DE69826255T2

DE69826255T2 - uPAR-IMITIERENDE PEPTIDE

Info

Publication number: DE69826255T2
Application number: DE69826255T
Authority: DE
Inventors: Francesco Blasi; Francesca Fazioli; Massimo Resnati; Sidenius Nicolai
Original assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Universita degli Studi di Milano; Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor
Current assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Universita degli Studi di Milano; Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-18
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2018-03-19
Also published as: AU7036398A; EP0970106A1; US6462170B1; DE69826255D1; DK0970106T3; EP0970106B1; CA2283637C; ATE276268T1; ES2224378T3; CA2283637A1; WO1998042733A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung oder Aktivierung der Migration von Zellen in einem Säugetier, insbesondere einem Menschen. Das Verfahren umfasst die Verwendung von synthetischen Peptiden oder von definierten rekombinanten löslichen Formen des Urokinaserezeptors, um die Rekrutierung von Entzündungszellen in einem Säugetier durch Stimulation eines zellulären Adaptors, welcher die chemotaktische Aktivität von uPA vermittelt, zu aktivieren. Dieser Mechanismus erfordert die Proteaseaktivität der Urokinase nicht. Tatsächlich umgeht er ihn durch eine Wirkung auf einen Schritt stromabwärts, nämlich die Wechselwirkung eines solchen Peptids oder einer rekombinanten löslichen Form des Urokinaserezeptors mit einem zellulären Adaptor. Außerdem sind die hergestellten Reagenzien auch nützlich, um Arzneimittel zu identifizieren und isolieren, welche diese Verfahren der Zellrekrutierung inhibieren können, und folglich bei der Blockierung des malignen Krebsphänotyps und von aggressiven hyper- oder autoentzündlichen Erkrankungen verwendet werden können.
Allgemeiner Hintergrund
Zellmigration und Erkrankung
Die Antwort des menschlichen Körpers auf schädliche Stimuli ist abhängig von der lokalen Produktion von inflammatorischen Molekülen und ebenso von der Rekrutierung von spezialisierten Zellen, welche aus dem Blut und dem benachbarten Gewebe in die geschädigte Stelle migrieren. Diese Zellen, Neutrophile, Monocyten-Makrophagen, Lymphozyten und Endothelzellen reagieren auf spezifische migratorische Stimuli und bilden eine Abwehrreaktion auf, welche die Zerstörung und Beseitigung des schädlichen Agens oder Organismus ergibt. Obwohl sie für die Abwehr des Wirts unentbehrlich und zuträglich ist, kann diese Art der Reaktion sich auch als gefährlich für den Wirt erweisen oder den Erfolg von einigen therapeutischen oder präventiven Ansätzen, wie etwa einer Transplantation und Impfung, behindern. Es existieren tatsächlich eine Reihe von schweren pathologischen Entitäten, welche dem Ausmaß oder einer fehlenden migratorischen Zellreaktion zugeordnet werden können. Beispielsweise können immundefiziente Patienten nicht auf infektive Agenzien reagieren und dies kann von der Unfähigkeit der Zellen herrühren, sich auf die geschädigte oder infizierte Stelle zuzubewegen. Ein Übermaß der Rekrutierung kann andererseits für destruktive Pathologien verantwortlich sein, in welchen Abwehrzellen Zellen und Funktionen des Wirts attackieren, wie es beispielsweise bei Autoimmunerkrankungen vorkommt. Eine Störung der richtigen Reaktion auf eine Impfung kann außerdem auch von einer unerwünschten Rekrutierung von Entzündungszellen des Wirts abhängen, welche die Antigenzellen zu schnell zerstören, um eine immunologische Reaktion zu fördern. Die Verfügbarkeit eines speziellen "Adjuvans" gegen natürliche Immunzellen wäre vorteilhaft, da es eine stärkere Antikörperreaktion erzeugen würde.
Die Malignität von Krebszellen besteht meist in der Fähigkeit, sich im Umkreis auszubreiten und über eine Entfernung zu metastasieren; aber an diesem Prozess nehmen nicht-maligne stromale Wirtszellen aktiv bei der Etablierung des malignen Phänotyps und folglich des destruktiven und invasiven Phänotyps teil. Obwohl die betroffenen Mechanismen weitgehend unbekannt sind, ist klar, dass stromale Zellen nicht nur auf Stimuli reagieren, welche von den Krebszellen ankommen, sondern auch durch ihre eigenen Mechanismen Krebszellen Signale senden. Um den invasiven Krebsphänotyp zu blockieren, ist es folglich wesentlich, sowohl auf Krebs- als auch auf stromale Zellen einzuwirken.
Das Urokinase/Urokinaserezeptor-System
Die Aktivität von Urokinase (uPA) kann auf die Zelloberfläche begrenzt werden durch die Anwesenheit eines spezifischen Rezeptors (uPAR, CD87). uPA ist eine Serinprotease, die bei der Beibehaltung des fibrinolytischen Zustands des Körpers wichtig ist, da sie Plasmin aus Plasminogen erzeugt und folglich eine Fibrinablagerung verhindert. Plasmin ist eine Protease mit breitem Spektrum, welche viele Proteine der extrazellulären Matrix und folglich die interzellulären Verbindungen und die Verbindungen von der Zelle zur extrazellulären Matrix zerstören kann. Es ist schon lange erkannt worden, dass uPA und uPAR Regulatoren der Zellmigration sind und folglich bei einer Entzündung und Krebsinvasion von Bedeutung sind. Außer den Funktionen, welche mit ihrer proteolytischen Aktivität verbunden sind, besitzt uPA andere Eigenschaften, welche keine proteolytische Aktivität, sondern nur die Bindung an den Rezeptor erfordern. Tatsächlich sind die proteolytische Aktivität und die Rezeptorbindungsaktivität auf dem uPA-Molekül getrennt und können einzeln untersucht werden (Rezeptorbindung im aminoterminalen Fragment, Proteolyse im carboxyterminalen Fragment). Unter den Funktionen, welche die proteolytische Komponente von uPA nicht erfordern, sind die Stimulation der Mitogenese, die Zellmigration, die Adhäsion und insbesondere die Chemotaxis (Gudewicz und Bilbo, 1987; Gyetko et al., 1994; Resnati et al., 1996; Besser et al., 1996).
Der spezifische uPA-Rezeptor (uPAR) ist ein durch GPI verankertes Plasmamembranprotein, welches eine sehr hohe Affinität (Kd von 0,1–1 nM) für uPA, pro-uPA und inhibierte Formen von uPA, wie etwa den uPA-PAI-1-Komplex (Fazioli und Blasi, 1994) besitzt. Neben uPA bindet uPAR auch Vitronectin mit einer Affinität von etwa 10–20 nM, ebenso wie Integrine. Strukturell wird uPAR durch drei Wiederholungen von etwa 90 Aminosäureresten gebildet, welche durch zwei Linkerregionen verbunden sind (Dan⌀, Blasi et al., 1990; Behrendt et al., 1991), welche funktionell und strukturell unterschiedliche Domänen definieren: die aminoterminale Domäne (D1) enthält die uPA-Bindungsstelle, während die carboxyterminale Region, welche die Domänen D2 und D3 enthält, Vitronectin bindet. Aber die Integrität der Struktur mit drei Domänen ist notwendig für eine Bindung an uPA mit hoher Affinität, zumindest bei dem gereinigten, löslichen Protein (Dan⌀ et al., 1994). Bislang ist hinsichtlich der Funktion der Linkerregionen keine Information verfügbar.
uPAR wird in zirkulierenden Blutzellen exprimiert, insbesondere in Monozyten, Neutrophilen und T-Lymphozyten, nicht aber in Erythrozyten oder B-Lymphozyten. Außerdem ist uPAR ein Zielgen bei der Lymphozyten- und Makrophagenaktivierung (CD87). Monozyten und monozytenartige Zellen (wie etwa HL 60, U937) exprimieren uPAR tatsächlich, oder werden durch eine Vielzahl von Cytokinen und anderen Agenzien, wie etwa Phorbolester PMA, Phytohämagglutinin, baterielles Liposaccharid, TGFb1/Vitamin D3, GM-CSF, IFNg, TNFa und andere zur Überexpression von uPA induziert. In humanen T-Lymphozyten induziert eine Stimulierung des TCR/CD3-Komplexes, die Lymphokine IL2, IL4, IL7 oder die einhergehende Aktivierung des T-Zellrezeptors und das Eingreifen von Integrinen alle eine uPAR-Expression (Nykjær et al., 1994; Bianchi et al., 1996). Es ist auch erwähnenswert, dass tumorinfiltrierende T-Lymphozyten uPAR stark exprimieren, und dass einige der Eigenschaften der aktivierten T-Lymphozyten, insbesondere deren Migration durch wiederhergestellte Basalmembranen zumindest teilweise von uPA und uPAR abhängig zu sein scheinen (Bianchi et al., 1996). Im Hinblick auf den wichtigen Beitrag von stromalen Zellen zur Invasivität von Krebs ist es auch wichtig, zu betonen, dass Makrophagen, welche in humanem Brustkrebs und anderen Krebsarten, bei denen die Spiegel der uPAR-Produktion durch den Tumor insgesamt bedeutend zu deren Malignität beitragen, hohe Spiegel von uPAR exprimieren (Brünner et al., 1996). Die Kooperation zwischen stromalen Zellen und Krebszellen bei der Invasivität von Krebs deutet an, dass eine hohe Expression von uPAR durch Krebszellen oder stromale Zellen eine Zellprognose betreffen können, möglicherweise durch unterschiedliche Mechanismen in Abhängigkeit vom überexprimierenden Zelltyp.
uPA/uPAR und Chemotaxis
Die Kooperation zwischen Krebszellen und stromalen Zellen wirft das Problem auf, wie die uPAR-Expression bei stromalen Zellen die Malignität von Krebszellen beeinflusst. Da das uPA/uPAR-System eine chemotaktische Aktivität besitzt, kann die Produktion von uPAR durch stromale Zellen Krebszellen durch eine chemokinartige Wirkung anziehen. In der Tat sind von bestimmten Zellen erzeugte Chemokine an einem Präsentationsmolekül in der extrazellulären Matrix verankert und ziehen andere Zellen an, welche spezielle Rezeptoren besitzen (Schall und Bacon, 1996). Die für das uPA/uPAR-System verfügbare Information stützt diese Möglichkeit.
Offenbarung der Erfindung
uPA/uPAR und Chemotaxis
Die Stimulierung der Chemotaxis in monozytenartigen Zellen, Fibroblasten und einigen Krebszellen erfordert den spezifischen Zelloberflächen-uPAR (CD87), welcher die chemotaktische Wirkung von uPA vermittelt (Resnati et al., 1996). Eine Chemotaxis durch uPA erfordert nicht deren Proteaseaktivität, sondern nur die Besetzung ihres Rezeptors, und kann mit der enzymatisch inaktiven Rezeptor bindungskomponente ATF (aminoterminales Fragment), mit pro-uPA und mit durch Chymotrypsin gespaltenem löslichem uPAR reproduziert werden (Resnati et al., 1996). Bei Mäusen wird die Bedeutung dieses Systems bei der Zellrekrutierung in vivo durch die Tatsache gezeigt, dass uPA für die Entzündungsreaktion wesentlich ist; in der Tat sind Mäuse ohne das uPA-Gen höchst mangelhaft bezüglich der Reaktion auf Bakterien und möglicherweise andere Infektionen, und sind unfähig zur Rekrutierung von T-Lymphozyten und Makrophagen an die Infektionsstelle (Gyetko et al., 1996). Beim Menschen werden uPA und uPAR während der T-Zellaktivierung induziert und tragen direkt zu der in vitro-Migration von humanen T-Zellen bei (Nykjær et al, 1994; Bianchi et al., 1996). Außerdem exprimieren tumorinfiltrierende T-Lymphozyten uPAR in hohem Maße (Bianchi et al., 1996).
Die uPA-abhängige Chemotaxis wird vermittelt durch die Aktivierung von Tyrosinkinasen der Src-Familie (d. h. Hck in Monozyyten und Src in Fibroblasten). Die betroffenen Mechanismen erfordern, dass uPA die uPAR-Konformation so verändert, dass es an einen noch nicht identifizierten Adaptor binden kann. In der Tat besitzt ein Gemisch aus Fragmenten, erzeugt durch Spaltung eines löslichen rekombinanten uPAR mit Chymotrypsin in Zellen ohne uPAR eine sehr wirksame chemotaktische Aktivität (IC50 von 10–20 pM) (Resnati et al., 1996).
In Assays mit einer Boyden-Kammer induziert uPA oder Derivate davon eine Migration durch einen chemotaktischen Gradienten in Nebennierenkapillarenendothelzellen des Rindes, Keratinozytenzelllinien, Monozyten, monozytenähnlichen Zellen, Fibroblastenzelllinien und in Neutrophilen sowohl in vitro als auch in vivo (Besser et al., 1996; Resnati et al., 1996). Die Beteiligung von uPAR in die Chemotaxis ist nicht nur eine direkte Beteiligung, sondern kann auch indirekt sein durch Überlagerung mit der Chemotaxis, welche durch andere Chemokine induziert wird. Die Exposition von humanen Neutrophilen gegenüber einem chemotaktischen Gradienten von FMLP oder MCP-1-Chemokin lokalisiert uPAR an führenden Rand der migrierenden Zelle; Anti-uPAR-Antikörper entfernen die chemotaktische Aktivität. Die chemotaktische Wirkung von FMLP oder MCP-1 erfordert nicht die proteolytische Aktivität von uPA, aber die uPAR-Besetzung ist für eine Chemotaxis absolut erforderlich, da uPAR- Antikörper oder eine Expression von Antisense-RNA die FMLP- oder MCP-1-Aktivität vollständig aufhebt.
Die Schritte zwischen der Bindung von Chemokinen an Chemokinrezeptoren und Zellbewegungen sind zahlreich und komplex: Signaltransduktion, Umorganisation des Cytoskeletts, Bildung von fokalen Adhäsionen, Anheftung und Ablösung vom Substrat mit einer Pseudopodien-Ausdehnung und Verkürzung zum Bewirken einer gerichteten Migration (Premack und Schall, 1996). Die chemotaktische Aktivität von uPAR besitzt viele der Eigenschaften von Chemokinen. In Neutrophilen ist eine Wechselwirkung zwischen uPAR und Integrinen beobachtet worden: Es ist gezeigt worden, dass das Leukozytenintegrin CD11b/CD18, aMb2, auch als Komplementrezeptor Typ-3 (CR3) bekannt, physisch mit uPAR assoziiert ist. Diese Wechselwirkung ist reversibel und korreliert mit der Zellgestalt. In ruhenden Zellen sind uPAR und CR3 colokalisiert, aber nach einer spontanen Zellpolarisierung und Migration dissoziieren die zwei Rezeptoren, CR3 konzentriert sich in den Uropoden und uPAR in den Lamellipoden der polarisierten Zellen. Da CR3 die Zelladhäsion, Chemotaxis und Zellmigration in Entzündungsstellen reguliert, kann die Wechselwirkung mit uPAR für alle diese Funktionen und folglich für die Zellrekrutierungswirkung von uPA/uPAR zentral sein. Es ist jedoch keine Information verfügbar im Hinblick darauf, ob dieses Integrin (oder andere) direkt in die Vermittlung des chemotaktischen uPAR-Signals involviert ist, d. h. ob dieses Integrin der bislang nicht identifizierte Adaptor ist.
Eine Aktivierung und Migration durch eine Besetzung des uPAR wird auch in Epithelzelllinien beobachtet, wobei uPAR mit einer Proteinkinase assoziiert, welche zwei Cytokeratine, CK18 und CK8, am Serin phosphorylieren kann. Das verantwortliche Enzym ist wahrscheinlich die Proteinkinase Cz, da der Prozess unabhängig ist von Ca2+, resistent gegenüber einer abwärts gerichteten PMA-Modulation, und weil die Kinase spezifisch immunerkannt werden kann. In vivo sind CK18 und CK8 am Serin phosphoryliert und eine Besetzung des uPAR löst einen zeitabhängigen Anstieg der Phosphorylierung von CK8, Veränderungen der Zellgestalt und eine Wiederverteilung von Cytokeratinfilamenten aus. Eine Behandlung mit pro-uPA verursachte eine Abrundung der Zellen und eine Verringerung ihres Durchmessers. Bei Kontroll zellen waren die Cytokeratine in einer Gitteranordnung parallel zur Oberfläche der Deckgläschen verteilt; bei der Behandlung mit pro-uPA wurden wenige oder keine Cytokeratine in Filamentform beobachtet. Diese Daten verbinden die migratorische Wirkung von pro-uPA, die Aktivierung der Proteinkinase C und die Veränderungen der Zellgestalt. Bei der Bindung von pro-uPA an U937-Knochenmarkszellen tritt eine Tyrosinphosphorylierung eines nicht charakterisierten 35 kDa Proteins auf. In diesen Zellen fördert die Besetzung von uPAR die Zelladhäsion während einer PMA-induzierten Differenzierung. Es ist gezeigt worden, dass uPAR Vitronectin direkt bindet und die Zelladhäsion fördert. Darüber hinaus beeinträchtigt uPAR direkt die Substraterkennung der Adhäsionsrezeptoren durch Bildung von Komplexen direkt mit den beta-Integrinen und folglich durch Förderung der Adhäsion an Vitronectin und Inhibition der Adhäsion an Fibronectin (Wei et al., 1996). In der Tat kann uPAR mit Anti-Integrinen IgG coimmunpräzipitiert werden. Die Wirkung von uPAR auf die Zelladhäsion stimmt auch mit seiner chemokinartigen Wirkung überein. Eine direkte Wechselwirkung von uPAR mit Integrinen wird aufgrund ihrer Coimmunpräzipitation vorgeschlagen, und durch das Auffinden von Peptiden, welche die Coimmunpräzipitation spezifisch hemmen, ohne die Bindung von uPA oder Vitronectin an uPAR zu beeinträchtigen (Wei et al., 1996). Deshalb schlagen Resnati et al. (1996) vor, dass Integrine den beschriebenen Adaptor darstellen können. In dieser Hinsicht besitzen die uPAR-ähnlichen kleinen Moleküle, welche in dieser Anmeldung beschrieben werden sollen, überhaupt keine Verbindung mit dem von Wei et al. (1996) identifizierten Peptid, weder strukturell noch konzeptionell.
Bei Monozyten und Fibroblasten induziert die Besetzung von uPAR eine Chemotaxis und die Wirkung erfordert keine extrazelluläre Proteolyse (Resnati et al., 1996). In diesem System verursacht eine ATF-Bindung eine zeitabhängige und transiente Aktivierung einer Tyrosinkinase der Src-Familie, der p56/p58 Hck. Außerdem assoziiert uPAR selbst mit Tyrosinkinasen, was als ein Transmembranadaptorvermittelter Mechanismus erscheint. Tatsächlich sind Zellen ohne uPAR, welche deshalb nicht auf ATF reagieren, zu einer Chemotaxis fähig, wenn sie mit einem Gemisch von chymotryptischen Fragmenten von löslichem uPAR (Chymotrypsin spaltet uPAR in zwei Fragmente zwischen der Domäne D1 und D2) angeregt werden (Resnati et al., 1996). Diese Wirkung tritt auch in Fibroblasten auf, welche von uPAR –/– Mäusen stammen. Deshalb kann uPAR ein Zelloberflächenmolekül erkennen, welches wiederum eine Signaltransduktion vermitteln kann. Die Belegung des Oberflächen-uPAR muss in der Tat Bindungsstellen für den nicht identifizierten Adaptor exponieren und folglich uPAR von einem Rezeptor in einen Liganden transformieren. Die Rolle der Tyrosinkinasen bei der uPAR-abhängigen Chemotaxis wird auch gezeigt durch die Wirkung von Tyrosinkinaseinhibitoren, welche die chemotaktische Reaktion auf ATF verhindern, und dadurch, dass primäre src –/– Fibroblasten nicht auf den löslichen, gespaltenen uPAR reagieren (Resnati, Blasi und Fazioli, nicht veröffentlicht). Während eine uPA-Bindung an uPAR streng speziesspezifisch ist, wirkt der humane uPAR interessanterweise als chemotaktischer Faktor ebenso effizient auf humane wie auch auf murine Zellen. Insbesondere besitzt ein mit Chymotrypsin gespaltener, löslicher uPAR einen IC50 von etwa 20 pM (Resnati et al., 1996).
Die chemotaktische Eigenschaft von uPAR als ein Ziel für neue Arzneimittel, welche stromabwärts der uPA/uPAR-Wechselwirkung wirken
Das uPA/uPAR-System ist in die Invasivität von Krebszellen verwickelt und auch bei Entzündungs- und anderen Erkrankungen (Dan⌀ et al., 1990). Und tatsächlich führt die Blockierung der uPA/uPAR-Wechselwirkung durch spezifische Antagonisten oder die Verringerung der uPAR-Synthese durch Expression von Antisensegenen zu einer drastischen Verringerung der migratorischen Eigenschaft von Krebszellen (Fazioli und Blasi, 1994). Bei menschlichem Krebs steht das Expressionsniveau der Bestandteile des Systems uPA, PAI-1 und uPAR direkt im Zusammenhang mit der Malignität der Erkrankung und ihrer Prognose (Brünner et al., 1996). In der Tat haben viele, wenn nicht alle festen Krebsarten bereits metastatische Zellen freigesetzt, die im Knochenmark gefunden werden. Die Anwesenheit von uPAR-positiven metastatischen Zellen zum Zeitpunkt der Diagnose stellt ein Zeichen dar für eine extreme Wahrscheinlichkeit einer schlechten Prognose, während die Anwesenheit von metastatischen Zellen per se dies nicht darstellt.
Auf Basis des Obigen scheint uPAR ein spezifisches Ziel für neue Arten von Arzneimitteln zu sein, welche mit dem Prozess der Entzündung oder der Invasivität von Krebs interferieren. Es gibt zwei verschiedene Möglichkeiten: uPAR durch eine Be einträchtigung mit einer uPA-Bindung zu blockieren (uPAR-Antagonisten), oder die direkte Transduktion eines migratorischen Signals zu verhindern, via Wechselwirkung mit anderen Molekülen, wobei der Schritt der Wechselwirkung zwischen uPA und uPAR umgangen wird. Arzneimittel, welche die Bindung von uPAR an den zuvor genannten Adaptor verhindern, sollten auch eine Chemotaxis via uPAR verhindern. Deswegen sollten Antagonisten der Wechselwirkung von uPAR/Adaptor die Migration von Zellen blockieren oder verringern und könnten folglich bei Erkrankungen nützlich sein, bei denen diese Abnahme oder Blockierung vorteilhaft ist, wie etwa Krebs, Autoimmun- und Überschussentzündungsreaktionen.
UPAR als Ziel für Arzneimittel, welche die Rekrutierung von Entzündungszellen verstärken
Die Rekrutierung von Zellen durch die uPA/uPAR-Wechselwirkung deutet darauf hin, dass Arzneimittel gefunden werden sollten, welche die Zellrekrutierung durch Bindung an uPAR fördern. Und in der Tat sind uPA-Derivate wie etwa das aminoterminale Fragment ATF, pro-uPAR oder möglicherweise auch synthetische Peptide, welche die uPAR-Bindungsregion von uPA bedecken, in der Tat dazu in der Lage, uPA im Hinblick auf verschiedene Funktionen zu ersetzen, welche nicht die proteolytische Aktivität von uPA erfordern (siehe beispielsweise Fazioli und Blasi, 1994; Besser et al., 1996, Resnati et al., 1996). Da eine uPA-Bindung an uPAR eine Konformationsänderung verursacht, welche uPAR von einem Rezeptor für uPA in einen Liganden für einen bislang nicht identifizierten Membranadaptor transformiert (Resnati et al., 1996), wäre es andererseits eine alternative Möglichkeit zur Verstärkung der Zellrekrutierung, den ersten Schritt, d. h. den uPA/uPAR-Bindungsschritt zu umgehen, und die Zellmigration zu stimulieren durch eine Wirkung auf dem Niveau des nicht identifizierten Adaptors mit uPAR selbst oder spezifischen uPAR-ähnlichen Agonisten. Diese Agonisten könnten deshalb bei Erkrankungen nützlich sein, bei denen die Rekrutierung von Zellen aufgrund von genetischen oder erworbenen Fehlfunktionen stromaufwärts der uPAR/Adaptor-Wechselwirkung blockiert ist. Die Verfügbarkeit eines solchen Arzneimittels könnte auch in Verbindung mit der Steigerung der Immunogenität von verschiedenen Antigenen vorteilhaft sein, beispielsweise bei einer Impfung, da es möglicherweise wie ein Adjuvans wirken könnte durch Rekrutierung von Zellen, welche für die natürliche Immunität verantwortlich sind.
uPAR als ein Ziel zum Kontrollieren einer HIV-Infektion
uPAR ist ein Aktivierungsantigen sowohl in T-Lymphozyten als auch in Monozyten (Nykjær et al., 1994; Bianchi et al., 1996), d. h. in Zellen, welche aktiv migrieren können und in welchen HIV replizieren kann. Während CD3-positive zirkulierende Lymphozyten uPAR nicht oder nur schwach exprimieren, weisen CD8+ T-Lymphozyten von Patienten mit AIDS und anderen viralen Erkrankungen eine hohe Expression von uPAR auf, und in mehreren dieser Patienten sind bis zu 80% ihrer T-Lymphozyten hochexprimierend (Nykjær et al., 1994). Ein Teil der Personen bleibt trotz einer mehrfachen sexuellen Exposition mit hohem Risiko durch HIV nicht infiziert, und dies ist verbunden mit dem Vorliegen von HIV-suppressiven Faktoren in ihrem Blut (Paxton et al., 1996). Es sind mehrere Chemokine als HIV-suppressive Faktoren identifiziert worden, welche von CD8+ T-Zellen erzeugt werden (Cocci et al., 1996), und diese Chemokine stellen neue Ziele für eine AIDS-Therapie dar. Im Blut existieren lösliche Formen von uPAR und uPAR wird tatsächlich in Zelllinien und in Krebsgeweben gespalten. Da eine Spaltung die chemotaktische Aktivität von löslichem uPAR aktiviert (Resnati et al., 1996), könnten diese löslichen, gespaltenen Formen wie tatsächliche Chemokine auch mit der Infektivität oder dem Überleben von HIV interferieren. Wenn eine gespaltene Form von löslichem uPAR auch in die HIV-Infektivität oder Resistenz involviert ist, könnte dies ein Ziel für eine neue Art der Therapie in Fällen von AIDS darstellen.
uPAR als Ziel für Arzneimittel, welche die Wundheilung verbessern
Übermäßige Fibrinablagerungen werden in plasminogendefizienten, uPA-defizienten und in doppelt uPAR/tPA-defizienten Mäusen beobachtet, und diesem Mäusen fehlt ebenso die Hautwundheilung (Carmeliet und Collen, 1996). Bei diesem Phänomen können mehrere Mechanismen aktiv sein, einschließlich Chemotaxis, da uPAR an dem führenden Rand von migrierenden Keratinozyten während der erneuten Epithelisierung von Hautwunden bei Mäusen lokalisiert ist. Die Bedeutung von Monozyten und Makrophagen im Prozess der Wundheilung macht es sogar noch wahr scheinlicher, dass dieser Prozess durch einen uPAR-Agonisten, welcher seine chemotaktische Eigenschaft reproduzieren kann, verstärkt wird.
Neuer Ansatz zum Blockieren von uPAR
Bislang sind Ansätze, welche auf die Blockierung der Wirkung von uPAR bei der Zellmigration gerichtet waren, auf die Suche von uPAR-Antagonisten beschränkt gewesen, d. h. auf Arzneimittel, welche die Bindung von uPA an uPAR verhindern. Es wird erwartet, dass solche Arzneimittel im Allgemeinen eine proteolytische Aktivität der Zelloberfläche inhibieren. Aber eine Bindung von uPA an uPAR simuliert die Chemotaxis durch Transformation dieses Moleküls von einem Rezeptor in einen Liganden für einen Adaptor (Resnati et al., 1996). Deshalb gibt die Identifizierung eines kleinen Moleküls, welches die chemotaktische Aktivität von uPAR nachahmt, eine neue Handhabe zur Kontrolle der uPAR-abhängigen Reaktionen, unabhängig von der Belegung durch uPA. In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung sind solche kleinen Moleküle gefunden und charakterisiert worden. Sie agieren stromabwärts der uPA/uPAR-Wechselwirkung und besitzen deswegen keine Wirkung auf die proteolytische Aktivität der Zelloberfläche. Diese kleinen Moleküle können sowohl in Fällen einer Defizienz (als Stimulatoren im Prozess) als auch in Fällen einer überschüssigen Zellrekrutierung und Migration verwendet werden. Im letzteren Fall können die uPAR-ähnlichen kleinen Moleküle verwendet werden, um geeignete Inhibitoren der uPAR-Adaptor-Wechselwirkung zu identifizieren.
uPA ist wesentlich für die Rekrutierung von Entzündungszellen, bindet uPAR und induziert eine Chemotaxis durch ein direktes Signal in einer uPAR-abhängigen Art und Weise. In dieser Funktion wechselwirkt uPAR mit einem nicht identifizierten Adaptormolekül, und tatsächlich besitzt ein Gemisch von chymotryptischen Fragmenten des löslichen uPAR eine chemotaktische Wirkung. Die vorliegende Erfindung basiert auf dieser Feststellung des Mechanismus, durch welchen uPAR die Chemotaxis aktiviert. Zuerst wurde die Region von uPAR identifiziert, welche eine Chemotaxis induziert. Wie in Beispiel 1 gezeigt wird, wurden lösliche Fragmente von uPAR entweder durch Auftrennung von mit Chymotrypsin gespaltenem uPAR oder durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt, und wurden in einem Chemotaxis-Assay verwendet, um die Region des uPAR zu lokalisieren, welche für die chemotaktische Wirkung auf THP-1-Zellen verantwortlich ist. Solch eine Region (Reste 88–92 von uPAR) wurde in der Linkerregion zwischen der Domäne D1 und D2 lokalisiert. Die chemotaktische Aktivität wurde tatsächlich entweder in der Domäne D1 oder D2 gefunden, wann immer sie diese Linkerregion enthielten: carboxyterminal von Domäne D1 oder aminoterminal von Domäne D2. In Beispiel 2 wurde die chemotaktische Aktivität von uPAR unter Verwendung synthetischer Peptide einschließlich der 88–92 uPAR-Sequenz des uPAR, auf humane monozytenartige THP-1-Zellen (und murine LB6-Fibroblastenzellen) reproduziert. Synthetische Moleküle (Peptide 1 und 2) einschließlich der Sequenz SRSRY (ser-arg-ser-arg-tyr) (SEQ ID NO: 7) besaßen eine sehr wirksame chemotaktische Aktivität bei so geringen Konzentrationen wie etwa 0,1 pM. Kontrollpeptide besaßen keine Aktivität, insbesondere ein Peptid, welches die carboxyterminale Sequenz, abgeleitet von uPAR cDNA enthielt, und ein Peptid mit der gleichen Aminosäurezusammensetzung wie Peptid 1, aber einer „durcheinandergewürfelten" Sequenz. In Beispiel 3 zeigen wir, dass Peptid 1 die Chemotaxis durch den gleichen Mechanismus stimuliert, welcher durch den Ligand uPA oder durch das Gemisch von Chymotrypsinfragmenten des löslichen uPAR angewendet wird. Peptid 1 aktiviert tatsächlich die Hck-Tyrosinkinase von THP-1-Zellen mit dem gleichen Zeitverlauf und der gleichen Konzentrationsabhängigkeit, welche bei dem Gemisch von Chymotrypsinfragmenten des löslichen uPAR beobachtet wurde. Beispiel 4 zeigt, wie Inhibitoren des uPAR durch Anwendung eines einfachen Panning-Assays praktisch identifiziert werden können unter Verwendung von Peptiden, welche den uPAR nachahmen, d. h. Peptid 1 und 2 der Erfindung.
Innerhalb des Umfangs der erfindungsgemäßen uPAR-Peptide sind uPAR-Peptide, welche von einem uPAR stammen, der in Säugetierspezies wie etwa dem Mensch, dem Rind, der Maus und der Ratte gefunden wurde.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "funktionelles Analogon" ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, welche nicht mit einem durch Chymotrypsin gespaltenen suPAR-Peptid identisch ist, aber welches im Hinblick auf die Stimulation oder Steigerung der chemotaktischen Aktivität einer Zelle eine im Wesentlichen identische Wirkung besitzt. Diese Wirkung wird normalerweise in einem Assay getestet, wie etwa dem in Beispiel 1 beschriebenen Assay. Die Steigerung der chemotaktischen Aktivität in solch einem Assay beträgt bevorzugt mindestens 100% der Kontrolle, mehr bevorzugt mindestens 200% der Kontrolle, noch mehr bevorzugt mindestens 400% der Kontrolle.
Funktionelle Analoga der chemotaktischen Aktivität des humanen uPAR gemäß der vorliegenden Erfindung sind:
Peptide mit einer 80%igen Sequenzidentität mit einem der aufgeführten Peptide, und welche eine Wirkung im Assay aufweisen, können erfindungsgemäß auch verwendet werden. Folglich ist die vorliegende Erfindung in einem Aspekt auf die Verwendung eines Peptids mit einer Sequenzidentität von 80% mit einem der aufgeführten Peptide für die Herstellung eines Medikaments nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und 15 bis 17 gerichtet.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft folglich ein Peptoidanalogon des Peptids mit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7), umfassend eine oder mehrere nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, wie in WO 94/28014 aufgezählt.
Die erfindungsgemäßen Peptoidanaloga können beispielsweise hergestellt werden unter Verwendung von Peptidsyntheseverfahren, wie etwa dem von Merrifield 1963 beschriebenen Verfahren. Die Synthese kann bei der Herstellung eine beliebige Anzahl von nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren und gegebenenfalls auch ein oder mehrere natürlich vorkommende Aminosäuren umfassen. Die Peptide und funktionelle Analoga der Erfindung können in einer wirksamen Menge direkt zu Zellen zugegeben werden oder einem Individuum, wie etwa einem menschlichen Patienten, verabreicht werden, welcher die Zellen besitzt, deren chemotaktische Aktivität stimuliert oder gesteigert werden kann.
Ein sehr wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäßen Peptide. Solche Peptide sind ein Peptid mit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) oder ein funktionelles Analogon davon, wie oben definiert, und ein Peptid mit der Sequenz AVTYSRSRYLEC (SEQ ID NO: 1) und ein Peptid mit der Sequenz SRSRYLEC (SEQ ID NO: 3).
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein rekombinantes Fusionsprotein, umfassend ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptidspezies und gegebenenfalls zusätzlich ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptidspezies.
Erfindungsgemäße funktionelle Analoga, welche unter Verwendung einer Peptidsynthese hergestellt werden, sind innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Funktionelle Analoga gemäß der Erfindung, welche unter Verwendung anderer Verfahren als einer Peptidsynthese hergestellt werden, wie etwa unter Verwendung einer rekombinanten Expression, liegen auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung oder Verstärkung einer lokalen Entzündungsreaktion. Erfindungsgemäß kann das erfindungsgemäße, mit Chymotrypsin gespaltene Fragment oder ein Gemisch von Fragmenten von uPAR, das Fragment oder ein Gemisch von Fragmenten mit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) oder ein funktionelles Analogon des Peptids wie oben definiert verwendet werden.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Stimulation oder Verstärkung einer lokalen Entzündungsreaktion", dass ein oder mehrere Charakteristika einer Entzündungsreaktion messbar stimuliert oder gesteigert werden können. Solche Charakteristika sind normalerweise die Freisetzung von Cytokinen durch T-Lymphozyten oder Monozyten-Makrophagen, die Steigerung der chemotaktischen Aktivität, die Fähigkeit, eine lokale Rekrutierung von Lymphozyten/Monozyten nach subkutaner Verabreichung in einem geeigneten Labortier zu verursachen usw. In diesem besonderen Fall ist die Verwendung von uPA-defizienten Mäusen besonders bevorzugt, da diese Mäuse eine sehr geringe entzündungshemmende Reaktion aufweisen. Verfahren zur Messung dieser Aktivitäten sind routinemäßig verfügbar, und eine Steigerung solcher beschriebener Aktivitäten von mindestens 50%, bevorzugt von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von mindestens 100% werden als signifikant betrachtet.
Ein anderer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids, insbesondere eines Peptids mit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) oder eines funktionellen Analogons des Peptids, wie oben definiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulation oder Steigerung der chemotaktischen Aktivität einer Zelle.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulation oder Verbesserung der Wundheilung: Insbesondere kann ein Peptid mit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) oder ein funktionelles Analogon des Peptids, wie oben definiert gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Stimulation oder Verbesserung der Wundheilung", dass mindestens eines der physiologischen Charakteristika oder Prozesse, welche bei der Heilung von verschiedenen Arten von Wunden in einem Individuum, wie etwa einem Menschen, betroffen sind, wesentlich stimuliert oder verbessert ist. Eine Art der Quantifizierung einer solchen Stimulation oder Verbesserung der Wundheilung umfasst das Messen der Wundheilung in einer Plasminogen-defizienten oder sogar einer normalen Maus und die Bestimmung der Zeit, die für 50% Heilung erforderlich ist. Eine Verringerung der Heilungszeit nach Zugabe einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, welche ein suPAR-Peptid umfasst, von mindestens 20%, bevorzugt von mindestens 50%, stellt eine wesentliche Stimulation der Wundheilung dar.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulation der Kinaseaktivität von p56/p59^hck. Insbesondere kann ein Peptid mit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) oder ein funktionelles Analogon des Peptids, wie oben definiert, verwendet werden.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Stimulation der Kinaseaktivität" einen wesentlichen Anstieg der Fähigkeit von p56/p59^hck, das Proteinsubstrat zu phosphorylieren. Dies wird normalerweise gemessen unter Verwendung von in vitro-Assays, wie diejenigen, welche in Beispiel 3 beschrieben werden. Die Quantifizierung solch einer Wirkung kann erhalten werden durch Ausschneiden der Banden aus einem Gel, wie etwa dem in 5 gezeigten Gel, und anschließendem Messen der 32P-Radioaktivität nach einer Normalisierung.
Ein sehr wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen, ob eine Verbindung die Bindung zwischen einer mit Chymotrypsin gespaltenen, löslichen Form von uPAR gemäß der vorliegenden Erfindung und einem zellulären Adaptor stimulieren kann, wobei das Verfahren das Zugeben einer wirksamen Menge der Verbindung zu einem Testsystem umfasst, welches Zellen ohne endogenen uPAR umfasst, und Messen der chemotaktischen Aktivität; wenn eine chemotaktische Aktivität vorliegt, dann kann die Verbindung die Bindung stimulieren.
Im vorliegenden Zusammenhang sollte der Begriff "Stimulation der Bindung" so aufgefasst werden, dass eine Steigerung der Bindung um mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, mehr bevorzugt mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 60% in einem Assay gemeint ist, welcher im Wesentlichen dem oben beschriebenen ähnelt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet für die Selektion einer Verbindung, welche die Bindung zwischen einer mit Chymotrypsin gespaltenen, löslichen Form von uPAR und einem zellulären Adaptor stimulieren kann.
Ein besonders wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen, ob eine Verbindung in der Lage ist, die Bindung zwischen einer mit Chymotrypsin gespaltenen, löslichen Form von uPAR gemäß der vorliegenden Erfindung und einem zellulären Adaptor zu blockieren oder zu inhibieren, wobei das Verfahren das Zugeben einer mit Chymotrypsin gespaltenen, löslichen Form des uPAR und einer wirksamen Menge der Verbindung zu einem Testsystem, welches Zellen ohne endogenen uPAR umfasst, und Messen der chemotaktischen Aktivität umfasst. Wenn die chemotaktische Aktivität inhibiert oder verhindert wird, dann kann die Verbindung diese Bindung blockieren.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "Blockierung oder Inhibition der Bindung" so aufgefasst werden, dass er eine Verringerung der Bindung um mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, mehr bevorzugt um mindestens 40%, noch mehr bevorzugt um mindestens 60% in einem Assay bedeutet, der im Wesentlichen dem oben beschriebenen ähnelt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet für die Selektion einer Verbindung, welche die Bindung zwischen einer mit Chymotrypsin gespaltenen, löslichen Form von uPAR und einem zellulären Adaptor blockieren oder inhibieren kann.
Eine wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung gemäß der Erfindung zur Behandlung von Krebs, einer Autoimmunerkrankung und/oder hyperinflammatorischen Erkrankungen. Eine Verbindung, welche in der Lage ist, die Bindung zwischen einer mit Chymotrypsin gespaltenen, löslichen Form von uPAR und einem zellulären Adaptor zu blockieren, wird erfindungsgemäß einem Individuum wie etwa einem menschlichen Patienten verabreicht, welcher der Verabreichung bedarf, in einer pharmazeutisch annehmbaren Form und in einer pharmazeutisch wirksamen Menge.
Ein sehr wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen im Hinblick auf mögliche entzündungshemmende oder anti-migratorische Eigenschaften. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst

(a) Beschichten einer Kunststoffoberfläche, welche Säugetierzellen normalerweise nicht bindet, mit einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids,
(b) Exponieren der ausgewählten Säugetierzellen gegenüber der beschichteten Oberfläche für 30–300 Minuten bei 37°C in Anwesenheit oder Abwesenheit einer potenziellen Inhibitorverbindung und
(c) Untersuchen der Fähigkeit der Zellen, an die mit Peptid beschichtete Oberfläche zu binden, durch mikroskopische Untersuchung oder Färbung der Platten mit Coomassie-Blau; wenn die zelluläre Bindung inhibiert oder verhindert wird, dann kann die Verbindung diese Bindung blockieren und ist ein potenzielles entzündungshemmendes oder anti-migratorisches Mittel.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Oligonukleotide, insbesondere Oligonukleotide, welche für die Peptide codieren, die durch SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 dargestellt sind.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids zur rekombinanten Expression von Peptiden zur Verwendung beim Screening von erfindungsgemäßen Verbindungen.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen die Verwendung von erfindungsgemäßen Oligonukleotiden, worin die rekombinante Expression in einem Expressionssystem durchgeführt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem E.coli-Expressionssystem, einem Hefe-Expressionssystem, einem Säugetier-Expressionssystem oder einem Insektenzellen-Expressionssystem.
Wenn die erfindungsgemäßen Oligonukleotide als Basis für die Herstellung von erfindungsgemäßen Peptiden verwendet werden mittels Durchführung einer rekombinanten Expression, ist es bevorzugt, die Oligonukleotide mit Nukleinsäuresequenzen zu kombinieren, wie etwa regulatorischen Sequenzen, welche es ermöglichen, dass das Expressionssystem der Wahl große Mengen der Peptide exprimiert.
Ein besonders wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines eukaryontischen Vektors, welcher eine Nukleinsäuresequenz exprimiert, die für ein erfindungsgemäßes Peptid codiert, insbesondere ein Peptid mit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) oder ein funktionelles Analogon davon, wie oben definiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung oder Steigerung der Anti-Tumor-Immunität bei einer autologen Knochenmarkstransplantationsbehandlung eines Individuums, wie etwa eines menschlichen Patienten, welcher Tumoren trägt. Das Medikament ist nützlich zur Modifikation von Tumorzellen durch deren Transfektion mit dem Vektor.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Anti-Tumor-Immunität" die Gruppe von zellulären und chemischen Reaktionen, welche ein Organismus mit dem Ziel der Abstoßung eines Tumors organisieren kann. In dieser Hinsicht ist die Erzeugung von Cytokinen und Chemokinen von wesentlicher Bedeutung, da sie die Rekrutierung und die funktionelle Aktivierung von Zellen steuert, welche die Tumorzellen spezifisch angreifen und folglich zerstören können.
Ein anderer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids, insbesondere eines Peptids mit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) oder eines funktionellen Analogons davon, wie oben definiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung oder Steigerung einer zellulären Immunität in einem Individuum, wie etwa einem humanen Patienten, welcher immundefizient ist.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "zelluläre Immunität" die Rekrutierung und funktionelle Aktivierung von Immunzellen, wie etwa T-Lymphozyten, NK-Zellen, B-Lymphozyten, Makrophagen usw.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Immundefizient", dass das Immunsystem eines Individuums beeinträchtigt ist und folglich auf einem Niveau unterhalb des normalen Niveaus fungiert, zumindest im Hinblick auf einige der systemischen Reaktionen.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer humanen Tumorzelllinie, welche sowohl auf Basis des Histotyps als auch des HLA-A2 kompatibel ist und so modifiziert ist, dass sie die chemotaktische Region des humanen oder murinen oder bovinen oder Ratten-uPAR freisetzt, wobei die chemotaktische Region ein Fusionspeptid oder eine Domäne von uPAR ist, welche das SRSRY (SEQ ID NO: 7) Peptid oder ein funktionelles Analogon davon, wie oben definiert, enthält, für die Herstellung eines Mittels zur Impfung eines Patienten, etwa eines Menschen, welcher an Tumoren leidet, mit dem Ziel der Stimulation einer Anti-Tumor-T-Zellreaktion.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die Herstellung des Mittels zur Impfung werden autologe Tumorzellen verwendet.
Ein sehr wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Ausnutzung der zellulären Immunität von uPAR-Derivaten oder Peptiden der vorliegenden Erfindung, um Tumorzellen abzutöten. Einem tumortragenden Patienten, wie etwa einem menschlichen Patienten, können auf einen Tumor gerichtete Zellen injiziert werden, welche so modifiziert sind, dass sie die chemotaktische Region des uPAR von Mensch, Rind, Maus oder Ratte exprimieren, oder einen anderen beliebigen uPAR mit im Wesentlichen gleichen Eigenschaften, worin der Zielvektor weiterhin an die Region fusioniert ist, welche ein Peptid oder eine Domäne von uPAR ist, welche das SRSRY (SEQ ID NO: 7) Peptid enthält oder ein funkionelles Analogon davon, wie oben definiert.
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff "uPAR-Derivate" verwendet, wie es in WO 90/12091 definiert ist, wohingegen der Begriff "auf einen Tumor gerichtete Zellen" Zellen bedeutet, welche auf natürliche Art oder weil sie speziell bearbeitet sind, in ein Individuum injiziert werden können und mit den Tumorzellen des Individuums spezifisch wechselwirken.
Legende zu den Figuren
1. Ein Teil dieser Figur zeigt die Sequenz der aktiven Peptide 1 und 2, welche Sequenzen des humanen uPAR reproduzieren, und die „durcheinandergewürfelte" Version von Peptid 1, welche als eine Negativkontrolle in Beispiel 2 verwendet wurde. Offensichtlich ist die Sequenz SRSRYLEC (SEQ ID NO: 3) den Peptiden 1 und 2 gemeinsam. Aber die aktive Region kann weiterhin eingeschränkt werden, da die Experimente aus Beispiel 1 zeigen, dass die Anwesenheit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) entweder carboxyterminal zur Domäne D1 oder aminoterminal zur Domäne D2, 3 diesen Peptiden eine anderenfalls fehlende chemotaktische Aktivität verleiht. Die Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) liegt im humanen uPAR zwischen den Positionen 88 und 92 vor. Teil B dieser Figur zeigt die Sequenz der aktiven Peptidregion beim uPAR von Ratte, Maus und Rind und seinen Vergleich mit dem des humanen uPAR. Er zeigt auch eine einleitende übereinstimmende Sequenz, welche zeigt, dass der vierte und fünfte Rest immer konserviert sind, dass der erste und zweite Rest eine konservative Veränderung aufweisen, während der dritte Rest freier substituiert zu sein scheint.
2. Diese Figur zeigt ein Schema, welches die Struktur von verschiedenen löslichen Formen des uPAR darstellt, die in Beispiel 1 verwendet werden. Eine schematische Darstellung des löslichen uPAR mit drei Domänen (D123) und der vier Deletionsmutanten. Die Zahl weist auf die Aminosäurereste gemäß der humanen, von cDNA abgeleiteten uPAR-Sequenz hin (Roldan et al., 1990), wobei als Nummer eins der erste Rest nach der Signalsequenz verwendet wird. Jedes Konstrukt wurde bezogen darauf benannt, welche der drei Domänen noch beibehalten wurde: D123 ist das Symbol für einen suPAR, welcher die Reste 1–274 enthält und in einer löslichen Form sekretiert wird. Jedes Konstrukt enthält am 3'-Ende ein FLAGTM (SEQ ID NO: 6) Epitop, welches für die Reinigung der Proteine auf einer kommerziellen Antikörperaffinitätssäule verwendet wird.
3. Diese Figur zeigt die chemotaktische Reaktion von THP-1-Zellen auf Fragmente oder Mutanten eines löslichen uPAR. Für jede Reihe von Experimenten diente die Migration in Richtung auf das Assaymedium als Kontrolle (zufällige Zellmigration) und wird als Bezug für eine 100%ige Migration verwendet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt; die Zahl der pro Hochenergiefeld gezählten Zellen (zehn Felder für jede Bedingung) wird als Prozent der Kontrollwerte ausgedrückt. Die Proteine wurden gereinigt, wie es im Methodenabschnitt beschrieben wird. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten dar (+ SEM). Die verwendeten Konstrukte sind in 2 dargestellt.
4. In dieser Figur wird die chemotaktische Wirkung von synthetischen Peptiden auf THP-1-Zellen gezeigt. Die Peptide 1 und 2 zeigen eine sehr wirksame Aktivität, während Peptid 3 oder das durcheinandergewürfelte Peptid 1 dies nicht tut. Dosisabhängige chemotaktische Reaktion von THP-1-Zellen auf Peptid 1 (AVTYSRSRYLEC (SEQ ID NO: 1), (aa 84–95) (Feld A), Peptid YTARLWGGTLLT (SEQ ID NO: 2) (aa 302–313 von uPAR) (Feld B), Peptid (SRSRYLEC (SEQ ID NO: 3), aa 88–95 von uPAR) (Feld C) im Zusammenhang mit uPAR-Sequenzen von Roldan et al. (1990); Feld D zeigt die chemotaktische Reaktion auf das Peptid TLVEYYSRASCR (SEQ ID NO: 4), eine durcheinandergewürfelte Version des Peptids 1.
5. In dieser Figur wird der stimulierende Effekt von Peptid 1 auf die Aktivität der Hck-Kinase von THP-1-Zellen gezeigt. THP-1-Zellen wurden mit [35S]-TransLabel metabolisch markiert, sauer gewaschen und entweder zum Schein oder mit 0,1 nM Peptid 1 (AVTYSRRYLEC, (SEQ ID NO: 1)) für die identische Zeit bei 37°C behandelt. Radiomarkierte Zelllysate wurden unter Verwendung eines affinitätsgereinigten polyklonalen Anti-p56/p59hck Kaninchen-Antikörpers immunpräzipitiert (Resnati et al., 1996).

(A) Ein Aliquot von jedem Immmunpräzipitat wurde direkt durch SDS-PAGE analysiert, um zu kontrollieren, dass während des in vitro-Kinase-Assays die gleiche Menge an p56/p59hck vorhanden ist.
(B) Der Rest jedes Immunpräzipitats wurde einem in vitro-Kinase-Assay in Gegenwart von 5–10 mCi [g-32P]ATP (~3000 Ci/mmol, Amersham) und 5 mg Kaninchenmuskelenolase für 5 Minuten bei Raumtemperatur unterzogen. Die Eluate wurden dann durch SDS-PAGE-Autoradiographie analysiert (7,5% Acrylamid).

Beispiel 1
Chemotaktische Reaktion von humanen oder murinen Zellen, die mit Fragmenten des löslichen uPAR oder mit löslichen rekombinanten uPAR-Mutanten stimuliert wurden
Methoden
Klonierung von löslichen uPAR-Mutanten
In der folgenden Beschreibung werden Aminosäurereste in Übereinstimmung mit der zuvor publizierten cDNA-Sequenz von uPAR nummeriert (Roldan et al., 1990). Mutanten-cDNAs, die für lösliche uPA-Rezeptoren codieren, wurden durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugt. Für die verschiedenen Konstrukte wurden die folgenden Oligonukleotide verwendet:
Konstrukt D1(1–92: Oligonukleotid FRAU18 und D1.3'T
Konstrukt D12(1–191): Oligonukleotid FRA18 und D2.3'T
Konstrukt D123(1–274): Oligonukleotid FRA18 und D3.3'T.
Die PCR-Produkte wurden mit BclI und ClaI verdaut und in Bluescript SK-(Stratagene) kloniert, welcher mit BamHI und ClaI verdaut wurde.
Um die für D2(93–191) und D23(93–274) codierenden Konstrukte zu erzeugen, wurde die D1-Region in den D12- und D123-Konstrukten durch Substitution des NruI/NsiI-Fragments, welches die für D1 codierende Region enthält, mit einem Fragment, das durch Amplifikation der uPAR-cDNA mit den Primern FRA18 und D2.5'T erzeugt wurde und mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, deletiert. Um das für D3 (192–275) codierende Konstrukt zu erzeugen, wurde die D12-Region im D123-Konstrukt durch Substitution des NruI/NcoI-Fragments, welches die für D12 codierende Region enthält, mit einem Fragment, das durch Amplifikation der uPAR-cDNA mit den Primern FRA18 und D3.5'T erzeugt wurde und mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, deletiert.
Alle Mutantenrezeptoren wurden am Carboxyterminus mit der Petpidsequenz HRRASVDYKDDDDK (SEQ ID NO: 5), welche das Proteinkinasesubstrat und das FLAGTM-Epitop umfasst, gekennzeichnet durch Insertion in die carboxyterminale ClaI-Stelle eines Linkers, hergestellt durch Annealing der zwei Oligonukleotide K/Focs und K/Foas. Dieser Linker wurde in die ClaI-Stelle insertiert, die am Carboxyterminus von allen Konstrukten lokalisiert ist. Alle rekombinanten codierenden Regionen wurden mit den Primern NS1 und 46D amplifiziert, mit NcoI verdaut und in den eukaryontischen Expressionsvektor pBNSEN transferiert, der mit NcoI und EcoRV verdaut wurde.
Oligonukleotide (5'–3'):
Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine
Halbkonfluente COS7-Zellen wurden in PBS mit 1 mM EDTA geerntet und zweimal mit RPMI-Medium gewaschen. 0,8 ml der Zellsuspension (1–2 × 10⁷ Zellen/ml in RPMI) wurden in Elektroporationsküvetten (0,4 cm, Bio-Rad) transferiert, welche die Plasmid-DNA (30 μg, 1 mg/ml in Wasser) enthielten und bei 960 μF, 240 V in einem Elektroporator (GenePulser, Bio-Rad) elektroporiert. Nach der Elektroporation wurden die Zellen in eine T175-Flasche mit 30 ml reichem Medium (DMEM mit 10% FCS) transferiert. Am nächsten Morgen wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit 50 ml serumfreiem Medium (DMEM mit 1% Nutridoma NS, Boehringer Mannheim) ergänzt. Alle 4–5 Tage wurde konditioniertes Medium gesammelt und frisches Medium zugegeben. Die rekombinanten Proteine wurden aus dem konditionierten Medium durch eine Passage über eine Anti-FLAGTM-Affinitätssäule (M2 Affinity Gel, Sigma) gereinigt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die rekombinanten Proteine mit 0,1 M Glycin pH 3,0 eluiert.
Gereinigtes D1 (1–87) und D23 (88–274) wurde durch Spaltung von D123 mit Chymotrypsin (Behrendt et al., 1991), gefolgt von einer Passage über die FLAGTM-Affinitätssäule hergestellt. D1 (1–87) wurde im Durchfluss wiedergewonnen, während das D23 (88–274), welches das FLAGTM-Epitop enthielt, zurückgehalten wurde und später mit 0,1 M Glycin pH 3,0 eluiert wurde.
Chemotaxis-Assay
Eine Untersuchung der Chemotaxis wurde unter Verwendung von modifizierten Boyden-Kammern durchgeführt, welche Polyvinylpyrrolidonpolycarbonatfilter enthielten (13 mm Durchmesser, 5 mm Porengröße), beschichtet mit Collagen Typ I (100 m/ml in PBS pH 7,4). Die beschichteten Filter wurden mit Medium gewaschen, welches mit 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) ergänzt war und dann in der Boyden-Apparatur platziert. Nach einem sauren Waschen wurden 2 × 10⁵ THP-1-Zellen, suspendiert in serumfreiem Medium, oberhalb des Filters in die Boyden-Kammer zugegeben. Gereinigte Mutanten wurden in serumfreiem Medium in den angegebenen Konzentrationen verdünnt und unterhalb des Filters in der unteren Kammer zugegeben. Die Kammern wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in 5% CO₂ in Luft für 90 Minuten inkubiert. Die Filter wurden entfernt, die obere Fläche von den Zellen freigekratzt, in Methanol fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Für jeden Satz der Experimente diente eine Migration in Richtung auf das Assaymedium als Kontrolle (zufällige Zellmigration) und dient als Bezug für 100% Migration. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt; die Daten werden als Anzahl der Zellen angegeben, welche im Hochenergiefeld gezählt wurden (zehn Felder für jede Bedingung) und als Prozent der Kontrollwerte ausgedrückt. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten (+ SEM) dar. Wenn Zellen des Fibroblasten-Typs oder Krebszellen für den Assay verwendet wurden, war die für die Migration erforderliche Zeit höher und die Boyden-Kammer wurde normalerweise über Nacht inkubiert.
Ergebnisse
2 zeigt eine schematische Darstellung der Struktur des rekombinanten löslichen uPAR und von verschiedenen erzeugten Mutanten. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, das eine lösliche Form des uPAR (suPAR) in verschiedenen Zelllinien ein wirksamer chemotaktischer Faktor ist, auch in Zellen ohne endogenen uPAR (Resnati et al., 1996). Aber die Aktivität von suPAR erfordert eine Chymotrypsinspaltung am Tyr87 zwischen der N-terminalen Liganden-bindenden Domäne D1 und der Domäne D2 + D3. Dies deutet darauf hin, dass eine einzigartige Konformation, freigelegt durch Chymotrypsinspaltung, erforderlich ist und mit einem bislang nicht identifizierten Zelloberflächenrezeptor wechselwirken muss, welcher als ein Transmembranadaptor agieren könnte. Der gleiche Mechanismus trifft zu bei einer uPAR-Bindung an den in der Oberfläche verankerten uPAR.
Um die Region des uPAR zu identifizieren, welche mit einer chemotaktischen Aktivität ausgestattet ist, definierten wir zuerst die Domäne von uPAR, welche für den Signaleffekt und folglich für die Wechselwirkung mit dem Transmembranadaptor verantwortlich ist. Wir erzeugten und reinigten verschiedene lösliche uPAR-Mutanten und analysierten sie im Hinblick auf ihre Fähigkeit, die Chemotaxis bei THP-1-Zellen zu stimulieren. Es ist bekannt, dass eine Trunkation der carboxyterminalen Domäne im Verlust der Membranverankerungskapazität und folglich in der Sekretion eines andernfalls aktiven Moleküls resultiert (Masucci et al., 1991); um lösliche Formen von uPAR zu erzeugen, wurde die mit den Aminosäuren 275–313 korrespondierende Sequenz (Roldan et al., 1990) in allen den Konstrukten weggelassen. 2 zeigt die schematische Darstellung des kompletten suPAR mit drei Domänen (D123) (Aminosäure 1–274) und die vier konstruierten Deletionsmutanten: D23 (Aminosäuren 93–274), D1 (Aminosäure 1–92), D2 (Aminosäure 93–191) und D3 (Aminosäure 192–274). Am C-Terminus jeder Mutante wurde eine Kinasestelle, gefolgt von einem FLAGTM-Epitop im Leseraster insertiert. Alle Konstrukte wurden in einer modifizierten Form des pBSNSEN-Expressionsvektors kloniert, COS7-Zellen durch das Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren transfiziert und das sekretierte uPAR-Mutantenprotein durch Affinitätschromatographie gereinigt. Als Kontrolle wurde das gereinigte D123-Protein mit Chymotrypsin verdaut (Resnati et al., 1996) und die entsprechenden Produkte D1 (Aminosäure 1–87) und D23 (88–274) wurden durch eine weitere Runde der Reinigung mit FLAGTM-Antikörpersäulen aufgetrennt. Die Einzelheiten der Herstellung der Konstrukte, das Reinigungsverfahren und das verwendete System zur Untersuchung der Chemotaxis sind im obigen Methodenabschnitt angegeben.
3 zeigt die Ergebnisse des Chemotaxis-Assays, welcher Derivate von suPAR D123 als chemotaktische Faktoren verwendet. Wie durch die vorherigen Ergebnisse vorhergesagt (Resnati et al., 1996), war gereinigtes ungespaltenes D123 nicht in der Lage, in THP-1-Zellen eine Chemotaxis zu stimulieren, während eine Spaltung dieses Proteins mit Chymotrypsin eine starke chemotaktische Eigenschaft verlieh (Daten nicht gezeigt). Wenn die Produkte der Chymotrypsinspaltung von D123 gereinigt und getrennt analysiert wurden, war nur das D23-Fragment (3, Feld F) (Reste 88–274) in der Lage, eine dosisabhängige chemotaktische Reaktion hervorzurufen, während D1 (1–87) (3, Feld E) die THP-1-Zellmigration nicht beeinflusste. Aber wenn die Domäne D1, hergestellt durch rekombinante DNA-Technologie (D1–92), untersucht wurde, wurde unerwartet gefunden, dass sie eine dosisabhängige chemotaktische Wirkung induziert (3, Feld A). Die Sequenz von löslichem D1 umfasste die Reste 88–92, während das chymotryptische Fragment nur die Sequenz 1–87 umfasste. Auf ähnliche Art und Weise konnte das rekombinante D23 (93–274) durch den kompletten analysierten Konzentrationsbereich keine Chemotaxis induzieren (3, Feld B). Es wurde bemerkt, dass die Sequenz 88–92 in dieser Mutante fehlte, während sie im chymotryptischen D23 (88– 274) Fragment vorlag. Diese Befunde deuten insgesamt darauf hin, dass die Sequenz von Aminosäure 88–92, SRSRY (SEQ ID NO: 7) für die chemotaktische Wirkung auf die THP-1-Zellmigration verantwortlich war. Entsprechend wurde keine Wirkung auf die Zellmigration beobachtet, wenn der Assay in Gegenwart von vergleichbaren Dosen der gereinigten Domäne D2 (83–191) (3, Feld C) und D3 (192–274) (3, Feld D) durchgeführt wurde, bei welchen die Sequenz SRSRY nicht vorlag. Dieses Ergebnis wurde nicht nur mit THP-1-Zellen erhalten, sondern auch mit anderen Zellen, wie etwa murinen 3T3-Fibroblasten und murinen LB6-Zellen (Daten nicht gezeigt). Deswegen ist die chemotaktische Wirkung von uPAR-Fragmenten nicht speziesspezifisch, im Gegensatz zur Bindungsspezifität von uPA an uPAR.
Beispiel 2
Chemotaktische Reaktion von humanen Zellen, stimuliert mit Peptiden, die vom humanen uPAR abgeleitet sind
Um die Hypothese zu bestätigen, dass die Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) des humanen uPAR für die uPAR-vermittelte Signalwirkung und folglich für die Wechselwirkung mit einem oder mehreren Adaptoren verantwortlich war, wurde eine andere Reihe von Experimenten durchgeführt. Drei mit humanem uPAR verwandte Peptide wurden analysiert als Auslöser einer Chemotaxis bei THP-1-Zellen: Peptid 1 (AVTYSRSRYLEC (SEQ ID NO: 1); Aminosäuresequenz 84–95 von humanem uPAR) und das kürzere analoge Peptid 2 (SRSRYLEC (SEQ ID NO: 3), Aminosäuresequenz 88–95 des humanen uPAR) wurden als Auslöser der Chemotaxis bei THP-1-Zellen untersucht. Die Nummerierung der Sequenzpositionen folgt der von Roldan et al (1990), wobei der Aminosäurerest 1 der erste Rest nach dem Signalpeptid ist. Dies zwei obigen Peptide enthalten beide das SRSRY (SEQ ID NO: 7)-Motiv. Das dritte Peptid wurde in der carboxyterminalen Region der uPAR-cDNA-Sequenz ausgewählt (YTARLWGGTLLT (SEQ ID NO: 2), Aminosäure 301–313) und in dem Assay als Negativkontrolle verwendet. Ein weiteres Peptid wurde als Kontrolle für die Spezifität der Wirkungen, welche durch die SRSRY (SEQ ID NO: 7) enthaltenen Peptide vermittelt wurden, verwendet. Genauer wurde eine durcheinandergewürfelte Version des Peptids 1 (TLVEYYSRASCR (SEQ ID NO: 4)) auch unter den gleichen experimentellen Bedingungen untersucht. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 4 gezeigt. Die Peptide 1 und 2 konnten eine dosisabhängige chemotaktische Wirkung auslösen, mit einer maximalen Reaktion bei so geringen Konzentrationen wie 0,1 pM (4, Felder A und C). Wenn der Assay in Anwesenheit von ähnlichen Dosen des Kontrollpeptids 3 oder des Peptids TLVEYYSRASCR (SEQ ID NO: 4) (Peptid 1 in einer durcheinandergewürfelten Sequenz) durchgeführt wurde, wurde im Gegensatz dazu über den gesamten analysierten Konzentrationsbereich keine Wirkung auf die Zellmigration beobachtet (4, Felder B und D). Folglich besitzen Peptide, welche das Motiv SRSRY (SEQ ID NO: 7) des humanen uPAR enthalten, eine starke chemotaktische Aktivität und müssen für eine uPAR-induzierte Migration verantwortlich sein. Diese Peptide stellen neue chemotaktische Mittel dar, die stromabwärts der uPA/uPAR-Wechselwirkung wirken.
Beispiel 3
Peptid 1 (AVTYSRSRYLEC (SEQ ID NO: 1)) beeinflusst Chemotaxis durch aktivierung der p56/p59hck Tyrosinkinaseaktivität bei THP-1-Zellen
Das Gemisch von Chymotrypsinfragmenten von suPAR induziert ähnlich wie die uPA/uPAR-Interaktion eine Chemotaxis durch transiente Aktivierung der p56/p59hck-Proteinkinase (Resnati et al., 1996). Wenn humane mit uPAR verwandte Peptide, welche das SRSRY (SEQ ID NO: 7) Motiv enthalten, bei THP-1-Zellen durch den gleichen Mechanismus, welcher durch die uPA/uPAR-Wechselwirkung ausgenutzt wird (d. h. durch Bindung an den nicht identifizierten Adaptor) eine chemotaktische Reaktion induzieren, sollten sie auch p56/p59hck aktivieren. THP-1-Zellen wurden metabolisch mit [35S]-TransLabel markiert, sauer gewaschen und entweder zum Schein oder mit 0,1 nM Peptid 1 (AVTYSRSRYLEC (SEQ ID NO: 1)) für die angegebene Zeit bei 37°C behandelt. Die radiomarkierten Zelllysate wurden immunpräzipitiert (Resnati et al., 1996) unter Verwendung eines affinitätsgereinigten polyklonalen Anti-p56/p59hck-Kaninchen-Antikörpers. Ein Aliquot von jedem Immunpräzipitat wurde direkt durch SDS-PAGE analysiert, um zu kontrollieren, dass während des in vitro-Kinase-Assays gleiche Mengen p56/p59hck vorlagen (5, Feld A). Der Rest von jedem Immunpräzipitat wurde in Gegenwart von 5–10 mCi [g-32P] ATP (~3000 Ci/mmol, Amersham) und 5 mg Kaninchenmuskelenolase (Substrat) für 5 Minuten bei Raumtemperatur einem in vitro-Kinase-Assay unterzogen. Die Eluate wurden dann mittels SDS-PAGE-Autoradiographie (7,5% Acrylamid) analysiert. Wie in 5, Feld B gezeigt ist, wurde nach einer Stimulation mit Peptid 1 ein Anstieg der Autophosphorylierung von p56/p59hck ebenso wie ein Anstieg der Phosphorylierung des exogenen Substrats beobachtet. Der Effekt war sehr schnell, da eine p56/p59hck-Stimulierung bereits nach 2 Minuten offensichtlich war, nach 10 Minuten ein Maximum erreichte und 30 Minuten nach der Zugabe des Peptids auf das Basisniveau zurückkehrte. Wenn 0,1 nM des entsprechenden durcheinandergewürfelten Peptids im Assay verwendet wurde, wurde keine Wirkung auf die p56/p59hck-Aktivität beobachtet (Daten nicht gezeigt). Der Zeitverlauf der Wirkung ist identisch mit dem, welcher bei der Zugabe von ATF oder eines chymotryptischen uPAR-Fragments zu THP-1-Zellen beobachtet wurde und zuvor beschrieben wurde (Resnati et al., 1996).
Beispiel 4
Panning mit einem uPAR-nachahmenden Peptid und Selektion von Inhibitoren dafür
Säugetierzellen haften an speziell beschichtete Kunststoffplatten an, aber sie haften nicht an, wenn sie auf Kunststoffschalen ausplattiert werden, welche normalerweise zum Wachstum von Bakterien verwendet werden. Aber wenn diese Platten mit Peptid 1 oder 2 (oder der Domäne D1–1–92) oder mit rekombinanten Formen dieser Peptide beschichtet werden, haften sie, weil sie auf ihrer Oberfläche spezifische D1 (1–92) bindende Proteine exprimieren. Die Adhäsion kann gemessen werden.
Als Positivkontrolle (d. h. um das Verfahren zu etablieren) werden Zellen (106) verwendet, welche eine hohe Anzahl von uPAR-Moleküle exponieren und das Panning wird auf Platten durchgeführt, die mit einem spezifischen Anti-uPAR-Antikörper beschichtet sind. Als Negativkontrolle werden die gleichen Zellen verwendet, welche nun aber kein uPAR exprimieren. Die als Negativkontrollen verwendeten Zellen sind LB6, 32D, 3T3-Fibroblasten, B-Lymphozytenzelllinien und andere. Als positive Kontrollen werden THP-1-Zellen, LB6/uPAR, 32D/uPAR und andere exprimierende Zelllinien verwendet.
Für den Screening-Assay werden die gleichen Zellen verwendet, welche als Negativkontrollen (106) eingesetzt werden und die Platten werden mit der Domäne D1 (1–92) oder der Domäne D1 (1–87) (Kontrolle) beschichtet. Die Fähigkeit der Zellen, an die Platten zu binden, wird nach 30 bis 300-minütiger Inkubation bei 37°C durch eine mikroskopische Untersuchung getestet, oder durch Färbung der Platten mit Coomassie Blau. Das Gleiche kann unter Verwendung verschiedener Verfahren durchgeführt werden.
Die Fähigkeit der mit Peptid 1 oder 2 beschichteten Platten, THP-1-Zellen spezifisch zu binden, ist die Grundlage für das Screeningverfahren, da jede Verbindung, welche diese Bindung hemmen kann, ein potenzielles entzündungshemmendes Mittel ist, welches Chemotaxis hemmt. Beispielsweise können Peptid 1 oder Peptid 2 tatsächlich die Adhäsion von Zellen auf D1 (1–92) hemmen, während das durcheinandergewürfelte Peptid oder andere Peptide dies nicht können. Solche Verbindungen können deshalb als Inhibitoren der Chemotaxis verwendet werden, wobei die in den Beispielen 1 bis 3 angeführten Verfahren angewandt werden. Die Beschichtung kann auch durchgeführt werden mit anderen rekombinanten Formen der SRSRY (SEQ ID NO: 7) Sequenz, in welchen das Epitop in Fusion mit anderen Proteinen synthetisiert ist. Geeignete Proteine sind Ferritin (Sidoli et al., (1993)), Thioredoxin, GST, beta-Galactosidase, humanes Serumalbumin.
Inhibitoren können ausgewählt werden aus Phagendisplaybibliotheken von Peptiden, kombinatorischen Bibliotheken verzweigter Tripeptide, Bibliotheken von natürlichen oder chemischen Verbindungen und einer beliebigen anderen potentiell verwertbaren Sammlung von Verbindungen.
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid mit der Sequenz SRSRY (SEQ ID NO: 7) oder ein funktionelles Analogon davon, welches ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe: SRNRY, SRGRY, SQSRY, SQNRY, SQGRY, PRSRY, PRNRY, PRGRY, PQSRY, PQNRY, PGQRY.
Peptid mit der Sequenz AVTYSRSRYLEC (SEQ ID NO: 1).
Peptid mit der Sequenz SRSRYLEC (SEQ ID NO: 3).
Rekombinantes Fusionsprotein, welches mindestens eines der Peptide nach einem der Ansprüche 1–3 umfasst.
Nukleinsäuremolekül, welches für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1–3 codiert.
Eukaryontischer Vektor, welcher das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5 trägt.
Zellulärer Wirt, welcher den Vektor nach Anspruch 6 trägt.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung oder Steigerung der chemotaktischen Aktivität einer Zelle.
Verwendung eines Peptids mit einer Sequenzidentität von 80% mit einem der Peptide nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung oder Steigerung der chemotaktischen Aktivität einer Zelle.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, worin das Medikament eine lokale Entzündungsreaktion stimuliert oder verstärkt.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, worin das Medikament die Wundheilung verbessert.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Medikaments, welches die Kinaseaktivität von p56/p59hck stimuliert.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der zellulären Immunität.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Anti-Tumor-Mittels.
Verwendung eines Peptids mit einer Sequenzidentität von 80% mit einem der Peptide nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Kinaseaktivität von p56/p59hck.
Verwendung eines Peptids mit einer Sequenzidentität von 80% mit einem der Peptide nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der zellulären Immunität.
Verwendung eines Peptids mit einer Sequenzidentität von 80% mit einem der Peptide nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, Autoimmunerkrankungen und/oder hyperinflammtorischen Erkrankungen.
Verwendung eines eukaryontischen Vektors nach Anspruch 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung oder Steigerung der Anti-Tumor-Immuniät bei einer autologen Knochenmarkstransplantationsbehandlung.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Bindung zwischen einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einem zellulären Adaptor modulieren können, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) in vitro in Kontakt bringen der Verbindung und eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit Zellen, welchen der endogene u-PAR fehlt, und (b) Messen der chemotaktischen Aktivität.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Verbindungen ausgewählt werden im Hinblick auf ihre Fähigkeit, die chemotaktische Aktivität von Zellen, welchen der endogene u-PAR fehlt, zu stimulieren oder zu inhibieren.
Verfahren zum Screenen von entzündungshemmenden oder anti-migratorischen Verbindungen, welches umfasst: (a) Beschichten einer Kunststoffoberfläche, welche Säugtierzellen normalerweise nicht bindet mit einer wirksamen Menge eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3; (b) Exponieren von ausgewählten Säugetierzellen gegenüber der beschichteten Oberfläche für 30 bis 300 Minuten bei 37°C in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Testverbindung; und (c) Untersuchen der Fähigkeit der Zellen, an die mit Peptid beschichtete Oberfläche zu binden, durch eine mikroskopische Untersuchung oder Färbung der Platten mit Coomassie-Blau.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19, 20 oder 21 zur Identifizierung von Verbindungen, welche für die Behandlung von Krebs, einer Autoimmunerkrankung und/oder hyperinflammatorischen Erkrankungen nützlich sind.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 5 zur rekombinanten Expression von Peptiden zur Verwendung beim Screenen von Verbindungen nach einem der Ansprüche 19 bis 22.
Verwendung nach Anspruch 23, worin die rekombinante Expression in einem E.coli-Expressionssystem durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 23, worin die rekombinante Expression in einem Hefe-Expressionssystem durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 23, worin die rekombinante Expression in einem Säugetier-Expressionssystem durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 23, worin die rekombinante Expression in einem Insektenzellen-Expressionssystem durchgeführt wird.