DE69914200T2

DE69914200T2 - Aminoiminochinon und aminochinon alkaloid verbindungen als caspase inhibitoren

Info

Publication number: DE69914200T2
Application number: DE69914200T
Authority: DE
Inventors: P. Sarath GUNASEKERA; J. Peter MCCARTHY; E. Ross LONGLEY; A. Shirley POMPONI; E. Amy WRIGHT
Original assignee: Harbor Branch Oceanographic Institution Inc
Current assignee: Harbor Branch Oceanographic Institution Inc
Priority date: 1998-07-08
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2004-10-14
Anticipated expiration: 2019-07-09
Also published as: CA2335623A1; ATE257822T1; JP2003520186A; EP1095018A1; WO2000002858A1; EP1095018B1; ES2214037T3; US6218419B1; DE69914200D1; CA2335623C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die als entzündungshemmende, immunomodulatorische und neuroprotektive Mittel sowie als Antikrebsmittel verwendet werden können, und Zusammensetzungen, die derartige Verbindungen als Wirkstoffe enthalten. Insbesondere betrifft die Erfindung biologisch aktive, von Tryptamin abgeleitete Aminochinon- und Aminoiminochinon-Alkaloidverbindungen, diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verwendung dieser Verbindungen und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.
Hintergrund der Erfindung
Die Verhinderung und Bekämpfung von Entzündungen ist bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit von Mensch und Tier von entscheidender Bedeutung. Es wurden zahlreiche Forschungsanstrengungen zur Entwicklung von Verbindungen mit entzündungshemmenden Eigenschaften unternommen. Es wurden bestimmte Verfahren und chemische Zusammensetzungen entwickelt, die einen Beitrag bei der Hemmung oder Bekämpfung von Entzündungen leisten, jedoch besteht ein Bedarf nach weiteren Verfahren und Zusammensetzungen zur Bekämpfung von Entzündungen.
Von großer Bedeutung bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit ist die Bekämpfung der pathologischen zellulären Proliferation, wie sie beispielsweise im Fall von Krebs auftritt. Erhebliche Forschungsbemühungen und Mittel werden für onkologische und Antitumormaßnahmen, einschließlich Chemotherapie, aufgewandt. Obgleich bestimmte Verfahren und chemische Zusammensetzungen entwickelt worden sind, die einen Beitrag bei der Hemmung, Remission oder Bekämpfung des Wachstums beispielsweise von Tumoren leisten, besteht immer noch ein Bedarf nach neuen Verfahren und Mitteln zur Krebsbekämpfung.
Ein weiterer Bereich von großer Bedeutung für die Gesundheit von Mensch und Tier ist die Immunomodulation. Immunomodulatorische Verbindungen und Zusammensetzungen eignen sich zur Modulation und Regulation von immunologischen Funktionen bei Tieren. Bei Immunomodulatoren kann es sich um Immunostimulanzien zum Aufbau von Immunität gegen bestimmte Krankheiten und Störungen oder zur Einleitung einer entsprechenden Heilung handeln. Andererseits kann es sich bei Immunomodulatoren um Immunoinhibitoren oder Immunosuppressoren handeln, die unerwünschte Immunreaktionen des Körpers gegen fremde Materialien verhindern oder die dazu dienen, Autoimmunreaktionen oder -krankheiten zu verhindern oder zu bessern.
Es würde festgestellt, dass sich Immunomodulatoren zur Behandlung von systemischen Autoimmunkrankheiten, wie Lupus erythematosus und Diabetes, sowie bei Immunschwächekrankheiten eignen. Ferner können sich Immunomodulatoren für die Immunotherapie von Krebs oder zur Verhinderung von Abstoßungen von fremden Organen oder Geweben bei Transplantationen, z. B. von Niere, Herz oder Knochenmark, eignen.
Es wurden verschiedene immunomodulatorische Verbindungen aufgefunden, einschließlich FK506, Muramylsäure-dipeptid-Derivate, Levamisol, Niridazol, Oxysuran, Flagyl, Interferone, Interleukine, Leukotriene, Corticosteroide und Cyclosporine. Von zahlreichen dieser Verbindungen wurde jedoch festgestellt, dass sie unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen und/oder stark toxisch sind. Man benötigt daher neue immunomodulatorische Verbindungen, um über einen breiteren Bereich von immunomodulatorischen Funktionen für bestimmte Gebiete bei minimalen unerwünschten Nebenwirkungen zu verfügen.
Es wurde festgestellt, dass einige natürliche Produkte und Organismen mögliche Quellen für chemische Moleküle mit wertvollen biologischen Aktivitäten sind. Meeresschwämme haben sich als eine derartige Quelle erwiesen. Eine Anzahl von Veröffentlichungen ist erschienen, die aus Meeresschwämmen abgeleitete organische Verbindungen beschreiben. Zu derartigen Veröffentlichungen gehören: P. J. Scheuer, Hrsg., Marine Natural Products, Chemical and Biological Perspectives, Academic Press, New York (1978–1983); D. Faulkner, J. Nat. Prod. Rep., Bd. 15 (1998), S. 113–158; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 14 (1997), S. 259–302; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 13 (1996), S. 75–125; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 12 (1995), S. 223–269; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 11 (1994), S. 355–394; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 10 (1993), S. 497–539; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 9 (1992), S. 323–364; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 8 (1991), S. 97–147; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 7 (1990), S. 269–309; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 5 (1988), S. 613–663; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 4 (1987), S. 539–576; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 3 (1986), S. 1–33; J. Nat. Prod. Rep., Bd. 1 (1984), S. 551–598; und D. Uemura, K. Takahashi, T. Yamamoto, C. Katayama, J. Tanaka, Y. Okumura, Y. Hirata, J. Am. Chem. Soc., Bd. 107 (1985), S. 4796–4798.
Unter Verwendung von Schwämmen als Ausgangsmaterial und unter Ergänzung durch neuartige synthetische Herstellungsverfahren wurden neue Klassen von biologisch aktiven Verbindungen und neue pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt. Jedoch besteht, wie vorstehend ausgeführt, ein großes Bedürfnis nach zusätzlichen Verbindungen, die sich zur Behandlung einer Vielzahl von pathologischen Zuständen eignen.
Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft von Tryptamin abgeleitete Aminoiminochinon- und Aminochinon-Alkaloidverbindungen. Als spezielle Beispiele werden die Secobatzelline A und B sowie die Zusammensetzungen mit einem Gehalt an diesen Verbindungen aufgeführt. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Verfahren zur Herstellung und zur Anwendung dieser Verbindungen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen als Inhibitoren von biologisch wichtigen Enzymen, die im Zusammenhang mit entzündlichen und neurodegenerativen Vorgängen stehen. Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Hemmung von Caspase (CPP32) macht diese Verbindungen für die Behandlung einer Vielzahl von chronischen und akuten entzündlichen Erkrankungen wertvoll, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Pankreatitis, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Asthma, entzündliche Darmerkrankungen, Psoriasis und bestimmte neurologische Störungen, wie die Alzheimer-Krankheit, gehören.
Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform können erfindungsgemäße Verbindungen zur Hemmung der pathologischen zellulären Proliferation, wie sie beispielsweise bei Krebs auftritt, verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform haben sich die erfindungsgemäßen Verbindungen als wertvoll für die Immunomodulation und insbesondere für die Immunosuppression erwiesen.
Secobatzellin A (ein Aminoiminochinon-Alkaloid) weist einige strukturelle Ähnlichkeiten mit den bisher bekannten Isobatzellinen A-D auf, einer Klasse von Verbindungen, die ein von Aminoiminochinon abgeleitetes Pyrrolo[4,3,2-de]-chinolin-Kohlenstoffgerüst aufweisen. Jedoch weist Secobatzellin A ein ungebräuchliches Pyrroloaminoiminochinon mit einem Secochinolin-Gerüstsystem auf, für das bisher keine natürliche Quelle angegeben wurde. Secobatzellin A besitzt eine starke biologische Aktivität gegen das CPP32-Enzym mit einem IC₅₀-Wert von 0,02 μg/ml und eine signifikante Antikrebsaktivität gegen P388-Mäuseleukämie (IC₅₀ 0,06 μg/ml) und gegen humanes A549-Lungenadenokarzinom (IC₅₀ = 0,04 μg/ml). Secobatzelline A und B lassen sich aus Meeresschwämmen der Gattung Batzella gemäß den hier gemachten Angaben isolieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Strukturformeln für Secobatzellin A und B und ihre Diacetate.
2 zeigt in schematischer Darstellung die Isolierung von Secobatzellin A und B aus einer Meeresschwammquelle.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft von Tryptamin abgeleitete Aminoiminochinon- und Aminochinon-Alkaloidverbindungen mit der Bezeichnung Secobatzelline und Analoge davon. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Zusammensetzungen mit einem Gehalt an den Secobatzellinen sowie Verfahren zur Herstellung und die Verwendung dieser Verbindungen. Gemäß einer Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Inhibitoren von biologisch wichtigen Enzymen verwendet werden. Gemäß einer speziellen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Hemmung von Entzündungen und/oder Neurodegenerationen herangezogen werden.
Eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Caspase-Inhibitoren. Caspase-Inhibitoren eignen sich zur Behandlung einer Vielzahl von chronischen und akuten entzündlichen Erkrankungen, wie Pankreatitis, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Asthma, entzündliche Darmerkrankungen und Psoriasis, und bei bestimmten neurologischen Störungen, wie Alzheimer-Krankheit.
Die Caspasen, einschließlich CPP32, sind eine Gruppe von mindestens 10 Cystein-proteasen (auch bekannt als Interleukin-2-konvertierende Enzyme oder ICE₂), die eine wichtige Rolle bei dem als Apoptose bekannten Zelltodmechanismus spielen (T. Patel, G. J. Gores, S. H. Kaufmann, FASEB, Bd. 10 (1996), S. 587–597). Diese Enzyme sind die Säugetier-Homologe des ced-3-Genprodukts, das die apoptotischen Vorgänge der Nematode Caenorhabditis elegans (L. M. Schwartz, C. E. Milligan, Trends Neursci., Bd. 19 (1996), S. 555–562) moduliert. Mutationen in ced-3 verhindern die Apoptose während der normalen Entwicklung der Nematode. Bei Säugetieren wurde gezeigt, dass Inhibitoren von Caspase-3 (CPP32) den apoptotisch vermittelten Tod einer Reihe von Zelllinien und bei verschiedenen Geweben verhindern (L. M. Schwartz, C. E. Milligan, Trends Neursci., Bd. 19 (1996), S. 555–562; C. E. Milligan, D. Prevette, H. Yaginuma, S. Homma, C. Cardwell, L. C. Fritz, K. J. Tomaselli, R. W. Oppenheim, L. M. Schwartz, Neuron, Bd. 15 (1995), S. 385–393).
Apoptotische Mechanismen spielen wichtige Rollen bei der normalen Entwicklung des Immunrepertoires und bei der Geweberemodellierung während der embryonalen Entwicklung sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Nichtwirbeltieren (J. F. R. Kerr, A. H. Wyllie, A. R. Currie, Br. J. Cancer, Bd. 26 (1972), S. 239–257). Jedoch ist eine abweichende Apoptose bei einer Anzahl von experimentellen und humanen Krankheitszuständen beteiligt. Beispielsweise gibt es bei akuten ZNS-Schädigungen im Anschluss an einen hypoxisch-ischämischen Anfall bei Mäusen Anzeichen, dass eine durch Caspase induzierte Apoptose den Hauptfaktor der neuronalen Zerstörung darstellt (H. Hara, R. M. Friedlander, V. Gagliardini, C. Ayata, K. Fink, Z. Huang, M. Shimizu-Sasamata, J. Yuan, M. A. Moskowitz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 94 (1997), S. 2007–2012). Ferner sind Caspasen bei chronischem neurodegenerativen Störungen beteiligt, was für eine Rolle bei der Pathogenese von amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Alzheimer-Krankheit sprechen würde (R. M. Friedlander, R. H. Brown, V. Gagliardini, J. Wang, J. Yuan, Nature, Bd. 388 (1997), S. 31; T.-W. Kim, W. H. Pettingell, Y.-K. Jung, D. M. Kovacs, R. E. Tanzi, Science, Bd. 277 (1997), S. 373–376). Von Caspase-3 (CPP32) wurde ferner gezeigt, dass es bei der Stimulation der IL-8-Sekretion von Synoviozyten bei rheumatoider Arthritis beteiligt ist, wo es zur Verstärkung der Gelenkentzündung und zum Fortschreiten der Krankheit beiträgt (C. Sekine, H. Yagita, T. Kobata, T. Hasunuma, K. Nishioka, K. Okumura, Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 228 (1996), S. 14–20). Daher können Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von Caspase dazu herangezogen werden, pathologische Störungen, die durch Caspasevermittelte apoptotische Ereignisse induziert werden, zu verhindern oder zu verringern.
Gemäß einer weiteren speziellen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von pathologischer zellulärer Proliferation bei Mensch oder Tier verwendet werden. Somit können die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung zur Behandlung eines Tiers (einschließlich des Menschen), der Wirt von Krebszellen ist, herangezogen werden, einschließlich beispielsweise der Hemmung des Wachstums von Tumorzellen in einem Säugetierwirt. Insbesondere können die vorliegenden Verbindungen zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen bei Menschen, einschließlich Zellen von Brust-, Kolon-, ZNS-, Ovarial-, Nieren-, Prostata- oder Lungentumoren, sowie von humanen Leukämie- oder Melanomzellen verwendet werden. Die Fähigkeit der vorliegenden Verbindungen zur Erzielung einer Antikrebsaktivität ermöglicht es dem Fachmann, Anwendungsmöglichkeiten für die vorliegenden Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren auf weitere Krebstypen gemäß den hier gemachten Angaben zu erkennen.
Erfindungsgemäß umfassen Verfahren zur Hemmung von Tumoren in einem Wirt das Kontaktieren der Tumorzellen mit einer wirksamen Menge der neuen erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen. Bei den erfindungsgemäß gehemmten Tumorzellen handelt es sich um solche Zellen, die gegenüber den hier beschriebenen Verbindungen oder gegenüber den Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, empfindlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der genannten Verbindung als Immunomodulatoren. Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die immunosuppressive Anwendung dieser Verbindungen. Diese Verbindungen können zur Verringerung, Unterdrückung, Hemmung oder Verhinderung von unerwünschten Immunreaktionen herangezogen werden. Vorteilhafterweise wird diese Immunosuppression ohne Zytotoxizität erreicht. Somit eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Menschen oder Tieren, bei denen eine Immunosuppression erforderlich ist. Zu Beispielen für Zuständen, bei denen eine Immunosuppression erwünscht ist, gehören (ohne Beschränkung hierauf) die Therapie oder Prophylaxe von Autoimmunerkrankungen, wie Diabetes, Lupus und rheumatoide Arthritis. Eine Immunosuppression ist häufig in Verbindung mit Organtransplantationen erforderlich. Immunosuppressive Mittel können auch verwendet werden, wenn Menschen oder Tiere Superantigenen oder anderen Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie eine Überstimulation des Immunsystems hervorrufen, ausgesetzt waren oder ausgesetzt sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich auch als Standards zur Bestimmung der Aktivität anderer mutmaßlicher immunosuppressiver Mittel.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen Calcineurin hemmen. Calcineurin ist ein Enzym und ein Mitglied der Serin/Threonin-phosphatase-Familie von Zellsignal-Transduktionsproteinen. Calcineurin wurde als ein hauptsächliches signalgebendes Molekül erkannt, das die Immunreaktivität reguliert. Die Phosphatase-Aktivität von Calcineurin wird durch eine Assoziation mit einem Komplex, der durch das Immunosuppressivum FK506 und ein intrazelluläres Protein, nämlich FKBP-12 (FK506 bindendes Protein) gebildet worden ist, gehemmt, was eine Immunosuppression ergibt. Daher können Inhibitoren von Calcineurin, wie die erfindungsgemäßen Verbindungen, zur Hemmung der Immunreaktivität der mit Calcineurin verbundenen Phosphatase-Aktivität verwendet werden. Eine Hemmung der Immunreaktivität durch die vorliegenden Verbindungen eignet sich zur Behandlung von Zuständen, einschließlich systemischen Autoimmunkrankheiten und Immunmangelkrankheiten, zur Immunotherapie von Krebs oder zur Verhinderung von Abstoßungen von fremden Organen oder Geweben bei Transplantationen (d. h. Niere, Herz, Lunge, Kolon, Leber oder Knochenmark).
Secobatzelline A (Aminoiminochinon) und Secobatzellin B (Aminochinon), die aus Meeresschwämmen isoliert worden sind, sind in 1 durch ihre Strukturformeln 1 bzw. 2 dargestellt. Die Acetylierung von Secobatzellin A ergibt das in 1 als Strukturformel 3 dargestellte Diacetat. Die Acetylierung von Secobatzellin B ergibt das in 1 als Strukturformel 4 dargestellte Diacetat.
Die Meeresschwämme, aus denen die erfindungsgemäßen Secobatzellin-Verbindungen isoliert werden können, lassen sich auf den Bahamas, North Bimini, westlich von Alice Town (Breite 25° 44,288' N; Länge 79° 18,981' W), sammeln. Beispielsweise wurde eine Probe in einer Tiefe von 455 ft gewonnen. Lebensraum: mit 10° geneigte Sandbank mit kleinen isolierten Felsen. Substrat: Felsgestein. Morphologie: dickes krustenbildendes Kissen mit Papillen. Externe und interne Farbe: schwarz. Eine weitere Sammelstelle ist die westliche Great Bahama Bank (Breite 25° 23,921' N; Länge 79° 14,104' W). Eine weitere Probe wurde in einer Tiefe von 500 ft gewonnen. Lebensraum: Sand und Bruchstein mit einer Neigung von 60°. Substrat: Bruchstein. Morphologie: dickes krustenbildendes Kissen mit Papillen. Äußere Farbe: dunkelbraun, innere Farbe: braun. Ausführliche taxonomische Beschreibung:

Phylum: Porifera

Klasse: Demospongiae

Ordnung: Poecilosclerida

Familie: Desmacididae

Gattung: Batzella

Spezies: nicht beschrieben
Dieser Schwamm wird der Gattung Batzella gemäß der Beschreibung und Erörterung von Van Socst et al., (Bulletin de I'lnstitut Royal des Sciences Naturelles de Belgique, Biologie, Bd. 66, Suppl: 89–101 (1996), S. 95–97), zugeordnet. Der Schwamm weist ein ablösbares Ectosom und ein nadelförmiges Gerüst von Strongylen in einer Größenkategorie auf. Einige der Strongylen weisen fehlgebildete Spitzen auf. Der Schwamm schließt in seinem Gerüst Sediment ein. Über der Oberfläche des Schwammes sind zahlreiche Papillen verteilt. Der Schwamm ist in lebendem Zustand dunkelbraun bis schwarz und bei Aufbewahrung in Ethanol braun. Taxonomische Referenzproben wurden beim Harbor Brauch Oceanographic Institution Museum, Katalog Nummer 003:00930 (25-VIII-94-1-001) und 003:00931 (26-VIII-94-4-003) hinterlegt. Proben werden in 70% Ethanol mit einer erwarteten Lebensdauer von mindestens 30 Jahren aufbewahrt und sind für den Fachmann beispielsweise für taxonomische Identifizierungen zugänglich.
Die endungsgemäßen Verbindungen lassen sich durch die folgende allgemeine Formel wiedergeben:
worin R¹ NH oder O bedeutet;
R² OZ bedeutet;
R³ OZ bedeutet;
R⁴ H oder R bedeutet;
R⁵ NH₂, NR₂ oder OZ bedeutet; und
R⁶ H oder X bedeutet;
wobei Z aus der Gruppe H, R, COR, Mesyl, Tosyl, Glutamyl, Succinyl und Malonyl ausgewählt ist;
R aus der Gruppe C₁-C₈-Alkyl, Phenyl und Benzyl ausgewählt ist; und
X Cl, Br oder I bedeutet.
Spezielle Beispiele sind Verbindungen der folgenden Strukturformeln:
Die Strukturformel 1 zeigt Secobatzellin A und die Strukturformel 2 Secobatzellin B. Unter die Erfindung fallen die Salze der protonierten Strukturformeln 1 und 2. Bei diesen Salzen kann es sich beispielsweise um Cl^–, Br^–, CH₃COO^–, HSO₃O^–, Citrat, Tartrat oder Oxalat handeln.
Eine Acylierung (OH → OCOR) lässt sich beispielsweise durch Behandeln einer Verbindung mit einem Gemisch aus einem Alkylanhydrid und Pyridin (1 : 1) bei Raumtemperatur über Nacht oder durch etwa 4-stündiges Belassen bei 60°C erreichen.
Eine Alkylierung (NH → NR⁴ oder NH₂ → NR⁵) lässt sich erreichen, indem man eine Verbindung in trockenem Aceton mit RI (Alkyliodid) in Gegenwart von wasserfreiem K₂CO₃ unter Rückfluss erwärmt.
Eine Hydrogenolyse (Cl → H) läst sich erreichen, indem man eine Verbindung in Ethanol unter einer H₂-Atmosphäre bei 50 psi in Gegenwart von 10% Vanadium-auf-Aktivkohle als Katalysator schüttelt.
Die Umwandlung von R⁵ = NH₂ → OH) lässt sich durch Diazotierung einer Verbindung bei 5 unter anschließendem Erwärmen des diazotierten Produkts für einige Stunden in Gegenwart von Ethanol erreichen.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist Secobatzellin A (Strukturformel 1) und dessen Diacetat (Strukturformel 3):
Secobatzellin A (1) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = Cl
Diacetat (3) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = Cl
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform ist Secobatzellin B (Strukturformel 2) und dessen Diacetat (Strukturformel 4):
Secobatzellin B (2) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = Cl
Diacetat (4) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = Cl

Zu weiteren bevorzugten Ausführungsformen gehören Verbindungen, bei denen die R-Gruppen unabhängig voneinander unter C₁-C₈-Alkyl und Phenyl ausgewählt sind, Z unter Mesyl, Tosyl, Glutamyl, Succinyl und Malonyl ausgewählt ist und X unter Cl, Br oder I ausgewählt ist. Nachstehend sind spezielle Analoge der vorliegenden Erfindung aufgeführt:
("Analog" bedeutet "analoge Verbindung")

Analog (5)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (6)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (7)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (8)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (9)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (10)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (11)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (12)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (13)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (14)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (15)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (16)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (17)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (18)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (19)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (20)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (21)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (22)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X
Analog (23)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (24)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (25)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (26)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (27)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (28)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (29)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X
Analog (30)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X

Analog (31)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (32)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (33)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H; R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (34)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (35)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (36)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (37)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (38)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (39)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (40)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (41)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (42)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (43)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (44)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (45)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (46)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (47)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (48)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (49)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (50)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (51)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (52)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H
Analog (53)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (54)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (55)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (56)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (57)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (58)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (59)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (60)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H
Analog (61)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (62)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (63)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OCOR, R⁶ = X
Analog (64)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵= OZ, R⁶ = X

Analog (65)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (66)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (67)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OCOR, R⁶ = X
Analog (68)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OZ, R⁶ = X
Analog (69)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (70)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (71)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (72)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (73)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (74)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (75)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OCOR, R⁶ = X
Analog (76)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OZ, R⁶ = X
Analog (77)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH₂, R⁶ = X
Analog (78)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH₂, R⁶ = X
Analog (79)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OCOR, R⁶ = X
Analog (80)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OZ, R⁶ = X
Analog (81)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (82)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (83)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (84)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (85)	R¹ = NH, R²= OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (86)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (87)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (88)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X
Analog (89)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (90)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (91)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ =OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OCOR, R⁶ = H
Analog (92)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OZ, R⁶ = H
Analog (93)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (94)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (95)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OCOR, R⁶ = H
Analog (96)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OZ, R⁶ = H
Analog (97)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (98)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H

Analog (99)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (100)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (101)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (102)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (103)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OCOR, R⁶ = H
Analog (104)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OZ, R⁶ = H
Analog (105)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH₂, R⁶ = H
Analog (106)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH₂, R⁶ = H
Analog (107)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OCOR, R⁶ = H
Analog (108)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OZ, R⁶ = H
Analog (109)	R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (110)	R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (111)	R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (112)	R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (113)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (114)	R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (115)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H
Analog (116)	R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H.

Materialien und Methoden
P388- und A549-in vitro-Antitumortest
P388-Zellen können vom National Cancer Institute, Bethesda, MD, und A549-Zellen vom American Type Culture Collection, Rockville, MD, bezogen werden.
Sämtliche Zelllinien werden in Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-Medium 1640, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt ist, gehalten. Sämtliche Zelllinien werden in Kunststoff-Gewebekulturkolben gezüchtet und in einem Inkubator bei 37°C in befeuchteter Luft mit einem Gehalt an 5% CO₂ gehalten. Vor dem Test werden antibiotikafreie Vorratskulturen der einzelnen Zelllinien einer Subkultur auf 10⁶ Zellen/ml durch Verdünnung in frischem Wachstumsmedium in Abständen von 2 bis 3 Tagen unterzogen.
Zur Bestimmung der antiproliferativen Wirkung der Mittel gegen die P388-Zelllinie werden 200 μl-Kulturen (Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen, Nunc, Dänemark) mit 1 × 10⁵ Zellen/ml in arzneistofffreiem Medium oder Medium mit einem Gehalt an dem Testagens mit 10,0, 1,0, 0,10 und 0,010 μg/ml bereitgestellt. Das Lösungsmittel für sämtliche Verdünnungen ist Ethanol. Sämtliche experimentellen Kulturen werden in Medium mit einem Gehalt an Gentamycinsulfat (50 μg/ml, Schering Corporation, Kenilworth, NJ) initiiert. Nach 48-stündiger Einwirkung werden die P388-Zellen unter Verwendung von 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) gemäß den nachstehenden Angaben gezählt.
Ähnliche Verfahren werden für A549-Zellen eingesetzt, die vor der MTT-Zugabe eine weitere 48-stündige Einwirkung erfordern. Die Ergebnisse werden als prozentuale Hemmung im Vergleich mit der negativen Kontrolle (ohne Arzneistoff) angegeben. Positive Arzneistoffkontrollen wurden mitgeführt, um die Arzneistoffempfindlichkeit der einzelnen Zelllinien zu überwachen. Hierzu gehören verschiedene Verdünnungen von 5-Fluorouracil, Adriamycin, Methotrexat und Vinblastin.
Zur quantitativen Ermittlung der Wirkungen auf die Zellproliferation und die sich ergebenden IC₅₀-Werte wird jede Vertiefung mit 75 μl warmem Wachstumsmedium mit einem Gehalt an 5 mg/ml MTT versetzt. Die Kulturen werden in den Inkubator zurückgebracht und 90 Minuten ungestört belassen. Zur spektrophotometrischen quantitativen Bestimmung der Bildung von reduziertem Formazan werden die Platten zentrifugiert (900 × g, 5 Minuten), die Kulturflüssigkeiten werden durch Absaugen entfernt und pro Vertiefung mit 200 μl angesäuertem Isopropanol (2 ml konzentrierte HCl/Liter Isopropanol) versetzt. Die Absorption der erhaltenen Lösungen wird bei 570 nm mit einem Plattenablesegerät (MR700 Microplate Reader, Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) gemessen. Die Absorption der Testvertiefungen wird durch die Absorption von arzneistofffreien Vertiefungen dividiert. Die Konzentration des Mittels, die zu 50% der Absorption von unbehandelten Kulturen (IC₅₀) führt, wird durch lineare Regression von Logit-transformierten Daten bestimmt. Eine lineare Beziehung zwischen der Tumorzellzahl und der Formazanbildung wurde routinemäßig über den Bereich von bei diesen Versuchen festgestellten Zelldichten beobachtet. Die vier Standard-Arzneistoffkontrollen (vorstehend angegeben) werden bei jedem Test als Prüfung zur Überwachung der Arzneistoffempfindlichkeit der einzelnen Zelllinien mitgeführt. Die IC₅₀-Werte werden für jede Arzneistoff-Zell-Kombination bestimmt.
Zweiweg-Misch-Lymphozytenreaktion (MLR) und Lymphozyten-Lebensfähigkeitstest (LCV)-Test
Diese Tests messen die Fähigkeit der Extrakte/reinen Verbindungen zur Hemmung der allogenen Immunreaktivität (MLR) und zur Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit von nicht-stimulierten Lymphozyten. Diese allgemeinen Verfahren werden in folgenden Literaturstellen beschrieben: R. E. Longley, D. Caddigan, D. Harmody, M. Gunasekera und S. P. Gunasekera, Transplantation, Bd. 52 (1991), S. 650–656.
EL-4-Hafttest
Dieser Test beruht auf den Eigenschaften von Extrakten/reinen Verbindungen, die als Protein-kinase C (PKC)-Wirkstoffe dienen, zur Induktion oder Hemmung der Haftung von EL-4.IL-2-Mäuse-Lymphomzellen an Kunststoffoberflächen. Die allgemeine Methodik bei diesem Test wird ausführlich von R. E. Longley und D. Harmody, J. Antibiotics, Bd. 44 (1991), S. 93–102, beschrieben.
Enzymtests
sEs wurden jeweils die folgenden Tests unter Verwendung eines automatisierten Tecan 8051- oder Tecan Megaflex-Flüssigkeitshandhabungssystems durchgeführt. Extrakte von Meeresorganismen wurden in 5 μg/ml für sämtliche Tests mit Ausnahme von DPP IV und LAR, die mit 50 μg/ml getestet wurden, getestet. Die Hemmung der Enzymaktivität, die in Gegenwart des Extrakts festgestellt wurde, wurde mit einer ungehemmten Kontrolle verglichen. Extrakte, die das Enzym > 50% hemmten, wurden zur Bestätigung der Aktivität in einem Dreifachtest getestet.
(i) CD45
CD45 wurde als eine Membranfraktion aus Jurkat-Zellen (Klon E6-1) präpariert. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum und L-Glutamin ergänzt war, gezüchtet, in hypotonischem Lysispuffer (25 mM Tris-HCl, 25 mM Saccharose, 0,1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreit, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid und 10 μg/ml Leupeptin, pH-Wert 7,5) lysiert und 5 Minuten mit 500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde sodann 1 Stunde mit 100 000 × zentrifugiert. Das Pellet mit einem Gehalt an CD45 wurde in Testpuffer (100 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, pH-Wert 6,0) resuspendiert und bei –80°C gelagert.
Der Test beruht auf den Angaben von Imoto et al. (M. H. Imoto, H. Kakeya, T. Sawa, C. Hayashi, M. Hamada, T. Takeuchi und K. Umezawa "Dephostin, a novel protein tyrosine phosphatase inhibitor produced by Streptomyces I. Taxonomy, isolation and characterization", J. Antibiotics, Bd. 46 (1993), S. 1342–1346) und wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Die CD45-Membransuspension (1 μg Protein/Vertiefung) wurde in Testpuffer bei 37°C mit 2,5 mM O-Phosphotyrosin als Substrat inkubiert. Testproben wurden nach Bedarf mitgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5% HClO₄ (150 μl) beendet. Freigesetztes anorganisches Phosphat wurde durch Veränderung der Absorption bei 620 mM unter anschließender Addition von 50 μl Farbreagenz (6 N H₂SO₄, 1 mg/ml Malachitgrün, 2,5% Ammoniummolybdat und 0,2% Tween 20) gemessen.
(ii) Calcineurin
Calmodulin wurde aus Rinderhirn gemäß dem Verfahren von Wallace et al. (R. W. Wallace, E. A. Tallant und W. Y. Chung, "Assay of calmodulin by Ca²⁺ dependent phosphodiesterase", Meth. Enzymol., Bd. 102 (1983), S. 244–286) präpariert. Das Calmodulin wurde entweder direkt verwendet oder zur Bildung der für die Isolierung von Calcineurin erforderlichen Calmodulin-Sepharose-Affinitätssäule an Sepharose-4B gekuppelt. Calcineurin wurde aus Rinderhirn nach dem Verfahren von Tallant et al. (E. A. Tallant, R. W. Wallace und W. Y. Chung, "Purification and radioimmunoassay of calmodulin-dependent protein phosphatase from bovine brain", Meth. Enzymol., Bd. 102 (1983), S. 244–286) präpariert, eingeengt, in Aliquotanteile aufgeteilt und bei –80°C aufbewahrt.
Die Aktivität von Calcineurin wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einem Endvolumen von 50 μl getestet. Die einzelnen Vertiefungen enthielten 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,5 mM MnCl₂, 0,05 mM CaCl₂, 1 mM DTT, 50 mM p-Nitrophenylphosphat (pNPP), 0,3 μg Calcineurin, einen 5-fachen Überschuss an Calmodulin und entweder Testproben oder Kontrollverbindungen. Die Platten wurden 60 Minuten bei 30°C inkubiert. Freigesetztes p-Nitrophenol wurde durch Veränderung der Absorption bei 405 nm bestimmt.
(iii) cdc25A
cdc25A wurde aus einem in Escherichia coli exprimierten rekombinanten Protein präpariert. Die Phosphatase-Aktivität des Enzyms wurde in ein Endvolumen von 200 μl in Platten mit 96 Vertiefungen nach dem Verfahren von Baratte et al. (B. Baratte, L. Meijer, K. Galatnikov und D. Beach, "Screening for antimitotic compounds using the cdc25 tyrosine phosphatase, an activator of the mitosis-inducing p34^cdc2/cyclin B^cdc13 protein kinase", Anticancer Research, Bd. 12 (1992), S. 873–880) getestet. Die einzelnen Vertiefungen enthielten 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 15 mM DTT, 50 mM pNPP, bis zu 10 μg rekombinantes Protein und entweder Testproben oder Kontrollen. Die Platten wurden 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Freigesetztes p-Nitrophenol wurde durch Veränderung der Absorption bei 405 nm bestimmt. Der Test (US-Patent 5 294 538, Mitotix, Inc., Cambridge, MA) wird von HBOI mit einer Mitotix-Lizenz durchgeführt.
(iv) DPPIV
Rekombinantes humanes DPP IV wurde durch vorübergehende Expression eines humanen DPP IV-Plasmidkonstrukts, das durch Elektroporation in COS-7-Zellen transfiziert worden war, hergestellt. Die Peptidase-Aktivität dieses Enzyms wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem Endvolumen von 200 μl in Platten mit 96 Vertiefungen bestimmt. Die einzelnen Vertiefungen enthielten 200 mM gly-pro-pNA als Substrat, 10 μl des rekombinaten DPP IV und Testproben oder Kontrollen. Freigesetztes p-Nitroanilin wurde durch Veränderung der Absorption bei 405 nm im Anschluss an eine 60-minütige Inkubation bei 37°C bestimmt.
(v) Aminopeptidase N (CD13)
Aminopeptidase N wurde unter Verwendung eines ELISA-Abfangtests bestimmt. Kurz zusammengefasst, Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit Ziegenanti-Maus-Immunoglobulinen (Sigma #M4169) beschichtet. Nach Inkubation über Nacht wurden die Platten 3-mal mit PBS-0,1% Triton X-100 gewaschen. Der sekundäre Antikörper (Abfangantikörper) wurde sodann zu der Platte gegeben (100 μl/Vertiefung, 3,7 μg/ml, antihumanes MY7, Coulter Corporation) und 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 3-mal mit PBS-0,1% Triton X-100 gewaschen. Die Quelle für Aminopeptidase N war die KG-1-Zelllinie. 100 μl einer entsprechenden Verdünnung des KG-1-Zelllysats wurden in jede Vertiefung gegeben, 3 Stunden inkubiert und sodann ein letztes Mal gewaschen. Der Enzymtest wurde in PBS in einem Endvolumen von 200 μl mit 200 μM ala-pNA als Substrat und Testproben oder Kontrollen durchgeführt. Freigesetztes p-Nitroanilin wurde durch Veränderung der Absorption bei 405 nm im Anschluss an eine 18-stündige Inkubation bei 37°C bestimmt.
(vi) CPP32
Testproben wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in Aliquotanteile aufgeteilt und an der Luft getrocknet. Das Vorratsenzym CPP32 (BASF, Worcester, MA) wurde durch Zugabe von 10 μl des Enzyms zu 17 ml Reaktionspuffer (50 mM Hepes, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin, 5 mM Dithiothreit, 0,5 mM EDTA) verdünnt. Ein Volumen von 180 μl des verdünnten Enzyms wurde zu Vertiefungen mit einem Gehalt an den getrockneten Testproben oder in leere Vertiefungen (Kontrolle) gegeben. Der Inhalt der Mikrotitervertiefungen wurde durch Schütteln an einem Plattenschüttelgerät vermischt. Die Platten wurden 5 Minuten bei 30°C inkubiert. Ein Volumen von 20 μl Substrat (Ac-DEVD-pNA) wurde in jede Vertiefung gegeben, was zu einer Endkonzentration von 25 μM führte. Kontrollen für die einzelnen Platten bestanden aus einer Inhibitorkontrolle (50 nM DEVD-CHO-Endkonzentration), einer positiven Kontrolle (Enzym und Substrat) und einer negativen Kontrolle (Reaktionspuffer und Substrat). Die Platten wurden mit einer Aluminiumfolie abgedeckt und 5 Minuten unter Verwendung eines Plattenschüttelgeräts vermischt. Sodann wurde eine 30-minütige Inkubation bei 30°C vorgenommen. Die Platten wurden unter Verwendung eines Plattenlesegeräts unter Messung der Absorption bei 405 nm abgelesen. Die Daten wurden als prozentuale Hemmung durch Vergleich der Absorptionswerte der Testproben mit den Werten der positiven Kontrolle (ohne Probe) angegeben. Die IC₅₀-Bestimmung ist als die Konzentration der Probe/reinen Verbindung definiert, die zu einer 50%igen Hemmung des Absorptionswerts von Enzym/Substrat führte.
(vii) ICE
Testproben wurden auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in Aliquotanteile aufgeteilt und an der Luft getrocknet. ICE-Vorratsenzym (bezogen von der Fa. BASF, Worcester, MA) wurde in Reaktionspuffer (50 mM Hepes, pH-Wert 7,5, 10% Glycerin, 5 mM Dithiothreit, 0,5 mM EDTA und 5 mM β-Mercaptoethanol) auf eine Konzentration verdünnt, die nach 30-minütiger Reaktionszeit eine minimale Zunahme der optischen Dichte von 0,1 ergab. Verdünntes ICE-Enzym wurde vor Bildung von Aliquotanteilen von jeweils 180 μl in jeder Probenvertiefung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden sodann 5 Minuten bei 30°C inkubiert, wonach ein kurzes Vermischen des Inhalts der Vertiefungen durch Schütteln auf einem Pattenschüttelgerät folgte. Ein Volumen von 20 μl des Enzymsubstrats (Ac-YVAD-pNA) wurde in jede Vertiefung gegeben, was zu einer Endkonzentration von 50 μM führte. Kontrollen für jede Platte bestanden aus einer Inhibitorkontrolle (50 nM YVAD-CHO-Endkonzentration), einer positiven Kontrolle (Enzym und Substrat) und einer negativen Kontrolle (Reaktionspuffer und Substrat). Die Platten wurden mit einer Aluminiumfolie abgedeckt und 15 Sekunden unter Verwendung eines Plattenschüttelgeräts vermischt. Sodann wurde eine 30-minütige Inkubation bei 30°C vorgenommen. Die Platten wurden unter Verwendung eines Piattenlesegeräts unter Messung der Absorption bei 405 nm abgelesen. Die Daten wurden als prozentuale Hemmung durch Vergleich der Absorptionswerte der Testproben mit den Werten der positiven Kontrolle (ohne Probe) angegeben. Die IC₅₀-Bestimmung wurde als die Konzentration der Probe oder reinen Verbindung bestimmt, die zu einer 50%igen Hemmung des Absorptionswerts von Enzym/Substrat führte.
Die nachstehenden Beispiele erläutern Verfahren zur Durchführung der Erfindung. Sämtliche Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht und sämtliche Anteile von Lösungsmittelgemischen auf das Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1 – Isolierung und biologische Aktivität von Secobatzellin A und Secobatzellin B
2 zeigt in schematischer Weise die Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen aus einem Meeresschwamm.
Beispiel 2 – Chemische und physikalische Charakterisierung von Secobatzellin A und Secobatzellin B
Strukturformel I (Secobatzellin A)
Dunkel orangefarben gefärbte, nicht kristalline Verbindung, F. > 300°C (α)_D –135° (c 0,01, CH₃OH)
Molekulargewicht: 255 (257 für das Cl-Isotop)
Summenformel: C₁₀H₁₁ClN₃O₃ (HRFABMS, NBA) m/z 256,055, Δ 6 mmu und 358,051, Δ 5 mmu für M⁺H
UV (MeOH) λmax: 322 (ε 10100), 233 (13600), 203 (15700) nm
IR (KBr) νmax: 3237, 2917, 1658, 1611, 1585, 1500, 1408, 1360, 1024 und 752 cm^–1
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12,5 (1H, br s, NH-1 ), 9,80 (1H, br s, NH-10), 7,16 (1H, s, H-2), 6,55 (2H, br s, NH-11), 4,67 (1H, t, J = 6,1 Hz, H-8), 3,49 (2H, d, J = 6,1 Hz, H-9)
¹³C-NMR (90,5 MHz, DMSO-d₆) δ 169,3 (s, C-7), 158,0 (s, C-4), 141,2 (s, C-6), 127,1 (s, C-7a), 127,1 (s, C-3), 125,8 (d, C-2), 124,4 (s, C-3a), 103,9 (s, C-5), 67,8 (d, C-8), 65,4 (t, C-9)
Strukturformel 2 (Secobatzellin B)
Rote, nicht-kristalline Verbindung, F. > 300°C, (α)_D –18° (c 0,01, CH₃OH)
Molekulargewicht: 256 (258 für das Cl-Isotop)
Summenformel: C₁₀H₁₀ClN₂O₄ (HRFABMS, "magic bullet") schwach m/z 257,043, 259,040 für M⁺H
UV (MeOH) λmax: 335 (ε 21200), 245sh (10200), 203 (21200) nm
IR (KBr) νmax: 3456, 3347, 2918, 1667, 1623, 1580, 1549, 1509, 1408, 1351, 1290, 1060, 890, and 830 cm^–1
¹H-NMR (360 MHz, CD₃COCD₃ und 10% DMSO-d₆) δ 7,18 (1H, s, H-2), 6,63 (1H, br s, NH), 4,90 (1H, dd, J = 6,6, 4,7 Hz, H-8), 3,65 (1H, dd, J = 10,8, 4,7 Hz, H-9), 3,50 (1H, dd, J = 10,8, 6,6 Hz, H-9)
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12,63 (1H, br s, H-1), 7,11 (1H, s, H-2), 7,09 (2H, br s, NH-11), 5,10 (1H, d, J = 5,5 Hz, OH-8), 4,87 (1H, ddd, J = 6, 5,5, 5,5 Hz, H-8), 4,57 (1H, t, J = 6,0 Hz, OH-9), 3,49 (1H, ddd, J = 9, 5,5, 6 Hz, H-9), 3,27 (1H, ddd, J = 9, 5,5, 6 Hz, H-9)
¹³C-NMR (125,7 MHz, DMSO-d₆) δ 175,8 (s, C-4), 169,5 (s, C-7), 145,9 (s, C-6), 129,0 (s, C-3), 127,5 (s, C-7a), 126,3 (d, C-2), 122,5 (s, C-3a), 104,9 (s, C-5), 67,5 (d, C-8), 66,0 (t, C-9)
Beispiel 3 – Aktivität des rohen Extrakts von 25-VIII-94-1-001
Getestete Konzentration: 5 μg/ml, ausgenommen LAR 50 μg/ml
Beispiel 4 – Aktivität des rohen Extrakts von 26-VIII-94-4-003
Getestete Konzentration: 5 μg/ml, ausgenommen LAR 50 μg/ml
Beispiel 5 – Biologische Aktivität von Secobatzellin A und Secobatzellin B
Nachstehend sind die Daten für die biologische Aktivität für folgende Verbindungen angegeben:
Daten der biologischen Aktivität: Secobatzellin A (1)

CaN, I = 75% bei 5 μg/ml
CaN, I = 46% bei 0,5 μg/ml
CaN, IC₅₀ = 0,55 μg/ml
ApN, I = 54,9% bei 5 μg/ml
P388, IC₅₀ = 0,06 μg/ml
A549, IC₅₀ = 0,04 μg/ml
EL-4, inh. Haftung
MLR, IC₅₀ = 0,68 μg/ml
LCV, IC₅₀ = 1,4 μg/ml
ICE, nicht nachgewiesen
CPP32, I = 86,5% bei 5 μg/ml
CPP32, I = 76,2% bei 0,5 μg/ml
CPP32, IC₅₀ = 0,02 μg/ml

Daten der biologischen Aktivität: Secobatzellin B (2)

CaN, I = 43% bei 5 μg/ml
CaN, I = 22% bei 0,5 μg/ml
CaN, IC₅₀ = 2,21 μg/ml
P388, IC₅₀ = 1,22 μg/ml
A549, IC₅₀ = 2,86 μg/ml

Beispiel 6 – Acetylierung von Secobatzellin A
Acetylierung von 18SG541 (Secobatzellin-A): Eine Lösung von 18SG541 (10,0 mg) in Pyridin (1,5 ml) und Essigsäureanhydrid (0,5 ml) wurde 4 Stunden bei 50°C gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Das erhaltene Öl wurde durch HPLC (SiO₂, 5 mm, 250 × 10 mm) mit 2% MeOH/CH₂Cl₂ gereinigt. Man erhielt reine Diacetate.
Beispiel 7 – Diacetat von Secobatzellin A
18SG791 (Strukturformel 3) (gleich wie das 18SG541-Diacetat)
Orangefarbene, nicht-kristalline Verbindung, F. 169-170°C, (α)_D –24° (c 0,01, CH₃OH)
Molekulargewicht 339 (341 für Cl-Isotop)
Summenformel C₁₄H₁₄ClN₃O₅ (HRFABMS, NBA) m/z, 340,054, Δ 2 mmu und 342,047, Δ 5 mmu für M⁺H
UV (MeOH) λmax 320 (ε 12900), 227 (21100), 203 (23200) nm
IR (Reinsubstanz) νmax 3225, 2930, 1726, 1651, 1623, 1229, 1216, 1021 und 765 cm^–1
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12,65 (1H, br s, NH-1), 10,15 (1H, br s, NH-10), 7,27 (1H, s, H-2), 6,55 (1H, t, J = 6,7 Hz, H-8), 6,41 (2H, br s, NH-11), 4,30 (2H, dd, J = 11,1, 6,7 Hz,), 2,06 (3H, s, OAc), 1,98 (3H, s OAc)
¹³C-NMR (125,7 MHz, CDCl₃/10% CD₃OD) δ 171,1 (s, OAc), 170,2 (s, OAc), 169,9 (s, C-7), 157,4 (s, C-4), 139,5 (s, C-6), 127,3 (s, C-7a), 125,1, (d, C-2), 124,1 (s, C-3a), 120,8 (s, C-3), 107,3 (s, C-5), 68,2 (d, C-8), 64,9 (t, C-9), 20,8 (q, OAc), 20,6 (q, OAc),
¹³C-NMR (125,7 MHz, DMSO-d₆) δ 169,8 (s, OAc), 169,5 (s, C-7), 169,4 (s, OAc), 157,2 (s, C-4), 140,2 (s, C-6), 127,0 (s, C-7a), 125,6 (d, C-2), 124,0 (s, C-3a), 120,1 (s, C-3), 104,1 (s, C-5), 67,5 (d, C-8), 64,9 (t, C-9), 20,6 (q, OAc), 20,3 (q, OAc)
Beispiel 8 – Diacetat von Secobatzellin B
18SG792 (Strukturformel 4) (gleich wie das 18SG542-Diacetat)
Dunkel rosafarbene, nicht-kristalline Verbindung, F. 170–171°C
Molekulargewicht 340 (342 für Cl-Isotop)
Summenformel C₁₄H₁₃ClN₂O₆
UV (MeOH) λmax 342 (ε 5400), 303 (14300), 238 (18700), 205 (19500) nm
IR (Reinsubstanz) νmax 3162, 2930, 1733, 1677, 1605, 1402, 1242, 1232 und 1042 cm^–1
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 12,80 (1H, br s, NH-1), 7,28 (1H, s, H-2), 7,13 (2H, br s, NH-11), 6,30 (1H, dd, J = 6,3, 6,2 Hz, H-8), 4,27 (2H, m, H-9), 2,04 (3H, s, OAc), 1,98 (3H, s, OAc)
¹³C-NMR (125,7 MHz, DMSO-d₆) δ 175,2 (s, C-4), 170,0 (2C, s, OAc), 169,6 (s, C-7), 145,9 (s, C-6), 128,0 (s, C-7a), 126,5 (s, C-2), 122,4 (d, C-3a), 121,4 (s, C-3) 105,1 (s, C-5), 66,8 (d, C-8), 64,3 (t, C-9), 20,8 (q, OAc), 20,6 (q, OAc)
Beispiel 9 – Formulierung und Zubereitung
Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich für verschiedene nichttherapeutische und therapeutische Zwecke. Aus den Tests ist ersichtlich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen sich für entzündungshemmende, neuroprotektive, antiproliferative und immunomodulatorische Anwendungen eignen.
Eine therapeutische Anwendung der neuen Verbindungen und von diesen Verbindungen enthaltenden Zusammensetzungen kommen unter Anwendung beliebiger geeigneter therapeutischer Verfahren und Techniken, die der Fachmann derzeit kennt oder die in der Zukunft bekannt werden, in Betracht. Ferner werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte zur Herstellung anderer wertvoller Verbindungen und Zusammensetzungen verwendet.
In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verbindungen oder Zusammensetzungen bei Verwendung als entzündungshemmende Mittel in einer Lotion oder einer anderen kosmetischen Zubereitung verwendet. Die Verabreichung erfolgt direkt auf die Haut, wo eine entzündungshemmende Wirkung angestrebt wird.
Aufgrund der antiproliferativen Eigenschaften der Verbindungen eignen sie sich auch zur Verhinderung von unerwünschtem Zellwachstum in einer Reihe von Situationen, einschließlich in vitro-Anwendungen. Sie eignen sich auch als Standards und für Unterrichtszwecke. Sie können als UV-Abschirmmittel in der Kunststoffindusirie verwendet werden, da sie in wirksamer Weise UV-Strahlen absorbieren. Gemäß den hier gemachten Ausführungen können sie prophylaktisch und therapeutisch zur Behandlung von Krebszellen bei Menschen und Tieren eingesetzt werden.
Bei einer anderen Ausführungsform zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine wirksame immunomoduiatorische Aktivität. Speziell eignen sie sich zur Regulierung von Immunreaktionen bei Menschen und Tieren. Somit erweisen sich pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen als Wirkstoffe enthalten, als wertvoll bei der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung einer immunomodulatorischen Reaktion bei Menschen oder anderen Säugern.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zur Modulation der T-Zellaktivität verwendet werden. Somit betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die in vivo-Suppression der T-Zellreaktion bei Menschen, z. B. bei Transplantationen und Autoimmunität.
Die an einen Wirt bei den vorstehenden Indikationen zu verabreichende Dosierung hängt von der Art des zu behandelnden Zustands, dem Typ des beteiligten Wirts, von dessen Alter, Gewicht, Gesundheitszustand, Art von etwaigen gleichzeitigen Behandlungen, Häufigkeit der Behandlung und therapeutischem Verhältnis ab.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gemäß bekannten Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch wertvollen Zusammensetzungen zubereitet werden. Zubereitungen, die ausführlich in einer Anzahl von Quellen beschrieben sind, sind dem Fachmann geläufig und für ihn leicht verfügbar. Beispielsweise beschreibt Remington's Pharmaceutical Science, E. W. Martin, Zubereitungen, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen so zubereitet, dass eine wirksame Menge einer oder mehrerer biologisch aktiver Verbindungen mit einem geeigneten Träger vereinigt wird, um eine wirksame Verabreichung der Zusammensetzung zu erleichtern.
Erfindungsgemäß können pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff eine wirksame Menge von einer oder mehreren der vorliegenden Verbindungen und einen oder mehrere nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel enthalten, vom Fachmann verwendet werden. Ferner kann die pharmazeutische Zusammensetzung eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen als ersten Wirkstoff zusammen mit einem zweiten Wirkstoff, der beispielsweise eine aus dem Stand der Technik bekannte entzündungshemmende, antiproliferative oder immunomodulatorische Verbindung enthält, umfassen. Zu bekannten entzündungshemmenden Arzneistoffen gehören (ohne Beschränkung hierauf) steroidale entzündungshemmende Arzneistoffe und nicht-steroidale entzündungshemmende Arzneistoffe (NSAIDs).
Erfindungsgemäß werden pharmazeutisch wirksame Mengen eines bekannten biologischen Wirkstoffes und der erfindungsgemäßen Aminoiminochinon- und/oder Aminochinon-Verbindungen (oder Secobatzelline) dem Patienten nacheinander oder gleichzeitig verabreicht. Die wirksamste Verabreichungsart und das wirksamste Dosierungsschema für die erfindungsgemäßen Verbindungen hängt vom Typ des zu behandelnden Zustands, der Schwere und dem Verlauf des Zustands, der vorherigen Therapie, dem Gesundheitszustand des Patienten, der Reaktion auf die Verbindungen und der Beurteilung durch den behandelnden Arzt ab. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können dem Patienten auf einmal oder im Verlauf einer Reihe von Behandlungen verabreicht werden.
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und ein etwaiges zweites Mittel dem Patient nacheinander verabreicht, wobei das zweite Mittel vor und/oder nach der Behandlung mit der oder den Aminoiminochinon- und/oder Aminochinon-Verbindungen verabreicht wird. Eine sequentielle Verabreichung beinhaltet eine Behandlung mit dem zweiten Mittel mindestens am gleichen Tag (innerhalb von 24 Stunden) der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen und kann eine fortgesetzte Behandlung mit dem zweiten Mittel an den Tagen, an denen die erfindungsgemäßen Verbindungen nicht verabreicht werden, beinhalten. Herkömmliche Verabreichungsarten und Standarddosierungsschemata von Wirkstoffen können herangezogen werden (vergl. A. G. Gilman et al. (Hrsg.), The Pharmacological Basis of Therapeutics, (1980), S. 697–713, 1482 und 1489–1491; Physicians Desk Reference, Ausgabe 1986). Beispielsweise kann Indomethacin oral in einer Dosierung von etwa 25–50 mg 3-mal täglich verabreicht werden. Es können auch höhere Dosen herangezogen werden. Alternativ können Aspirin (etwa 1500–2000 mg/Tag, Ibuprofen (etwa 1200–3200 mg/Tag) oder herkömmliche therapeutische Dosen anderer Mittel verwendet werden. Die Dosierungen von Wirkstoffen können auf den einzelnen Patienten eingestellt werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann der Patient eine gleichzeitige Behandlung mit einem zweiten Wirkstoff und mit Zusammensetzungen; die die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, erhalten. Beispielsweise wird eine lokale, intraläsionale oder intravenöse Injektion der Aminoiminochinone und/oder Aminochinone bevorzugt (vergl. Gilman et al., a. a. O., S. 1290–1291). Die Mittel können durch subkutane Injektion, durch ein subkutanes Implantat mit langsamer Wirkstofffreisetzung oder oral verabreicht werden.
Alternativ kann der Patient eine Zusammensetzung, die eine Kombination aus einer oder mehreren der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen zweiten Wirkstoff enthält, gemäß üblichen Verabreichungsarten von Mitteln, die eine antibakterielle, Antikrebs-, immunomodulatorische, Antitumor- oder entzündungshemmende Aktivität entfalten, erhalten. Hierzu gehören beispielsweise eine parenterale, subkutane, intravenöse oder intraläsionale Verabreichungsart.
Die bei diesen Therapien verwendeten Zusammensetzungen können ebenfalls in einer Reihe von Darreichungsformen vorliegen. Hierzu gehören beispielsweise feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen, wie Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Suppositorien, injizierbare und infundierbare Lösungen. Die bevorzugte Form hängt vom beabsichtigten Verabreichungsweg und von der therapeutischen Anwendung ab. Die Zusammensetzungen können vorzugsweise ferner herkömmliche pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe und Hilfsstoffe enthalten, die dem Fachmann geläufig sind. Vorzugsweise liegen die Zusammensetzungen in Form von Dosiseinheiten vor und werden üblicherweise dem Patienten einmal oder mehrmals täglich verabreicht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch unter Anwendung der Liposomentechnik sowie in Form von Kapseln mit langsamer Wirkstofffreisetzung, implantierbaren Pumpen und biologisch abbaubaren Behältern verabreicht werden. Diese Verabreichungsverfahren können in vorteilhafter Weise eine gleichmäßige Dosierung über einen längeren Zeitraum hinweg gewährleisten.
Zu Beispielen für derartige Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel gehören Ethanol, Dimethylsulfoxid, Glycerin, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Stärke und gleichwertige Träger und Verdünnungsmittel. Obgleich die wirksamen Mengen je nach den Bedingungen, unter denen die Zusammensetzungen verwendet werden, variieren können, beträgt eine zur Erzielung einer entzündungshemmenden Aktivität erforderliche minimale Dosis im allgemeinen 0,01 bis 100 μg der Verbindung. Um die Verabreichung derartiger Dosierungen für die angestrebte therapeutische Behandlung zu erreichen, enthalten die erfindungsgemäßen neuen pharmazeutischen Zusammensetzungen vorteilhafterweise etwa 0,1 bis 45% und insbesondere 1 bis 15 Gew.-% insgesamt an einer oder mehreren der neuen Verbindungen, bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung, einschließlich Trägerstoff oder Verdünnungsmittel.
Nachstehend sind beispielhafte Dosierungen für die verabreichten Wirkstoffe angegeben: intravenös 0,01 bis etwa 50 mg/kg; intraperitoneal 0,01 bis etwa 100 mg/kg; subkutan 0,01 bis etwa 100 mg/kg; intramuskulär 0,01 bis etwa 100 mg/kg; oral 0,01 bis etwa 200 mg/kg und vorzugsweise etwa 1 bis 100 mg/kg; intranasale Instillation 0,01 bis etwa 50 mg/kg; und Aerosol 0,01 bis etwa 50 mg/kg des Körpergewichts des Tiers.
Nachdem eine Besserung im Zustand des Patienten eingetreten ist, wird gegebenenfalls eine Aufrechterhaltungsdosis verabreicht. Anschließend können die Dosierung und/oder die Häufigkeit der Verabreichung in Abhängigkeit von den Symptomen auf ein Maß reduziert werden, bei dem der verbesserte Zustand erhalten bleibt. Wenn eine Besserung der Symptome auf das gewünschte Maß eingetreten ist, sollte die Behandlung beendet werden. Bei dem Patienten kann jedoch beim Wiederauftreten von Krankheitssymptomen eine intermittierende Behandlung auf Langzeitbasis erforderlich sein.

Claims

Verbindung der folgenden Strukturformel:
worin R¹ NH oder O bedeutet; R² OZ bedeutet; R³ OZ bedeutet; R⁴ H oder R bedeutet; R⁵ NH₂, NR₂ oder OZ bedeutet; und R⁶ H oder X bedeutet; wobei Z aus der Gruppe H, R, COR, Mesyl, Tosyl, Glutamyl, Succinyl und Malonyl ausgewählt ist; R aus der Gruppe C₁-C₈-Alkyl, Phenyl und Benzyl ausgewählt ist; und X Cl, Br oder I bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei es sich um Secobatzellin A handelt, d. h. R¹ bedeutet NH; R² bedeutet OH; R³ bedeutet OH; R⁴ bedeutet H; R⁵ bedeutet NH₂; und R⁶ bedeutet Cl; oder ein Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ NH bedeutet; R² OCOR bedeutet; R³ OCOR bedeutet; R⁴ H bedeutet; R⁵ NH₂ bedeutet; und R⁶ Cl bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei es sich um Secobatzellin B handelt, d. h. R¹ bedeutet O; R² bedeutet OH; R³ bedeutet OH; R⁴ bedeutet H; R⁵ bedeutet NH₂; und R⁶ bedeutet Cl; oder ein Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ O bedeutet; R² OCOR bedeutet; R³ OCOR bedeutet; R⁴ H bedeutet; R⁵ NH₂ bedeutet; und R⁶ Cl bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist: ("Analog" bedeutet jeweils "analoge Verbindung") Analog (5) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (6) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (7) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (8) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (9) R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (10) R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (11) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (12) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (13) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (14) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (15) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (16) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (17) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (18) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (19) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (20) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (21) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (22) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = X Analog (23) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (24) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (25) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (26) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (27) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (28) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (29) R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X Analog (30) R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = X

Analog (31) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (32) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (33) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H; R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (34) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (35) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (36) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (37) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (38) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (39) R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (40) R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (41) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (42) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (43) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (44) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (45) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (46) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (47) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (48) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (49) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (50) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (51) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (52) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NH₂, R⁶ = H Analog (53) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (54) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (55) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (56) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (57) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (58) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (59) R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (60) R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = NR₂, R⁶ = H Analog (61) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (62) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (63) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OCOR, R⁶ = X Analog (64) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OZ, R⁶ = X

Analog (65) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (66) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (67) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OCOR, R⁶ = X Analog (68) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OZ, R⁶ = X Analog (69) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (70) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (71) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (72) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (73) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (74) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (75) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OCOR, R⁶ = X Analog (76) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OZ, R⁶ = X Analog (77) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH₂, R⁶ = X Analog (78) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH₂, R⁶ = X Analog (79) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OCOR, R⁶ = X Analog (80) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OZ, R⁶ = X Analog (81) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (82) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (83) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (84) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (85) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (86) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (87) R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (88) R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = X Analog (89) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (90) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (91) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OCOR, R⁶ = H Analog (92) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OZ, R⁶ = H Analog (93) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (94) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (95) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = H, R⁵ = OCOR, R⁶ = H Analog (96) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = H, R⁵ = OZ, R⁶ = H Analog (97) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (98) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H

Analog (99) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (100) R¹ = O, R² = OH, R³ = OH, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (101) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (102) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (103) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OCOR, R⁶ = H Analog (104) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OZ, R⁶ = H Analog (105) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH₂, R⁶ = H Analog (106) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH₂, R⁶ = H Analog (107) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OCOR, R⁶ = H Analog (108) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OZ, R⁶ = H Analog (109) R¹ = NH, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (110) R¹ = NH, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (111) R¹ = O, R² = OCOR, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (112) R¹ = O, R² = OZ, R³ = OH, R⁴ = H, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (113) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (114) R¹ = NH, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (115) R¹ = O, R² = OH, R³ = OCOR, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H Analog (116) R¹ = O, R² = OH, R³ = OZ, R⁴ = R, R⁵ = OH, R⁶ = H.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Entzündungen.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Vermehrung von Krebszellen.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Krebszellen unter Krebszellen von Brust, Colon, Niere, Ovarium, Prostata, Zentralnervensystem (ZNS), Lunge, Leukämie und Melanom ausgewählt sind.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Immunantwort eines Tiers.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung einer Caspase.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer neurodegenerativen Störung.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei es sich bei der neurodegenerativen Störung um ALS oder Alzheimer-Krankheit handelt.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Calcineurin-Aktivität.