DE69837915T2

DE69837915T2 - Zusammensetzung aus liganden/lytischen peptiden und ihre verwendung

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Publication number: DE69837915T2
Application number: DE69837915T
Authority: DE
Inventors: Frederick M. Baton Rouge ENRIGHT; Jesse M. Raleigh JAYNES; William Baton Rouge HANSEL; Kenneth L. Baton Rouge KOONCE; Samuel M. Baton Rouge McCANN; Wen H. Baton Rouge YU; Patricia A. Baton Rouge MELROSE; Lane D. Baton Rouge FOIL; Philip H. Baton Rouge ELZER
Original assignee: Louisiana State University
Current assignee: Louisiana State University
Priority date: 1997-03-27
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2018-03-28
Also published as: WO1998042364A1; JP2000514836A; EP0975354A4; DE69837915D1; EP0975354A1; CA2283630C; EP0988048A4; WO1998042365A1; CA2283630A1; ATE364392T1; ES2289775T3; EP0988048A1; EP0975354B1; AU6587998A

Description

Der Vorteil des Anmeldedatums: 27. März 1997 der vorläufigen Anmeldung, Aktenzeichen 60/041,009 und des Anmeldedatums: 3. September 1997 der vorläufigen Anmeldung 60/057,456 wird unter 35 U.S.C. § 119(e) in den Vereinigten Staaten beansprucht und wird unter anwendbaren Verträgen und Übereinkommen außerhalb der Vereinigten Staaten beansprucht. Der Vorteil des Anmeldedatums: 4. Juni 1997 der nicht vorläufigen Anmeldung 08/869,153 in den Vereinigten Staaten wird in den Vereinigten Staaten unter 35 U.S.C. § 120 beansprucht und wird unter anwendbaren Verträgen und Übereinkommen außerhalb der Vereinigten Staaten beansprucht.
TECHNISCHES GEBIET
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Verbindungen spezifisch zur Inhibierung von Zellen, die durch spezifische Ligandeninteraktionen angetrieben werden oder von ihnen abhängig sind. Zu Beispielen gehören Zusammensetzungen zum Inhibieren oder Abtöten maligner und nicht maligner hormonabhängiger Tumoren.
HINTERGRUND DES STANDES DER TECHNIK
Die folgende Besprechung erscheint auf Seite 37: „Spezifische Toxine können mit einem Antikörper oder Hormon verknüpft sein und an eine spezifische Targetzelle (oder Targetzellen) geschleppt werden, die dann vom Toxin abgetötet wird/werden. Der Gedanke zur Entwicklung einer „Wunderwaffe" (magic bullet) wurde seit Jahrzehnten besprochen, gewinnt aber nun erneute Anerkennung als ein potenzielles, hoch selektives Verfahren zur Zerstörung spezifischer Gewebe, während andere Gewebe verschont bleiben. Seit vielen Jahren war es unmöglich, große Mengen an Antikörpern zu entwickeln, die mit nur einer einzigen antigenen Determinanten spezifisch reagieren würden. Mit dem Aufkommen der monoklonalen Antikörper wurde dieses Problem jedoch weitgehend aus dem Weg geräumt. Es können Antikörper gegen spezifische Hormonrezeptoren (wie zum Beispiel den LH-Rezeptor) entwickelt und dann an ein Toxin gekoppelt werden. Alle Zellen mit LH-Rezeptoren sollten dann zerstört werden. Obwohl verschiedene Zelltypen nicht in den Corpora lutea vom Hund charakterisiert wurden, könnte – wenn Zelltypen kommunizieren – die Zerstörung von jedwedem lutealem Zelltyp po tenziell zur Luteolyse führen." (Zitierungen ausgelassen.)
T. Janaky et al., „Short Chain Analogs of Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Containing Cytotoxic Moieties", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, S. 10203–10207 (1992), offenbaren die Verwendung bestimmter Hexapeptid- und Heptapeptid-Analoge von GnRH als Träger für bestimmte alkylierende Stickstoff-Senfe, bestimmte Anthrachinon-Derivate, Antimetabolite und Cisplatin-ähnliche Platin-Komplexe. Die Autoren teilten mit, dass mehrere der Verbindungen cytotoxische Wirkungen auf die Brustkrebs-Zelllinie MCF-7 ausübten.
D. Fitzgerald et al., „Targeted Toxin Therapy for the Treatment of Cancer", J. Natl. Cancer Inst., Vol. 81, S. 1455–1463 (1989), überprüften targetierte Toxintherapien für Krebserkrankungen, einschließlich konjugierender Toxine, wie zum Beispiel das Pseudomonas-Exotoxin, Diphtherietoxin und Ricin gegen ein zellbindendes Protein, wie zum Beispiel einen monoklonalen Antikörper oder einen Wachstumsfaktor. Die Konjugate werden dann in Cytoplasma internalisiert, wo das Toxin die Zellaktivität unterbricht.
Übliche targetierte Toxintherapien weisen mehrere Nachteile auf. Mit einem besonders targetierten Toxin besteht ein kleines Fenster zur Behandlung (in der Größenordnung von zwei Wochen), bevor das Immunsystem des Empfängers eine Antikörper-Antwort gegen das targetierte Toxin herbeiführt. Diese Antikörper neutralisieren das Toxin; oder schlimmer, sie können in der Ablagerung des Toxins in retikuloendothelialen Geweben (z. B. in der Leber, Milz, in den Lymphknoten, Lungen, im Knochenmark) resultieren, wo sie anderweitig gesundes Gewebe schädigen können. Außer diesem Nachteil muss das Toxin, um eine Wirkung zu haben, von der targetierten Zelle internalisiert und in das Cytoplasma transloziert werden.
Ein damit in Bezug stehender Ansatz stellt die Verknüpfung eines monoklonalen Antikörpers mit einem Enzym dar. Dieses Konjugat richtet sich spezifisch an ein Oberflächenantigen von Tumorzellen. Ein Prodrug wird dann an den Patienten verabreicht. Das Prodrug ist im Wesentlichen weniger toxisch als das Arzneimittel, das aus der Aktivie rang des Arzneimittels an der Tumorstelle durch das konjugierte Enzym resultiert. Das aktivierte Arzneimittel greift dann selektiv Tumorzellen an. Siehe z. B. D. Kerr et al., „Regressions and Cures of Melanoms Xenografts following Treatment with Monoclonal Antibody β-Lactamase Conjugates in Combination with Anticancer Prodrugs", Cancer Research, Vol. 55, S. 3558–3563 (1995); und H. Svensson et al., „In Vitro and In Vivo Activities of a Doxorubicin Prodrug in Combination with Monoclonal Antibody β-Lactamase Conjugates", Cancer Research, Vol. 55, S. 2357–2365 (1995).
S. Sealfon et al., „Molecular mechanisms of ligand interaktion with the gonadotropinreleasing hormone receptor", Endocrine Reviews, Vol. 18, S. 180–205 (1997), stellen einen Überblick über die sich auf die Interaktion zwischen GnRH und seinen Rezeptor beziehende Forschung bereit.
F. Hu et al., „Theophylline and Melanocyte-Stimulating Hormone Effects an Gamma-Glutamyl Transpeptidase and DOPA Reactions in Cultured Melanoms Cells", J. Investigative Dermatology, Vol. 79, S. 57–61 (1982) offenbarten, dass sowohl Theophyllin als auch das Melanocyten-stimulierende Hormon (MSH) die Pigmentierung in murinen Melanomzellen, anscheinend mittels verschiedener Mechanismen förderten. J. Murphy et al., „Genetic Construction, Expression, and Melanoms-Selective Cytotoxicity of a Diphtheria Toxin-Related α-Melanocyte-Stimulating Hormone Fusion Peptide", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, S. 8258–8262 (1986), offenbaren eine selektive Aktivität gegen Melanomzellen in vitro durch ein MSH-Diphtherietoxin-Konjugat. Siehe auch D. Bard, „An Improved Imaging Agent for Malignant Melanoms, Based an [Nle⁴, D-Phe⁷]α-Melanocyte Stimulating Hormone", Nucl. Med. Comm., Vol. 16, S. 860–866 (1995).
W. Siegrist et al., „Homologous and Heterologous Regulation of α-Melanocyte-Stimulating Hormone Receptors in Human and Mouse Melanoms Cell Lines", Cancer Research, Vol. 54, S. 2604–2610 (1994), berichten, dass gut etabliert ist, dass humane Melanomzellen spezifische Rezeptoren mit einer hohen Affinität zu α-MSH besitzen. Siehe auch J. Tatro et al., „Melanotropin Receptors Demonstrated In Situ in Human Melanoms", J. Clin. Invest., Vol. 85, S. 1825–1832 (1990).
P. Bachs et al., „Thyrotropin-Releasing Hormone-Diphtheria Toxin-related Polypeptide Conjugates", J. Biol. Chem., Vol. 258, S. 1565–1570 (1983), offenbaren Konjugate des Thyrotropin-Releasing-Hormons (TRH) mit zwei Diphtherie-Toxinen; eines von diesen Konjugaten führte eine 50%ige Inhibition der Proteinsynthese in GH₃-Hypophysenzellen der Ratte in einer Konzentration von 3 × 10^–9 M herbei. Siehe auch P. Bachs et al., „Organ-Specific Binding of a Thyrotropin-Releasing Hormone-Diphtheria Toxin Complex after Intravenous Administration to Rats", Endocrinology, Vol. 113, S. 1072–1076 (1983).
V. Chaudhary, „Activity of a Recombinant Fusion Protein between Transforming Growth Factor Type a and Pseudomonas toxin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84, S. 4538–4542 (1987), offenbart, dass ein Fusionsprotein von einem modifizierten Pseudomonas-Toxin und transformierenden Wachstumsfaktor Typ a selektiv Zellen abtötet, die epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptoren exprimieren. Siehe auch D. Cawley et al., „Epidermal Growth Factor-Toxin A Chain Conjugates: EGF-Ricin Is a Potent Toxin while EGF-Diphtheria Fragment A is Nontoxic", Cell, Vol. 22, S. 563–570 (1980).
E. Vitetta et al., „Redesigning Nature's Poisons to Create Anti-Tumor Reagents", Science, Vol. 238, S. 1098–1104 (1987), überprüfen die Anwendung von Immuntoxinen gegen Tumoren. Anwendungen bei der Verhinderung von Graft-versus-Host-Reaktionen werden auch erwähnt. Die Autoren erwähnten, dass die in vivo-Wirksamkeit weniger als erwünscht war. Zu den erwähnten Schwierigkeiten zählten die Zugänglichkeit von Toxinen im Kreislauf zu Targetzellen, die Instabilität der Verknüpfung von Toxin mit einem Antikörper, die schnelle Clearance der Immuntoxine aus dem Kreislauf über die Leber; die Response des Immunsystems des Empfängers auf das Toxin oder auf den monoklonalen Antikörper, wobei die Langzeittherapie kompliziert wird; möglicher Mangel an Spezifität für neoplastische Erneuerungszellen; Kreuzreaktivität mit normalen Zellen; Heterogenität von Tumorzellen; und Abstoßen von Oberflächenantigenen durch Tumorzellen.
P. Trail et al., „Antigen-specific Activity of Carcinoma-reactive BR64-Doxorubicin Conjugates Evaluated in Vitro and in Human Tumor Xenograft Models", Cancer Research, Vol. 52, S. 5693–5700 (1992), offenbaren die Konjugation des Antikarzinom-Antikörpers BR64 an ein Doxorubicin-Derivat und Besprechung der Antitumorwirkungen des Konjugats.
J. Olson, „Laboratory Evidence for the Hormonal Dependency of Meningiomas", Human Reproduction, Vol. 9, Supp. 1, S. 195–201 (1994), offenbart Hinweise, dass Meningiome, benigne intrakranielle Tumoren, Progesteron-Rezeptoren besitzen.
S. Prigent et al., „The Type 1 (EGFR-Related) Family of Growth Factor Receptors and their Ligands", Progress in Growth Factor Research, Vol. 4, S. 1–24 (1992), überprüfen die Biologie des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), seinen Rezeptor und verwandte Liganden und Rezeptoren (z. B. c-erbB-2, c-erbB-3, TGFα, Amphiregulin, Heregulin) und ihre Rollen bei der normalen Zellproliferation und in der Pathogenese des humanen Krebses. Siehe auch D. Davies et al., „Targeting the Epidermal Growth Factor Receptor for Therapy of Carcinomas", Biochem. Pharm., Vol. 51, S. 1101–1110 (1996).
D. Morbeck et al., „A Receptor Einding Site Identified in the Region 81–95 of the β-Subunit of Human Luteinizing Hormone (LH) and chorionic gonadotropin (hCG)", Molecular and Cellular Endocrinology, Vol. 97, S. 173–181 (1993), offenbarten eine Region von LH und hCG mit fünfzehn Aminosäuren, die als eine Rezeptor-Bindungsstelle wirkte. (LH und hCG stellen homologe Hormone dar, die ähnliche Wirkungen hervorrufen.)
W. Theunis et al., „Luteinizing Hormone, Follicle Stimulating Hormone and Gonadotropin Releasing Hormone Immunoreactivity in Two Insects: Locusta migratoria migratoroides R & F and Sarcophaga bullata (Parker)", Invert. Reprod. and Develop., Vol. 16, S. 111–117 (1989), offenbarten, dass Materialien, die immunologisch mit LH, FSH und GnRH verwandt sind, im Cerebralgewebe von Locusta migratoria und Sarcophaga bullata lokalisiert waren. Siehe auch P. Verhaert et al., „Substances Resembling Peptides of the Vertebrate Gonadotropin System Occur in the Central Nervous System of Periplaneta americana L.", Insect Biochem., Vol. 16, S. 191–197 (1986).
US-Patente Nr. 5,378,688 ; 5,488,036 ; und 5,492,893 offenbaren Verbindungen, von denen gesagt wird, dass sie bei der Induktion von Sterilität in Säugern und bei der Behandlung bestimmter Geschlechtshormon-verwandter Krebserkrankungen bei Säugern nützlich sind. Die offenbarten Verbindungen wurden generisch als GnRH (oder ein GnRH-Analog), konjugiert an ein Toxin, beschrieben. Das Toxin war bevorzugt mit der sechsten Aminosäure des GnRH-Agonisten verknüpft. Bei dem Toxin handelte es sich bevorzugt um eines mit einer Trans lokationsdomäne zur Förderung seiner Aufnahme in eine Zelle. Es wurde erfindungsgemäß zur Kenntnis genommen, dass die Konjugation des GnRH-Agonisten an das Toxin „notwendig ist, weil die vorstehenden Toxine größtenteils im Allgemeinen von selbst nicht fähig sind, mit Zellmembranen zu binden. Das heißt, es wurde von den Anmelderinnen gefunden, dass nur, wenn ein GnRH-Analog des hierin beschriebenen Typs mit einem Toxin des vorstehend angemerkten Typs verknüpft ist, das Toxin zur Bindung an Zellmembranen fähig wird ..." (z. B. Patent-Nr. 5,488,036 , Spalte 7, Zeilen 46–52.) Die spezifisch erwähnten Toxine scheinen alle metabolische Toxine, wie zum Beispiel Ricin, Abrin, Modeccin, verschiedene sich von Pflanzen herleitende Ribosom-inhibierende Proteine, antivirales Kermesbeeren-Protein, α-Amanitin, Diphtherie-Toxin, Pseudomonas-Exotoxin, Shiga-Toxin, Melphalan, Methotrexat, Stickstoff-Senf, Doxorubicin und Daunomycin, gewesen zu sein. Es besteht die Ansicht, dass keines dieser Toxine aufgrund einer direkten Interaktion mit der Zellmembran toxisch ist. In den berichteten in vivo-Experimenten wurde mitgeteilt, dass es sich bei dem wirksamsten zeitlichen Ablauf um wöchentliche Injektionen über 4 Wochen handelte. (Z. B. Patent 5,488,036 , Spalte 20, Zeilen 46–47.) Da es sich bei den meisten der angeführten Konjugate um relativ große Verbindungen handelt, könnte die Antigenität gegebenenfalls ein Problem darstellen, wenn solche mehrfachen Verabreichungen angewendet werden. Das GnRH-Analog war bevorzugt mit einem von mehreren spezifizierten heterobifunktionellen Reagenzien mit dem Toxin verknüpft. Die Spezifikationen deuten darauf hin, dass erhebliche Bemühungen zum Konjugieren des Toxins an den GnRH-Agonisten aufgewendet wurden. Die Toxine müssen, um wirksam zu sein, im Allgemeinen in die Targetzellen internalisiert werden und wirken nicht auf Zellmembranen; außerdem müssen mindestens einige dieser Toxine sekundär aus dem Membran-gebundenen Vesikel in das Cytoplasma transportiert werden, um mit Ribo somen, Mitochondrien oder anderen zellulären Komponenten interagieren zu können.
M. Kovacs et al., „Recovery of pituitary function after treatment with a targeted cytotoxic analog of luteinizing hormone-releasing hormone", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, S. 1420–1425 (1997), offenbart, dass ein an einen LH-RH-Agonisten (d. h. GnRH-Agonisten) konjugiertes Doxorubin-Analog Zellen mit LH-RH-Rezeptoren selektiv angriff und dass seine Wirkung auf Hypophysenzellen reversibel war. Diese wissenschaftliche Arbeit deutet darauf hin, dass das Konjugat gegebenenfalls zur Behandlung von Tumoren mit LH-RH-Rezeptoren angewendet werden könnte. Siehe auch A. Jungwirth et al., „Regression of rat Dunning R-3227-H prostate carcinoma by treatment with targeted cytotoxic analog of luteinizing hormone-releasing hormone AN-207 containing 2-pyrrolinodoxorubicin", Intl. J. Oncol., Vol. 10, S. 877–884 (1997).
R. Moretti et al., „Luteinizing hormone-releasing hormone agonists interfere with the stimulatory actions of epidermal growth factor in human prostatic cancer cell lines, LNCaP and DU 145", J. Clan. Endocrin. & Metab., Vol. 81, S. 3930–3937 (1996), offenbaren, dass LH-Releasing-Hormon-Agonisten sowohl Androgen-abhängige (LNCaP) als auch Androgen-unabhängige (DU 145) humane Prostatakarzinom-Zelllinien inhibieren und deuten darauf hin, dass die Agonisten die Proliferation der Tumorzellen durch Interferenz mit den stimulatorischen Wirkungen des epidermalen Wachstumsfaktors inhibieren können.
I. Mezô et al., „Synthesis of GnRH analogs having direct antitumor and low LH-releasing activity", J. Med. Chem., Vol. 40, S. 3353–3358 (1997), offenbaren GnRH-I-Agonisten und -Antagonisten vom Huhn. Es wurde mitgeteilt, dass der Agonist MI-1892 eine geringe endokrinologische Aktivität aufweist, aber eine Antitumor-Aktivität besitzt.
A. Nechushtan et al., „Adenocarcinoma cells are targeted by the new GnRH-PE₆₆ chimeric toxin through specific gonadotropin-releasing hormone binding sites", J. Biol. Chem., Vol. 272, S. 11597–11603 (1997), offenbaren zur Abtötung bestimmter Krebszelltypen die Anwendung eines an GnRH gekoppelten Pseudomonas-Exotoxins.
X. Zhu, "Steroid-independent activation of androgen receptor in androgen-independent prostate cancer. A possible role for the MAP kinase signal transduction pathway?" Mol. & Cell. Endocrinol., Vol. 134, S. 9–14 (1997), offenbart, dass Androgen-Rezeptoren beim Prostatakarzinom in Abwesenheit des Androgen-Signals aktiviert werden konnten.
G. Emons et al., „Growth-inhibitory actions of analogues of luteinizing hormone releasing hormone an tumor cells", Trends in Endocrin. Metab., Vol. 8, S. 355–362 (1997), überprüfen die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen GnRH-Rezeptoren von Krebszellen und von normalen Hirn- und Hypophysenzellen; und weisen darauf hin, dass LHRH-Analoge mit der mitogenen Signaltransduktion der Wachstumsfaktor-Rezeptoren und verwandten Onkogenprodukten, die mit der Tyrosinkinase-Aktivität in einer Anzahl maligner humaner Tumoren, einschließlich Brust-, Ovarial-, Endometrium- und Prostata-Karzinomen, assoziiert werden, interferieren.
D. Tang et al., „Target to Apoptosis: A Hopeful Weapon for Prostate Cancer", The Prostate, Vol. 32, S. 284–293 (1997), stellen eine Übersicht über die Forschung zur Apoptose als eine Route zur Behandlung von Prostata-Karzinomen bereit.
A. Goustin et al., „Growth Factors and Cancer", Cancer Research, Vol. 46, S. 1015–1029 (1986), stellen eine Übersicht über verschiedene Wachstumsfaktoren bereit, die mit verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert wurden.
S. Cho et al., „Evidence for autocrine inhibition of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) gene transcription by GnRH in hypothalamic GT1-1 neuronal cells", Mol. Brain Res., Vol. 50, S. 51–58 (1997), offenbaren, dass neuroendokrine Populationen von GnRH-Neuronen Rezeptoren mit hoher Affinität zu GnRH und zu GnRH-Analogen aufweisen.
S. Sower et al., „Primary structure and biological activity of a third gonadotropin-releasing hormone from lamprey brain", Endocrinology, Vol. 132, S. 1125–1131 (1993), beschreiben die Struktur von GnRH-III von Lampreten.
E. Stopa et al., „Immunocytochemical evidence for a lamprey-like gonadotropin-releasing hormone in human brain", Soc. Neurosci. Abstr., Abstract Nr. 437.8, S. 1577 (1987), offenbaren dass ein Lampreten-ähnliches GnRH-III in Menschen gefunden wird.
S. White et al., „Three gonadotropin-releasing hormone genes in one organism suggest novel roles for an ancient peptide", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, S. 8363–8367 (1995); und J. Powell et al., „Three forms of gonadotropin-releasing hormone characterized from brains of one species", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, S. 12081–12085 (1994), stellen Beispiele wissenschaftlicher Arbeiten dar, die über die typische Anwesenheit von drei GnRH-Formen in Vertebraten-Spezies berichten.
J. Warnock et al., „Anxiety and mood disorders associated with gonadotropin-releasing hormone agonist therapy", Psychopharmacology Bull., Vol. 33, S. 311–316 (1997), berichten, dass die chronische Behandlung mit GnRH-Agonisten von psychologischen Nebenwirkungen begleitet sein kann.
L. Deligdisch et al., „Pathological changes in gonadotropin releasing hormone agonist analogue treated uterine leiomyomata", Fertility and Sterility, Vol. 67, S. 837–841, berichteten über die mit der Behandlung von Leiomyomata mit einem GnRH-Analog zur Induktion der iatrogenen Menopause assoziierten pathologischen Veränderungen.
J. Fuerst et al., „Effect of active immunization against luteinizing hormone-releasing hormone an the androgen-sensitive Dunning R3327-PAP and Androgen-Independent Dunning R3327-AT2.1 prostate cancer sublines", Prostate, Vol. 32, S. 77–84 (1997), berichteten, dass die aktive Immunisierung von Ratten mit einem LHRH-Diphtherie-Toxoid-Konjugat eine Atrophie der Hoden, Prostata und Androgen-empfindlicher Prostatatumoren hervorrief, wobei die Inhibition der Tumoren durch die Suppression der Zellteilung anstelle einer Steigerung des Zelltods herbeigeführt wurde; und dass die Volumenzunahme der Androgen-unabhängigen Prostatatumoren geringgradig reduziert war.
C. Mantzoros et al., „Insulin-like growth factor 1 in relation to prostate cancer and benign prostatic hyperplasia", Br. J. Cancer, Vol. 76, S. 1115–1118 (1997), berichteten, dass erhöhte Spiegel des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors 1 mit einem erhöhten Risiko für ein Prostatakarzinom assoziiert waren.
V. Ding, „Sex hormone-binding globulin mediates prostate androgen receptor action via a novel signaling pathway", Endocrinology, Vol. 139, S. 213–218 (1998), berichteten, dass Androgen-unabhängige Pfade die Progression einiger Prostatakarzinome aktivieren können.
J. King et al., „Evolution of gonadotropin-releasing hormones", Trends in Endocrin. Metab., Vol. 3, S. 339–344 (1992) offenbaren die Primärstrukturen verschiedener GnRH von verschiedenen Vertebraten. Siehe auch J. King et al., „Structure of chicken hypothalamic luteinizing hormone-releasing hormone. II. Isolation and characterization", J. Biol. Chem., Vol. 257, S. 10729–10732 (1982).
N. Mores et al., „Activation of LH receptors expressed in GnRH neurons stimulates cyclic AMP production and inhibits pulsatile neuropeptide release", Endocrinology, Vol. 137, S. 5731–5734 (1996), offenbaren, dass LH direkt auf neuroendokrine Neuronen im Hirn wirkt. Siehe auch Z. Lei et al., „Signaling and transacting factors in the transcriptional inhibition of gonadotropin releasing hormone gene by human chorionic gonadotropin in immortalized hypothalamic GT1-7 neurons", Mol. & Cell. Endocrinology, Vol. 109, S. 151–157 (1995).
Die US-Patente 5,597,945 und 5,597,946 offenbaren Pflanzen, die mit für verschiedene lytische Peptide codierenden Genen transformiert sind.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wurde unerwartet entdeckt, dass amphipathische lytische Peptide auf ideale Weise zur Verwendung in einer Liganden-/Cytotoxin-Kombination zur spezifischen Inhibition abnormer oder normaler Zellen geeignet sind, die zum Beispiel zum Angriff auf Tu morzellen, durch eine spezifische Liganden-Interaktion angetrieben werden oder von einer solchen abhängig sind. Die Peptide wirken direkt auf Zellmembranen und brauchen nicht internalisiert zu werden.
Die Verabreichung einer Kombination aus einem Liganden und einem Membran-aktiven lytischen Peptid in vivo tötet Zellen mit einem Rezeptor für den Liganden ab. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen sind relativ klein und verhalten sich nicht antigen. (Es ist bekannt, dass lytische Peptide nicht sehr antigen sind; und die Liganden sich überhaupt nicht antigen verhalten.) Die Verbindungen können in einer Einzeldosis, oder in zwei oder mehr Dosen dicht aufeinander verabreicht werden.
Die Lyse von Tumorzellen erfolgt schnell. Die beiden Komponenten – der Ligand und das lytische Peptid – können optional als ein Fusionspeptid verabreicht werden, oder sie können getrennt verabreicht werden, wobei der Ligand etwas vor dem lytischen Peptid verabreicht wird, um Zellen mit Rezeptoren für den Liganden zu aktivieren und diese Zellen dadurch für die Lyse durch das lytische Peptid suszeptibel zu machen. Wenn ein Fusionspeptid verwendet wird, wurde unerwartet entdeckt, dass ein Verknüpfungsteil zur Verbindung des Liganden mit dem lytischen Peptid nicht notwendig ist: eines kann, ohne die Notwendigkeit für irgendeine intervenierende Verknüpfung, direkt an das andere gebunden werden; die Bindung kann durch Bindung des einen Endes des Liganden an ein Ende des Peptids oder durch Bindung an die Mitte von einem der beiden durchgeführt werden. Das Toxin, das lytische Peptid, benötigt keine Translokationsdomäne und braucht nicht internalisiert zu werden, da es zur Herbeiführung der Lyse direkt an die aktivierte Zellmembran bindet und darauf einwirkt. Der Ligand kann eine vollkommen native Verbindung darstellen oder kann anstatt dessen die Bindungsdomäne allein darstellen, wobei Letzteres bevorzugt ist, wenn der vollständige Ligand relativ groß ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind zur Anwendung in der Gentherapie zur Behandlung maligner oder nicht maligner Tumoren und anderer Erkrankungen, die durch Klone oder Populationen „normaler" Wirtszellen, die spezifische Rezeptoren (wie zum Beispiel Lymphozyten) tragen, geeignet sind, weil Gene, die für ein lytisches Peptid codieren oder für eine Fusion von lytischem Peptid/Peptid-Hormon codieren, ohne weiteres in hämatopoetische Stammzellen oder myeloide Vorläuferzellen insertiert werden können.
AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Mehrere Krebszellen (im Uterus, Endometrium, in der Prostata, in den Hoden und im Ovar) exprimieren LH- oder hCG-Rezeptoren. Tao et al., „Expression of Luteinizing Hormone/Human Chorionic Gonadotropin Receptor Gene in Benign Prostatic Hyperplasia and in Prostatic Carcinoma in Humans", Biol. Reprod., Vol. 56, S. 67–72 (1997). Konjugate eines lytischen Peptids und LH oder ein Anteil des LH-Moleküls können folglich zur selektiven Zerstörung dieser Zellen verwendet werden. So sind zum Beispiel die Gene bekannt, die für solche Hormone, wie zum Beispiel FSH, TRH und LH codieren und können mit einer DNA-Sequenz verknüpft werden, die für ein lytisches Peptid zur Herstellung eines sezernierten Fusionspeptids codiert, alles unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, wie zum Beispiel die in der akuten Phase ansprechenden Promotoren, die in der US-Patentanmeldung, Aktenzeichen 08/474,678 , angemeldet am 7. Juni 1995 und in der PCT-Anmeldung WO 95/01095 , veröffentlicht am 12. Januar 1995, offenbart sind. Eine Bindungsstelle von einem Hormon kann anstelle des vollständigen Hormons, zum Beispiel der Bindungsstelle von LH und hCG mit 15 Aminosäuren, verwendet werden. Siehe D. Morbeck et al., „A Receptor Einding Site Identified in the Region 81–95 of the β-Subunit of Human Luteinizing Hormone (LH) and chorionic gonadotropin (hCG)", Molecular and Cellular Endocrinology, Vol. 97, S. 173–181 (1993).
Einen hochwirksamen Vektor, der für die Transformation von in der Gentherapie zu verwendenden Zellen geeignet ist, stellt der in US 5,719,055 offenbarte Transposonbasierte Vektor dar.
Es ist bekannt, dass die D-Aminosäureform von GnRH an gonadotrope Zellen in der Hypophyse, an GnRH-Neuronen im Hirn und an verschiedene Krebszellarten bindet. Es ist auch bekannt, dass die D-Aminosäureformen von lytischen Peptiden im Wesentlichen die gleiche Neigung zur Lyse von Zellmembranen aufweisen wie die L-Aminosäureformen. Erfindungsgemäße Verbindungen (ob als Fusionspeptid oder getrennt verabreicht) können deshalb entweder in der L-Form oder der D-Form verabreicht werden. Obwohl Peptide der D-Form im Allgemeinen teurer sind als die L-Form, weisen sie den Vorteil auf, dass sie durch normale enzymatische Prozesse nicht abgebaut werden, so dass die Peptide der D-Form folglich oral verabreicht werden können und im Allgemeinen eine längere biologische Halbwertzeit aufweisen. Die orale Verabreichung des Peptids der D-Form kann durch Verknüpfung des Peptid-/Hormon-Fusionsprodukts an einen geeigneten Träger zur Förderung der Aufnahme durch den Darm, wie zum Beispiel Vitamin B₁₂, im Allgemeinen im Anschluss an das B₁₂-Konjugationsverfahren von G. Russell-Jones et al., „Synthesis of LHRH Antagonists Suitable for Oral Administration via the Vitamin 1312 Uptake System", Bioconjugate Chem., Vol. 6, S. 34–42 (1995), verbessert werden.
GnRH- oder GnRH-Analoge (kollektiv „GnRH-Agonisten") können erfindungsgemäß verwendet werden. Es wurde berichtet, dass Substitutionen an den 6- und 10-Stellungen des GnRH-Decapeptids „Superagonisten" mit einer größeren Bindungsaffinität zum GnRH-Rezeptor als das GnRH selbst produzieren können. Diese „Superagonisten" schließen Goserelin, Leuprolid, Buserelin und Nafarelin ein. Siehe US-Patent 5,488,036 .
Ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass ein Mechanismus (obwohl nicht der ausschließliche Mechanism) der Sterilisation/Langzeitkontrazeption wie folgt zugrunde liegt: GnRH aktiviert gonadotrope Zellen in der Hypophyse ebenso wie neuroendokrine GnRH-Neuronen im Hirn. Die aktivierten Zellen weisen im Wesentlichen eine erhöhte Suszeptibilität zur Lyse durch ein lytisches Peptid auf. Das lytische Peptid zerstört dann präferenziell diese aktivierten Zellen (oder schädigt sie schwerwiegend). Wenn die gonadotropen Zellen in der Hypophyse zerstört sind und an GnRH aus dem Hirn verarmt sind, sezerniert die Hypophyse kein Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) oder luteinisierendes Hormon (LH) mehr, wobei das Tier temporär oder permanent steril gemacht wird.
Obwohl der Ligand und das lytische Peptid getrennt verabreicht werden können, wird bevorzugt, die beiden zu einem einzelnen Molekül zu verknüpfen, weil eine derartige Verknüpfung weitgehend die wirksame Konzentration des lytischen Peptids in der Umgebung von Liganden-aktivierten Zellen erhöht. Überdies kann diese Erhöhung der wirksamen lytischen Peptid-Konzentration die Notwendigkeit zur Aktivierung der Zellen umgehen, wobei dem Peptid erlaubt wird, mit einer Bindungsstelle von einem Liganden allein verknüpft zu werden, ohne dass „der Rest" eines nativen Liganden, der in der Regel zur Aktivierung der Targetzellen benötigt würde, eingeschlossen werden muss. Diese Verknüpfung kann in einer der folgenden beiden Reihenfolgen erfolgen: zum Beispiel als GnRH/Peptid oder Peptid/GnRH. Modifiziertes GnRH/Hecate (SEQ ID NO:3) und Hecate/modifiziertes GnRH (SEQ ID NO:4) stellen Beispiele dar. Man sollte beachten, dass kein intermediärer Linker notwendig ist und dass der Carboxy-Terminus von einem der beiden Peptide direkt an den Amino-Terminus des anderen gebunden werden kann. (Es wurde gefunden, dass der initiale Pyroglutaminsäurerest von GnRH oder der GnRH-Anteil eines Fusionspeptids durch Glutamin substituiert werden kann, ohne die Aktivität der entsprechenden Peptide im Wesentlichen zu ändern. Siehe z. B. SEQ ID NO: 9, 3 und 4.)
Experimentelle Ergebnisse
Beispiele 1–6
Die Hypophyse von einer adulten weiblichen Ratte wurde entnommen und in sechs Stücke von ca. gleicher Größe aufgeteilt. Jeweils ein Stück wurde in jede der sechs Wells mit Gewebekulturmedium bei 37°C gegeben. Jede Well wurde wie nachstehend beschrieben einer unterschiedlichen Behandlung unterzogen. Zehn Stunden nach der Behandlung wurde das Gewebe aus jedem Well fixiert und die Histologie von jedem mikroskopisch untersucht.
Behandlung 1 wendete Gewebekulturmedium allein als Kontrolle an. Die Histologie dieses Gewebes nach der Behandlung schien normal zu sein.
Behandlung 2 stellte eine Applikation von 5 Nanogramm GnRH (SEQ ID NO:1) pro ml Medium dar. Die Histologie dieses Gewebes nach der Behandlung war normal; es wurde ein kleiner Grad zellulärer Vakuolisierung bemerkt. Zum Vergleich variiert die Konzentration von GnRH während der LH-Gipfel-Phase des Estruszyklus in normalen, unbehandelten Ratten von so niedrig wie 1 ng/ml bis so hoch wie 20 ng/ml.
Behandlung 3 stellte eine Applikation von 50 μM des lytischen Peptid-Hecates (SEQ ID NO:2) im Medium dar. Die Histologie dieses Gewebes nach der Behandlung schien normal zu sein.
Behandlung 4 stellte eine initiale Applikation von 5 Nanogramm GnRH pro ml Medium für 15 Minuten dar. Nach dieser Inkubation wurde das GnHR enthaltende Medium entfernt, und das Gewebe wurde einmal mit einfachem Medium gewaschen. Dieses Medium wurde dann entfernt und wurde durch Medium, enthaltend 50 μM des lytischen Peptid-Hecates, ersetzt. Nach dieser Behandlung wurde eine ausgedehnte basophile (gonadotrope) zelluläre Zerstörung beobachtet.
Behandlung 5 stellte eine Applikation von 50 μM des mit Fusionspeptid modifizierten GnRH/Hecates (SEQ ID NO:3) dar. Nach der Behandlung wurde eine ausgedehnte basophile (gonadotrope) Zerstörung der Zellen beobachtet.
Treatment 6 stellte eine initiale Applikation des Fusionspeptids GnRH/Hecate (SEQ ID NO:3), gefolgt von einer zweiten Applikation des Fusionspeptids GnRH/Hecate zwei Stunden später dar. Nach der Behandlung war das Gewebe nahezu zerstört, indem nur Stromazellen zurückblieben.
Beispiel 7
Zwei sexuell immaturen weiblichen Ratten vom gleichen Wurf (33 Tage alt) wurden im Abstand von 24 Stunden zwei intravenöse Injektionen mit Kochsalz-Kontrolllösung gegeben. Nachdem die Ratten das Brutalter erreicht hatten, wurden sie 105 Tage nach der Inokulation untersucht. Die äußeren Genitalien schienen normal zu sein. Während einer 14-tägigen Überwachungsdauer, 107 Tage bis 121 Tage nach der Inokulation, durchlief jede der Kontrollratten mindestens zwei Estruszyklen. Die Ratten wurden dann geopfert und nekropsiert. Die Reproduktionsorgane schienen histologisch normal zu sein.
Beispiel 8
Zwei sexuell immaturen weiblichen Ratten aus dem gleichen Wurf wie die von Beispiel 7 (33 Tage alt) wurden im Abstand von 24 Stunden zwei intravenöse Injektionen von 500 μg GnRH/Hecate-Fusionspeptid in Kochsalzlösung gegeben. Nachdem die Ratten das Brutalter erreicht hatten, wurden sie 105 Tage nach der Inokulation untersucht. Die äußeren Genitalien sahen klein aus. Im Gegensatz zu den Kontrollratten war das Einführen eines Baumwollstäbchens in die Vagina schwierig. Während einer 14-tägigen Überwachungsdauer 107 Tage bis 121 Tage nach der Inokulation wies keine der behandelten Ratten einen Estrus oder Metestrus auf. Die Ratten wurden dann geopfert und nekropsiert. Die mit Peptid-behandelten Ratten wiesen ein ausgedünntes, inaktives Uterus- und Eileiterepithel auf. Ihre Ovare enthielten keine großen Follikel und wiesen eine hohe Anzahl an atretischen Follikeln (d. h. an anovulatorischen Follikeln) auf.
Beispiele 9–14
Achtzehn sexuell mature weibliche Ratten aus gemischter Zucht wurden nach dem Zufallsprinzip einer von sechs Gruppen, die jeweils drei Ratten enthielten, zugeteilt. Jede Rattengruppe erhielt, wie nachstehend beschrieben, eine intravenöse Doppelbehandlung. Zwei Wochen nach der Behandlung wurden die Ratten geopfert und nekropsiert. Von den reproduktiven und endokrinen Organen wurden Schnitte angefertigt, die gewogen und histologisch untersucht wurden.
Behandlung 9 stellte eine Kochsalz-Kontrolllösung dar. Die Ratten in dieser Gruppe wiesen eine normale Ovarialfunktion (z. B. normale Follikel und neue Corpora lutea) auf. Die Hypophysen aus dieser Gruppe waren von normaler Größe. Die Histologie zeigte eine normale Anzahl an basophilen Zellen aus der Hypophyse.
Behandlung 10 stellte eine Injektion mit insgesamt 1,0 mg GnRH/Hecate-Fusionspeptid in Kochsalzlösung dar, die im Abstand von 24 Stunden, aufgeteilt in zwei gleiche Injektionen von 0,5 mg, verabreicht wurden. Die Ratten in dieser Gruppe zeigten einen Stillstand der normalen ovariellen Follikelentwicklung. Es lagen wenige Corpora lutea vor, und die, die anwesend waren, sahen alt aus. Die Follikel waren groß und waren nicht gesprungen. Die uterine Morphologie war mit der hormonellen Inaktivität konsistent. Die Hypophysen aus dieser Gruppe waren geringgradig kleiner als die Hypophysen aus der Kochsalz-Kontrollgruppe. Die Histologie ließ im Vergleich zu den Kontrollen eine 60%ige bis 70%ige Reduktion der Zahl der basophilen Zellen in der Hypophyse erkennen.
Behandlung 11 stellte eine Injektion mit 100 μl einer 1,35 mM Lösung von GnRH (162 μg) in Kochsalzlösung dar, gefolgt von einer Injektion mit 100 μl einer 1,35 mM Hecate-Lösung (337 μg) in Kochsalzlösung 15 Minuten später. Die gleiche aus zwei Schritten bestehende Behandlung wurde 24 Stunden später wiederholt. Die Ratten in dieser Gruppe wiesen eine veränderte Ovarialhistologie auf. Es waren wenige Corpora lutea anwesend, und diejenigen, die anwesend waren, sahen alt aus. Die Follikel waren groß, und waren nicht gesprungen. Die uterine Morphologie war mit der hormonellen Inaktivität konsistent. Die Hypophysen und die Hypophysenhistologie waren ähnlich denen, die in Behandlung 10 beobachtet wurden.
Behandlung 12 stellte die Injektion von 100 μl einer 1,35 mM Hecate-Lösung (337 μg) in Kochsalzlösung dar. Die Behandlung wurde nach 24 Stunden wiederholt. Die Ratten in dieser Gruppe wiesen eine normale Ovarialfunktion (z. B. normale Follikel und neue Corpora lutea) auf. Die Hypophysen und die Hypophysenhistologie waren ähnlich denen, die in Behandlung 9 beobachtet wurden.
Behandlung 13 stellte die Injektion von 100 μl einer 1,35 mM Lösung von GnRH (162 μg) in Kochsalzlösung dar. Die Behandlung wurde nach 24 Stunden wiederholt. Die Ratten in dieser Gruppe wiesen eine normale Ovarialfunktion (z. B. normale Follikel und neue Corpora lutea) auf. Die Hypophysen und die Hypophysenhistologie waren denen ähnlich, die in Behandlung 9 beobachtet wurden.
Behandlung 14 war mit Behandlung 10 identisch, außer dass das GnRH/Hecate-Fusionspeptid anhand der HPLC weiter gereinigt wurde. Die Ratten in dieser Gruppe zeigten einen Stillstand der normalen ovariellen Follikelentwicklung. Es lagen wenige Cor pora lutea vor und die anwesend waren, sahen alt aus. Die Follikel waren groß und waren nicht gesprungen. Die uterine Morphologie war mit der hormonellen Inaktivität konsistent. Die Hypophysen und die Hypophysenhistologie waren denen ähnlich, die in der Behandlung 10 beobachtet wurden.
Diese Experimente wiesen nach, dass GnRH und das lytische Peptid entweder getrennt oder als ein Fusionspeptid verabreicht werden kann, obwohl das Fusionspeptid bevorzugt ist, da erwartet wird, dass es bei niedrigeren Dosen aktiver ist.
Obwohl Experimente zur Bestimmung der optimalen Dosierungen zum Zeitpunkt des Einreichens dieser Anmeldung nicht durchgeführt worden waren, kann ein Durchschnittsfachmann, dem die Lehren der vorliegenden Beschreibung gegeben werden, ohne weiteres die optimalen Dosierungen anhand von Routinetests ermitteln.
Obwohl die Experimente bisher an weiblichen Tieren durchgeführt wurden, werden für männliche Tiere ähnliche Ergebnisse erwartet, weil GnRH den Hypophysenzellen signalisiert, sowohl in Männchen als auch Weibchen, Gonadotropine freizusetzen.
Die Gewebs- und Zellspezifität von cytotoxischen Konjugaten kann weiter durch Verwendung verschiedener an ein lytisches Peptid gekoppelter Hormone oder Hormonanaloge gefördert werden. Einige erläuternde Beispiele folgen. Zur Fertilitätskontrolle werden sowohl die hypophysäre als auch die zentralnervöse neuronale GnRH-Komponente der Reproduktionsachse durch das GnRH-Hecate-Konjugat selektiv geschädigt. Wenige Zellen im Zentralnervensystem sollten durch diese Behandlung geschädigt werden, weil die Huhn-II-GnRH- und Lampreten-III-GnRH-Formen die primären Moleküle darstellen, die sich in den meisten Säugern auf die Hirnfunktionen auswirken. Die Fertilitätskontrolle kann auch selektiv durch Behandlung von Tieren mit einem bLH-Hecate-Konjugat erreicht werden; diese Verbindung sollte sich spezifisch auf die GnRH-Neuronen auswirken, welche die Reproduktion und die Gonaden kontrollieren. Zum Targetieren von Prostata-, Brust-, Ovarial- oder Endometriumkrebszellen könnte das 1-LHRH-III-Hecate-Konjugat verwendet werden, da es an Rezeptoren auf Krebszellen bindet und keine signifikante bekannte Wirkung auf das Hirn aufweist. (Andere lytische Peptide können in diesen Konjugaten anstelle von Hecate verwendet werden.)
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können wie beschrieben oder als pharmazeutisch verträgliche Salze verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können intravenös, subkutan, intramuskulär oder oral (insbesondere in der D-Aminosäureform, bevorzugt komplexiert mit einem Träger, wie z. B. Vitamin B₁₂) verabreicht werden.
Beispiele 15–22
Acht sexuell mature weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip einer von acht Behandlungen zugeteilt. Jede Ratten-Gruppe erhielt, wie nachstehend beschrieben, eine einzelne intravenöse Behandlung. Die Ratten wurden entweder 48 oder 96 Stunden nach der Behandlung geopfert und nekropsiert. Die Ovare, der Uterus, der Pankreas, die Leber, die Milz, die Lungen, das Herz, die Schilddrüse und die Nebennieren wurden in 10 % gepuffertem Formalin fixiert; es wurden Schnitte angefertigt; und mit der H&E-Färbung (Hämatoxylin-Eosin-Färbung) gefärbt; mit Ausnahme der Hypophysen, die mittels PAS-Färbung (Periodsäure-Schiff-Färbung) mit keiner Gegenfärbung gefärbt wurden. Die Behandlungen wurden dergestalt ausgewählt, dass jedes Tier eine äquimolare Menge der Verbindung, mit der es behandelt wurde, erhielt.
Behandlungen 15 und 16 stellten i.v.-Injektionen mit 674 μg D-Hecate in 200 μl Kochsalzlösung (1,35 mM) dar. Die Ratte in der Behandlung 15 wurde 48 Stunden nach der Injektion geopfert, und die Ratte in der Behandlung 16 wurde 96 Stunden nach der Injektion geopfert. In keinem der beiden Tiere wurden makroskopische Läsionen bemerkt. Die Hypophysen von beiden Ratten enthielten eine normale Anzahl PAS-positiver Zellen.
Behandlungen 17 und 18 stellten i.v.-Injektionen mit 334 μg GnRH in 200 μl Kochsalzlösung (1,35 mM) dar. Die Ratte in der Behandlung 17 wurde 48 Stunden nach der Injektion geopfert, und die Ratte in der Behandlung 18 wurde 96 Stunden nach der Injektion geopfert. In keinem der beiden Tiere wurden in den Organen makroskopische Läsionen bemerkt. Die Hypophysen von beiden Ratten enthielten eine normale Anzahl PAS-positiver Zellen.
Behandlungen 19–22 stellten i.v.-Injektionen mit 1 mg GnRH-Hecate-Fusionspeptid (SEQ ID NO:3) in 100 μl Kochsalzlösung (2,7 mM) dar. Die Ratten in Behandlungen 19 und 20 wurden 48 Stunden nach der Injektion geopfert, und die Ratten in den Behandlungen 21 und 22 wurden 96 Stunden nach der Injektion geopfert. In den Organen von jedem der vier Tiere wurden mit Ausnahme in der Hypophyse keine makroskopischen Läsionen bemerkt. Die Hypophysen der Tiere von den Behandlungen 19 und 20 waren geringgradig vergrößert, hyperämisch und ödematös. Die Hypophysen der Tiere von Behandlungen 21 und 22 waren geringgradig hyperämisch, aber von erwarteter Größe. Die Hypophysen von allen vier Ratten zeigten eine deutliche Verarmung an PAS-positiven Zellen; es wurde geschätzt, dass die Verarmung, im Vergleich zu der der Kontrollgruppen, 80 bis 90 % betrug. (Die PAS-Färbung färbt bevorzugt Glycopeptide. LH, FSH, TSH und MSH stellen Glycopeptid-Hormone dar; Zellen, die diese Hormone in ihren sekretorischen Vakuolen gespeichert enthalten, ergeben eine positive Färbung mit PAS.)
Es wurde folglich gesehen, dass die GnRH-lytische Peptid-Kombination morphologische und funktionelle Veränderungen im Reproduktionssystem von adulten weiblichen Ratten herbeiführte, und in präpupertären weiblichen Ratten die sexuelle Maturität verhinderte, dass aber das Fusionspeptid selektiv eine spezifische Population PAS-positiv färbender Zellen in der Hypophyse eliminierte.
Beispiel 23
Hecate stellt ein amphipathisches lytisches Peptid dar, das auf Zellmembranen wirkt, ohne internalisiert zu werden. Es stellt ein synthetisches Peptidanalog von Melittin, dem primären Toxin im Gift der Honigbiene, dar. Es wird angenommen, dass Hecate durch Disruption der Zellmembranen wirkt. Die Struktur des in diesen Studien verwendeten modifizierten GnRH-Hecate-Konjugats stellte SEQ ID NO:3 dar.
Wir synthetisierten auch D-Lys⁶GnRH (SEQ ID NO:13), damit Hecate an das D-Lys⁶ konjugiert werden konnte, eine Position, die die Interferenz mit der Bindung der GnRH-Domäne an den GnRH-Rezeptor minimieren konnte. Diese synthetischen Peptide verdrängten spezifisch radiomarkiertes monoiodiertes GnRH aus den Membranen der Hypophyse von Ratten. Die Verdrängumg durch D-Lys⁶GnRH-Hecate war vergleichbar mit der (und faktisch geringgradig größer als die) Verdrängung durch native Säuger-GnRH, wie anhand der Radioaktivität in cpm (Impulse/min) gemessen wurde. Wenn die GnRH- und GnRH-Hecate-Bindung auf einer molaren Basis über einen Konzentrationsbereich über das 1000fache (n = 6) verglichen wurde, verdrängte das GnRH-Hecate spezifisch das radiomarkierte Peptid in einem Ausmaß gleich 123 % ± 4 % bezogen auf die Bindung, die durch äquimolare Konzentrationen von GnRH aufgewiesen wurde; äquimolare Konzentrationen von D-Lys⁶GnRH verdrängten 187 % ± 8 % der cpm, die durch natives GnRH verdrängt wurden.
Beispiele 24–31
Es wurde die in vitro-Lyse boviner lutealer Zellen mit GnRH-Hecate-Konjugat und mit Hecate-bLH-Konjugat (SEQ ID NO:12) untersucht. (Die bLH-Komponente des Konjugats stellt ein 15mer-Fragment der β-Kette des luteinisierenden Hormons (SEQ ID NO:11) dar. Kleine luteale Zellen wurden nach dem Schlachten aus den Corpora lutea von Vieh gesammelt. Kleine luteale Zellen sind reich an LH-Rezeptoren, und es wurde gefunden, dass sie für die Lyse durch das Hecate-bLH-Konjugat hoch suszeptibel sind.
Kleine luteale Zellen in Kultur wurden 22 Stunden mit einer der folgenden Behandlungen inkubiert und wurden dann unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses und Freisetzung der Milchsäuredehydrogenase auf Viabilität untersucht.
Behandlung 24 – Kontrolle: keine zusätzliche Behandlung (Medium allein)
Behandlung 25 – 10 ng bLH (positive Kontrolle)
Behandlung 26 – Hecate-bLH, 10 μM
Behandlung 27 – Hecate-bLH, 5 μM
Behandlung 28 – Hecate-bLH, 1 μM
Behandlung 29 – Hecate (allein), 10 μM
Behandlung 30 – Hecate (allein), 5 μM
Behandlung 31 – Hecate (allein), 1 μM
Nach 22-stündiger Inkubation mit 10 μM Hecate allein wurde ein signifikantes Abtöten der kleinen lutealen Zellen und mit 5 μM Hecate allein (eine ca. 50%ige Abtötung) beobachtet. Der Zelltod für 1 μM Hecate allein unterschied sich nicht signifikant von der negativen Kontrolle (Medium) oder von bLH allein. Alle drei Behandlungsdosen mit Hecat-bLH riefen im Vergleich zur Behandlung mit Hecate allein signifikante Zunahmen des Zelltods hervor. Das Hecate-bLH-Konjugat tötete ca. die zweifache Anzahl der Zellen ab, wie sie in den gleichen Konzentrationen durch Hecate allein abgetötet wurden.
Die beobachteten Spiegel der Milchsäuredehydrogenase-Aktivität wies auch nach, dass die Hecate-bLH-Behandlung eine signifikant größere Anzahl an Zellen abtötete als Hecate allein.
Beispiele 32–33
Wir untersuchten auch die in vitro-Lyse der bovinen Granulosazellen mit GnRH-Hecate-Konjugat und mit Hecate-bLH-Konjugat. Granulosazellen wurden aus bovinen präovulatorischen Follikeln isoliert. (Granulosazellen stellen hormonell aktive Zellen mit zahlreichen LH-Rezeptoren dar.) Die Experimente mit Granulosazellen waren anderweitig im Allgemeinen ähnlich denen, die vorstehend für Beispiele 24–31 beschrieben wurden. Diese Experimente wiesen (1) nach, dass die Granulosazellen viel suszeptibler für die Abtötung durch Hecate allein als die kleinen Lutealzellen waren, und (2) dass, wie dies mit den kleinen Lutealzellen der Fall gewesen ist, die Granulosazellen, selbst in der niedrigsten Konzentration (1 μM), signifikant suszeptibler für Hecate-bLH waren, als sie mit Hecate allein waren. Bei 1 μM tötete das Hecate-bLH-Konjugat ca. zweimal so viele Targetzellen wie Hecate allein ab. Wiederum waren die Spiegel der freigesetzten Milchsäuredehydrogenase nach der Behandlung mit 1 μM Hecate bLH signifikant höher als die Spiegel des freigesetzten Enzyms nach der Behandlung mit 1 μM Hecate allein.
Zusätzliche Studien (Daten nicht gezeigt) wiesen nach, dass ein 15mer-Fragment der bLH-Untereinheit spezifisch an LH-Rezeptoren auf den Target-Granulosazellen band, aber nicht die Produktion von Steroidhormonen initiierte, was indikativ für eine Stimulus-gekoppelte Response wäre. Es wurde folglich nachgewiesen, dass die selektive Abtötung von Targetzellen aus der physikalischen Nähe des lytischen Peptids zur Zelle resultierte, die durch die Bindung der LH-Untereinheit hervorgerufen wurde. Die Stimulation der Hormonproduktion der Targetzelle war für die Zelllyse nicht erforderlich. Dieses Ergebnis war überraschend, da zuvor erwartet wurde, dass die Aktivierung der Targetzellen für eine gesteigerte Suszeptibilität für die Lyse erforderlich ist. Diese Daten weisen nach, dass eine derartige Aktivierung nicht erforderlich ist. Diese Daten sind jedoch konsistent mit unseren anderen Daten, die zeigen, dass die Zellaktivierung auch eine Route darstellt, die zur gesteigerten Suszeptibilität gegen das lytische Peptid (ihren kann.
Beispiele 34–37
Eine andere Reihe von Experimenten wurde zur Untersuchung der in vivo-Wirkungen des GnRH-Hecate-Konjugats auf weibliche Ratten und Kaninchen durchgeführt. Die Ovare, der Uterus, die Eileiter, die Nebennieren, die Milz, die Schilddrüse, der Pankreas, die Leber, die Lungen und das Herz wurden zur histologischen Analyse aufgearbeitet. Die Hypophysen wurden zur histologischen Analyse von PAS-gefärbten Zellen und für immuncytochemisch gefärbte Zellen auf bLH, BFSH (bovines Follikel-stimulierendes Hormon), adrenocorticotropes Hormon und andere Proopiomelanocortin-Peptidprodukte (am bemerkenswertesten α-Melanocyten-stimulierendes Hormon (MSH)), Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), Prolactin (PRL), Vasopressin (VP), Oxytocin (OXY) oder Wachstumshormon (GH) aufgearbeitet. Die verwendeten immuncytochemischen Färbungsverfahren folgten im Allgemeinen den Verfahren von M. Rahmanian et al., „Histological and immunocytochemical characterization of pituitary cell types in ponies", Proc. 13th Soc. Equine Nutrition & Phys. Symp., S. 348–349 (1993); M. Rahmanian et al., „Immunocytochemical localization of luteinizing hormone and folliclestimulating hormone in the equine pituitary", J. Anim. Sci., Vol. 76, S. 839–846 (1998); M. Rahmanian et al., „Immunocytochemical localisation of prolactin and growth hormone in the equine pituitary", Animal Sci., Vol. 75, S. 3010–3018 (1997); und P. Melrose et al., „Comparative topography of the immunoreactive alpha-melanocyte-stimu lating hormone neuronal system in the brains of horses and rats", Brain Beh. & Evol., Vol. 32, S. 226–235 (1988).
Von den Hirnen wurden Serienschnitte von der Höhe des diagonalen Bandes von Broca bis zum Corpus mamillare an einem Vibrotom angefertigt. Alternierend wurden die Schnitte konsekutiv auf vier bis fünf Platten aufgeteilt, und die Schnitte in alternierenden Platten wurden mit Cresylviolett gefärbt, oder sie wurden immuncytochemisch auf GnRH oder den GnRH-Präkursor, VP, OXY oder Tyrosin-Hydroxylase (das ratenlimitierende Enzym in der Catecholamin-Synthese) gefärbt. Außer den vorstehend angeführten Färbungsverfahren wurden auch die immuncytochemischen Färbungsverfahren von P. Melrose et al., „Distribution and morphology of immunoreactive gonadotropinreleasing hormone (GnRH) neurons in the basal forebrain of ponies", J. Corp. Neurol., Vol. 339, S. 269–287 (1994); und P. Melrose et al., „Topography of oxytocin and vasopressin neurons in the forebrain of Equus caballus: Further support of proposed evolutionary relationships for proopiomelanocortin, oxytocin and vasopressin neurons", Brain, Beh. & Evol., Vol. 33, S. 193–204 (1989), verwendet.
33 Tage alten, sexuell immaturen weiblichen Ratten wurden intravenöse Verabreichungen wie folgt gegeben:
Behandlung 34: 0,03 μg GnRH (eine normale physiologische Dosis) (zwei Ratten)
Behandlung 35: 1,62 μg GnRH (das molare Äquivalent zur Menge von GnRH in Behandlung 36) (eine Ratte)
Behandlung 36: 0,5 mg GnRH-Hecate (eine Ratte)
Behandlung 37: 0,03 μg GnRH, gefolgt 11 Minuten später von 0,337 μg Hecate (zwei Ratten).
Die Tiere wurden 14 Tage nach der Behandlung geopfert. Im Vergleich zu den beiden GnRH-Kontrollgruppen, reduzierte die Behandlung mit GnRH-Hecate und die Behandlung mit GnRH, gefolgt von Hecate allein, die Hypophysengewichte um 13 % bzw. 14 % und reduzierte die Zahlen der bLH-spezifischen gonadotropen Zellen um 92 % bzw. 87 %. Im Anschluss an diese beiden experimentellen Behandlungen waren die Zellkörper von GnRH-gefärbten Neuronen in den hypophysiotropen Arealen des Hirns überdies häufig deformiert; und eine erhebliche Menge von immunreaktivem Material trat in die umgebenden Areale aus, in denen zahlreiche Zellkörper (das Organum vasculosum laminae terminalis) konzentriert sind. An den Zellen lag aufgrund der beiden experimentellen Behandlungen in den C1- und C3-Feldern des Hippocampus eine histologische Schädigung, und eine verstärkte Färbung von parvizellulären VP-Neuronen im paraventrikulären Nukleus vor. (Die VP-Färbung könnte gegebenenfalls durch die Bildung eines Präzipitats in bestimmten Hirnarealen hervorgerufen worden sein. Sich anschließende Studien mit einem hoch gereinigten Peptid wiesen kein Präzipitat auf). Die Änderung der VP-Expression, wahrscheinlich in Corticotropin-Releasing-Neuronen, kann eine Verschiebung der posttranslationalen Verarbeitung von Proopiomelanocortin-Peptidprodukten in der Pars distalis verursachen, da Behandlungen mit GnRH-Hecate und GnRH + Hecate die adrenocorticotropen Hormonspiegel reduzierten und die Zahl der α-MSH-gefärbten Zellen in dieser Subdivision der Hypophyse erhöhten. In allen anderen Geweben wurden keine pathologischen Veränderungen bemerkt.
Da die Neuronen im Hirn nicht regenerieren, könnte eine schwerwiegende Schädigung an diesen Neuronen die Sterilisation mit einer Kombination aus GnRH/lytischem Peptid permanent (aber temporär durch Verabreichung von gonadotropen Hormonen reversibel) machen.
Beispiele 38–42
Sexuell immature (33 Tage alte) weibliche Ratten (nach dem Zufallsprinzip in Gruppen von drei zugeteilt) wurden intravenös mit Kochsalzlösung oder GnRH-Hecate in Kochsalzlösung wie folgt injiziert:
Behandlung 38: 0,0 mg GnRH-Hecate
Behandlung 39: 0,1 mg GnRH-Hecate
Behandlung 40: 0,5 mg GnRH-Hecate
Behandlung 41: 1,0 mg GnRH-Hecate
Behandlung 42: 1,5 mg GnRH-Hecate.
Die Tiere wurden 24 Stunden oder 14 Tage nach der Behandlung geopfert. Die Ergebnisse waren den vorstehend für Beispiele 34–37 berichteten ähnlich, außer dass im Hirn kein Präzipitat gefunden wurde und die VP-Färbung im ZNS nicht verändert war. Die Behandlungen mit höheren GnRH-Hecate-Konzentrationen produzierten eine große Anzahl von GnRH-Rezeptor-enthaltenden Neuronen mit abnormen Morphologien, einschließlich Distorsion der somatischen Anteile der Zellen und Degeneration von Neuriten. In den 14 Tagen nach der Behandlung geopferten Ratten waren 66 % und 87 % der GnRH-Rezeptor-enthaltenden Neuronen in den Ratten, die 1,0 bzw. 1,5 mg GnRH-Hecate erhalten hatten, abnorm. Die Axondegeneration in der Gruppe unter 1,5 mg GnRH-Hecate war von einer über 90%igen Reduktion der auf GnRH gefärbten Eminentia medialis begleitet.
Beispiele 43–45
Sieben sexuell mature weibliche Neuseeland-Kaninchen wurden intravenös mit Kochsalzlösung, enthaltend GnRH-Hecate wie folgt injiziert:
Behandlung 43: 0 mg GnRH-Hecate (n = 3)
Behandlung 44: 5 mg GnRH-Hecate (n = 3)
Behandlung 45: 10 mg GnRH-Hecate (n = 1).
46 Tage später wurden alle Kaninchen intramuskulär with 100 μg GnRH injiziert. Blutproben wurden nach 0, 1, 4 und 24 Stunden abgenommen, und die LH- und FSH-Spiegel in den Blutproben wurden anhand des Radioimmunassays gemessen. Die Hormon-Analysen gaben zu erkennen, dass sowohl die Kontroll- als auch die Versuchstiere LH als Response auf das GnRH freisetzten, was darauf hindeutet, dass nach der Behandlung mindestens ein geringer Grad der Reversibilität, mindestens für die hypophysären gonadotropen Zellen bei niedrigeren Dosen des Liganden/Peptids, vorliegen könnte. Die Kaninchen wurden am nächsten Tag (Tag 47) zur histologischen Analyse post mortem geopfert. Es wurde gefunden, dass die Zahlen der Tertiärfollikel, Corpora lutea und GnRH-induzierten Ovulationen durch die GnRH-Hecate-Behandlung reduziert waren. Die Gewichte von Ovaren und der Hypophyse wurden durch die Behandlung mit 10 mg GnRH-Hecate reduziert. Das in den Geweben nach den GnRH-He cate-Behandlungen beobachtete immunreaktive GnRH war schwach und diffus in den ZNS-Arealen lokalisiert, die in der Regel Zellkörper enthalten; normale individuelle Zellkörper wurden zahlenmäßig um mindestens 50 % reduziert; und die terminalen Felder, die in der Regel die Axonen der GnRH-Rezeptor-Neuronen enthalten, wurden nicht auf GnRH gefärbt. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die ausgeprägtesten Wirkungen der GnRH-Hecate-Behandlungen in diesen Experimenten bei Kaninchen auf die neuroendokrinen Neuronen im Hirn gewesen sein könnten. Der Hippocampus und andere Hirnareale, die hohe Konzentrationen von GnRH enthalten, wurden nicht erkennbar von den GnRH-Hecate-Behandlungen beeinflusst. Die GnRH-Hecate-Behandlung steigerte die Zahl der PAS-gefärbten Hypophysenzellen in der Pars distalis auf 177 % von der für Kontrollkaninchen; diese Steigerung schien sich in der erhöhten Anzahl von Zellen, die α-MSH färben, und in den reduzierten Zellzahlen, die auf LH färben, widerzuspiegeln.
Beispiele 46–47
Neun sexuell mature weibliche Kaninchen wurden intravenös mit Kochsalzlösung, enthaltend 0 mg (n = 4) (Behandlung 46) oder 10 mg GnRH-Hecate (n = 5) (Behandlung 47) injiziert. Die Kaninchen wurden am Tag 6 nach der Behandlung intramuskulär mit GnRH injiziert. Für den Radioimmunassay von LH und FSH wurden wie vorstehend beschrieben Blutproben entnommen, und die Tiere wurden am Tag 7 nach der Behandlung geopfert. Sowohl die Kontroll- als auch Versuchstiere setzten LH als Response auf das GnRH frei; die Menge des freigesetzten LH war in den behandelten Tieren jedoch niedriger als in den Kontrollen. Die GnRH-Hecate Behandlung reduzierte die Zahlen der ovariellen Tertiärfollikel und die Anzahl der GnRH-induzierten Ovulationen. Es wurden weder auf die peripheren Gewebe noch auf die Hypophysengewichte irgendwelche Wirkungen bemerkt. Die Wirkungen von GnRH-Hecate auf die ZNS-Morphologie und die immuncytochemischen Ergebnisse waren ähnlich denen, die vorstehend in den Beispielen 34–45 beschrieben wurden. Die Wirkungen waren wiederum ausgeprägter auf die GnRH-Neuronen als auf die Färbung der hypophysären gonadotropen Zellen.
Die Anzahl der Ovulationstellen in Kaninchen in den Beispielen 46 und 47, die mit 10 mg GnRH-Hecate behandelt wurden, waren im Vergleich zu den Kochsalz-Kontrollen reduziert. Die mittlere Anzahl der Ovulationsstellen in vier Kochsalz-Kontrollen betrug gleich 12,2 ± 5,4, mit einem S.E.M. = 2,7. Die mittlere Anzahl der Ovulationsstellen in den fünf Kaninchen, denen 10 mg GnRH-Hecate gegeben wurde, betrug 3,6 ± 1,1, mit einem S.E.M. = 0,5. Dieser Unterschied von der Kontrolle war signifikant (p = 0,025).
Der „LH-Gipfel" (der LH-Spiegel eine Stunde nach der GnRH-Challenge, minus dem Ruhespiegel vor der Challenge) in den vier Kontrollen betrug 61,2 ± 16,5 ng/ml, mit einem S.E.M. = 8.3; und betrug in der behandelten Gruppe 49,6 ± 26,1 ng/ml, mit S.E.M. = 12 (p = 0,22). Folglich bestand in der behandelten Gruppe ein Trend in Richtung der niedrigeren LH-Spiegel.
Die in vivo-Studien wiesen deutlich nach, dass das GnRH-Hecate-Konjugat GnRH-Rezeptor-tragende Zellen im Hirn (Neuronen) und in der Hypophyse (gonadotrope Zellen) selektiv schädigt. Diese Studien wiesen weiter eine signifikante Veränderung im Ovar nach, vermutlich als Folge der Veränderung in den reproduktiven Zentren der Hirn-Hypophysen-Achse. Selektivität des Konjugats wurde durch die folgenden Beobachtungen nachgewiesen: (1) In Neuronen, denen die GnRH-Rezeptoren mangelten, wurden keine cytotoxischen Veränderungen gesehen. (2) Keine Veränderungen wurden in den hypophysären Zellen gesehen, denen es an GnRH-Rezeptoren mangelte. (3) In anderen endokrinen und nicht endokrinen Geweben (außer für das Ovar, das vermutlich indirekt auf die Zerstörung von gonadotropen Zellen in der Hypophyse ansprach) wurden keine Veränderungen gesehen.
Viele der Ereignisse, auf die als auf „Ovulationen" in den mit GnRH-Hecate behandelten Kaninchen verwiesen wird, handelte es sich möglicherweise um keine funktionellen Ovulationsstellen, sondern sie könnten anstelle dessen hämorrhagische präovulatorische degenerative Veränderungen dargestellt haben. Zusätzliche Zuchtversuche werden zur Verifikation durchgeführt, dass die Ovulation funktioneller Ova verhindert wird.
Beispiele 48–51
Die folgenden Beispiele wiesen die Fähigkeit einer GnRH-lytischen Peptid-Kombination nach, die Fertilität in Insekten zu reduzieren. Es wurde unerwartet auch entdeckt, dass das lytische Peptid allein (d. h. ohne GnRH verabreicht) ähnliche Wirkungen aufwies. Obwohl nicht angenommen wird, dass Insekten ein GnRH sezernieren, das identisch zu dem in Säugern gefundenen ist, scheint eine gewisse Homologie vorhanden zu sein, insofern, dass die Insekten auf die Sauger-GnRH und auf das mit dem lytischen Peptid-Hecate verknüpfte GnRH ansprachen.
Die Puppen von Diatraea saccharalis (Zuckerrohrbohrer) im Spätstadium wurden mit 1,0 μl Kochsalzlösung, enthaltend eine Konzentration von 1,35 mM Peptid wie angegeben, oder Kochsalzlösung allein als Kontrolle, inokuliert. Den Puppen wurde erlaubt, die Metamorphose abzuschließen. In keinen der Insekten, die die Metamorphose abschlossen, wurden irgendwelche makroskopischen morphologischen Defekte beobachtet. Adulte weibliche Motten durften mit behandelten Männchen paaren und dann Eier legen. Die Viabilität der Eier wurde mittels Auszählen der in Larven ausschlüpfenden Zahlen gemessen.
Behandlung 48 stellte die Kontrolle, eine Inokulation von 21 Puppen mit Kochsalzlösung allein, dar. Zwölf der Puppen schlossen die Metamorphose zu adulten Motten (4 Männchen, 8 Weibchen) ab. Die 8 Weibchen legten insgesamt ca. 900 Eier, im Durchschnitt ca. 112 Eier pro Weibchen. Ca. 22 % dieser Eier schlüpften aus, was ca. 25 ausgeschlüpften Larven pro Weibchen entsprach.
Behandlung 49 stellte die Inokulation von 10 Puppen mit 1,35 mM GnRH dar. Vier der Puppen schlossen die Metamorphose zu adulten Motten (2 Männchen, 2 Weibchen) ab. Die 2 Weibchen legten insgesamt ca. 300 Eier, oder im Durchschnitt ca. 150 Eier pro Weibchen. Ca. 40 % dieser Eier schlüpften aus, was ca. 60 ausgeschlüpften Larven pro Weibchen entsprach.
Behandlung 50 stellte die Inokulation von 10 Puppen mit 1,35 mM GnRH-Hecate (SEQ ID NO:3) dar. Acht der Puppen schlossen die Metamorphose zu adulten Motten (3 Männchen, 5 Weibchen) ab. Die 5 Weibchen legten insgesamt ca. 200 Eier, oder im Durchschnitt ca. 40 Eier pro Weibchen. Ca. 40 % dieser Eier schlüpften aus, was ca. 16 ausgeschlüpften Larven pro Weibchen entsprach.
Behandlung 51 stellte die Inokulation von 10 Puppen mit D-Hecate dar. Sechs der Puppen schlossen die Metamorphose zu adulten Motten (2 Männchen, 4 Weibchen) ab. Die 4 Weibchen legten insgesamt 18 Eier, oder im Durchschnitt 4,5 Eier pro Weibchen. 100 % dieser Eier schlüpften aus, was 4,5 ausgeschlüpften Larven pro Weibchen entsprach.
Es wurde folglich beobachtet, dass im Vergleich zu den Kontrollen, mit GnRH allein behandelte Weibchen im späten Puppenstadium einen verbesserten reproduktiven Erfolg aufwiesen; die mit der GnRH-Hecate-Kombination behandelten, wiesen einen verminderten reproduktiven Erfolg auf; und die mit D-Hecate allein behandelten, wiesen einen sogar noch niedrigeren reproduktiven Erfolg auf.
Ohne an die folgende Hypothese gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass diese Ergebnisse wie folgt erklärt werden können. Aufgrund der Sequenzhomologie über die Taxa hinweg (bisher noch nicht identifiziert) beeinflussen kleine Peptide, die in der Kontrolle der Säugerreproduktion aktiv sind, auch die reproduktive Funktion in Insekten. Siehe W. Theunis et al., „Luteinising Hormone, Follicle Stimulating Hormone and Gonadotropin Releasing Hormone Immunoreactivity in Two Insects: Locusta migratoria migratoroides R & F and Sarcophaga bullata (Parker)", Invert. Reprod. and Develop., Vol. 16, S. 111–117 (1989); und P. Verhaert et al., „Substances Resembling Peptides of the Vertebrate Gonadotropin System Occur in the Central Nervous System of Periplaneta americana L.", Insect Biochem., Vol. 16, S. 191–197 (1986).
Diese Aktivität wird wahrscheinlich durch die inhärente Fähigkeit dieser Peptide, mit geeigneten Intermediärzellen durch eine Liganden-Rezeptor-Interaktion zu reagieren, vermittelt, wobei folglich die funktionelle Aktivität der Intermediärzellen verändert wird. Insekten weisen ganz besonders einen Rezeptor auf, der auf Säuger-GnRH anspricht. GnRH allein stimuliert die reproduktive Aktivität in Insekten. An ein lytisches Peptid gekoppeltes GnRH greift die Intermediärzellen in den Insekten an, wobei die reproduktive Aktivität inhibiert wird.
Die für das ohne GnRH verabreichte D-Hecate beobachteten Ergebnisse waren überraschend und werden etwas anders erklärt, wiederum, ohne durch die folgende Hypothese gebunden sein zu wollen. Die Metamorphose stellt eine Zeit der hohen Zeltaktivität dar. Die lytischen Peptide weisen im Allgemeinen eine größere Aktivität gegen aktive Zellen auf. Es wird angenommen, dass die beobachtete Response auf Hecate allein eine generalisierte Response durch aktivierte Zellen und nicht eine durch einen Rezeptor vermittelte spezifische Response darstellt. Die Tatsache, dass die D-Konformation von Hecate in diesem Experiment verwendet wurde, kann signifikant sein, da Peptide der D-Form im Allgemeinen eine längere biologische Halbwertzeit aufweisen. Es ist derzeit unbekannt, ob ähnliche Ergebnisse mit L-Hecate allein gesehen wurden. (D-Hecate wurde in Behandlung 26 aus dem einfachen Grund verwendet, dass zuvor synthetisiertes D-Hecate den Untersuchern ohne weiteres zur Verfügung stand.)
Behandlung maligner und benigner Tumoren
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind beim Abtöten oder Inhibieren des Wachstums von malignen und benignen Tumorzellen, die Rezeptoren für GnRH, LH, hCG, 1-LHRH-III oder Steroide exprimieren, nützlich. Der Ligand wird mit einem lytischen Peptid (entweder sequenziell oder miteinander verknüpft) verabreicht, und die targetierten Tumorzellen werden abgetötet oder inhibiert.
Bei der Behandlung von Hormon- oder Liganden-verknüpften Krebserkrankungen (z. B. Krebserkrankungen des Ovars, der Hoden, der Brust, des Uterus, des Endometriums, der Hypophyse und der Prostata) können die lytischen Peptide an das Hormon gebunden werden, für das der Tumor einen Rezeptor oder ein Set von Rezeptoren, wie z. B. ein Estrogen, Testosteron, LH, FSH, Estradiol-17β, einen transformierenden Wachstumsfaktor α (TGFα), einen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), GnRH, LH, hCG, Lampreten-III-LHRH (1-LHRH-III) und Melanozyten-stimulierendes Hormon exprimiert. So kann zum Beispiel eine Esterverknüpfung von einem lytischen Peptid mit Estradiol oder Testosteron zweckmäßigerweise durch Kondensation des Carboxy-Ter minus des lytischen Peptids mit der Hydroxylgruppe an der 17-Kohlenstoffposition des Steroids hergestellt werden. Eine Kombination aus Estradiol/lytischem Peptid kann als eine Behandlung gegen Brust- oder Ovarialkrebs angewendet werden; und eine Kombination aus Testosteron/lytischem Peptid kann zur Behandlung des Prostatakrebses angewendet werden. Außerdem können die spezifischen Bindungsdomänen des Peptidhormons LH oder FSH in Fusionspeptiden mit einem lytischen Peptid zur selektiven Bindung des Fusionspeptids zum Targetieren von Tumorzellen mit Zelloberflächenrezeptoren für diese Hormone angewendet werden. Die Rezeptor-Bindungsstelle der β-Untereinheit von LH und hCG kann verwendet werden (SEQ ID NO:11). Siehe Morbeck et al., Mol. and Cell Endocrin., Vol. 97, S. 173–186 (1993).
Hypophysentumoren
Die anteriore Hypophyse enthält verschiedene Epithelzelltypen, die die komplexen Prozesse des Wachstums, der Reproduktion, der Laktation, der Schilddrüsenfunktion und der Nebennierenfunktionen kontrollieren. Aufgrund der hohen funktionellen Plastizität der Hypophysenzellen (d. h. ihre Fähigkeit zur Differenzierung zu verschiedenen zellulären Phänotypen als Response auf Stimuli) neigen diese Zellen besonders zu aberrantem Verhalten. Da viele der Signale, auf die die Hypophyse anspricht, Rezeptor-vermittelt sind, können pathologische Zustände durch Kooptieren der geeigneten Liganden-Rezeptor-Interaktion kontrolliert werden. Mehrere Beispiele sind nachstehend angegeben.
Dopamin-Rezeptoren bei Prolactinomen und anderen Adenomen
Eine chronische Dopamin-Defizienz wurde mit einigen Typen von Hyophysentumoren in Verbindung gebracht. In bestimmten Adenomen ist die Anzahl der Dopamin-Bindungsstellen um ca. 50 % reduziert, und die Anzahl kann während der dopaminergen Therapie noch weiter reduziert werden. Es wurde auch mitgeteilt, dass der Nervenwachstumsfaktor Prolactinomzellen zur Reexpression der Dopamin-Rezeptoren stimulieren kann. Die Vorbehandlung eines Prolactinoms mit einem Nervenwachstumsfaktor vor der Behandlung mit einer Kombination aus Dopamin/lytischem Peptid macht es für die erfindungsgemäße Behandlung suszeptibel. Das lytische Peptid kann mit dem Dopamin zur Untersuchung durch eine Amidgruppe, die durch Kondensation des Car boxy-Terminus des Peptids mit der Aminogruppe des Dopamins verknüpft werden.
Diese Therapie ist nicht nur für Prolactinome wirksam, sondern auch für andere Adenome, die Dopamin-Rezeptoren, wie zum Beispiel Wachstumshormon-sezernierende Adenome, Thyrotropin-Releasing-Hormon sezernierende Adenome und Gonadotropinsezernierende Adenome, exprimieren.
Somatostatin-Rezeptoren bei Wachstumshormon-sezernierenden Adenomen Es wurde mitgeteilt, dass Wachstumshormon-(GH)-sezernierende Adenome eine hoch variable Anzahl an Somatostatin-Rezeptoren aufweisen. (Eine Variation um einen Faktor von mindestens 10 kann unter individuellen Tumoren gesehen werden.) Es besteht auch eine erhebliche Variation bei der Verteilung der Bindungsstellen: die Somatostatin-Rezeptoren können homogen verteilt sein, indem sie sich ausschließlich in einem Anteil des Tumorgewebes oder dazwischen befinden.
Somatostatin-Rezeptoren liegen auch in anderen Hypophysentumortypen vor. Es wurde mitgeteilt, dass die Zelloberflächen einer Vielzahl von GH- und Thyrotropin-Releasing-Hormon-(TRH)-sezernierenden Adenomen eine erhöhte Anzahl von Somatostatin-Rezeptoren aufweisen.
Solche Tumoren können erfindungsgemäß durch eine Kombination aus Somatostatin/lytischem Peptid behandelt werden.
Andere Hypophysenadenome
Andere Liganden, die in einer Kombination aus Liganden/lytischem Peptid zur Behandlung anderer Hypophysen-Adenome angewendet werden, schließen TRH, MSH, GnRH, Corticotropin-Releasing-Hormon, Wachstumshormon-Releasing-Hormon, vasoaktives intestinales Polypeptid und Hypophysenadenylat-Cyclase aktivierendes Peptid ein. Ein Kurzkettenanalog von α-MSH, das anstelle von MSH angewendet werden kann, stellt Ser-Tyr-Cys-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Asn-Lys-Pro-Val-NH₂ (SEQ ID NO:10) dar.
Andere endokrin-verwandte Erkrankungen
In anderen Applikationen kann die erfindungsgemäße Kombination aus Liganden/lytischem Peptid zur Behandlung endokrin-verwandter Erkrankungen im Allgemeinen angewendet werden. Wenn eine Erkrankung kausal mit der Dysfunktion von Zellen mit bestimmten Hormonrezeptoren verwandt ist, können Zellen mit solchen Rezeptoren durch Verabreichung einer Kombination des Hormons und eines lytischen Peptides selektiv inaktiviert werden.
Bei einem alternativen Ansatz wurde zuvor bemerkt, dass die Reduktion der LH- und FSH-Spiegel bei Patienten mit Brust- und Prostatakrebs vorteilhaft ist. Wenn die gonadotropen Zellen in der Hypophyse mit einer Kombination aus GnRH/lytischem Peptid selektiv abgetötet werden, kann die Hypophyse kein LH und FSH mehr sezernieren. Die sich auf diese Weise ergebenden reduzierten Spiegel dieser Hormone helfen bei der Kontrolle der Ausbreitung von Krebserkrankungen. Dieser alternative, indirekte Ansatz, kann anstelle von oder zusätzlich zur Behandlung von Krebserkrankungen direkt mit einer Kombination aus LH/lytischem Peptid oder aus FSH/lytischem Peptid angewendet werden. Die chronische Verabreichung von GnRH wurde zuvor zur Downregulation seiner Rezeptoren angewendet und entfernt folglich wirksam LH aus dem Kreislauf, was zu einer „chemischen Kastration" von Patienten mit Prostatakarzinom führt. GnRH und bestimmte GnRH-Analoge weisen jedoch auch direkte Wirkungen auf das Prostata-Zellwachstum auf.
Durch Analogie ist gut etabliert, dass die chirurgische Entfernung der anterioren Hypophyse bei der Behandlung von Geschlechtshormon-verwandten Erkrankungen wirksam ist. Die chemische Zerstörung von gonadotropen Zellen in der Hypophyse durch die vorliegende Erfindung wird deshalb ähnliche Wirkungen auf Geschlechtshormon-verwandte Erkrankungen aufweisen, aber ohne die zusätzlichen Risiken und Komplikationen der Chirurgie.
Beispiele 52–58
In diesen Experimenten wurde die in vitro-Lyse der humanen Prostatakrebs-Zelllinien nachgewiesen. LNCaP FGC und DU145, humane Prostatakrebs-Zelllinien, wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville MD), ATCC-Zugangsnummern CRL 1740 bzw. HTB-81 erworben. Die LNCaP FGC-Adenocarcinoma-Zelllinie wurde ursprünglich von einem 50 Jahre alten männlichen Kaukasier erhalten. Die LNCaP FGC-Zellen sind empfindlich für Dihydrotestosteron und für Estrogene (A+). Das DU145-Karzinom wurde ursprünglich aus dem Hirn eines 69 Jahre alten männlichen Kaukasiers mit metastasierendem Karzinom der Prostata isoliert; diese Zelllinie ist gegen Steroidhormone nicht empfindlich (A–).
Die Zellen wurden von den Kulturflaschen gelöst, und 1000 Zellen/Well wurden auf 24-Well-Kulturplatten transferiert. Die Zellen wurden 24 Stunden mit 10 % Kalbserum inkubiert. Daran anschließend wurden die Zellen 48 Stunden ohne Serum inkubiert. Die Zellen wurden dann 22 Stunden mit einer der folgenden Behandlungen inkubiert:
Behandlung 52 : 10 μM luteinisierendes Hormon (LH)
Behandlung 53 : 30 μM freies Hecate
Behandlung 54 : 90 μM Hecate-bLH
Behandlung 55 : 60 μM Hectate-bLH
Behandlung 56 : 50 μM GnRH-Hecate
Behandlung 57 : 10 μM GnRH-Hecate
Behandlung 58 : FSH-Vorbehandlung, gefolgt von 90 μM Hecate-bLH
Zur Beurteilung der Viabilität der Zellen nach der Behandlung wurde der Trypanblau-Ausschluss verwendet. Die Behandlung, die am konsistentesten und wirksamsten sowohl die A+- als auch die A–-Krebszelllinien abtötete, stellt GnRH-Hecate in der höheren Dosis (50 μM) dar. GnRH-Hecate in der niedrigeren Dosis (10 μM) war gleich wirksam gegen die Androgen-unempfindlichen DU145-Zellen. Die DU145-Zellen wurden auch von Hecate allein abgetötet. Die Behandlung mit einem lytischen Peptid allein könnte in vivo jedoch nicht selektiv sein, sofern spezifische Zelltypen, z. B. durch Hormone, die ihre Aktivität kontrollieren, nicht getrennt stimuliert werden. Das Hecate-bLH-Konjugat tötete fast alle DU145-Zellen ab, wies aber wenig Wirkung auf A+-LNCaP auf. Dieses Ergebnis ist konsistent mit der spezifischen Bindung von LH an DU145-Zellen, aber nicht an LNCaP-Zellen. LH bindet spezifisch DU145-Zellen, es war aber nicht möglich, die spezifische Bindung von LH an die A+-LNCaP-Zellen konsistent zu messen. Die mit FSH vorbehandelten LNCaP-Zellen waren empfindlicher gegen das Hecate-bLH-Konjugat als die, die nicht vorbehandelt wurden.
Andere Applikationen, einschließlich der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und das Targetieren abnormer Zellen
Diese Erfindung kann verwendet werden, wo immer sie erwünscht ist, um abnorme (oder normale) Zellen, die durch spezifische Liganden-Interaktionen getrieben werden oder von ihnen abhängig sind, spezifisch zu inhibieren. Als anderes Beispiel kann diese Erfindung bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten verwendet werden, für die das für die Autoimmunkrankheit verantwortliche Antigen oder Epitop bekannt ist.
Spezifische Immunantworten werden von B-Lymphocyten, T-Lymphocyten oder beiden vermittelt. Wenn Lymphozyten unangemessen „sich selbst" anstelle von „nicht sich selbst" angreifen, können sich viele verschiedene Autoimmunkrankheiten ergeben, von denen einige verheerende Folgen haben können. Erkrankungen, die mit der Autoimmunität assoziiert wurden, schließen folgende ein: rheumatoide Arthritis, juvenile rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, Addison-Krankheit, Goodpasture-Syndrom, autoimmune hämolytische Anämie, Morbus Basedow, Hashimoto-Thyreoiditis, idiopathische thrombozytopenische Purpura, insulinabhängigen Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Myokardinfarkt, aplastische Anämie, perniziöse Anämie, poststreptokokkale Glomerulonephritis, spontane Infertilität, Spondylitis ankylosans, Sklerodermie und Sjögren-Syndrom.
Ob von T-Zellen oder B-Zellen vermittelt, eine Autoimmunkrankheit ist gekennzeichnet durch Lymphozyten mit spezifischen Rezeptoren für ein Selbstepitop, das ihre Funktion triggert – d. h. Antikörpersekretion, Proliferation, Sekretion cytotoxischer Faktoren oder Sekretion inflammatorischer Cytokine. Diese Responses verursachen die Schädigung oder Zerstörung von Selbstzellen oder -organen.
Die spezifischen Antigene und selbst Epitope, die als Liganden zur Stimulation der Lymphozyten wirken, wurden für mehrere Autoimmunkrankheiten identifiziert, in der Regel durch die proliferative Response in vitro, die sie in Lymphozyten induzieren. So wurde zum Beispiel Thyrotropin als das Selbstantigen impliziert, das von Lymphozyten bei der Hashimoto-Krankheit erkannt wird. Wenn das Epitop bekannt ist, kann die Autoimmunkrankheit durch Verabreichung einer Verbindung behandelt werden, die das mit einem lytischen Peptid verknüpfte Epitop enthält, das Klone der autoreaktiven Lymphozyten selektiv deletiert.
Es hat zuvor keine allgemeinen Behandlungen für Autoimmunkrankheiten gegeben. Davor haben die Behandlungen cytotoxische Verbindungen und Corticosteroide in hohen Dosen eingeschlossen, die beide bei der Langzeittherapie mit Risiken einhergehen. Keine der beiden targetiert selektiv autoreaktive Lymphozyten.
Bestimmte abnorme Zellen (z. B. viral infizierte Zellen, wie zum Beispiel HIV-infizierte Zellen, Krebszellen) weisen Oberflächenrezeptoren auf, die nicht auf normalen Zellen gefunden werden. In einigen Fällen werden diese Rezeptoren durch virale Nukleinsäuren codiert. Liganden für diese Rezeptoren, wie zum Beispiel monoklonale Antikörper gegen diese Rezeptoren oder die Rezeptor-/Ligandenpaare, von D. Fitzgerald et al., „Targeted Toxin Therapy for the Treatment of Cancer", J. Natl. Cancer Inst., Vol. 81, S. 1455–1463, die in Tabelle 2 gezeigt werden, können in der Kombination aus erfindungsgemäßen Liganden/lytischem Peptid zur selektiven Zerstörung von Zellen, die den Rezeptor aufweisen, verwendet werden. Die Zerstörung einer derartig viral infizierten Zelle, zum Beispiel vor Abschluss des viralen Maturationszyklus, resultiert in der Freisetzung von inkompletten, nicht infektiösen Viruspartikeln, wodurch die Virusinfektion behandelt wird. Die Zerstörung einer derartigen Krebszelle verhindert die weitere Metastasierung. Wenn ein Antikörper als der Ligand verwendet wird, wird häufig die sequenzielle Verabreichung des Antikörpers und des lytischen Peptids bevorzugt, anstelle dass sie miteinander verknüpft werden. Komplement und andere Responses auf die gebundenen Antikörper machen die Zellen suszeptibler für einen Angriff durch die lytischen Peptide.
Erfindungsgemäß nutzliche lytische Peptide
Es besteht die Annahme (ohne durch diese Theorie gebunden sein zu wollen), dass lyti sche Peptide über das Disruptieren der Zellmembranen wirken. „Ruhende" eukaryote Zellen schützen sich selbst durch ihre Fähigkeit, die sich ergebende Membranschädigung zu reparieren. Im Gegensatz dazu sind aktivierte Zellen (z. B. durch GnRh stimulierte Zellen) unfähig (oder weniger fähig) geschädigte Membranen zu reparieren. Da GnRH-aktivierte Hypophysenzellen eine verminderte Kapazität zur Reparatur von Membranen aufweisen, werden sie von lytischen Peptiden präferenziell zerstört, während benachbarte nicht aktivierte Zellen ihre Membranen reparieren und überleben.
Obwohl die erfindungsgemäßen Ausführungsformen, die bisher getestet wurden, Hecate als den Effektor des lytischen Peptids verwendet haben, funktioniert diese Erfindung auch mit einer Kombination aus einem Liganden mit anderen lytischen Peptiden. Viele lytische Peptide sind im Stand der Technik bekannt und schließen zum Beispiel die in den Referenzen erwähnten ein, die in der nachstehenden Besprechung angeführt sind.
Lytische Peptide stellen kleine basische Peptide dar. Native lytische Peptide scheinen bedeutende Komponenten der antimikrobiellen Abwehrsysteme einer Anzahl an Tierspezien, einschließlich der von Insekten, Amphibien und Säugern darzustellen. Sie umfassen in der Regel 23–39 Aminosäuren, obwohl sie kleiner sein können. Sie besitzen das Potenzial zur Bildung amphipathischer α-Helices. Siehe Boman et al., „Humoral immunity in Cecropia pupae", Curr. Top. Microbiol. Immunol., Vol. 94/95, S. 75–91 (1981); Boman et al., „Cell-free immunity in insects", Annu. Rev. Microbiol., Vol. 41, S. 103–126 (1987); Zasloff, „Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterisation of two active forms and partial DNA sequence of a precursor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84, S. 3628–3632 (1987); Ganz et al., „Defensins natural Peptide antibiotics of human neutrophils", J. Clin. Invest., Vol. 76, S. 1427–1435 (1985); und Lee et al., „Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, S. 9159–9162 (1989).
Bekannte Aminosäuresequenzen für lytische Peptide können zur Schaffung neuer Peptide, von denen auch erwartet würde, dass sie lytische Aktivität aufweisen, durch Substitutionen von Aminosäureresten, die die amphipathische Beschaffenheit der Peptide konservieren (z. B. Ersatz eines polaren Restes mit einem anderen polaren Rest oder ei nen nicht polaren Rest mit einem anderen nicht polaren Rest usw.); durch Substitutionen, die die Ladungsverteilung erhalten (z. B. Ersatz eines sauren Restes durch einen anderen sauren Rest, oder einen basischen Rest durch einen anderen basischen Rest usw.); oder durch Verlängerung oder Verkürzung der Aminosäuresequenz, während sein amphipathisches Merkmal oder seine Ladungsverteilung erhalten bleibt, modifiziert werden. Lytische Peptide und ihre Sequenzen werden offenbart in: in Yamada et al., „Production of recombinant sarcotoxin IA in Bombyx mori cells", Biochem. 1, Vol. 272, S. 633–666 (1990); Taniai et al., „Isolation and nucleotide sequence of cecropin B cDNA clones from the silkworm, Bombyx mori", Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 1132, S. 203–206 (1992); Boman et al., „Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids", Febs Letters, Vol. 259, S. 103–106 (1989); Tessier et al., „Enhanced secretion from insect cells of a foreign protein fused to the honeybee melittin signal peptide", Gene, Vol. 98, S. 177–183 (1991); Blondelle et al., „Hemolytic and antimicrobial activities of the twenty-four individual omission analogs of melittin", Biochemistry, Vol. 30, S. 4671–4678 (1991); Andreu et al., „Shortened cecropin A-melittin hybrids. Significant size reduction retains potent antibiotic activity", Febs Letters, Vol. 296, S. 190–194 (1992); Macias et al., „Bactericidal activity of magainin 2: use of lipopolysaccharide mutants", Can. J. Microbiol., Vol. 36, S. 582–584 (1990); Rana et al., „Interactions between magainin-2 and Salmonella typhimurium outer membranes: effect of Lipopolysaccharide structure", Biochemistry, Vol. 30, S. 5858–5866 (1991); Diamond et al., „Airway epithelial cells are the site of expression of a mammalian antimicrobial peptide gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, S. 4596 ff (1993); Selsted et al., „Purification, primary structures and antibacterial activities of β-defensins, a new family of antimicrobial peptides from bovine neutrophils", J. Biol. Chem., Vol. 268, S. 6641 ff (1993); Tang et al., „Characterisation of the disulfide motif in BNBD-12, an antimicrobial β-defensin peptide from bovine neutrophils", J. Biol Chem., Vol. 268, S. 6649 ff (1993); Lehrer et al., Blood, Vol. 76, S. 2169–2181- (1990); Ganz et al., Sem. Resp. Infect. I.,S. 107–117 (1986); Kagan et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, Vol. 87, S. 210–214 (1990); Wade et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, S. 4761–4765 (1990); Romeo et al., J. Biol. Chem., Vol. 263, S. 9573–9575 (1988); Jaynes et al., „Therapeutic Antimicrobial Polypeptides, Their Use and Methods for Preparation", WO 89/00199 (1989); Jaynes, „Lytic Peptides, Use for Growth, Infection and Cancer", WO 90/12866 (1990); Berkowitz, „Prophylaxis and Treatment of Adverse Oral Conditions with Biologically Active Peptides", WO 93/01723 (1993).
Familien von natürlich vorkommenden lytischen Peptiden schließen die Cecropine, die Defensine, die Sarcotoxine, die Melittine und die Magainine ein. Boman und Mitarbeiter in Schweden führten die Originalarbeit am humoralen Abwehrsystem von Hyalophora cecropia, dem amerikanischen Seidenspinner, zum Selbstschutz vor bakterieller Infektion ein. Siehe Hultmark et al., „Insect immunity. Purification of three inducible bactericidal Proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia", Eur. J. Biochem., Vol. 106, S. 7–16 (1980); und Hultmark et al., „Insect immunity. Isolation and structure of cecropin D. and four minor antibacterial components from cecropia pupae", Eur. J. Biochem., Vol. 127, S. 207–217 (1982).
Eine Infektion in H. cecropia induziert die Synthese von spezialisierten Proteinen, die zum Disruptieren der Bakterienzellmembranen fähig sind, was zur Lyse und zum Zelltod führt. Unter diesen spezialisierten Proteinen sind diejenigen, die kollektiv als Cecropine bekannt sind. Die wichtigsten Cecropine – Cecropin A, Cecropin B und Cecropin D – stellen kleine, hoch homologe, basische Peptide dar. In Zusammenarbeit mit Merrifield, zeigte Bomans Gruppe, dass die Amino-terminale Hälfte der verschiedenen Cecropine eine Sequenz enthält, die eine amphipathische α-Helix bildet. Andrequ et al. „N-terminal analogues of cecropin A: synthesis, antibacterial activity, and conformational properties", Biochem., Vol. 24, S. 1683–1688 (1985). Die Carboxy-terminale Hälfte des Peptids umfasst einen hydrophoben Schwanz. Siehe auch Boman et al., „Cell-free immunity in Cecropia", Eur. J. Biochem., Vol. 201, S. 23–31 (1991).
Ein Cecropin-ähnliches Peptid wurde aus dem porzinen Darm isoliert. Lee et al., „Antibacterial Peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, S. 9159–9162 (1989).
Es wurde beobachtet, dass Cecropin-Peptide eine Anzahl von Tierpathogenen mit Ausnahme von Bakterien abtöten. Siehe Jaynes et al., „In Vitro Cytocidal Effect of Novel Lytic Peptides an Plasmodium falciparum and Trypanosoma cruzi", FASEB, 2878– 2883 (1988); Arrowood et al., „Hemolytic properties of lytic peptides active against the sporozoites of Cryptosporidium parvum", J. Protozool., Vol. 38, Nr. 6, S. 1615–1635 (1991); und Arrowood et al., „In vitro activities of lytic peptides against the sporozoites of Cryptosporidium parvum", Antimicrob. Agents Chemother., Vol. 35, S. 224–227 (1991). Normale Säugerzellen scheinen jedoch, selbst in hohen Konzentrationen, nicht von Cecropinen nachteilig beeinflusst zu werden. Siehe Jaynes et al. „In vitro effect of lytic peptides an normal and transformed mammalian cell lines," Peptide Research, Vol. 2, Nr. 2, S. 1–5 (1989); und Reed et al., „Enhanced in vitro growth of murine fibroblast cells and preimplantation embryos cultured in medium supplemented with an amphipathic Peptide", Mol. Reprod. Devel., Vol. 31, Nr. 2, S. 106–113 (1992).
Defensine, die ursprünglich in Säugern gefunden wurden, stellen kleine Peptide dar, die sechs bis acht Cysteinreste enthalten. Ganz et al., „Defensins natural Peptide antibiotics of human neutrophils", J. Clan. Invest., Vol. 76, S. 1427–1985). Extrakte aus normalen humanen Neutrophilen enthalten drei Defensin-Peptide: humane neutrophile Peptide HNP-1, HNP-2 und HNP-3. Defensin-Peptide wurden auch in Insekten und höheren Pflanzen beschrieben. Dimarcq et al., „Insect immunity: expression of the two major inducible antibacterial peptides, defensin and diptericin, in Phormia terranvae", EMBO J., Vol. 9, S. 2507–2515 (1990); Fisher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84, S. 3628–3632 (1987).
Geringgradig größere Peptide, die als Sarcotoxine bezeichnet werden, wurden aus der Fleischfliege Sarcophaga peregrina gereinigt. Okada et al., „Primary structure of sarcotoxin I, an antibacterial Protein induced in the hemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh fly) larvae", J. Biol. Chem., Vol. 260, S. 7174–1985). Obwohl sie von den Cecropinen und Defensinen weitgehend abweichen, weisen die Sarcotoxine vermutlich eine ähnliche antibiotische Funktion auf.
Andere lytische Peptide wurden in Amphibien gefunden. Gibson und Mitarbeiter isolierten zwei Peptide aus dem afrikanischen Krallenfrosch, Xenopus laevis, Peptide, die sie als PGS und Gly¹⁰Lys²²PGS bezeichneten. Gibson et al., „Novel Peptide fragments originating from PGL_a and the caervlein and xenopsin precursors from Xenopus laevis", J. Biol. Chem., Vol. 261, S. 5341–5349 (1986); und Givannini et al., „Biosynthesis and degradation of peptides derived from Xenopus laevis prohormones", Biochem. J., Vol. 243, S. 113–120 (1987). Zasloff zeigte, dass die sich von Xenopus herleitenden Peptide eine antimikrobielle Aktivität aufweisen, und benamten sie in Magainine um. Zasloff, „Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial DNA sequence of a precursor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84, S. 3628–3632 (1987).
Es wurde mitgeteilt, dass die Synthese von nicht homologen Analogen von verschiedenen Klassen lytischer Peptide zeigt, dass eine positiv geladene, amphipathische Sequenz mit mindestens 20 Aminosäuren eine Erfordernis für die lytische Aktivität in einigen Klassen von Peptiden zu sein schien. Shiba et al., „Structure-activity relationship of Lepidopteran, a self-defense Peptide of Bombyx more", Tetrahedron, Vol. 44, Nr. 3, S. 787–803 (1988). Ein andere Arbeit hat gezeigt, dass kleinere Peptide auch lytisch sein können. Siehe McLaughlin et al., nachstehend angeführt.
Es wurde gezeigt, dass Cecropine Pathogene oder kompromittierte Zellen selektiv targetieren, ohne sich auf die normalen Wirtszellen auszuwirken. Vom synthetischen lytischen Peptid, das als S-1 (oder Shiva 1) bekannt ist, wurde gezeigt, dass es intrazelluläre mit Brucella abortus, Trypanosoma cruzi, Cryptosporidium parvum und infektiösem bovinem Herpes Virus I (IBR) infizierten Wirtszellen, mit wenig oder keinen toxischen Wirkungen auf nicht infizierte Sängerzellen zerstört. Siehe Jaynes et al., „In vitro effect of lytic peptides an normal and transformed mammalian cell lines", Peptide Research, Vol. 2, Nr. 2, S. 1–5 (1989); Wood et al., „Toxicity of a Novel Antimicrobial Agent to Cattle and Hamster cells In vitro", Proc. Ann. Amer. Soc. Anim. Sci., Utah State University, Logan, UT. J. Anim. Sci. (Suppl. 1), Vol. 65, S. 380 (1987); Arrowood et al., „Hemolytic properties of lytic peptides active against the sporozoites of Cryptosporidium parvum", J. Protozool., Vol. 38, Nr. 6, S. 161S–163S (1991); Arrowood et al., „In vitro activities of lytic peptides against the sporozoites of Cryptosporidium parvum", Antimicrob. Agents Chemother., Vol. 35, S. 224–227 (1991); und Reed et al., „Enhanced in vitro growth of murine fibroblast cells and preimplantation embryos cultured in medium supplemented with an amphipathic Peptide", Mol. Reprod. Devel., Vol. 31, Nr. 2, S. 106–113 (1992).
Morvan et al., „In vitro activity of the antimicrobial Peptide magainin 1 against Bonamia ostreae, the intrahemocytic parasite of the flat oyster Ostrea edulis", Mol. Mar. Biol., Vol. 3, S. 327–333 (1994) berichten die in vitro-Verwendung eines Magainins zur selektiven Reduktion der Viabilität des Parasiten Bonamia ostreae in Dosen, die sich nicht auf die Zellen der Europäischen Auster Ostrea edulis auswirken Auch von Interesse sind die synthetischen Peptide, die in den nachstehenden anhängigen Patentanmeldungen offenbart sind, Peptide, die lytische Aktivität mit so wenigen wie 10–14 Aminosäureresten aufweisen: McLaughlin et al., „Amphipathic Peptides", US-Patentanmeldung, Aktenzeichen 08/681,075 , angemeldet am 22. Juli 1996; und Mark L. McLaughlin et al., „Short Amphipathic Peptides with Activity against Bacteria and Intracellular Pathogens", US-Patentmeldung, Aktenzeichen 08/796,123 , angemeldet am 6. Februar 1997.
Lytische Peptide, wie sie zum Beispiel im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt sind, können in der erfindungsgemäßen praktischen Ausführung verwendet werden. Die selektive Toxizität für Liganden-aktivierte Zellen ist wünschenswert, besonders, wenn der Ligand und das Peptid getrennt verabreicht werden. Die selektive Toxizität ist weniger wichtig, wenn der Ligand und das Peptid miteinander verknüpft sind, weil in diesem Fall das Peptid in der unmittelbaren Umgebung von Zellen mit Rezeptoren für den Liganden wirksam konzentriert ist.
Beispiele solcher Peptide stellen diejenigen dar, die als D1A21 (SEQ ID NO:5) D2A21 (SEQ ID NO:6), D5C (SEQ ID NO:7) und D5C1 (SEQ ID NO:8) bezeichnet sind. Diese Peptide und andere lytische Peptide, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, sind in Jaynes, „Methods for the Design of Amphipathic Peptides Having Enhanced Biological Activities", vorläufige US-Patentanmeldung, Aktenzeichen 60/027,628 , angemeldet am 4. Oktober 1996, offenbart. In bisher unter Verwendung dieser Peptide allein (d. h. einem dieser vier Peptide ohne einen assoziierten Liganden) durchgeführten Studien, lagen die LD₅₀-Werte in vitro gegen humane Prostatakrebszell linien im Bereich von ca. 0,57 μM bis ca. 1,61 μM. In bisher unter Verwendung von D2A21 allein (d. h. ohne einen assoziierten Liganden) durchgeführten Studien, lagen die LD₅₀-Werte gegen humane Brust-, Blasen-, Kolon-, Zervix-, Lungen-, Kolon- und Hautkrebszelllinien im Bereich von ca. 0,28 μM bis ca. 3,1 μM. Zum Vergleich wurde gemessen, dass die LD₅₀ für jedes von D2A21, D5C, und D5C1 für jedes der folgenden Typen von normalen, nicht kanzerösen humanen Zellen: Endothelzellen, Fibroblasten, enterische Zellen und Keratinozyten größer als 100 μM ist. Für D2A21 wurde gemessen, dass die LD₅₀ für Monozyten im humanen peripheren Blut bei ca. 100 μM und für T-Zellen im humanen peripheren Blut bei höher als 100 μM liegen.
Andere GnRH-Analoge können mit einem erfindungsgemäßen lytischen Peptid konjugiert werden. Unter den Analogen, die als Teil eines solchen Konjugats verwendet werden können, befinden sich 1-LHRH-III (oder 1-GnRH-III), SEQ ID NO:16. Es wurde berichtet, dass dieses Peptid das Wachstum mehrerer Krebszellen unterdrückt. Siehe 1. Mezö et al., „Synthesis of Gonadotropin-Releasing Hormone III Analogs. Structure-Antitumor Activity Relationships", J. Med. Chem. Vol. 40, S. 3353–3358 (1997). Das gleiche 1-LHRH-III führt selektiv die Freisetzung von FSH herbei. Siehe W. Yu et. al., „A hypothalamic follicle-stimulating hormone-releasing decapeptide in the rat", Proc. Natl. Acad. Sd., USA, Vol. 94, S. 9499–9503 (1997); und US-Patentanmeldung, Aktenzeichen 08/869,153 , angemeldet am 4. Juni 1997. Die lytischen Peptid-Konjugate von 1-LHRH-III sind als Kontrazeptiva und in der Behandlung von Krebserkrankungen, wie zum Beispiel den Prostatakarzinomen, nützlich. Agonisten von 1-LHRH-III, wie sie zum Beispiel in der US-Patentanmeldung, Aktenzeichen 08/869 153 offenbart sind, können ebenso angewendet werden.
Verschiedenes
Wie in den Ansprüchen verwendet, versteht man unter einer „wirksamen Menge" einer Zusammensetzung eine Menge, die zur selektiven Abtötung der targetierten Zellen in einer Hintergrund-Population von nicht targetierten Zellen ausreicht. Wo vom Kontext her angemessen, versteht man unter einer „wirksamen Menge" einer Zusammensetzung auch eine Menge, die die zur Induktion einer Langzeitkontrazeption oder Sterilität in einem Tier ausreicht. Wo vom Kontext her angemessen, versteht man unter einer „wirksamen Menge" von GnRH oder 1-LHRH-III eine Menge, die zur temporären Wiederherstellung der Fertilität in einem Tier, das durch Zerstörung von gonadotropen Zellen steril gemacht wurde, ausreicht. Wie in den Ansprüchen verwendet, ist beabsichtigt, dass der Begriff „Tier" sowohl humane als auch nicht humane Metazoen einschließt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer Verbindung, umfassend: (a) eine Hormon-Domäne, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Gonadotropin-Releasing-Hormon, der β-Untereinheit des Choriongonadotropins, bLH, luteinisierendem Hormon, Choriongonadotropin und Analogen dieser Hormone; und (b) eine lytische Peptid-Domäne, worin die Hormon-Domäne und das lytische Peptid zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des Brustkrebses chemisch aneinander gebunden sind.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Hormon-Domäne, ohne eine intermediäre Verknüpfungsdomäne, welche die genannte Hormon-Domäne mit der genannten lytischen Peptid-Domäne verbindet, direkt an die genannte lytische Peptid-Domäne gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die genannte lytische Peptid-Domäne aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Cecropin-Peptid, einem Melittin-Peptid, einem Defensin-Peptid, einem Magainin-Peptid, einem Sarcotoxin-Peptid und Analogen der genannten Peptide.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die genannte lytische Peptid-Domäne Hecate umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Verbindung die Sequenz SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Verbindung die Sequenz SEQ ID NO:12 oder SEQ ID NO:15 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Hormon-Domäne oder die genannte lytische Peptid-Domäne oder beide Aminosäurereste in der D-Konformation umfassen.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, zusätzlich umfassend eine Trägerdomäne zur Erleichterung der Aufnahme durch den Darm, wenn die Verbindung oral verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 8, worin die genannte Trägerdomäne eine Vitamin B₁₂-Domäne umfasst.