DE69810636T2

DE69810636T2 - Polymere platinverbindungen

Info

Publication number: DE69810636T2
Application number: DE69810636T
Authority: DE
Inventors: G. Buckley; Ruth Duncan; G. Evagorou; Elisabetta Gianasi
Original assignee: Access Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Abeona Therapeutics Inc
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2003-11-06
Anticipated expiration: 2018-04-16
Also published as: EP1009439B1; CA2286091A1; AU7102698A; CA2286091C; DK1009439T3; DE69810636D1; TW509573B; ZA983250B; ES2194312T3; JP2010132685A; EP1009439A1; JP2001524098A; JP4536165B2; ATE230613T1; WO1998047537A1; US5965118A; AU736297B2

Description

Diese Patentanmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 60/044 743, eingereicht am 18. April 1997.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Polymer-Platin-Verbindung zur Verwendung bei der Tumorbehandlung.

Literaturstellen

Bogdanov, Jr., A. A., et al., Bioconjugate Chem. 7: 144-149 (1996).
Duncan, R., et al., Brit. J. Cancer 55: 165-174 (1987).
Duncan, R., et al., Anti-Cancer Drugs 3: 175-210 (1992).
Fiebig, H. H., et al., Proc. Am. Ass. for Cancer Res. 37: 297, Abstract No. 2021 (1996).
Filipov -Vopr lov , M., et al., J. Controlled Release 17(89-98) (1991).
Freise, J., et al., Arch. Int. Pharmacodyn. 258: 180-192 (1982).
Fuji, K., et al., Proc. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 23: 639-640 (1996).
Han, M. J., et al., J. Bioact. and Biocompat. Polymers 9: 142 (1994).
Johnsson, A., and Cavallin-Ståhl, E., Anti-Cancer Drugs 7: 70-77 (1996).
Neuse, E. W., et al., J. Inorganic and Organometallic Polymer 5(3): 195-207 (1995).
Prestayko, A. W., CANCER AND CHEMO. VOL III (Crooke, et al., Eds.) Academic Press, NY, 133-154 (1981).
Schechter, B., et al., J. Controlled Release 10: 75-87 (1989).
Seymour, L. W., et al., J. of Biomed. Mat. Res. 21: 1341-1358 (1987).
Steerenberg, P. A., et al. International Journal of Pharmaceutics 40: 51-62 (1987).
Sur, B., et al. Oncology 40: 372-376 (1983).
Weiss, R. B., et al., Drugs 46(3): 360-377 (1993).
Cisdiamindichlorplatin(II) (Cisplatin) wird weithin bei der Krebschemotherapie zur Behandlung fester Tumore, einschließlich Ovarial-, Hoden- und Kopf und Hals-Tumore, verwendet, und es ist besonders effektiv bei der kombinierten Chemotherapie gegen Schuppenzellkarzinom und kleinzelliges Lungenkarzinom (Sur et al., 1983; Steerenberg et al., 1987).
Die Antitumoraktivität von Cisplatin beruht auf der Fähigkeit der Diaquo-Spezies, mit dem N-7- Guaninrest von DNA zu vernetzen, so dass Intrastrang- und Interstrang-Vernetzungen erhalten werden. Damit Platinkomplexe Antitumoraktivität aufweisen, benötigen sie 2 cis-Amin- oder Ammin-Funktionalitäten mit mindestens einem Wasserstoffatom, das die Sauerstoffatome der DNA-Phosphatgruppen wasserstoffbindet, und zwei stark gebundene Abgangsgruppen, bspw. Chlorid.
Cisplatin - ist wie andere Krebschemotherapeutika ein sehr toxisches Medikament. Die Hauptnachteile von Cisplatin sind seine extreme Nephrotoxizität, die der dosislimitierende Hauptfaktor ist, seine rasche Ausscheidung über die Nieren, mit einer Halbwertszeit im Kreislauf von nur einigen Minuten und seine starke Affinität zu Plasmaproteinen (Freise et al., 1982).
Versuche zur Minimierung der Toxizität des Medikamentes umfassen die Kombinations- Chemotherapie, die Synthese von Cisplatin-Analoga (Prestayko, 1991; Weiss et al., 1993), Immuntherapie und den Einschluss in Liposomen (Sur et al., 1983; Weiss et al. 1993) und die Herstellung von Polymerplatinat-Konjugaten (Bogdanov, Jr. et al., 1996; Filipov -Vopr lov , et al., 1991; Fuji, et al. 1996; Han, et al., 1994; Johnsson und Cavallin-Ståhl, 1996; Fiebig, et al., 1996; Neuse, et al., 1995; Schechter, et al., 1989).
In Bezug auf die Synthese von Cisplatin-Analoga durchliefen zahlreiche Platin-Analoga vorklinische und klinische Versuche, jedoch bewährten sich nur Cisplatin und Carboplatin für den klinischen Routineeinsatz (Prestayko, 1991; Weiss, et al., 1993). Viele dieser Analoga zeigen, verglichen mit Cisplatin, keine signifikante Verbesserung der therapeutischen Breite. Cisplatin und seine Analoga haben andere Nachteile. Viele sind bei oraler Verabreichung inaktiv, einige haben eine geringe Löslichkeit in Wasser und induzieren meist schwere toxische Nebenwirkungen, einschließlich renaler Dysfunktion, Übelkeit und Erbrechen, Myelosuppression und Neurotoxizität.
In Bezug auf die Herstellung der Polymer-Platin-Konjugate, wurden diese Konjugate als Ansatz zur Steigerung der Löslichkeit und zur Reduktion der systemischen Toxizität vorgeschlagen. Es wurden zwar einige Platin-Polymer-Systeme beschrieben (Bogdanov, Jr., et al., 1996; Filipov - Voprsälovä, et al., 1991; Fuji, et al. 1996; Han, et al., 1994; Johnsson und Cavallin-Ståhl, 1996; Fiebig, et al., 1996; Neuse, et aL, 1995; Schechter, et al., 1989), jedoch ist niemand bisher zur klinischen Untersuchung vorgedrungen, und wenige weisen einen signifikanten Nutzen in vivo auf. Das Versagen beruhte auf dem Fehlen der Biokompatibilität, der Toxizität des vorgeschlagenen Trägers, dem Fehlen der Antitumor-Aktivität und anderen Problemen.
Eine Aufgabe der Erfindung ist folglich die Bereitstellung neuer Polymer-Platin-Verbindungen mit Antitumoraktivität in vivo.
In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung in der Tumorbehandlung, umfassend Polymer-Platin-Verbindungen, die zur Ansammlung am Ort eines Tumors bestimmt sind. Die Verbindung besteht aus einem synthetischen Polymergerüst mit platinhaltigen Seitenketten, die in Abständen entlang des Gerüsts verteilt sind. Die Seitenketten (i) bestehen aus einem Oligopeptid, das an einem Ende mit dem Gerüst und am anderen Ende mit einer Platinverbindung verbunden ist und (ii) umfassen mindestens eine Verknüpfung, die dazu bestimmt ist, unter ausgewählten physiologischen Bedingungen gespalten zu werden, um die Platinverbindung freizusetzen, die Antitumoraktivität aufweist oder in vivo so umgewandelt wird, dass sie diese aufweist.
Bei einer Ausführungsform ist das synthetische Polymer ein Homopolymer eines N- Alkylacrylamids mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 1.000 und 5.000.000 Dalton.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das synthetische Polymer ein Copolymer mit einem Molekulargewicht zwischen 1.000 und 5.000.000 Dalton und enthält zwei Grundeinheiten m und n in einem Verhältnis von m : n zwischen etwa 0,1 bis 99,9.
Die Grundeinheiten bestehen bei einer Ausführungsform aus einer N-Alkylacrylamid-Einheit und aus einer Einheit, die die Oligopeptidseitenkette trägt, welche in einer proximalen Endgruppe abschließt, die die Platinverbindung binden kann.
Bei einer Ausführungsform ist das Polymer in der Polymer-Platin-Verbindung ein Copolymer der Form:
wobei R&sub1; die Bedeutung H oder CH&sub3; hat, R&sub2; ein Niederalkyl- oder Niederhydroxyalkylrest ist und R&sub3; eine Oligopeptidseitenkette ist.
Das Oligopeptid ist in einer weiteren Ausführungsform ein Oligoeptid der Form Gly-(W)p-Gly, wobei p 0 bis 3 sein kann und (W) irgendeine Aminosäure oder eine Kombination von beliebigen Aminosäuren sein kann. Bei einer Ausführungsform ist das Peptid Gly-Phe-Leu-Gly und schließt in einer Carboxyl-, Diamin- oder Malonyleinheit zur Bindung an der Platinverbindung. Bei einer anderen Ausführungsform ist das Peptid Gly-Gly, das mit einer proximalen Carboxyl-Endgruppe abschließt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat R&sub1; die Bedeutung CH&sub3;, R&sub2; ist 2-Hydroxypropyl, und R&sub3; ist Gly-Phe-Leu-Gly-[X], wobei [X] eine Diamin-, eine Carboxylgruppe oder eine Malonyleinheit ist.
Die Polymer-Platin-Verbindung wird in einem pharmazeutisch verträglichen Medium gelöst, das sich zur parenteralen Verabreichung eignet.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Ansteuerung einer Platinverbindung zu einem festen Tumor in einem Individuum. Das Verfahren beinhaltet die Herstellung einer Polymer-Platin-Verbindung, die aus einem synthetischen Polymergerüst besteht und Seitenketten aufweist, die in Abständen entlang des Gerüsts verteilt sind. Die Seitenketten (i) bestehen aus einem Oligopeptid, das an einem Ende mit dem Gerüst und am anderen Ende mit einer Platinverbindung verbunden ist und (ii) umfassen mindestens eine Verknüpfung, die dazu bestimmt ist, unter ausgewählten physiologischen Bedingungen gespalten zu werden, um die Platinverbindung freizusetzen, die Antitumoraktivität aufweist oder in vivo so umgewandelt wird, dass sie diese aufweist. Die Verbindung wird in einer pharmazeutisch wirksamen Menge parenteral an ein Individuum verabreicht.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der therapeutischen Breite einer Platinverbindung, wenn die Verbindung zur Behandlung eines Tumors verwendet wird, indem eine pharmazeutisch verträgliche Lösung, die die Verbindung enthält, parenteral an ein Individuum verabreicht wird. Das Verfahren umfasst, vor der Verabreichung der Verbindung, die Komplexierung der Platinverbindung mit einem Copolymer, das aus einer ersten N-Alkylacrylamidgrundeinheit und einer zweiten Grundeinheit mit einer Oligopeptidseitenkette besteht, die mit einer proximalen Endgruppe abschließt, welche dazu fähig ist, die Platinverbindung zu komplexieren.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit und/oder Stabilität einer Platinverbindung durch Komplexieren der Verbindung mit einem Copolymer, das aus einer ersten N-Alkylacrylamidgrundeinheit und einer zweiten Grundeinheit mit einer Oligopeptidseitenkette besteht, die mit einer proximalen Endgruppe abschließt, welche dazu fähig ist, die Platinverbindung zu komplexieren. Der Polymer-Platin- Komplex ist unter physiologischen Bedingungen löslicher und/oder stabiler als Nicht-Komplex- Platinverbindungen.
Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden besser verstanden, wenn die nachstehende eingehende Beschreibung der Erfindung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen gelesen wird.
Fig. 1A-1B sind Reaktionsschemata zur Synthese eines Hydroxypropylmethylacrylamid (HPMA)-Copolymers, das eine Oligopeptidseitenkette mit einer Ethylendiaminendgruppe trägt, wobei das Oligopeptid Gly-Phe-Leu-Gly (Fig. 1A) oder Gly-Gly (Fig. 1B) ist;
Fig. 2 ist ein Reaktionsschema zur Synthese eines HPMA-Copolymers, das eine Gly-Gly- Oligopeptidseitenkette mit einer Carboxylendgruppe trägt;
Fig. 3 ist ein Plot der Lyse roter Blutzellen, ausgedrückt als Prozentsatz eines Kontroll- Detergenzes, das die vollständige Lyse bewirkt, als Funktion der Polymer-Konzentration in ug/ml, für HPMA-Gly-Gly-Ethylendiamin (offene Kreise), HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly- Ethylendiamin (offene Dreiecke), HPMA-Gly-Gly-COOH (ausgefüllte Kreise) und HPMA-Gly- Phe-Leu-Gly-COOH (ausgefüllte Dreiecke);
Fig. 4A-4B sind Reaktionsschemata für die Synthese von Polymer-Platin-Verbindungen, wobei das Polymer ein HPMA-Copolymer mit einer Gly-Phe-Leu-Gly-Oligopeptidseitenkette mit einer Ethylendiaminendgruppe (Fig. 4A) und einer Gly-Gly-Oligopeptidseitenkette mit einer endständigen Ethylendiamingruppe ist (Fig. 4B);
Fig. 5A-5B sind Reaktionsschemata für die Synthese von Polymer-Platin-Verbindungen, wobei das Polymer ein HPMA-Copolymer mit einer Gly-Phe-Leu-Gly- (Fig. 5A) oder Gly-Gly (Fig. 5B)-Oligopeptidseitenkette ist, das mit einer Carboxylgruppe abschließt;
Fig. 6 ist ein Reaktionsschema für die Synthese einer Polymer-Platin-Verbindung gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wobei das Polymer ein HPMA-Copolymer mit einer Gly-Phe-Leu-Gly-Peptidseitenkette ist, die mit einer Malonyleinheit für die Bindung mit der Platinverbindung abschließt;
Fig. 7A-7E zeigen Polymer-Platin-Verbindungen gemäß anderer Ausführungsformen der Erfindung;
Fig. 8A-8B sind Plots, die den Prozentsatz von Platin, welches in vitro aus HPMA-Copolymer- Platinverbindungen freigesetzt wird, als Funktion der Zeit in Std. darstellen, bei einem pH-Wert = 5,5 (Fig. 8A) und einem pH-Wert = 7,4 (Fig. 8E) für HPMA-Gly-Gly-Ethylendiamin-Pt (offene Kreise), HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt (offene Dreiecke), HPMA-Gly-Gly- O-Pt (ausgefüllte Kreise) und HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt (ausgefüllte Dreiecke);
Fig. 9A-9B sind Plots, die die In-vitro-Freisetzung von Platin aus der Polymer-Platin- Verbindung HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Malonat-Pt in Salzlösung als Funktion der Zeit zeigen, wobei das freigesetzte Platin durch AAS (Fig. 9A) und durch den o-Phenylendiamin- Colorimetrie-Assay (Fig. 9B) gemessen wird;
Fig. 10A-10B sind Säulendiagramme, die die Wirkung von HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly- Ethylendiamin-Pt (Fig. 10A) und HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt (Fig. 10B) gegen ein ausgeprägtes B 16-Melanom in Mäusen zeigen, ausgedrückt als das Verhältnis der mittleren Überlebenszeit der behandelten Tiere zu den unbehandelten Kontrolltieren · 100 (T/C) für verschiedene Platindosierungen, und im Vergleich mit Tieren, die 1 mg/kg Cisplatin erhielten, und mit unbehandelten Kontrolltieren;
Fig. 11 ist ein Plot, der die Tumorgröße in mm² als Funktion der Zeit in Tagen aufführt, für Mäuse, die ein s.c. B 16-Melanom haben, die mit 10 mg/kg HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt (ausgefüllte Dreiecke), 1 mg/kg Cisplatin (offene Kreise) behandelt oder nicht behandelt (durchgezogene Linie) wurden;
Fig. 12 ist ein Plot, der die relative Platinkonzentration als Funktion der Zeit in Minuten in einem B16F10-Tumor 72 Std. nach der intravenösen Injektion von 1 mg/kg HPMA-Gly-Gly- Ethylendiamin-Pt (offene Dreiecke) oder 1 mg/kg Cisplatin (ausgefüllte Kreise) zeigt; und
Fig. 13 ist ein Plot, der den Platingehalt in ug/g in Tumoren in Mäusen nach der intravenösen Verabreichung von HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Malonat-Pt (ausgefüllte Quadrate) oder freiem Cisplatin (offene Kreise) als Funktion der Zeit zeigen.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

1. Herstellung der Polymer-Platin-Verbindung

Die erfindungsgemäße Polymer-Platin-Verbindung umfasst ein Polymer zur Bindung einer Platinverbindung. Der Begriff "Platin", wie er hier gewöhnlich im Zusammenhang mit einem Platinkomplex oder einer Platinverbindung verwendet wird, betrifft ein Platinmetallatom, das an einen oder mehrere Liganden gebunden ist. Das Platinatom kann eine formale Ladung tragen, wie im Falle der Platinsalze, wie K&sub2;PtCl&sub4;, Kaliumtetrachlorplatinat, worin das Platin eine formale Ladung von (-2) trägt oder keine formale Ladung tragen kann wie in Cisplatin, PtCl&sub2;(NH&sub3;)&sub2;. Das Platinmetallatom kann in verschiedenen Oxidationstufen, wie Pt(0), Pt(II) oder Pt(IV) vorkommen, obwohl Platin im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gewöhnlich Pt(II) ist. Die Platin-Spezies kann in einem beliebigen Koordinationszustand vorliegen, ist aber gewöhnlich vierwertig. "Platinat" oder "Platinat-Spezies", wie es hier verwendet wird, betrifft eine Platinverbindung, worin das Platinatom in einem Oxidationszustand von Pt(II) oder Pt(IV) vorliegt.
Eine Anzahl von Polymeren eignet sich für die Verwendung und umfasst gewöhnlich irgendein Polymer, das biologisch verträglich, bspw. nicht-toxisch und nicht-immunogen, ist. Das Polymer ist vorzugsweise synthetisch, so dass der Molekulargewichtsbereich leicht eingestellt werden kann, damit eine Größe erzielt wird, die sich für eine verstärkte Endothel-Permeation und Retention am Ort eines Tumors und zur renalen Filtration eignet. Bevorzugte Polymere sind für eine leichte Herstellung eines Pharmazeutikums hydrophil, und stärker bevorzugt ist das Polymer wasserlöslich. Das Polymer sollte auch stabil sein, und insbesondere nach der Herstellung der Polymer-Platin-Verbindung und Formulierung in ein pharmazeutisches Präparat stabil sein.
Polymere, die sich zur In-vivo-Verabreichung und zur Konjugation mit Medikamenten eignen, wurden von Duncan beschrieben (Duncan, et al., 1992). Diese Polymere, die sich ebenfalls zur erfindungsgemäßen Verwendung eignen, umfassen Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol und deren Copolymere, Dextrane, Methacrylat-Vinylpyrrolidon-Copolymere und andere. Man beachte, dass das ausgewählte Polymer mit den chemischen Einheiten derivatisiert werden kann, die sich zur Bindung der Platinverbindung eignen.
Das Polymer kann ein Homopolymer oder ein Copolymer sein, einschließlich Block- Copolymeren, Random-Copolymeren und alternierenden Copolymeren. Das Polymer kann, wenn gewünscht, mit nicht-abbaubaren oder biologisch abbaubaren Bindungen vernetzt werden, so dass die gewünschten physikalischen Eigenschaften erzielt werden. Eine bevorzugte Familie von Polymeren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind die N-Alkylacrylamidpolymere. Sie umfassen Homopolymere und Copolymere, die aus Monomeren der Acrylamidfamilie hergestellt werden, wie Acrylamid, Methyacrylamid und Hydroxypropylacrylamid. In den zur Unterstützung der Erfindung durchgeführten Untersuchungen wurde ein Copolymer auf der Basis von N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (HPMA) hergestellt, indem HPMA mit einer Monomereinheit mit einer Oligopeptidseitenkette für die Bindung der Platinverbindung copolymerisiert wurde. Das Copolymer wurde mit einer Platinverbindung umgesetzt, so dass eine Polymer-Platin-Verbindung mit Antitumoraktivität in einem tumortragenden Säugetier erhalten wurde.

A. Herstellung eines beispielhaften HPMA-Copolymers

Ein beispielhaftes Copolymer, das zur Unterstützung der Erfindung hergestellt wurde, ist ein Copolymer, das aus zwei Grundeinheiten besteht. Eines ist eine N-Alkylacrylamid-Grundeinheit. Die andere Einheit ist so bestimmt, dass sie eine Oligopeptidseitenkette trägt, die mit einer Endgruppe zur Bindung an eine Platinverbindung abschließt. Das beispielhafte N- Alkylacrylamid-Copolymer hat die allgemeine Struktur:
wobei R&sub1; H oder CH&sub3; ist, R&sub2; ein Niederalkyl- oder Niederhydroxyalkylrest ist und R&sub3; eine Alkylkette oder Peptidylseitenkette ist, die nachstehend beschrieben ist, und m und n jeweils zwischen 0,1 bis 99,9 Molprozent, vorzugsweise zwischen 1 bis 99 Molprozent, am stärksten bevorzugt zwischen 5 und 95 Molprozent betragen.
"Alkyl" betrifft Kohlenwasserstoffketten, gewöhnlich in der Länge im Bereich von etwa 1 bis 12 Kohlenstoffatomen. Die Kohlenwasserstoffketten können gesättigt oder ungesättigt sein und können gegebenenfalls zusätzliche funktionelle Gruppen enthalten, die daran befestigt sind, wie Hydroxylgruppe oder Halogenatom. Die Kohlenwasserstoffketten können verzweigt oder geradkettig sein. Beispielhafte Alkylgruppen umfassen Ethyl, Propyl, 1-Methylbutyl, 1- Ethylpropyl und 3-Methylpentyl.
"Niederalkyl" betrifft einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und kann geradkettig oder verzweigt sein, wie bspw. Methyl, Ethyl, n-Butyl, i-Butyl, tert.-Butyl, einschließlich fluorierter, Monohydroxy- oder chlorierter Formen davon.
Die Oligopeptidseitenkette R&sub3; besteht vorzugsweise aus Peptidyl- oder Aminosäureeinheiten, die eine funktionelle Gruppe zur Bindung von Platin enthalten oder so funktionalisiert werden können, dass sie eine solche enthalten. Die Seitenkette sollte die In-vivo-Löslichkeit oder Toxizitätseigenschaften des resultierenden Platin-Polymer-Komplexes nicht beeinträchtigen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform endet die Oligopeptidseitenkette in einer proximalen Endgruppe, die eine Platinverbindung binden kann, wobei Bindung für Befestigung, Komplexierung, Koordinierung, Chelatbildung und kovalente Bindung steht. Es ist auch möglich, dass die Platinverbindung eine Gruppe zur Umsetzung und Komplexierung mit der Oligopeptidseitenkette enthält, oder so funktionalisiert wird, dass sie eine solche enthält.
"Aminosäure", betrifft eine beliebige Verbindung, die eine Aminogruppe und eine Carbonsäuregruppe enthält. Die Aminogruppe kann an Stellen nahe der Carboxyfunktion vorkommen, wie z. B. in den α-Aminosäuren, oder an irgendeiner Stelle im Molekül. Die Aminosäure kann ebenfalls zusätzliche funktionelle Gruppen enthalten, wie Amino, Thio, Carboxyl, Carboxamid, Imidazol, usw. Die Aminosäure kann synthetisch oder natürlich vorkommend sein.
"Oligopeptid" oder "Peptidyl" betreffen zwei oder mehrere miteinander verbundene Aminosäuren. Beispielhafte Oligopeptide umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Aminosäurekombinationen von Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly- Phe-Leu-Gly-Phe, Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe. Bevorzugte Oligopeptide haben die Form Gly- (W)p-Gly, wobei p die Bedeutung 0 bis 3 hat und (W) eine beliebige Aminosäure oder eine Kombination von beliebigen Aminosäuren ist. Zwei Beispiele umfassen Gly-Gly und Gly-Phe- Leu-Gly. Die Platinverbindung kann mit den Amid- oder Carboxylgruppen des Oligopeptides komplexiert werden oder, wie nachstehend erörtert, die Peptidylseitenketten enden in einer proximalen Endgruppe zur Komplexierung mit dem Platin entweder in Monodentat- oder Bidentat-Bindung.
Wie obenstehend erwähnt, trägt die Oligopeptidseitenkette in einer bevorzugten Ausführungsform kovalent an ihrem proximalen Ende eine Gruppe, durch die die Platinverbindung mit dem Polymer komplexiert wird. Die Endgruppe hat gewöhnlich Einheiten, die sich zur Bindung von Platin über Bindungen eignet, die gewöhnlich in vitro stabil sind, jedoch in vivo gespalten werden können, damit die aktive Form der Platinverbindung freigesetzt wird. Beispielhafte Endgruppen umfassen Hydroxy-, Carboxygruppe, eine Anzahl von α,ω- Aminen, einschließlich Ethylendiamin und Ethylentriamin, und Komplex- oder Chelatringe, wie eine Malonyleinheit.
Ein bevorzugtes Copolymer zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Verbindung ist ein Copolymer von HPMA. In Bezug auf die vorstehende Struktur hat bei einem HPMA-Copolymer R&sub1; die Bedeutung CH&sub3; und R&sub2; die Bedeutung CH&sub2;CHOHCH&sub3; (Hydroxypropyl). Untersuchungen wurden erfindungsgemäß durchgeführt, indem HPMA-Copolymere, einschließlich entweder Gly- Gly- oder Gly-Phe-Leu-Gly-Oligopeptidseitenketten mit proximalen Endgruppen von Ethylendiamin, Carboxyl oder Malonat, wie beschrieben wird, hergestellt werden.
Fig. 1A-1B zeigen Reaktionsschemata für die Synthese eines Hydroxypropylmethylacrylamid (HPMA)-Copolymers, das eine Peptidylseitenkette von Gly-Phe-Leu-Gly (Fig. 1A) oder Gly-Gly (Fig. 1B) und eine proximale Endgruppe von Ethylendiamin trägt. Wie in Beispiel 1 gezeigt, wird das HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Copolymer (Verbindung III in Fig. 1A) hergestellt, indem ein HPMA-Copolymer, das eine Gly-Phe-Leu-Gly-p-Nitrophenol-(Verbindung I)-Seitenkette enthält, mit Ethylendiamin (Verbindung (II) umgesetzt wird. Die Herstellung der HPMA-Copolymere, die Peptidyl-p-nitrophenol enthalten, wurden von Duncan (Duncan, et al., 1987) beschrieben.
Fig. 2 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese eines HPMA-Copolymers, das seitenständige Peptidylcarboxygruppen trägt, wobei die Peptidylseitenkette Gly-Gly ist. Wie in Beispiel 2 beschrieben, wird ein HPMA-Copolymer, das eine Gly-Gly-p-Nitrophenol-Seitenkette (Verbindung IV) enthält, hergestellt und mit Natriumhydroxid (Verbindung VI) behandelt, so dass das Natriumcarboxylat (Verbindung VII) erhalten wird. Die Umsetzung mit 0,02 M HCl erzeugt das gewünschte HPMA-Copolymer, das eine Gly-Gly-Oligopeptidseitenkette mit einer Carboxylendgruppe (Verbindung VIII) trägt.
Das Reaktionsschema von Fig. 2 eignet sich ebenfalls zur Synthese eines HPMA-Copolymers, das eine Gly-Phe-Leu-Gly-Oligopeptidseitenkette mit einer endständigen Carboxylgruppe (Verbindung XII, Fig. 5A) enthält. Wie vorstehend erörtert, ist das Polymer zur Verwendung in dem Polymer-Platin-Komplex in einer weiteren Ausführungsform ein Homopolymer, insbesondere ein Homopolymer, das aus Monomeren der Acrylamid-Familie hergestellt wird. Das Homopolymer wird mit einer Seitenkette zur Bindung der Platinverbindung gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren derivatisiert.
Das synthetische Polymer zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Polymer-Platin-Komplex hat ein Molekulargewicht zwischen etwa 1.000 und 5.000.000 Dalton, stärker bevorzugt zwischen 5.000 bis 1.000.000 Dalton. Das Molekulargewicht ist ein wichtiger Parameter bei der Bestimmung der Blutkreislaufs-Lebensdauer und der Körperverteilung der Verbindung, insbesondere seine erhöhte Endothel-Permeation und Retention am Tumor. Die Polydispersität des Polymers ist ebenfalls ein Faktor bei der Kreislaufs-Lebensdauer und Verteilung (Seymour, et al., 1987).
Wie vorstehend erörtert ist das Polymer zur Verwendung in der Polymer-Platin-Verbindung in einem physiologisch verträglichen Medium löslich. Das Polymer ist vorzugsweise zur, Verabreichung in Salzlösung oder anderen pharmazeutischen Trägern auf wässriger Basis wasserlöslich.
Die in den Beispielen 1 und 2 hergestellten Polymere wurden auf biologische Verträglichkeit, wie in Beispiel 3 beschrieben, untersucht. Die Cytotoxizität der Polymere wurde durch Zugabe der HPMA-Copolymere zu Kulturen von L132 (menschliche embryonische Lungenzellen) oder B 16-Melanomzellen und Inkubation für 72 Std. bestimmt. Nach der Inkubation wurde 5- Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu dem Kulturmedium gegeben und vor der Entfernung des Kulturmediums und der Zugabe von Dimethylsulfoxid inkubiert, so dass die MTT-Kristalle gelöst wurden. Die Extinktion der Zellen wurde quantifiziert, um die Lebensfähigkeit der Testkulturen relativ zu einer Kontrollkultur der Zellen in Abwesenheit des Polymers zu messen. Eine positive Kontrolle von Poly-L-Lysin wurde ebenfalls untersucht. Keine Toxizität der HPMA-Copolymere wurde im Vergleich zu Dextran als negative Kontrolle und Poly-L-Lysin als positive Kontrolle beobachtet.
Die biologische Verträglichkeit der HPMA-Copolymere wurde ebenfalls durch Bewertung der Fähigkeit der Polymere zur Lyse der roten Blutzellen bestimmt. Wie in Beispiel 3B beschrieben, wurden die in phosphatgepufferter Salzlösung suspendierten roten Blutzellen zu den HPMA- Copolymeren gegeben und 1 Std. oder 24 Std. inkubiert. Poly-L-Lysin wurde als positives Kontrollpolymer verwendet, und das Detergenz Triton X 100 wurde zur Erzeugung einer 100%igen Lyse verwendet. Nach der Inkubation wurden die Testzellen zentrifugiert, und die Überstände wurden für die Freisetzung von Hämoglobin analysiert. Die Ergebnisse sind in der Fig. 3 gezeigt, wobei die Lyse roter Blutzellen, ausgedrückt als Prozentsatz eines Kontrolldetergenzes, das eine vollständige Lyse herbeiführt, als Funktion der Polymerkonzentration in ug/ml, für HPMA-Gly-Gly- Ethylendiamin (offene Kreise), HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin (offene Dreiecke), HPMA- Gly-Gly-COOH (ausgefüllte Kreise) und HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-COOH (ausgefüllte Dreiecke) gezeigt ist. Die Daten zeigen, dass die HPMA-Copolymere rote Blutzellen nicht signifikant lysieren.

B. Herstellung der Polymer-Platin-Verbindungen

Die wie in den Beispielen 1 und 2 hergestellten HPMA-Copolymere wurden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polymer-Platin-Verbindungen verwendet.
Fig. 4A zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese einer Polymer-Platin-Verbindung, die aus einem HPMA-Copolymer mit einer Gly-Phe-Leu-Gly-Oligopeptid-Seitenkette mit Ethylendiamin-Termius besteht. Wie in Beispiel 4A beschrieben wird das HPMA-Copolymer mit Kaliumtetrachlorplatinat(II) (Verbindung IX) umgesetzt, so dass eine Verbindung gebildet wird, bei der Platin an die Aminfunktionalitäten in der Ethylendiaminendgruppe (Verbindung X) gebunden ist.
Fig. 4B ist ein ähnliches Reaktionsschema für ein HPMA-Copolymer mit einer Gly-Gly- Seitenkette, das mit Ethylendiamin abschließt, hergestellt wie in Bezug auf Fig. 1B beschrieben. Wie in Beispiel 4B eingehend beschrieben führt die Umsetzung mit Kaliumtetrachlorplatinat zu einer Verbindung, bei der das Platin an die Amingruppen in der endständigen Ethylendiaminendgruppe (Verbindung XI) gebunden ist.
Löslichkeitsuntersuchungen der in den Fig. 4A-4B gezeigten Polymer-Platin-Verbindungen wurden durchgeführt, um die Löslichkeit in Wasser bei 25ºC zu bestimmen. Die in der Tabelle 1 gezeigten und mit der Wasserlöslichkeit von Cisplatin verglichenen Ergebnisse zeigen, dass die Polymer-Platin-Verbindungen eine Wasserlöslichkeit größer als etwa 320 mg/ml, eine signifikante Verbesserung gegenüber der Löslichkeit von Cisplatin, aufweisen. Die Stabilitätsdaten der in Tabelle 1 gezeigten Verbindungen zeigen, dass die Verbindungen in Lösung bleiben, bspw. länger als 6 Monate stabil sind. Tabelle 1
¹Gew.% Pt, bestimmt durch Atomabsorptionsspektroskopie.
²en = Ethylendiamin
Die Synthese der Polymer-Platin-Verbindungen aus HPMA-Copolymeren mit einer Peptidylseitenkette mit einer endständigen freien Säurehydroxylgruppe ist in den Fig. 5A-5B gezeigt und in Beispiel 5 beschrieben. In Fig. 5A wird HPMA-Copolymer mit einer Gly-Phe- Leu-Gly-Seitenkette und einer terminalen Carboxylgruppe mit Cisplatin (Verbindung XIII) umgesetzt, so dass eine Polymer-Platin-Verbindung erhalten wird, in der Platin mit dem Polymer über die Carboxylgruppe (Verbindung XIV) komplexiert wird. Fig. 5B zeigt eine ähnliche Reaktion für ein HPMA-Copoplymer mit einer Gly-Gly-Seitenkette.
Fig. 6 ist ein Reaktionsschema für die Synthese einer Polymer-Platin-Verbindung gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform, wobei das Polymer ein HPMA-Copolymer mit einer Gly-Phe-Leu-Gly-Peptidseitenkette ist, das mit einer Malonyleinheit für die Bindung mit der Platinverbindung endet. Das Polymer wird durch Umsetzung des HPMA-Copolymers mit der Gly-Phe-Leu-Gly-p-Nitrophenol-Seitenkette (Verbindung XVI) mit Diethylaminomalonathydrochlorid (Verbindung XVII) hergestellt. Das Produkt (Verbindung XVIII) wird wie in Beispiel 6 beschrieben behandelt, und schließlich mit cis-[Pt(NH&sub3;)&sub2;(H&sub2;O)&sub2;]²&spplus; (hergestellt wie in Beispiel 6A beschrieben) behandelt, so dass die gewünschte Polymer-Platin-Verbindung (Verbindung XX) erhalten wird.
Die vorstehend beschriebenen Polymer-Platin-Verbindungen wurden mit Cisplatin oder Kaliumtetrachlorplatinat als Ausgangsmaterial für Platin hergestellt. Man beachte, dass sich eine Reihe leicht verfügbarer oder synthetisierter Platinkomplexe verwenden lässt, um den erfindungsgemäßen Polymer-Platin-Komplex herzustellen. Das Platin-Ausgangsmaterial sollte mindestens einen, vorzugsweise zwei, leicht verdrängbare Liganden zur Komplexbildung mit dem Polymer besitzen, und ist für eine einfache Synthese vorzugsweise wasserlöslich. Die Platin-Ausgangsverbindung hat nicht notwendigerweise eine therapeutische Aktivität in vivo, und wird vorzugsweise in vivo in eine biologisch aktive Form bei einer biologisch induzierten Verdrängung des Polymers insgesamt oder teilweise umgewandelt. Die Platinverbindung wird insbesondere in vivo am beabsichtigten Zielort in die biologisch aktive Form umgewandelt, indem das Polymer ganz oder teilweise freigesetzt wird.
Man beachte, dass die Platinverbindung mit dem Polymer durch eine Bindung an die Amide oder Carboxylgruppen der Peptidylseitenketten komplexiert werden kann. Bei den Ausführungsformen, bei denen die Seitenketten eine proximale Endgruppe zur Anbindung der Platinverbindung beinhalten, geht man davon aus, dass die Verbindung derart gebunden werden kann, dass entweder eine Monodentat-Spezies, eine Bidentat-Spezies oder ein Gemisch davon erhalten wird. Die vorstehend für die Herstellung der Polymer-Platin-Verbindung beschriebenen Reaktionsbedingungen ergeben ein Gemisch aus Monodentat- und Bidentat-Spezies. Die Reaktionsbedingungen können folglich so ausgewählt werden, dass eine oder mehrere dieser Spezies begünstigt werden. Man geht davon aus, dass auch andere Endgruppen zur Bindung der Platinverbindung in Frage kommen, und einige Beispiele sind in der Fig. 7 gezeigt. Bei diesen Strukturen wird das Polymergerüst durch eine gewellte Linie veranschaulicht, und eine einzelne Peptidylseitenkette ist am Polymer gebunden gezeigt, und (AA) ist eine beliebige Aminosäure, l ist 0-4, q ist 0-2, Z¹ ist O oder NH, Z² ist OH oder NH&sub2;, Z³ ist OH&sub2;, NH&sub3;, NH&sub2;R&sub4;, wobei R&sub4; ein Niederalkyl ist, X hat die Bedeutung F, Br, Cl, I, OH oder Wasser, a ist 0-9, b und c können unabhängig 0-2 sein, zusammengenommen jedoch nicht größer als 2 sein, R&sup5; und R&sup6; haben die Bedeutung H, Niederalkyl oder bilden zusammengenommen einen Ring mit 5-7 Atomen.

II. In-Vitro-Charakterisierung der Polymer-Platin-Verbindungen

Wie in Beispiel 7A-7C beschrieben, wurden die wie vorstehend beschrieben hergestellten Polymer-Platin-Verbindungen (Beispiele 4, 5 und 6) in vitro auf die Freisetzung von Platin untersucht. Die In-Vitro-Freisetzung wurde bei einem pH-Wert von 5,5 und einem pH-Wert von 7,4 bestimmt, indem die Testverbindungen in Citrat-Phosphatpuffer bzw. in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst wurden. Das freie Pt im Puffer wurde mit dem o-PDA-Test oder durch AAS, wie im Abschnitt über die Methoden unten beschrieben, analysiert.
Die Ergebnisse für die Polymer-Platin-Verbindungen mit proximalen Ethylendiamin- und Carboxylendgruppen sind in den Fig. 8A-8B gezeigt, wo die Konzentration von Pt, welches aus den Polymer-Platin-Verbindungen freigesetzt wurde, ausgedrückt als Prozentsatz des insgesamt Verfügbaren, als Funktion der Zeit aufgetragen ist. Wie ersichtlich setzen bei einem pH-Wert von 5,5 (Fig. 8A) und bei einem pH-Wert von 7,4 (Fig. 8B) die HPMA-Copolymere mit einer Seitenkette mit endständiger Carboxylgruppe, HPMA-Gly-Gly-O-Pt (ausgefüllte Kreise) und HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt (ausgefüllte Dreiecke), das Platin rascher frei als die Copolymere mit Ethylendiamin-Endgruppe, HPMA-Gly-Gly-Ethylendiamin-Pt (offene Kreise) und HPMA- Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt (offene Dreiecke).
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Platin, welches am Polymer über eine Carboxylendgruppe gebunden ist, rascher als Platin freigesetzt wird, das am Polymer über eine Ethylendiamin- Endgruppe gebunden ist. Die Ergebnisse legen ebenfalls nahe, dass die Peptidylseitenketten, die mit einer Ethylendiaminspezies abschließen, zuerst enzymatisch gespalten werden müssen, damit eine Platin-Spezies freigesetzt wird.
Wie ersichtlich setzen HPMA-Gly-Gly-O-Pt und HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt mit etwa äquivalenten Geschwindigkeiten bei einem pH-Wert von 5,5 Platin frei. Bei einem pH-Wert von 7,4 setzt das Polymer mit den kürzeren Gly-Gly-Seitenketten Pt mit ungefähr 50% der Geschwindigkeit bei einem pH-Wert von 5,5 frei. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Geschwindigkeit für die Freisetzung der Platinverbindung aus der Polymer-Platin-Verbindung durch die Auswahl der Zusammensetzung und der Länge der Seitenkette kontrolliert werden kann.
Die Ergebnisse für die In-vitro-Freisetzung für die Polymer-Platin-Verbindung mit einer Malonat-Endgruppe ist in den Fig. 9A-9B gezeigt. In Fig. 9A wurde die Verbindung (hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben) in phosphatgepufferter Salzlösung bei einem pH-Wert von 7,4 bei 37ºC gelöst, und die Lösung wurde nach 7 min. 4 Std. und 24 Std. entnommen, wie eingehender in Beispiel 7B beschrieben. Die Proben wurden auf den Pt-Gehalt durch AAS analysiert, und die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Gesamtmenge gezeigt. In Fig. 9B wurde die Platinfreisetzung aus dem gleichen Polymer wie in Beispiel 7C beschrieben bestimmt, wobei die Proben über einen 72-Std.-Zeitraum entnommen und mittels o-Phenylendiamin-Colorimetrie-Assay auf freies Pt untersucht wurden. Die Ergebnisse der Fig. 9A und 9B stimmen gut miteinander überein.
Die In-vitro-Freisetzungsdaten zeigen zusammengefasst, dass die Freisetzungsrate von Platin aus den Polymer-Platin-Verbindungen durch Auswahl der Endgruppe für die Bindung von Platin, durch die Zusammensetzung und Länge der Oligopeptidseitenkette und durch den pH-Wert gesteuert werden kann.

III: In-vivo-Charakterisierung der Polymer-Platin-Verbindung

Die wie vorstehend beschrieben hergestellten Polymer-Platin-Verbindungen wurden in vivo in Mäusen untersucht, um die Antitumor-Aktivität, Toxizität und die biologische Verteilung zu bestimmen. Die Antitumor-Aktivität und die Toxizität wurden mit den in Beispiel 8 beschriebenen Tumormodellen bestimmt.

A. Intraperitoneal überimpfter L1210-Tumor

Wie in Beispiel 8A beschrieben wurden die Polymer-Platin-Verbindungen gegen ein intraperitoneales (i.p.) L1210-Tumormodell untersucht. Der Tumor wurde an Tag 0 überimpft und anschließend an den Tagen 1, 2 und 3 mit HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt oder HPMA-Gly-Gly-Ethylendiamin-Pt, in verschiedenen Dosierungen intraperitoneal verabreicht, welche als Einzeldosis pro 24-Std.-Zeitraum verabreicht wurden, behandelt. Freies Cisplatin wurde als Vergleichsbehandlung verabreicht. Die Ergbnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
¹ die angegebene Dosis wurde einmal täglich für 3 Tage nach der Tumorüberimpfung verabreicht.
² T/C = Verhältnis der mittleren Überlebensdauer der behandelten Tiere, geteilt durch das mittlere Überleben der unbehandelten Kontrollgruppe · 100.
³ en = Ethylendiamin
Aus Tabelle 2 geht hervor, dass die maximale tolerierte Dosis von freiem Cisplatin in diesem Modell 2 mg/kg, einmal täglich drei Tage lang verabreicht, war. Das HPMA-Copolymer mit der enzymatisch abbaubaren Seitenkette Gly-Phe-Leu-Gly, das mit einer Ethylendiamin-Endgruppe für die Bindung von Platin abschloss, war, verglichen mit der optimalen Dosis für freies Platin, gleichsam aktiv. Das HPMA-Copolymer war jedoch signifikant weniger toxisch als freies Cisplatin, wie durch den mehr als siebenfachen Anstieg der Platin-Dosierung bewiesen wurde, bspw. 15 mg/kg einmal täglich für drei Tage, gegenüber 2 mg/kg für freies Cisplatin, das ohne toxische Todesfälle verabreicht wurde. Es wird auch vermerkt, dass die HPMA-Gly-Phe-Leu- Gly-Ethylendiamin-Pt-Verbindung eine Antitumoraktivität bei einer Dosis von 3 mg/kg pro Tag für drei Tage aufwies. Freies Cisplatin war dagegen bei dieser Dosierung toxisch.
Weiter Bezug nehmend auf Tabelle 2, zeigte das HPMA-Copolymer mit der nicht enzymatisch biologisch abbaubaren Seitenkette Gly-Gly mit einer endständigen Ethylendiamingruppe für die Bindung von Platin keine signifikante Aktivität über den untersuchten Dosierungsbereich.

B. Intraperitoneales B16-Melanom-Tumormodell

Wie in Beispiel 8B beschrieben wurde die Polymer-Platin-Verbindung HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly- Ethylendiamin-Pt gegen ein VB16-Melanom-Model getestet, das intraperitoneal (i.p.) beimpft wurde. Am Tag nach der Beimpfung wurde das HPMA-Copolymer i.p. als Einzeldosis bei Platinkonzentrationen von 5, 10, 15 und 20 mg/kg verabreicht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
¹ T/C = Verhältnis der mittleren Überlebensdauer behandelter Tiere, geteilt durch das mittlere Überleben der unbehandelten Kontrollgruppe · 100.
² en = Ethylendiamin
Die Daten zeigen, dass die Menge an Platin, die in Form der Polymer-Platin-Verbindung sicher verabreicht werden kann, mehr als viermal höher ist als bei freiem Cisplatin sicher verabreicht werden kann; z. B. 2/5 toxische Todesfälle bei 5 mg/kg freiem Cisplatin und 0/5 toxische- Todesfälle bei 20 mg/kg Polymer-Platin-Verbindung.

C. Subkutanes-B16-Melanom-Tumormodell

Wie im Beispiel 8C beschrieben, wurden B16-Melanomzellen subkutan an Mäuse verabreicht, um einen soliden Tumor zu erzeugen. Die Wirkung der HPMA-Copolymer-Platin-Verbindungen gegen den Tumor wurde getestet, indem die Polymer-Platin-Verbindungen HPMA-Gly-Phe-Leu- Gly-Ethylendiamin-Pt und HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt in Platindosen von 2, 5, 10, 15 mg/kg verabreicht wurden.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 10A-10B dargestellt, wobei Fig. 10A Tieren entspricht, die mit HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt behandelt wurden, und Fig. 10B für Tiere steht, die mit HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt behandelt wurden. Die Daten sind als Verhältnis der mittleren Überlebensdauer behandelter Tiere zur mittleren Überlebensdauer der unbehandelten Kontrolltiere X 100 (T/C) für mehrere Platindosierungen ausgedrückt. Eine Tiertestgruppe erhielt 1 mg/kg Cisplatin, und eine Gruppe tumortragender Mäuse wurde als Kontrolle unbehandelt belassen.
Aus den Daten ist ersichtlich, dass im s.c.-Tumormodell die HPMA-Copolymer-Platin- Verbindung erheblich bessere Anti-Tumorwirkung hat als freies Cisplatin. Bezüglich der HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt-Verbindung (Fig. 10A) war die Anti-Tumorwirkung, verglichen mit freiem Cisplatin, signifikant verbessert und war am besten bei einer Platindosierung von 10 mg/kg. Das HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt war mehr als 15-fach weniger toxisch als freies Cisplatin.
Hinsichtlich der HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt-Verbindung (Fig. 10B) war die Anti- Tumorwirkung bei 10 mg/kg mit einem T/C von mehr als 200 am höchsten. Toxische Todesfälle bei Dosen von 10 mg/kg und 15 mg/kg (2/6 bzw. 4/4) traten bei den Dosierungen 10 mg/kg und 15 mg/kg auf, aber die HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt-Verbindung war immer noch 5-10-fach weniger toxisch als freies Cisplatin, dessen maximale tolerierte Dosis in diesem Modell 1 mg/kg betrug.
Unter weiterer Bezugnahme auf die Fig. 10A-10B zeigte die Anti-Tumorwirkung für die Verbindung, bei der Platin über eine freie Säurehydroxylgruppe gebunden ist, wie sie beispielsweise durch eine endständige Carboxylgruppe bereitgestellt wird (Fig. 10B), eine höhere Anti-Tumorwirkung als die Verbindung mit Ethylendiamin-gebundenem Platin (Fig. 10A). Dieses Ergebnis korreliert mit den vorstehend erläuterten gemessenen Raten der Platinfreisetzung in vitro (Fig. 8A-8B). HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt ist in vitro stabil und erfordert für die Anti-Tumorwirkung eine intratumorale enzymatische Aktivierung. Dies liefert eine Verbindung, die erheblich weniger toxisch ist als der freie Arzneistoff. Die Freisetzungsrate für die enzymatisch biologisch abbaubare Gly-Phe-Leu-Gly-Seitenkette kann durch Verabreichung geeigneter Enzyme zur Erleichterung der enzymatischen Spaltung, wie Proteasen, Trypsin oder Papain, kontrolliert werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Freisetzungsrate der Platinverbindung aus der Polymer-Platin- Verbindung durch Auswahl der endständigen Gruppe zur Bindung der Platinverbindung und durch Auswahl der Zusammensetzung der Oligopeptidseitenkette kontrolliert werden kann.
Die Tumorgröße von Tieren mit einem soliden B16-Tumor wurde als Funktion der Zeit in Tagen für Mäuse untersucht, die mit der Polymer-Platin-Verbindung HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt oder mit Cisplatin behandelt wurden. Wie in Fig. 11 ersichtlich ist, zeigten die mit 10 mg/kg Polymer-Platin-Komplex behandelten Tiere (ausgefüllte Dreiecke) eine deutliche Hemmung des Tumorwachstums verglichen mit denjenigen, die mit 1 mg/kg Cisplatin behandelt wurden (offene Kreise). Die durchgezogene Linie steht für unbehandelte Tiere.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in-vivo-Daten zeigen, dass die erfindungsgemäßen Polymer-Platin-Verbindungen, verglichen mit Cisplatin, eine verbesserte Anti-Tumorwirkung erzielen. Die Polymer-Platin-Verbindungen erreichen eine verbesserte Anti-Tumorwirkung zumindest teilweise durch die Ansammlung der Verbindung am Tumorort. Die Polymer-Platin- Verbindungen können eine biologisch wirksame Form von Platin freisetzen, wobei die Platinfreisetzung durch Auswahl der an das Platin anbindenden Endgruppen und durch Auswahl der Zusammensetzung und Länge der Oligopeptidseitenkette kontrolliert werden kann.
Ein weiterer Beweis für die verstärkte Ansammlung der Polymer-Platin-Verbindung in der Tumorregion ist in Fig. 12 gezeigt. Wie im Beispiel 9 beschrieben, wurden tumortragende Mäuse intravenös mit freiem Cisplatin (1 mg/kg, ausgefüllte Kreise) oder HPMA-Gly-Gly- Ethylendiamin-Pt (1 mg/kg, offenes Dreieck) behandelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung wurden die Tumoren operativ entfernt und der Platingehalt mittels Atomabsorptionsspektroskopie bestimmt.
Wie in Fig. 12 ersichtlich, ist die relative Platinkonzentration in den mit HPMA-Copolymer behandelten Tumoren signifikant höher als bei Tieren, die mit einer äquivalenten Dosis Cisplatin behandelt wurden. Dies zeigt, dass in Form der Polymer-Platin-Verbindung verabreichtes Platin eine verbesserte Ansammlung am Tumorort erzielt. Die verbesserte Ansammlung zeigt eine verstärkte oder selektive Hinführung oder Ansteuerung der Polymer-Platin-Verbindungen zu den Tumoren.
In einer anderen Untersuchung wurden tumortragende Mäuse, wie im Beispiel 10 beschrieben, mit HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Malonat-Pt behandelt. Die Tumore wurden in Zeitabständen bis zu 72 Stunden nach Verabreichung der Polymer-Platin-Verbindung entfernt und mittels AAS auf den Platingehalt untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 gezeigt, und wie ersichtlich, gibt es einen signifikanten Unterschied im Platingehalt zwischen Mäusen, die mit der Polymer-Platin-Verbindung behandelt wurden (ausgefüllte Vierecke), und Mäusen, die mit freiem Cisplatin behandelt wurden (offene Kreise). Vier Stunden nach Verabreichung von HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Malonat-Pt wurde ein Maximum im Platingehalt des Tumors gemessen, wobei das Maximum fast 4-mal höher war als das in den Tumoren von Mäusen, die mit freiem Cisplatin behandelt wurden. Die erfindungsgemäße Polymer-Platin- Verbindung bewirkt eindeutig eine Ansammlung im Tumor.

IV. Verfahren zur Verabreichung und Steuerung der Polymer-Platin-Verbindungen

In einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Verabreichung einer Platinverbindung an einen Tumor in einem Patienten. Das Verfahren umfasst die Herstellung einer Polymer-Platin-Verbindung, die ein Polymer mit Platin enthaltenden Oligopeptidseitenketten aufweist, wie vorstehend beschrieben. Die Verbindung wird an den tumortragenden Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht.
Zur Verabreichung kann die Verbindung auf vielfältige Weise formuliert werden. Zur parenteralen Verabreichung wird die Polymer-Platin-Verbindung in einem wässrigen Medium, z. B. isotonischer Kochsalzlösung, in einer gewünschten Platinkonzentration gelöst. Die Verbindung kann parenteral als einzelne Bolusdosis oder langsame Infusion verabreicht werden. Alternativ kann die Verbindung zur oralen Verabreichung durch Herstellung von Tabletten, Elixieren, Suspensionen und dgl. formuliert werden.
Geeignete Dosierungen für die Tumorbehandlung werden auf der Grundlage der hier dargestellten Daten über die in-vivo-Verabreichung an tumortragende Mäuse bestimmt. Diese Information in Kombination mit den bekannten Dosierungen für andere Platinverbindungen, wie Cisplatin und Carboplatin, und dem Verhältnis der Toxizität zwischen diesen üblichen Platinaten und der erfindungsgemäßen Polymer-Platin-Verbindung liefern eine Anleitung für die Auswahl geeigneter therapeutischer Dosen in Menschen. Der Fachmann kann die Dosierungsspiegel und -schemata auf der Grundlage der Unterschiede in der Toxizität und/oder der Pharmakokinetik der bekannten Platinate und der Polymer-Platin-Verbindungen einstellen, um einen noch größeren therapeutischen Nutzen zu erhalten.
Eine Chemotherapie unter Verwendung der erfindungsgemäßen Polymer-Platin-Verbindungen in Kombination mit anderen Chemotherapeutika kann für bestimmte Krebsarten ebenfalls geeignet sein. Zum Beispiel können Vinblastin, Bleomycin, Actinomycin, Adriamycin, Prednison, Vincristin, Taxane (Taxoter, Taxol), 5-Fluoruracil, Camptothecane, Cyclophosphamid und Gemcytobin in Verbindung mit der Polymer-Platin-Verbindung verabreicht werden. Als Beispiel kann eine Ovarkrebstherapie die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis der Polymer-Platin-Verbindung und von Adriamycin umfassen, die als 24-Stunden-Infusion gemeinsam verabreicht werden. Außerdem wird in Betracht gezogen, dass andere in der Entwicklung stehende Chemotherapeutika, wie Topoisomerase-Hemmstoffe, Angiogense- Hemmstoffe, in Verbindung mit der Polymer-Platin-Verbindung verabreicht werden können.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der therapeutischen Breite einer Platinspezies bereit. Das Verfahren umfasst das Komplexieren einer Platinverbindung über eine Peptidylseitenkette, die in einer proximalen Endgruppe für eine solche Bindung endet, um eine erhöhte therapeutische Breite, z. B. das Verhältnis der maximal tolerierten Dosis zur minimalen heilenden Dosis, zu erzielen. Dies wird durch die vorstehend erläuterten in-vivo-Daten gezeigt, wobei der Polymer-Platin-Komplex signifikant weniger toxisch war als Cisplatin, aber trotzdem zur Tumorbehandlung biologisch wirksam war.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Ansteuerung oder selektiven Hinführung eines höheren Prozentsatzes der dosierten Materialien an den Tumor bereit. Wie durch ein vorstehend bereitgestelltes Beispiel gezeigt, erreicht in Form einer Polymer-Platin-Verbindung verabreichtes Platin eine höhere Ansammlung im Tumor im Vergleich zu Platinverbindungen und insbesondere Platinatverbindungen, die nicht mit einem Polymer komplexiert sind. Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, wie verschiedene Merkmale und Aufgaben der Erfindung erfüllt werden. Die erfindungsgemäße Polymer-Platin-Verbindung ist biologisch, verträglich, wie durch fehlende Cytotoxizität und fehlende Fähigkeit zur Lyse roter Blutkörperchen demonstriert wird. Die Platinverbindung wird an das Polymergrundgerüst über eine Oligopeptidseitenkette gebunden, die mit ihren distalen Ende an das wasserlösliche synthetische Polymer und ihrem proximalen Ende an die Platinverbindung gebunden ist. Die Freisetzungsrate der gebundenen Platinverbindung wird durch Auswahl der Zusammensetzung und Länge der Seitenkette und der endständigen Endgruppe der Seitenkette kontrolliert. In einer Ausführungsform ist die Seitenkette enzymatisch biologisch abbaubar, was eine stabile Verbindung in Abwesenheit geeigneter Enzyme liefert. In einer anderen Ausführungsform ist die Seitenkette nicht enzymatisch biologisch abbaubar und liefert eine wünschenswertere Freisetzungsrate von Platin, sodass eine verbesserte Anti-Tumorwirkung erreicht wird. Die Platinverbindung aus der Polymer-Platin-Verbindung kann auch durch pH-Wirkungen sowohl auf die Zusammensetzung als auch die Länge der Oligopeptidseitenkette kontrolliert werden.
Die durch den erfindungsgemäßen Polymer-Platin-Komplex erzielte Anti-Tumorwirkung ist; zumindest teilweise, auf die verstärkte Ansammlung der Platinverbindung am Tumorort zurückzuführen. Die Zusammensetzung und das Molekulargewicht des Polymers und der Oligopeptidseitenkette sind Faktoren, welche die Ansammlung und Zurückhaltung der Verbindung in Tumoren beeinflussen.
Es ist ersichtlich, dass andere Polymere als HPMA zur Verwendung in der Polymer-Platin- Verbindung geeignet sind. Wie vorstehend erläutert, ist das in der Verbindung zu verwendende Polymer eines, das biologisch verträglich ist und ein für die Endothelpermeabilität am Tumorort und zur Entfernung aus dem Körper mittels Nierenstoffwechsel ausreichendes Molekulargewicht aufweist. Für HPMA wurde die Molekulargewichtsschwelle, welche die Glomerulusfiltration beschränkt, als etwa 45.000 Dalton identifiziert (Seymour, et al., 1987). Diese Schwelle ist jedoch für jedes Polymer, je nach dessen physikochemischen Eigenschaften, unterschiedlich und kann experimentell bestimmt werden. Für jedes ausgewählte Polymer kann das Gleichgewicht zwischen Endothelpermeabilität am Tumorort und Entfernung mittels Nierenstoffwechselmechanismen experimentell bestimmt werden. Das Polymer hat außerdem physikochemische Eigenschaften, z. B. Löslichkeit, Stabilität, Formulierbarkeit in einem pharmazeutisch verträglichen Träger und Langzeitlagerung.

Beispiele

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung der erfindungsgemäßen Polymer- Platin-Verbindung und die Charakterisierung der Verbindungen. Es ist ersichtlich, dass die Beispiele veranschaulichend sind und die Erfindung in keiner Weise beschränken.

V. Materialien

A. Chemikalien

Cisplatin (Cisdiamindichlorplatin(II)), Kaliumtetrachlorplatinat, o-Phenylendiamin, Ethylendiamin, Diethylentriamin, Ninhydrin und Hydrindantin wurden von Sigma, GB, geliefert. Aminopropan-2-ol wurde von Fluka geliefert. Alle Lösungsmittel und Chemikalien wurden von Sigma, GB, oder Aldrich, GB, geliefert und wurden vor Gebrauch entweder destilliert oder über Molekularsieben getrocknet.

B. Zelllinien

Die verwendeten Zelllinien L132 (menschliche embryonale Lungenzellen), COR L23 (nichtkleinzellige Lungenkrebszellen) und H69 (kleinzelliger Lungenkrebs) würden von der European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Biology, Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire, GB, erhalten.

VI. Verfahren

A. Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)

Die Atomabsorption erfolgte unter Verwendung eines (Flammen-) Perkin-Elmer-280- Instruments (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) oder eines (flammenfreien) Perkin-Elmer-AA100 (Graphitofen), die mit wässrigen Lösungen von Kaliumtetrachlorplatinat (K&sub2;PtCl&sub4;) oder Cisplatin (Pt(NH&sub3;)&sub2;Cl&sub2;) in konzentrierter Salpetersäure, konzentrierter -Salzsäure und Wasserstoffperoxid (30%) kalibriert wurden.

B. Kolorimetrischer o-Phenylendiamin-Test (o-PDA)

Proben mit einem unbekanntem Platingehalt von 1-5 mg wurden in 1 ml doppelt destilliertem Wasser und 1 ml o-Phenylendiamin-(o-PDA)-Lösung in Dimethylformamid (DMF) (1-2 mg/ml) gelöst und 10 min bei 100ºC inkubiert. Die in der Probe vorliegende Menge an Platin wurde durch Messen der Extinktion bei 703 nm unter Verwendung von Cisplatin als Bezug bestimmt.

Beispiel 1

Synthese von HMPA-Copolymer-Peptid-Ethylendiamin

Die Synthese von HMPA-Copolymeren, die Peptidyl p-nitrophenol (ONp) enthalten, wurde zuvor beschrieben (Duncan, et al., 1987), wobei die Abschnitte darin, welche die Synthese beschreiben, hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
1 g HMPA-Copolymer mit einer massegemittelten Molekülmasse (MW) von etwa 30.000 und einer Polydispersität (Mw/Mn) von 1,3-1,5, das anhängende Peptidylseitenketten, zum Beispiel Gly-Gly-ONp oder Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (5 mol% oder 10 mol%), enthielt, wurde zu 50 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW) gegeben und 15 Minuten oder bis zur Auflösung bei Raumtemperatur gerührt. Wenn nötig, wurde der pH-Wert mit 0,01 M HCl auf 5,7 eingestellt.
Die Lösung wurde tropfenweise über 20 Minuten zu einer rührenden Lösung von Ethylendiamin in 10 ml DDW gegeben und dann 4 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und anschließend einer 4-tägigen Dialyse (Visking-Schläuche, Porengröße 10.000) gegen 5 l DDW unterworfen. Die erhaltene Lösung wurde unter Verwendung von Amicon-"CENTRIPREP"- Filtern (Amicon, Danvers, MA), Porengröße 10.000, auf etwa 20 ml eingeengt und lyophilisiert, wobei ein weißes/gelblichweißes flauschiges Produkt erhalten wurde (übliche Ausbeute: 0,9 g). Der Gehalt an Ethylendiamin im Produkt wurde mit dem Ninhydrin-Verfahren bestimmt.
Ninhydrinlösung (1 ml, aus einer Lösung von 20 g/l Ninhydrin und 3 g/l Hydrinantin in DMSO und Natriumacetatpuffer (pH 5,5) 75 : 25 Vol./Vol.) wurde zu 1 ml einer Lösung der Probe gegeben und 15 Minuten bei 75ºC inkubiert. Man ließ die Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen, bevor 3 ml Ethanollösung (50% Vol./Vol. in DDW) hinzugefügt wurden. Die Extinktion wurde bei 570 nm aufgezeichnet. Die Anzahl primärer Aminogruppen, die bezogen auf Standardlösungen aus 1-Aminopropan-2-ol berechnet wurde, war für HMPA- Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin 3-4 · 10&sup4; mol/mg und für HMPA-Gly-Gly-Ethylendiamin 3-8 · 10&sup4; mol/mg.

Beispiel 2

Synthese von HMPA-Coyolymer-Peptid-COONa

Die Synthese von HMPA-Copolymeren, die Peptidyl-p-nitrophenol (ONp) enthalten, wurde zuvor beschrieben (Duncan, et al., 1987).
Eine Lösung von NaOH (0,01 M, 50 ml) wurde zu 1 g HMPA-Copolymer mit einem massegemittelten MW von etwa 30.000 und einer Polydispersität (Mw/Mn) von 1,3-1,5, das anhängende Peptidylseitenketten, zum Beispiel Gly-Gly-ONp oder Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (5 oder 10 mol%), enthielt, gegeben. Die Lösung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend filtriert und einer Dialyse unter Verwendung von Visking-Schläuchen, Porengröße 10.000, gegen 5 l DDW für 4 Tage unterworfen. Die erhaltene Lösung wurde, wenn nötig mit Filtration, unter Verwendung von Amicon-"CENTRIPREP"-Filtern, Porengröße 10.000, auf etwa 20 ml eingeengt und lyophilisiert, wobei ein weißes/gelblichweißes flauschiges Produkt erhalten wurde (übliche Ausbeute: 0,9 g).
Das nachstehende Verfahren wurde zur Herstellung von HPMA-Copolymer-Gly-Gly-OH und HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-OH verwendet. Eine Lösung von HCl (0,02 M; 20 ml) wurde zu HMPA-Copolymer-Gly-Gly-ONa oder HMPA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-ONa (0,7 g) gegeben und das Gemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, bevor es mittels Zentrifugation unter Verwendung eines Amicon-"CENTRIPREP"-Filters, Porengröße 10.000, gereinigt wurde. Die Proben wurden bei 2.000 g 40 Minuten zentrifugiert, bis die filtrierte Lösung farblos war (maximal 4 Zentrifugationen). Auf jeder Stufe wurde die Polymerlösung vor der Zentrifugation mit DDW auf 15 ml verdünnt. Die erhaltene Lösung wurde lyophilisiert, wobei ein flauschiges weißes/gelblichweißes Produkt erhalten wurde (übliche Ausbeute: 0,5 g).
Die Quantifizierung der Carbonsäuregruppen erfolgte durch Titrieren einer bekannten Konzentration an Natriumhydroxid mit einem bekannten Gewicht der Probe in einer Lösung von DDW (Säure-Base-Titration). Für HMPA-Gly-Phe-Leu-Gly-OH lagen 2 · 10&supmin;&sup4; mol/g COOH- Gruppen und für HMPA-Gly-Gly-OH 3-5 · 10&supmin;&sup4; mol/g COOH-Gruppen vor.

Beispiel 3

Biologische Verträglichkeit von HMPA-Copolymeren

A. Cytotoxizität

Zellen wurden unter Standardbedingungen in Mikrotiterplatten kultiviert. Nach 24 Stunden wurden Impfzellen (gewöhnlich L132 oder B16-Melanom) in einer Dichte von 1 · 10&sup6; Zellen/ml der Testpolymere und Poly-L-Lysin (MW 56.500) als positiver Bezug in verschiedenen Konzentrationen (0-5 mg/ml) zugesetzt. Die Zellen wurden 72 Stunden inkubiert, bevor 5- Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT: 10 ul) zum Kulturmedium hinzufügt wurde. Die Platten wurden weitere 5 Stunden inkubiert, das Medium wurde entfernt, und 100 ul Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden zum Lösen der dunkelblauen Kristalle hinzugefügt. Die Extinktion bei 550 nm wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesegeräts gemessen, und die Lebensfähigkeit der Testkulturen wurde als Prozentsatz der in Abwesenheit vo Polymer inkubierten Kontrollzellen ausgedrückt.

B. Lyse roter Blutkörperchen

Blut wurde von männlichen Wistar-Ratten nach Tötung mittels Herzpunktion gewonnen. Die Erythrozyten wurden mittels dreimaligem Zentrifugieren des Bluts in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4ºC und 1 : 000 g für 10 Minuten gesammelt. Das endgültige Sediment wurde in PBS resuspendiert, wobei eine 2%ige Gew./Vol. Erythrozytenlösung erhalten wurde. Unter Verwendung eines Mikrotiterplattentests wurden 100 ul der Erythrozytenlösung zu etwa 1.000 ul der Testpolymere in verschiedenen Konzentrationen gegeben und 5 Stunden inkubiert. Das Detergenz Triton X-100 (1% Vol./Vol.) wurde zur Erzeugung von 100%iger Lyse zu einem hinzugesetzt. Nach der Inkubation wurden die Mikrotiterplatten 10 Minuten bei 1.000 g zentrifugiert, um intakte Zellen zu sedimentieren, und die Überstände (100 ul) wurden in eine neue Platte überführt, um die Hämoglobinfreisetzung spektralphotometrisch bei 550 nm zu bestimmen. Die Ergebnisse, ausgedrückt als freigesetzte Menge Hämoglobin als Prozentsatz der Gesamtmenge (Triton X-100), sind in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 4

Synthese von HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt und HPMA-Gly-Gly-Ethylendiamin-Pt

A. Synthese von HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Glv-Ethylendiamin-Pt

Zu einer Lösung von HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin (von Beispiel 1) (0,8 g in 20 ml DDW) wurde tropfenweise über 20 Minuten K&sub2;[PtCl&sub4;] in DDW hinzugefügt. Ungebundenes Platin wurde mittels Zentrifugation (Amicon-"CENTRIPREP"-Filter, Porengröße 10.000) entfernt, wobei wiederholt bei 2.000 · g 40 Minuten zentrifugiert wurde (mindestens 4mal), bis die abgetrennte Lösung farblos war. Die erhaltene, die Polymer-Platin-Verbindung enthaltende Lösung wurde zu Beginn jeder Zentrifugation mit DDW auf 15 ml verdünnt. Die erhaltene Polymer-Platin-Lösung wurde lyophilisiert, wobei ein brauner flauschiger Feststoff erhalten wurde (übliche Ausbeute: 0,7 g). Die Umsetzung ist in Fig. 4A veranschaulicht.
Der Gesamtplatingehalt wurde mit Atomabsorptionsspektroskopie oder dem o-PDA-Verfahren, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Die Ergebnisse einer typischen Analyse mehrerer Chargen von HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu- Gly-Ethylendiamin-Pt sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

B. Synthese von HPMA-Gly-Gly-Ethylendiamin-Pt

Zu einer Lösung von HPMA-Copolymer-Gly-Gly-Ethylendiamin (von Beispiel 1) (0,8 g in 20 ml DDW) wurde tropfenweise über 20 Minuten K&sub2;[PtCl&sub4;] in DDW hinzugefügt. Ungebundenes Platin wurde mittels Zentrifugation (Amicon-"CENTRIPREP"-Filter, Porengröße 10.000) entfernt, wobei wiederholt bei 2000 · g 40 Minuten zentrifugiert wurde (mindestens 4mal), bis die abgetrennte Lösung farblos war. Die erhaltene, Polymer-Platin enthaltende Lösung wurde zu Beginn jeder Zentrifugation mit DDW auf 15 ml verdünnt. Die zentrifugierte Polymer-Platin- Lösung wurde lyophilisiert, wobei ein brauner flauschiger Feststoff erhalten wurde (übliche Ausbeute: 0,7 g). Die Umsetzung ist in Fig. 4B veranschaulicht.
Der Gesamtplatingehalt wurde mit Atomabsorptionsspektroskopie oder dem o-PDA-Verfahren, wie vorstehend im Abschnitt Verfahren beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse einer typischen Analyse mehrerer Chargen von HPMA-Copolymer-Gly-Gly-Ethylendiamin-Pt sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

Beispiel 5

Synthese von HPMA-Copolymer-Gly-Gly-O-Pt und HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt

Pt(NH&sub3;)&sub2;Cl&sub2; (0,12 g in 80 ml doppelt destilliertem Wasser) wurde tropfenweise über 20 Minuten zu einer Lösung von HPMA-Copolymer-Gly-Gly-ONa (0,8 g in 30 ml DDW) unter Rühren bei Raumtemperatur gegeben. Ungebundenes Platin wurde mittels Zentrifugation (Amicon- "CENTRIPREP"-Filter, Porengröße 10.000) entfernt, wobei wiederholt bei 2.000 · g 40 Minuten zentrifugiert wurde (mindestens 4mal), bis die abgetrennte Lösung farblos war. Die erhaltene Lösung, üblicherweise 20 ml, wurde lyophilisiert, wobei ein weißer flauschiger Feststoff erhalten wurde (übliche Ausbeute: 0,7 g). Die Umsetzung ist in den Fig. 5A-5B veranschaulicht.
Der Platingehalt wurde mit AAS oder dem o-PDA-Verfahren, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Die Ergebnisse einer typischen Analyse von HPMA-Copolymer-Gly-Gly-O-Pt und HPMA- Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6

Beispiel 6

Synthese von HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Malonat-Pt

Eine Lösung von Diethylaminomalonathydrochlorid (Verbindung XVII, 0,21 g in 2 ml wasserfreiem DMF) wurde zu einer rührenden Lösung von HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu- Gly-ONp (Verbindung XVI, 0,5 g in 4 ml wasserfreiem DMF) gegeben. Triethylamin (0,2 g) wurde über 4 Minuten hinzugefügt und das Ganze 15 Stunden gerührt. Nach Verdampfen bis zur Trockne unter Vakuum wurde der Rückstand in 4 ml DDW gelöst. Die Lösung wurde dann filtriert, auf eine 2,6 · 34 cm Sephadex-G25-Säule aufgetragen und mit DDW eluiert. Die Polymerfraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein flauschiger weißer Feststoff erhalten wurde (Verbindung XVIII, 0,439 g). Eine 0,435-g-Portion des Feststoffs wurde in 1,3 ml Methanol gelöst. Die Lösung wurde auf 15ºC abgekühlt, und 0,686 ml 0,99 M wässrige Natriumhydroxidlösung wurden unter Rühren hinzugefügt. Nach Rühren bei 15ºC für 15 Minuten wurde das Rühren bei Raumtemperatur weitere 3,75 Stunden fortgesetzt. Der pH der Lösung wurde durch Zugabe von 1 M Salzsäure auf etwa 10,5 eingestellt, und nach Filtrieren wurde die Lösung auf eine 2,5 · 34 cm Sephadex-G25-Säule aufgetragen und mi Wasser eluiert. Die Polymerfraktionen (Volumen 60 ml) wurden vereinigt und unter Verwendung von Amicon- "Centriprep-10"-Konzentratoren (Ausschluss-MW 10.000 Dalton) auf ein Volumen von 20 ml eingeengt (Amicon, Danvers, MA). Das Volumen wurde unter Verwendung von doppelt destilliertem Wasser auf 45 ml erhöht und auf 30 ml eingeengt, auf 45 ml erhöht und schließlich auf 12 ml eingeengt (wiederholtes Ultrafiltrationsverfahren). Der pH einer 9-ml-Portion der Lösung wurde unter Verwendung von 0,01 M NaOH auf 7,5 eingestellt und die Lösung (Verbindung XIX) dann tropfenweise zu 7,53 ml cis-[Pt(NH&sub3;)&sub2;(H&sub2;O)&sub2;]²&spplus;-Lösung gegeben, die wie nachstehend beschrieben hergestellt wurde. Das Ganze wurde im Dunkeln 20 Stunden gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde auf eine 2,6 · 34 cm Sephadex-G25-Säule aufgetragen und mit Wasser eluiert. Die Polymerfraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert, wobei ein weißer flauschiger Feststoff erhalten wurde (Ausbeute 0,206 g). Es wurde gefunden, dass der Feststoff (Verbindung XX) 9,9 Gew.-% Pt enthielt (ICP-Analyse). Das Reaktionsschema ist in Fig. 6 veranschaulicht.

A. Herstellung der cis-[Pt(NH&sub3;)&sub2;(H&sub2;O)&sub2;]²&spplus;-Lösung

Zu einer rührenden Suspension von cis-[PtCl&sub2;(NH&sub3;)&sub2;] (0,2 g in 4 ml doppelt destilliertem Wasser) wurde eine Lösung von Silbernitrat (0,221 g in 4 ml doppelt destilliertem Wasser) gegeben. Das Gemisch wurde im Dunkeln 4 Stunden gerührt und dann filtriert. Ein festgelegtes Volumen des Filtrats wurde wie vorstehend erläutert zu Platinierungszwecken eingesetzt.

Beispiel 7A

In-vitro-Freisetzung von Pt aus Polymer-Platin-Verbindungen

Die wie vorstehend in den Beispielen 4 und 5 beschrieben hergestellten Polymer-Platin- Komplexe wurden in Citrat-Phosphat-Puffer oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 5,5 bzw. pH 7,4 gelöst und gegen die entsprechende Lösung bei 37ºC dialysiert. Proben wurden aus der Dialyse regelmäßig über 48 Stunden entnommen, und freies Pt wurde unter Verwendung des o-PDA-Tests oder mittels AAS, wie vorstehend beschrieben, analysiert. Die Konzentration des aus den Polymer-Platin-Verbindungen freigesetzten Pt wurde als Prozentsatz des insgesamt Verfügbaren ausgedrückt, und die Ergebnisse sind in den Fig. 8A-8B gezeigt.

Beispiel 7B

In-vitro-Freisetzung von Pt aus HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Malonat-Pt (AAS-Verfahren)

Das wie im Beispiel 6 beschrieben hergestellte Konjugat wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PES), bei 37ºC gelöst. Proben der Lösung wurde nach 7 Minuten, 4 Stunden und 24 Stunden entnommen und jeweils auf eine Sephadex-G-25-Säule aufgetragen. Die Säule wurde unter Verwendung von PBS eluiert, und die eluierten Fraktionen wurden mittels AAS auf den Pt-Gehalt analysiert. Die Menge an aus dem Konjugat freigesetztem Pt wurde als Prozentsatz des Gesamten ausgedrückt, und die Ergebnisse sind in Fig. 9A gezeigt.

Beispiel 7C

In-vitro-Freisetzung von Pt aus HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Malonat-Pt (o-PDA-Verfahren)

Das wie vorstehend im Beispiel 6 beschrieben hergestellte Konjugat wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, gelöst und gegen die PBS-Lösung bei 37ºC dialysiert (nahtlose Visking-Celluloseschläuche mit einer Porengröße von 24 nm und einer Molekulargewicht-Ausschlussgröße von etwa 10.000). Proben wurden aus der Dialyse regelmäßig über 72 Stunden entnommen, und freies Pt wurde unter Verwendung des kolorimetrischen o-Phenylendiamin-Tests (o-PDA) analysiert; Proben mit unbekanntem Platingehalt wurden zu 1 ml o-PDA-Lösung in DMF (1,2 mg/ml) gegeben und 10 Minuten bei 100ºC inkubiert. Die in der Probe vorliegenden Menge Platin wurden durch Messen der Extinktion bei 704 nm unter Verwendung von Cisplatin als Bezug bestimmt. Die Konzentration des aus dem Konjugat freigesetzten Pt wurde als Prozentsatz des insgesamt Verfügbaren ausgedrückt, und das Ergebnis ist in Fig. 9B gezeigt.

Beispiel 8

In-vivo-Untersuchung der Anti-Tumorwirkung und der Toxizität

Alle Tierstudien wurden gemäß den Richtlinien des UKCCCR (United Kingdom Coordinating Committe on Cancer Research) durchgeführt.

I. L1210-i.p.-Tumormodell

10&sup6; lebensfähige Zellen wurden an DBA&sub2;-Mäuse (männlich, 9-12 Wochen, 20 = 30 g) am Tag 0 i.p. verabreicht. Die Tiere wurden anschließend entweder mit einer einzelnen oder mehrfachen i.p.-Dosen an den Tagen 1, 2 und 3 mit Cisplatin oder mit den Polymer-Platin-Verbindungen mit HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt oder HPMA-Gly-Gly-Ethylendiamin-Pt (wie im Beispiel 4 beschrieben hergestellt) behandelt. Die Tiere wurden täglich gewogen und zweimal täglich bezüglich Anzeichen des Tumorfortschreitens beobachtet und getötet, wenn ihr Körpergewicht unter 80% des Anfangsgewichts fiel oder wenn andere schwerwiegende toxikologische Probleme festgestellt wurden. Am Ende des Experiments wurden Veränderungen in der Gesamtanatomie notiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

A. B16-Melanom-i.p.-Modell

Männliche C57BL/6 J-Mäuse wurden intraperitoneal (i.p.) mit 10&sup6; lebensfähigen B16F10-Zellen beimpft. Die Zellen wurden am Tag 0 injiziert, und freies Cisplatin oder die Polymer-Platin- Verbindung HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt wurden als einzelne oder mehrfache Dosen an anschließenden Tagen injiziert. Die Tiere wurden wie vorstehend beschriebenüberwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

B. B16-Melanom-s.c.-Modell

Männliche C57BL/6 J-Mäuse wurden subkutan (s.c.) mit 10&sup5; lebensfähigen B 16F10-Zellen beimpft. Man ließ den Tumor sich etablieren, bis die Fläche etwa 50-70 mm² betrug, gemessen durch das Produkt zweier orthogonaler Durchmesser. Tiere mit s.c.-Tumoren wurden mittels Injektion von entweder freiem Cisplatin oder den Polymer-Platin-Verbindungen HPMA-Gly- Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt und HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-O-Pt bei 2, 5, 10, 15 mg Pt/kg behandelt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 10A für die HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Ethylendiamin-Pt-Verbindung und in Fig. 10B für die HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-Hydroxy-Pt-Verbindung gezeigt. Die Daten sind als das Verhältnis der mittleren Überlebensdauer der behandelten Tiere, geteilt durch das mittlere Überleben der unbehandelten Kontrollgruppe · 100 (TIC) ausgedrückt.

Beispiel 9

Biologische Verteilung von HPMA-Copolymer-Platin-Verbindungen

A. B16-Melanom-s.c.-Modell

Männliche C57BL/6J-Mäuse wurden s.c. mit 10&sup5; lebensfähigen B 16F10-Zellen beimpft, und man ließ den Tumor sich etablieren, bis die Fläche etwa 50-70 mm² betrug, gemessen durch das Produkt zweier orthogonaler Durchmesser. Den Tieren wurde freies Cisplatin (1 mg/kg) oder HPMA-Copolymer-Gly-Gly-Ethylendiamin-Pt (1 mg/kg) i.v. injiziert, und sie wurden zu Zeitpunkten bis zu 72 Stunden getötet. Die Tumoren wurden operativ entfernt und unter Verwendung von NaOH zu einer farblosen Lösung gelöst. Die Proben wurden unter Verwendung von AAS analysiert, sodass der Pt-Gehalt von Tumoren von Tieren, denen freies Cisplatin und Polymer-Platin-Komplex injiziert worden war, verglichen werden konnte. Die Ergebnisse sind in Fig. 12 gezeigt.

Beispiel 10

Ansammlung von HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Malonat-Pt in Mäusen mit B15F10-Tumoren

Männliche C57BL/6 J-Mäuse wurden s.c. mit 10&sup5; lebensfähigen B16F10-Zellen beimpft, und man ließ den Tumor sich etablieren, bis die Fläche etwa 50-70 mm² betrug, gemessen durch das Produkt zweier orthogonaler Durchmesser. Den Tieren wurde freies Cisplatin (1 mg/kg) oder HPMA-Copolymer-Gly-Phe-Leu-Gly-Malonat-Pt (1 mg/kg) i.v. injiziert, und die Tiere wurden zu Zeitpunkten bis zu 72 Stunden getötet. Die Tumoren wurden entfernt, gewogen und in Salpetersäure, gefolgt von Wasserstoffperoxid gelöst, sodass eine farblose Lösung erhalten wurde, und anschließend mit Wasser auf ein bekanntes Volumen aufgefüllt. Die Proben wurden unter Verwendung von (flammenloser) Atomabsorptionsspektroskopie analysiert, die unter Verwendung eines Perkin-Elmer-280-Instuments und Kalibration mit Cisplatin (Pt(NH&sub3;)&sub2;Cl&sub2;) in konzentrierter Salpetersäure, Wasserstoffperoxid (30%) und Wasser erfolgte. Die Ergebnisse sind in Fig. 12 gezeigt.
Obwohl die Erfindung im Hinblick auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben wurde, ist für den Fachmann ersichtlich, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend einen Polymer-Platin-Komplex, der dazu bestimmt ist, sich am Ort eines Tumors anzusammeln und der aus einem N-Alkylacrylamidpolymer zusammengesetzt ist, das Seitenketten zur Komplexierung einer Platinverbindung aufweist, die in Abständen entlang des Polymers verteilt sind, wobei die Seitenketten (i) aus einem Oligopeptid zusammengesetzt sind, das an einem Ende mit dem Polymer und am anderen Ende mit der Platinverbindung verbunden ist und (ii) mindestens eine Verknüpfung einschließen, die dazu bestimmt ist, unter ausgewählten physiologischen Bedingungen gespalten zu werden, um die Platinverbindung freizusetzen, die Antitumorwirkung aufweist oder in vivo so umgewandelt wird, daß sie diese aufweist.

2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das N-Alkylacrylamidpolymer ein Homopolymer mit einem Molekulargewicht ist, das zwischen etwa 1.000 bis 5.000.000 Dalton liegt.

3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das N-Alkylacrylamidpolymer ein Copolymer ist, das ein Molekulargewicht zwischen 1.000 und 5.000.000 Dalton aufweist, wobei das Copolymer zwei Grundeinheiten m und n in einem Verhältnis m : n von zwischen etwa 0,1 bis 99,9 enthält.

4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei die Grundeinheiten aus einer N- Alkylacrylamideinheit und einer Einheit zusammengesetzt sind, die die Oligopeptidseitenkette trägt, und wobei das Oligopeptid mit einer proximalen Endgruppe abschließt, die dazu fähig ist, die Platinverbindung zu binden.

5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, die ein Copolymer der Form

darstellt, wobei R&sub1; H oder CH&sub3; ist, R&sub2; ein Niederalkylrest oder ein Niederhydroxyalkylrest ist und R&sub3; die Oligopeptidseitenkette darstellt.

6. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei das Oligopeptid ausgewählt ist aus Gly- (W)p-Gly, wobei p eine Zahl von 0 bis 3 ist und W eine Aminosäure oder eine Kombination von beliebigen Aminosäuren darstellt.

7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei das Oligopeptid ausgewählt ist aus Gly-Phe- Leu-Gly und Gly-Gly.

8. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei die proximale Endgruppe ausgewählt ist aus einer Carboxyl-, einer Diamin- und einer Malonylgruppe.

9. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei R&sub1; CH&sub3; ist, R&sub2; 2-Hydroxypropyl ist und R&sub3; Gly-Phe-Leu-Gly-[X] ist, wobei [X] ausgewählt ist aus einer Carboxyl-, einer Diamin- und einer Malonylgruppe.

10. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei R&sub1; CH&sub3; ist, R&sub2; 2-Hydroxypropyl ist und R&sub3; Gly-Phe-Leu-Gly ist und die proximale Endgruppe eine Diamingruppe ist.

11. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung als Medikament.

12. Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, wobei der Polymer-Platin-Komplex in einem wäßrigen Medium gelöst ist, das sich zur parenteralen Verabreichung eignet.

13. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Antitumorbehandlung.

14. Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das Medikament in einer Form vorliegt, die sich zur parenteralen Verabreichung eignet.

15. Verwendung gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei das Medikament in einer Form vorliegt, die sich zur Ansteuerung eines festen Tumors eignet.

16. Verfahren zur Verbesserung der therapeutischen Breite einer Platinverbindung, umfassend das Komplexieren der Platinverbindung mit einem Copolymer, das aus einer ersten N- Alkylacrylamidgrundeinheit und einer zweiten Grundeinheit mit einer Oligopeptidseitenkette zusammengesetzt ist, die mit einer proximalen Endgruppe abschließt und die dazu fähig ist, die Platinverbindung zu komplexieren.

17. Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit einer Platinverbindung, umfassend das Komplexieren der Platinverbindung mit einem Copolymer, das aus einer ersten N- Alkylacrylamidgrundeinheit und einer zweiten Grundeinheit mit einer Oligopeptidseitenkette zusammengesetzt ist, die mit einer proximalen Endgruppe abschließt und die dazu fähig ist, die Platinverbindung zu komplexieren.

18. Verfahren zur Verbesserung der Stabilität einer Platinverbindung, umfassend das Komplexieren der Platinverbindung mit einem Copolymer, das aus einer ersten N- Alkylacrylamidgrundeinheit und einer zweiten Grundeinheit mit einer Oligopeptidseitenkette zusammengesetzt ist, die mit einer proximalen Endgruppe abschließt und die dazu fähig ist, die Platinverbindung zu komplexieren.