bis pH 6,0 und von 40 bis 60°C zeigt; und iii) Feststellen, ob die Xylanase eine Xylanase der Familie 11 ist und nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C, 80°C oder 90°C in Gegenwart von 40% Glycerol; einem 30- oder 60-minütigen Vorinkubationsschritt bei 62,5°C in Abwesenheit von Glycerol; oder einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C oder 68°C in Abwesenheit von Glycerol wenigstens 30% restliche Aktivität zeigt; iv) Feststellen, ob die Xylanase eine basische Aminosäure in Position 162 (Trichoderma reesei-Xylanase II-Nummerierung), wobei diese Position aufgrund eines Sequenz-Alignments der genannten isolierten Xylanase gegenüber der Trichoderma reesei-Xylanase II-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:16 definiert ist, bestimmt wird, und eine intramolekulare Disulfid-Bindung aufweist; und v) Aufbewahren der Xylanase, die diese Eigenschaften zeigt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei Schritt i) umfasst, die Xylanase teilweise zu reinigen.
Verfahren zur Herstellung von Tierfutter, welches ein Aufbringen der isolierten Xylanase nach Anspruch 1 auf das Tierfutter, um eine Xylanase-Tierfutter-Kombination zu erzeugen, und ein Hitzesterilisieren der Xylanase-Tierfutter-Kombination umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Tierfutter ein Geflügel- oder Schweinefutter ist.
Verfahren zur Herstellung von Tierfutter, welches ein Aufbringen der aus Schritt v) von Anspruch 10 erhaltenen Xylanase auf das Tierfutter, um eine Xylanase-Tierfutter-Kombination zu erzeugen, und ein Hitzesterilisieren der Xylanase-Tierfutter-Kombination umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Tierfutter ein Geflügel- oder Schweinefutter ist.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 1, wobei die Xylanase rekombinant ist.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 1, welche eine Disulfid-Brücke umfasst.
Isolierte Xylanase nach Anspruch 1, wobei die Xylanase erhalten wird aus einem Organismus, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Aspergillus niger, Aspergillus kawachii, Aspargillus tubigensis, Bacillus circulans, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Cellulomonas fimi, Chainia spp., Clostridium acetobutylicum, Clostridium stercorarium, Fibrobacter succinogenes, Neocallimasterix patriciarum, Nocardiopsis dassonvillei, Ruminococcus flavefaciens, Schizophyllum commune, Streptomyces lividans, Streptomyces sp. No. 36a, Streptomyces thermoviolaceus, Thermomonospora fusca, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei und Trichoderma viride.
Isolierte Xylanase der Familie 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine intramolekulare Disulfid-Bindung und eine basische Aminosäure in Position 162 (Trichoderma reesei-Xylanase II-Nummerierung) oder deren Äquivalent, wobei diese Position aufgrund eines Sequenz-Alignments der genannten isolierten Xylanase gegenüber der Trichoderma reesei-Xylanase II-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:16 definiert ist, bestimmt wird, umfasst, wobei die Xylanase nach einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 70°C, 80°C oder 90°C in Gegenwart von 40% Glycerol; einem 30- oder 60-minütigen Vorinkubationsschritt bei 62,5°C in Abwesenheit von Glycerol; oder einem 30-minütigen Vorinkubationsschritt bei 64°C oder 68°C in Abwesenheit von Glycerol wenigstens 30% restliche Aktivität zeigt.