DE69737326T2

DE69737326T2 - Transkriptions zwischen faktor-2 tif2

Info

Publication number: DE69737326T2
Application number: DE69737326T
Authority: DE
Inventors: Pierre Chambon; Hinrich Gronemeyer; Johannes Voegel; Yves Lutz
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Louis Pasteur Strasbourg I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Louis Pasteur Strasbourg I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1996-07-12
Filing date: 1997-07-11
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2017-07-12
Also published as: EP1865060A1; ES2281105T3; ES2354379T3; EP1865060B1; US20020106727A1; US6268173B1; DK1865060T3; WO1998002455A2; ATE353364T1; DE69740057D1; DE69737326D1; EP0939810A2; EP0939810B1; ATE488589T1; WO1998002455A3; US6861508B2; DK0939810T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Transkriptionsmediator des nuclearen Rezeptors (NR). Spezifischer werden Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die den transkriptionalen intermediären Faktor-2 (TIF2) codieren. Rekombinante Verfahren zur Herstellung von TIF2-Polypeptiden werden auch bereitgestellt, ebenso werden Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten der Aktivierungsfunktion AF-2 des nuclearen Rezeptors sowie TIF2-Antikörper bereitgestellt. Auch werden Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten der Aktivität der TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne, sowie Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten der Aktivität der TIF2-AD2-Aktivierungsdomänen bereitgestellt.
Hintergrund der Erfindung
Aktivatoren, die den Transkriptionsstart durch RNA-Polymerase B (II) verbessern, sind mindestens aus zwei funktionellen Domänen zusammengesetzt: eine DNA-bindende Domäne und eine Aktivierungsdomäne (M. Ptashne, Nature 335: 683-689 (1988); P.J. Mitchell et al., Science 245: 371-378 (1989)). Diese zwei Domänen sind allgemein trennbare funktionelle Einheiten und jede kann sogar mit der komplementären Region eines nicht verwandten Aktivators ausgetauscht werden und dabei funktionelle chimäre Aktivatoren erzeugen (S. Green et al., Nature 325: 75-78 (1987)).
Eine Anzahl von Struktur-Funktions-Analysen von eukaryontischen transkriptionalen wurde unter anfänglicher Fokussierung auf die Hefeproteine GAL4 und GCN4 und auf Mitglieder der nuclearer Rezeptor-Familie durchgeführt. Die GAL4- und GCN4-Proteine aktivieren die Transkription durch Binden an eine spezifische Stromaufwärts-Aktivierungssequenz, die viele der Merkmale von höheren eukaryontischen Verstärkerelementen hat (K. Struhl, Cell 49:295-297 (1987)). Der Herpes-simplex-Aktivator VP16 repräsentiert einen anderen Aktivatortyp, der die Transkription eher durch Binden an den DNA-gebundenen Oktamer-Transkriptionsfaktor als durch Binden an die DNA direkt aktiviert (T. Gerster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6347-6351 (1988)).
Die Familie der nuclearen Rezeptoren, welche die Rezeptoren für Steroidhormone, Thyroidhormone, Vitamin D und dem Vitamin A-Derivat Retinolsäure beinhaltet, sind auch transkriptionale Verstärkerfaktoren, die DNA in der Anwesenheit ihres verwandten Liganden direkt binden durch Erkennung der spezifischen Verstärkerelemente, d.h. Hormon- oder Liganden-responsive Elemente (R.M. Evans, Cell 240:889-895 (1988)). Diese verwandten Liganden neigen dazu, kleine, hydrophobe Moleküle zu sein, die Steroidhormone wie Östrogen und Progesteron, Thyroidhormon, Vitamin D und verschiedene Retinoide beinhalten (S. Halachmi et al., Science 264:1455-1458 (1994); Gronemeyer, H. und Laudet, V., Protein Profile 2:1173-1308 (1995)).
Trotz ihrer kleinen Größe und offensichtlich einfachen Struktur sind jedoch die mit NRs assoziierten verwandten Liganden bekannt, einen weiten Bereich von physiologischen Reaktionen auszulösen. Nebennierenhormone zum Beispiel, wie Cortisol und Aldosteron, beeinflussen weitgehend die Körperhomeostase unter Kontrolle des Glycogen- und Mineralstoffwechsels, haben ausgedehnte Wirkungen auf das Immun- und das Nervensystem und beeinflussen das Wachstum und die Differenzierung von gezüchteten Zellen. Die Geschlechtshormone (Progesteron, Östrogen und Testosteron) treiben die Entwicklung und die Ermittlung des embryonalen reproduktiven Systems an, machen das Gehirn bei der Geburt männlich/weiblich, kontrollieren Fortpflanzung und zugehöriges Verhalten bei Erwachsenen und sind verantwortlich für die Entwicklung von sekundären Geschlechtsmerkmalen. Vitamin D ist notwendig für angemessene Knochenentwicklung und spielt eine entscheidende Rolle beim Calciumstoffwechsel und bei der Knochendifferenzierung. Bezeichnenderweise wurde eine abweichende Produktion dieser Hormone mit einem breiten Spektrum klinischer Erkrankung assoziiert, einschließlich Krebs und ähnliche pathologische Bedingungen.
Alle NRs stellen eine. modulare Struktur dar, mit fünf bis sechs verschiedenen Regionen, die als A-F bezeichnet werden. Die N-terminale A/B-Region enthält die Aktivierungsfunktion AF-1, die die Transkription wesentlich aktivieren kann. Region C umfasst die DNA-bindende Domäne (DBD), die verwandte cis-acting-Elemente erkennt. Region E enthält die Liganden-bindende Domäne (LBD), eine Dimerisierungsoberfläche und die Liganden-abhängige transkriptionale Aktivierungsfunktion AF-2 (besprochen in Mangelsdorft, D.J. et al., Cell 83:835-839 (1995a); Mangelsdorft & Evans, Cell 83:841-850 (1995b); Beato, M. et al., Cell 83:851-857 (1995); Gronemeyer & Laudet, „Transcriptional Factors 3: Nuclear Receptors", in Protein Profile, Bd. 2, Academic Press (1995); Kastner, P. et al., EMBO J. 11:629-642 (1992); Chambon, P., FASEB J 10:940-954 (1996)).
Mehrere Klassen von Domänen bei Aktivatoren sind in der Lage, die Transkriptionsaktivierung zu vermitteln. Die Hefeaktivatoren GAL4 und GCN4 und der Herpes simplex VP16 enthalten alle Aktivierungsdomänen, die aus Strecken saurer Aminosäuren zusammengesetzt sind, die durch Bildung amphipathischer α-Helices wirken können (I.A. Hope et al., Cell 46:885-894 (1986); J. Ma et al., Cell 48:847-853 (1987); E. Giniger et al., Nature 330:670-672 (1987); S.J. Triezenberg et al., Genes Dev. 2:718-729 (1988)). Die Aktivierungsfunktionen von menschlichen Sp1- und CTF/NF1-Proteinen enthalten jeweils Glutamin- und Prolin-reiche Bereiche (A.J. Courey et al., Cell 55:887-898 (1988); N. Mermod et al., Cell 58:741-753 (1989)). Studien mit Steroidhormonrezeptoren zeigten, dass sowohl die N-terminale A/B-Domäne als auch die C-terminale Hormon-bindende Domäne (HBD) Transkriptionsaktivierungsfunktionen (AFs) enthalten (M.T. Bocquel et al., Nucl. Acids. Res., 17:2581-2595 (1989); L. Tora et al., Cell 59:477-487 (1989)). Die AFs des menschlichen Östrogen-Rezeptors (hER) enthalten keine Strecken von sauren Aminosäuren (S. Halachmi et al., Science 264:1455-1458 (1994)). Umgekehrt enthält jedoch der menschliche Glucocorticoid-Rezeptor (hGR) zwei Aktivierungsfunktionen, τ-1 (in der A/B-Domäne gelegen) und τ-2 (in der N-terminalen Region der HBD gelegen), von denen beide sauer sind (S.M. Hollenberg et al., Cell 55:899-906 (1988)).
Aus den Ergebnissen der Studien der Transkriptionsinterferenz/"Squelching" zwischen nuclearen Rezeptoren und der homo- und heterosynergistische Stimulation des Transkriptionsstarts aus minimalen Promotoren durch die in hER (AF-1 und AF-2) anwesenden Aktivierungsfunktionen und dem sauren Aktivator VP16 wurde vorgeschlagen, dass AFs die Transkription durch Interaktion mit verschiedenen Komponenten des basischen Startkomplexes aktivieren können (Bocquel et al., Nucl. Acids. Res. 17:2581-2595 (1989); Meyer et al., Cell 57:433-442 (1989); L. Tora et al., Cell 59:477-487 (1989). Studien der Transkriptionsinterferenz/"Squelching"-Eigenschaften von AADs, hER-AF-1 und hER-AF-2 zeigten jedoch, dass sowohl hER-AF-1 als auch -AF-2 saure Aktivatoren wie VP16 unterdrücken können, aber dass die Umkehrung nicht wahr war, d.h. AADs unterdrücken nicht hER-AF-1 oder – AF-2. Außerdem unterdrücken sich hER-AF-1 und -AF-2, die deutlich durch ihre synergistischen Eigenschaften unterschieden werden, dennoch gegenseitig (D. Tasset et al., Cell 62:1177-1187 (1990)).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Abfolge von transkriptionalen intermediären Faktoren (TIFs) existiert, eingeschoben zwischen Verstärkerfaktoren und den basischen Transkriptionsfaktoren. Zum Beispiel wurde vorgeschlagen, dass AF-1 und AF-2 mit der Folge der TIFs an funktionell equivalenten Punkten Kontakt aufnehmen, während geglaubt wird, dass AADs an einem früheren Punkt in der Serie interagieren (D. Tasset et al., Cell 62:1177-1187 (1990)).
Mehrere vermeintliche Coaktivator-TIFs für NR-AF-2s wurden charakterisiert (s. Chambon, P., FASEB J 10:940-954 (1996); Glass, C.K. et al., Current Opin. Cell Biol. 9:222-232 (1997); Horwitz, K.B. et al., Mol. Endocrinol.10:1167-1177 (1996) für neue Reviews). Insbesondere zeigte LeDouarin, B. et al., EMBO J. 15:6701-6715 (1996), dass ein 10-Aminosäuren-Fragment von TIF1α notwendig und ausreichend ist, um die Interaktion mit RXR auf eine Liganden- und AF-2-Integrität-abhängige Weise zu vermitteln. Besonders identifizierten sie innerhalb dieses TIF1α-Fragments ein LxxLLL (SEQ ID NO:13)-Motiv, bezeichnet als NR-Box, dessen Integrität für die Interaktion mit nuclearen Rezeptoren benötigt wird, und betonten, dass dieses Motiv in mehreren anderen vermeintlichen Coaktivatoren konserviert ist (LeDouarin, B. et al., EMBO J. 15:6701-6715 (1996)) Während TIF1α und mehrere andere vermeintliche Coaktivatoren nicht oder nur sehr schlecht die Transaktivierung durch NRs in vorübergehend transfizierten Säugetierzellen stimulieren, wurde eindeutig gezeigt, dass die TIF2/SRC-1-Familie (Oñate, S.A. et al, Science 270:1354-1357 (1995); Voegel, J.J. et al., EMBO J. 15:3667-3675 (1996), die CBP/p300-Familie (Kamel, Y. et al., Cell 85:403-414 (1996); Chakravarti, D. et al., Nature 5:99-103 (1996); Hanstein, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11540-11545 (1996), Smith; C.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8884-8888 (1996); für neue Reviews s. Eckner, R., Biol. Chem. 337:685-688 (1996); Janknecht & Hunter, Current Biol. 6:951-954 (1996b); Shikama, N. et al., Trends in Cell Biol. 7:230-236 (1997)) und der Androgenrezeptor-Coaktivator ARA70 (Yeh & Chang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5517-5521 (1996)) die AF-2-Aktivität erhöhen.
Außer dem Binden an NRs kann CBP/p300 auch direkt mit SRC-1 interagieren (Kamel, Y. et al., Cell 85:403-414 (1996); Yao, T.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10626-10631 (1996)), und es wurde gezeigt, dass beide Faktoren Histon-Acetyltransferase-Aktivität ausüben (Bannister & Kouzarides, Nature 384:641-643 (1996); Ogryzko, V.V. et al., Cell 87:953-959 (1996)). Außerdem kann CBP/p300 p/CAF rekrutieren, das selbst eine nucleare Histon-Acetyltransferase ist (Yang, X.J. et al., Nature 382:319-324 (1996)). Abgesehen von der Interaktion mit Coaktivatoren auf eine Liganden-abhängige Weise, wurde jedoch auch gezeigt, dass NRs oft auf eine Liganden-unabhängige Art und Weise direkt oder indirekt mit Komponenten der Transkriptionsmaschinerie interagieren wie mit TFIIB, TBP, TAFs oder TFIIH (Baniahmad et al., (1993)); Jacq, X. et al., Cell 79:107-117 (1994); Schulman, IG. et al., Mol. Cell. Biol. 16:3807-3813 (1996); May, M. et al., EMBO J. 15:3093-3104 (1996); Mengus, G. et al., Genes & Dev. 11:1381-1395 (1997)).
Hong, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4948-4952 (1996) beschrieb ursprünglich eine partielle cDNA des Maushomologs von TIF2, GRIP1 genannt, und berichtete kürzlich über die Isolierung Volllängen-GRIP1-cDNA (Hong, H. et al., Mol. Cell. Biol. 17:2735-2744 (1997)). Unter Verwendung der Hefe Saccharomyces cerevisiae als ein Modellsystem zeigten sie, dass Transkriptionsaktivierung durch TR, RAR und RXR auch durch GRIP1-Coexpression stimuliert werden konnte, was darauf hinweist, dass TIF2/GRIP1 ein allgemeiner Coaktivator für NRs sein könnte (Hong, H. et al., Mol Cell. Biol. 17:2735-2744 (1997)).
Das Gesamtbild, das sich aus mehreren neuen Studien über die Mechanismen, durch die nucleare Rezeptoren die Transkription des Zielgens modulieren, ergibt, bezieht drei aufeinanderfolgende Schritte ein, (i) die Liganden-induzierte Transkonformation der NR-LBD, die zu (ii) der Dissoziation von Corepressoren und der Bildung von TIFs/Coaktivator-Komplexen führt, die selbst (iii) durch Interaktion mit zusätzlichen stromabwärts-Faktoren (z.B. CBP, p300) den Acetylierungszustand von Core-Histonen und demnach die Chromatin-Kondensation/Dekondensation modulieren. Die Histonacetylierung für sich allein ist jedoch unzureichend zur Transkriptionsaktivierung (Wong et al., (1997)) und ein simultanes oder nachfolgendes viertes Ereignis umfasst die direkte und/oder die indirekte Rekrutierung von Elementen der Transkriptionsmaschinerie (z.B. TFIB, TBP, TAFs, TFIIH; Jacq, X. et al., Cell 79:107-117 (1994); Schulman, IG. et al., Mol. Cell. Biol. 16:3807-3813 (1996); May, M. et al., EMBO J. 15:3093-3104 (1996); Mengus, G. et al, Genes & Dev. 11:1381-1395 (1997)). Beachten Sie, dass solche Interaktionen nicht Liganden-abhängig zu sein brauchen, wenn die primäre Funktion der ligandierten LBD (AF-2) ist, die DNA-Zugänglichkeit durch Chromatin-Umbau zu regulieren. Allerdings geschehen mehrere der berichteten Interaktionen zwischen NRs und allgemeinen Transkriptionsfaktoren auf eine Liganden-unabhängige Weise. Demgemäß gibt es einen Bedarf auf dem Fachgebiet zur Isolierung und Charakterisierung von transkriptionalen intermediären Faktoren.
Zusammenfassung der Erfindung
Durch Durchmusterung von 340,000 Klonen einer menschlichen PlazentacDNA-Expressions-Bank mit einer Estradiol-gebundenen Östrogenrezeptorsonde identifizierten die anwesenden Erfinder einen cDNA-Klon, der das Gen enthält, das den transkriptionalen intermediären Faktor 2 (TIF2) codiert. Durch die Erfindung wurde gezeigt, dass TIF2 alle die für einen TIF/Mediator von AF-2 erwarteten Eigenschaften aufweist: er interagiert direkt mit den LBDs von mehreren NRs auf eine Agonisten- und AF-2-Integrität-abhängige Weise in vitro und in vivo, beherbergt eine unabhängige AF, erleichtert das NR-Autosquelching und erhöht die Aktivität von NR-AF-2s, wenn er in Säugetierzellen überexprimiert wird.
Demnach stellt in einem Aspekt die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle bereit, die ein Polynucleotid umfassen, das TIF2 codiert, dessen Aminosäuresequenz in 1 gezeigt ist (SEQ ID NO:2), oder ein Fragment davon mit einer Aktivität, wie hierin nachstehend beschrieben. In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Nucleinsäuremoleküle bereit, die TIF2 mit einer Aminosäuresequenz codieren, wie sie durch die cDNA codiert wird, die als ATCC-Hinterlegungsnummer 97612 hinterlegt ist.
Auch wird ein Nucleinsäuremolekül beschrieben, das unter stringenten Bedingungen mit den voranstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülen hybridisiert. Außerdem werden Varianten der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung beschrieben, die Fragmente, Analoga oder Derivate des TIF2-Proteins codieren, z.B. Polypeptide mit mindestens einer biologischen Aktivität, die im Wesentlichen zu mindestens an biologischer Aktivität des TIF2-Proteins gleich ist.
Die vorliegende Erfindung ist ferner auf Nucleinsäuremoleküle ausgerichtet, die ein cytoplasmatisches TIF2-Polypetid codieren. Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäuremolekülen, die ein cytoplasmatisches TIF2-Polypeptid codieren, beinhalten Mutieren oder Deletieren der NLSs-codierenden N-terminalen Region der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1). Vorzugsweise werden Nucleinsäuremoleküle, die ein cytoplasmatisches TIF2-Polypeptid codieren, Fragmente mit einer Deletion in allen oder einem Teil der N-terminalen NLSs codierenden Region sein. Durch die Erfindung entfalten die hierin beschriebenen cytoplasmatischen TIF2-Polypeptide mindestens eine biologische Aktivität, die im Wesentlichen zu mindestens einer biologischen Aktivität von TIF2 gleich ist, wie hierin beschrieben.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung beinhalten Nucleinsäuremoleküle, die ein Polynucleotid mit einer mindestens zu 90% identischen und mehr bevorzugt mit einer mindestens zu 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identischen Nucleotidsequenz zu den voranstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülen umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Vektoren, welche die voranstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle enthalten, auf Wirtszellen die mit den Vektoren transformiert sind und auf die Herstellung von TIF2-Polypeptiden durch rekombinante Verfahren.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner TIF2-Polypeptide mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) bereit. In einem weiteren Aspekt werden TIF-Polypeptide bereitgestellt mit einer Aminosäuresequenz, wie diejenige die durch die cDNA codiert wird, die als ATCC-Hinterlegungsnummer 97612 hinterlegt ist.
Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten der Funktion des nuclearen Rezeptors AF-2, zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten der TIF2-AD1-Aktivität und zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten der TIF2-AD2-Aktivität werden auch bereitgestellt. TIF2-Antikörper werden auch bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1(a-b). Die Nucleotid-(SEQ ID NO:1) und die Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO:2) des TIF2-Proteins (transcriptional intermediary factor). Dieses Protein hat ein abgeleitetes Molekulargewicht von etwa 160 kDa. Die Aminosäuresequenz des funktionellen Coaktivator-TIF2.1-Proteinfragments ist von dem Aminosäurerest 624 bis zu Rest 1287 gezeigt.
2(a-c). TIF2 ist der 160-kDa-nuclearer-Rezeptor-interagierender Faktor.

(a) Die GST-Pulldown-Experimente identifizieren ein 160-kDa-Protein, das mit dem ligandierten Östrogenrezeptor (ER)- und Retinolsäure-Rezeptor (RAR)-α-Liganden-bindenden Domänen (LBDs) (ER(DEF) beziehungsweise RARα(DEF)) interagiert. Beachten Sie, dass weniger Material in Spur 5 als in Spuren 1-4 ausgeführt wurde.
(b) Die Immunodepletion gefolgt vom Far-Western-Nachweis zeigt die Identität von TIF2 mit dem biochemisch identifizierten 160-kDa-Protein. Offenes Dreieck, TIF2; Pfeilspitze, TIF1; Kreis, Antikörper-Kreuzreaktion mit GST-ER(DEF). Die pα-TIF2-immunonachgewiesene Spezies, die kleiner ist als TIF2 (Spuren 2 und 6) ist höchstwahrscheinlich ein Abbauprodukt von TIF2, da es durch Immunodepletion mit mα-TIF2 entfernt wurde (Spuren 4 und 8).
(c) Das Northern-Blotting offenbart ein ≈9-kb-TIF2-Transkript in verschiedenen menschlichen Geweben.

Verfahren.

(a) Gesamtzellextrakte von in vivo-³⁵S-Met-markierten MCF7 (Cavailles, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10009-100013 (1994)), die vorher zweimal mit GST-geladener Glutathion-Sepharose aufgearbeitet wurden, wurden (Le Douarin, B. et al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995)) mit GST, GST-hER (DEF) oder GST-hRARα(DEF), in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10^–6M E2 oder T-RA inkubiert. Gebundene Proteine wurden mit SDS-Probenpuffer zurückgewonnen und durch Fluorographie (Amplify, Amersham) der SDS-Polyacrylamidgelen erkennbar gemacht.
(b) Gesamtzellextrakte von HeLa (2 ml in 500 mM NaCl, 250 mM TrisHCl pH 7.5, 20% Glycerin, 5 mM DTT) wurden vorher mit Protein-G-Sepharose (400 μl) aufgearbeitet und mit Protein-G-Sepharose (3 × 400 μl), beladen mit mα-TIF2 (erzeugt gegen ein synthetisches Peptid, das die an Ovalbumin gekoppelten Aminosäuren E624-Q653 umfasst) oder nicht-spezifischem IgG-Serum der Maus, behandelt. Nach weiterem Aufarbeiten mit Protein-G-Sepharose (400 μl), wurde der Überstand inkubiert (Le Douarin, B. et al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995)) mit GST-hER(DEF) in Anwesenheit oder Abwesenheit von E2(10^–6M). Zurückgehaltene Proteine wurden mit SDS-Probenpuffer zurückgewonnen, durch SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulose-Membranen elektrogeblottet. Das Far-Western-Blotting war, wie beschrieben (Cavailles, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10009-100013 (1994)). Zum Immunoblotting wurde polyklonales Kaninchen-Antiserum (pα-TIF2), erzeugt gegen gereinigten (Chen, Z-P. et al., J. Biol. Chem. 269:25770-25776 (1994)) rekombinanten E.coli-exprimierten, His-markierten TIF2.1 verwendet. pα-TIF2 und polyklonales Kaninchen-pα-TIF1 wurden 1:2000 für das ECL-bezogene Western-Blotting (Amersham) verdünnt. Alle in dieser Studie verwendeten Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
(c) Der menschliche Northern-Blot (Clonetech, Nr. 7760-1; Abfüllcharge 5×332) wurde mit ³²P-markiertem TIF2.1 erkennbar gemacht. Um das angemessene Beladen zu bestätigen, wurde die Membran mit ³²P-markierter β-Actin-cDNA (Clonetech) rehybridisiert.

3(a-b). Aminosäuresequenz von TIF2: Die Homologie mit SRC-1 zeigt die Existenz einer neuen Familie von NR-Mediatoren an.

(a) Die Angleichung und die Aminosäuresequenzen von TIF-2 (SEQ ID NO:2) und von dem Steroidrezeptor-Coaktivator SRC-1 (SEQ ID NO:3) (Onate, S.A. et al., Science 270:1354-1357 (1995)). Zwei geladene Cluster, die reich an sauren und basischen Aminosäureresten sind, drei Serin/Threonin (S/T)-reiche Regionen und eine Glutamin-reiche Region sind hervorgehoben. Der N-terminale geladene Cluster enthält die vermeintlichen zweiteiligen nuclearen Lokalisierungssignale (NLSs) (überstrichen). Die Regionen, die TIF2.1 (Aminosäuren 624 bis 1287; funktionelles Coaktivator-Fragment) und dnSRC-1 (Aminosäuren 865 bis 1061; dominantnegatives Fragment) codieren, sind angezeigt. Ein Stern identifiziert das TIF2-Stopp-Codon. Beachten Sie, dass TIF2.1 und dnSRC-1 nicht überlappen, was anzeigt, dass dnSRC-1 möglicherweise eine NR-interagierende Region enthalten kann, die von der von TIF2.1 verschieden ist.
(b) Schematischer Vergleich von TIF2 und SRC-1. Prozent-Identitäten (Ähnlichkeiten in Klammern) von homologen Regionen sind angezeigt. Der N-terminale geladene Cluster, der das vermeintliche NLS beherbergt, und die C-terminale S/T-reiche Region von TIF2 sind nicht oder nur schwach in SRC-1 konserviert.

Verfahren.
340,000 Klone der λExlox Expressions-cDNA-Bank der menschlichen Plazenta wurde mit einer ³²P-markierten GST-hER(DEF)-Sonde in Anwesenheit von 10^–6M E2 unter Verwendung der Far-Western-Methode (Cavailles, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10009-100013 (1994)) durchmustert. Das 1992-bp-Insert, das dem Ausgangsklon (TIF2.1) entspricht, wurde verwendet, um dieselbe Genbank wieder zu durchmustern. Fünf stark überlappende cDNA-Inserts bedeckten eine Region von 6 kb, die ein 1,464-Aminosäuren-ORF enthält. Alle Inserts wurden an beiden Strängen sequenziert. Die vorübergehende Expression der assemblierten cDNA-Inserts, die das vorhergesagte ORF umfassen, ergab ein 160-kDa-Protein.
4(a-n). In vivo- und in vitro-Interaktionen von TIF2 mit nuclearen Rezeptoren.

(a) Das überexprimierte TIF2-Protein ist hauptsächlich in diskreten nuclearen Körpern lokalisiert und von den Nucleoli ausgeschlossen. Eine überlagernde Abbildung der Hoechst-DNA-Färbung und der TIF2-Immunofärbung wird gezeigt.
(b-i) Cytoplasmatisches TIF2.1 interagiert auf eine Agonisten-abhängige Weise mit nuclearen Rezeptoren in Säugetierzellen. Die helle Färbung zeigt die TIF2.1-NO-Kolokalisierung an.
(k-n) TIF2.1 interagiert direkt in vitro auf eine Agonisten-abhängige Weise mit nuclearen Rezeptoren, und Punktmutationen innerhalb der AF-2-Aktivierungsdomäne (AD)-Core heben diese Interaktion auf. WT, Wildtyp. Ligandenkonzentrationen für n: 9C-RA, T-RA und T3, 10^–6 M; E2, 5 × 10^–8M; OHT, 5 × 10^–6M. Das kleinere immunodetektiert Polypeptid ist ein Abbauprodukt von TIF2.1. Beachten Sie, dass das anti-TIF2-Serum schwach mit GST-hER(DEF) kreuzreagiert.

Verfahren.

(a-i) Cos-1-Zellen wurden vorübergehend mit TIF2.1 (10 μg) transfiziert entweder (a) alleine oder (b-i) zusätzlich mit den angezeigten NR-Expressionsvektoren (10 μg, ausgenommen RARa, 1 μg) in Abwesenheit oder Anwesenheit des verwandten Liganden (10^–6M, ausgenommen R5020, 10^–8 M). In d-f wurde HE0 (Webster, N.J. et al., Cell 54:199-207 (1988)) verwendet. Die Immunocytofluoreszenz-Assays waren, wie beschrieben (Kastner, P. et al., EMBO J. 11: 629-642 (1992)). Bilder wurden durch konfokale Lasermikroskopie aufgenommen.
(k-n) GST-Interaktionsassays mit E.coli-exprimiertem rekombinanten TIF2.1 (2b) wurden durchgeführt, wie beschrieben (Le Douarin, B. et al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995)). Gebundene Proteine wurden durch Western-Blotting mit pα-TIF2-Antiserum (Verdünnung 1:30,000) offenbart, die gleich große Ladung von Aftinitätsmatrizen wurde durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung verifiziert. ,Input'-Spuren enthalten ein Drittel des TIF2.1-Inputs.

5(a-e). TIF2 enthält eine unabhängige AF, „Antisquelches" und stimuliert die NO-AF2-Aktivität auf eine Agonisten-, Promotor- und Zell-abhängige Weise.

(a) Ansteigende Mengen des GAL-TIF2.1-Fusionsproteins (Spuren 2-4) aktiviert die Transkription eines verwandten Reporters in transfizierten Zellen. Das Vielfache der Induktion ist unter den CAT-Assays gegeben.
(b) TIF2.1 kehrt teilweise die transkriptionale Autointerferenz von ER um. Die normalisierte CAT-Expression (Mittelwert ± s.e. von 4 unabhängigen Experimenten) ist gezeigt. Offene Kreise, +E2, +TIF2; Quadrate, +E2,-TIF2; Kreuze, +OHT, +TIF2.
(c) TIF2 erhöht die Transaktivierung, die durch einige NR-AF-2s vermittelt wird, aber nicht die, die durch andere Transkriptionsfaktoren vermittelt wird. Die mittleren TIF2-Stimulationen von 3 unabhängigen Experimenten sind gegeben (Variation <_ 13%). Liganden: Spuren 3-4, E2; Spuren 7-8, DHT (Dihydrotestosteron); Spuren 11-12, R5020; Spuren 15-16, T-RA.
(d) TIF2 erhöht die PR-vermittelte Transkriptionsaktivierung von sowohl einem minimalen (GRE-TATA)_- als auch einem komplexen (MMTV)-Promotor; diese Stimulation ist in Cos-1-Zellen signifikant größer als in HeLa-Zellen.
(e) TIF2 erhöht außerordentlich die Agonisten-induzierte Aktivierung durch ER in Cos-1- und schwächer in HeLa-Zellen. Beachten Sie, dass die schwache, anscheinend Liganden-unabhängige TIF2-Induktion von ER (vgl. Spuren 1 mit 2 und 7 mit 8) an rückständigem Estradiol an dem Kulturmedium liegt. In d und e sind TIF2-Induktionen von ≥ 3 Experimenten gezeigt (Variation ≤ 10%).

Verfahren.
Mit der Ausnahme von GAL-TIF2.1, TIF2.1 und TIF2 wurde die Konstruktion von Reporterplasmiden und Expressionsvektoren beschrieben (Meyer, M-E. et al., Cell 57:433-442 (1989); Bocquel, M-T. et al., Nucl. Acids Res. 17:2581-2595 (1989); Tasset, D. et al., Cell 62: 1177-1187 (1990); Gronemeyer, H. und Laudet, V., Protein Profile 2: 1173-1308 (1995); Webster, N.J. et al., Cell 54: 199-207 (1988); Strähle, U. et al., EMBO J. 7:3389-3395 (1988); Seipel, K. et al., EMBO J. 11:4961-4968 (1992); Nagpal, S. et al., EMBO J. 12:2349-2360 (1993); Chen, J-Y. et al., EMBO J. 14:1187-1197 (1995)). CAT-Assays wurden durchgeführt, wie beschrieben (Bocquel, M-T. et al., Nucl. Acids Res. 17:2581-2595 (1989)).

(a) HeLa-Zellen wurden jeweils mit 1 μg (17m)₅-βG-CAT und 10 μg GAL(1-147) oder 1,3 und 10 μg GAL(1-147)-TIF2.1 cotransfiziert.
(b) HeLa-Zellen wurden mit 5 μg Vit-tk-CAT und der angezeigten Menge von HEG0 mit oder ohne 5 μg TIF2.1 in der Anwesenheit von 10^–6 M E2 oder OHT cotransfiziert. Die CAT-Aktivität wird relativ zu derjenigen gegeben, die durch 100 ng HEG0 in Anwesenheit von E2 induziert wird.
(c) HeLa-Zellen wurden mit 1 μg 17m-tk-CAT und 1 μg der angezeigten GAL-Fusionsvektoren mit oder ohne die Zugabe von 3 μg TIF2-Expressionsvektor in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10^–6M Ligand cotransfiziert.
(d) HeLa- (Spuren 1-12) oder Cos-1- (Spuren 13-18) Zellen wurden mit 5 μg GRE-TATA-CAT (Spuren 1-6) oder 1 μg MMTV-CAT (Spuren 7-18) zusammen mit 1 μg hPR mit oder ohne 3 μg TIF 2 in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10^–6 M des angezeigten Liganden transfiziert.
(e) Cos-1-Zellen wurden mit 1 μg Vit-tk-CAT und 1 μg HEG0 mit oder ohne 3 μg TIF2 in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10^–6 M der angezeigten Liganden cotransfiziert.

6(a-b). Schematische Darstellung der Reportergene (A) und Rezeptorexpressionsvektoren (B) (s. den Abschnitt Materials and Methods von Nagpal et al., EMBO J. 12(6):2349-2360 (1993) für eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion). Die Sequenzen von mCRBPII (SEQ ID NO:11) und mCRBPII(17m-ERE)/CAT (SEQ ID NO:11) sind angezeigt. Minus- und Plus-Zahlen sind hinsichtlich der RNA-Startstelle (+1). In (B) werden die verschiedenen Regionen (A-F) der Wildtyp-RARs und -RXRs, sowie ihre Kürzungsmutanten, Substitutionsmutanten und chimäre Rezeptor-Konstrukte schematisch dargestellt (nicht maßstabsgetreu) (s. Zelent et al., Nature 339:714-717 (1989); Leid et al., Trends Biochem. Sci. 17:427-433 (1992); Leid et al., Cell68:377-395 (1992); Nagpal et al., Cell 70:1007-1019 (1992); und Allenby et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:30-34 (1993)). Die Zahlen zeigen die Aminosäurepositionen in dem Wildtyp-Rezeptor an. Die Positionen der Aminosäuresubstitutionen sind mit einem Pfeil angezeigt.
7(a-e). Kartierung von TIF2-Domänen.

(a) Schematische Darstellung von in TIF2 identifizierten funktionellen Domänen. Die verschiedenen TIF2-Konstrukte sind angegeben; exprimierte Reste sind in Klammern angegeben. Die fett gedruckten Linien zeigen exprimierte Sequenzen an. Die Konstrukte, die für die NR-Interaktion, Transaktivierung oder CBP-Binden positiv oder negativ ausgewertet werden, werden rechts jeweils durch „+" und „-"-Zeichen identifiziert; nd, nicht bestimmt.
(b) Kartierung der nuclearen Rezeptor-Interaktionsdomäne von TIF2. Glutathion-S-transferase (GST)-Pulldown-Experimente wurden mit ³⁵S-markierten in-vitro-translatierten TIF2-Polypeptiden und bakteriell hergestellter GST, GST-hERa(DEF) und GST-hRARa(DEF) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 10^–6 M des verwandten Liganden (E2, Estradiol für ER; RA all-trans-Retinolsäure für RAR) durchgeführt.
(c) Die Analyse der Transkriptionsaktivität der GAL-TIF2-Fusionsproteine. Cos-1- und HeLa-Zellen wurden mit 3 μg von Plasmiden, die verschiedene Regionen von TIF2 exprimieren, der mit der DNA-bindenden Domäne des Hefe-Transkriptionsfaktors GAL4 fusioniert ist, zusammen mit 1 μg des (17m)₅-G-CAT_- Reporterplasmids transfiziert. CAT-Assays wurden durchgeführt, wie beschrieben (Bocquel, M.T. et al., Nucl. Acids. Res. 17:2581-2595 (1989)). Quantitative Daten über die CAT-Reporterexpression wurden entweder durch die Phosphoimager-Analyse (BAS2000, Fuji) von ¹⁴C-markierten CAT-Reaktionsprodukten, die durch Dünnschichtchromatographie getrennt wurden, oder durch Verwendung des CAT-ELISA-Kits (Boehringer Mannheim) erhalten. Bei allen Fällen wurden die CAT-Aktivitäten auf die β-Galactosidase-Konzentrationen normalisiert, die aus der Cotransfektion von 1 μg von pCMVβGal (Geschenk von T. Lerouge) als interne Kontrolle resultierten. Das Vielfache der Induktion über dem GAL4-DBD-Wert ist angezeigt. Der Mittelwert und die Standardabweichung von mindestens drei Experimenten werden gezeigt. Ein representativer Western-Blot, der die Expressionsniveaus der GAL4-TIF2-Fusionsproteine, die aus 10 μg der entsprechenden Expressionsvektoren exprimiert wurden, veranschaulicht, ist links gezeigt. Der Blot wurde mit den monoklonalen Antikörpern 2GV3 und 3GV2 der Maus offenbart, die spezifisch für GAL4-DBD und 2GV4B7, spezifisch für die VP16-Aktivierungsdomäne, sind.
(d) Kartierung der CBP-Interaktionsdomäne von TIF2. GST-Pulldown-Experimente wurden mit ³⁵S-markierten in-vitro-translatierten TIF2-Polypeptiden und bakteriell hergestellten GST und GST-CBP (das die CBP-Reste 1872 bis 2165 exprimiert) durchgeführt.
(e) Zwei-Hybrid-Analyse der CBP-TIF2-Interaktion in Säugetierzellen in vivo. HeLa-Zellen wurden mit 0.2 μg der GAL4- oder GAL4-CBP- (das die CBP-Reste 1872 bis 2165 exprimiert) Expressionsvektoren zusammen mit 0.2 μg der VP16- oder VP16-TIF2-Expressionsvektoren in der Anwesenheit von 1 μg des (17m)₅-TATA-CAT-Reporterplasmids transfiziert. Das Vielfache der Induktion, relativ zur GAL-CBP-Aktivität, ist angezeigt. Der Mittelwert von drei Experimenten ist gezeigt; bei jedem Fall variierten die Werte um weniger als ±20%.

8(a-e). Kartierung der TIF2-nuclearer-Rezeptor-Interaktionsdomäne (NID).

(a) Angleichung der TIF2-NID (SEQ ID NO:2) mit den entsprechenden Regionen von SRC-1 (SEQ ID NO:3) und P/CIP (SEQ ID NO:5) und Beschreibung der NID-Mutationen. Die drei konservierten Regionen sind mit den entsprechenden Aminosäurenummern von hTIF2 oder hSRC-1 (F-SRC-1) von ganzer Länge dargestellt; die Leucine, die zu den drei NR-Box-Motiven (I, II, III) gehören, sind umrahmt. Die verschiedenen Deletions- und Leucin-zu-Alanin-Punktmutationskonstrukte sind angegeben.
(b) Angleichung der TIF2 (SEQ ID NO:2)-NR-Boxen mit den in mehreren Cofaktoren identifizierten NR-Boxen: TIF1α (SEQ ID NO:6), RIP140 (SEQ ID NO:7) und TRIP3 (SEQ ID NO:8). Die konservierten Leucine sind umrahmt.
(c-d) Interaktion von TIF2-NID-Mutanten mit NRs in vitro. Die GST-Aftinitätschromatographie-Experimente wurden mit ³⁵S-markierten in vitro-translatierten GAL4-DBD-Verbindungen der TIF2-Deletionsmutanten (c) oder TIF2.1-Punktmutanten (d) und bakteriell exprimierten GST und GST-Verbindungen der ER(DEF) und RAR(DEF) in der Abwesenheit oder Anwesenheit von jeweils 10^–6 M Estradiol oder all-trans-Retinolsäure durchgeführt. Zur Quantifizierung der Punktmutanten-Interaktionen s. nachstehend.
(e) Wirkung der TIF2-NID-Punktmutation auf die Stimulation der NR-AF-2-Aktivität. Cos-1-Zellen wurden mit 1 μg des (17m)₅-TATA-CAT_Reporters, 0.2 μg von GAL-hERα(EF) oder GAL-mRXRα(DE) und 2.5 μg des TIF2.1-Wildtyps oder mutierten Fragmenten cotransfiziert, wie angezeigt. Die Aktivierung des Reportergens relativ zur TIF2.1-Wildtyp-Aktivität und in Anwesenheit von jeweils 10^–6 M Estradiol (E2) oder all-trans-Retinolsäure (RA) ist für jede Mutante angezeigt (schwarze Balken); zum Vergleich ist das in vitro-Binden der jeweiligen Mutanten relativ zum TIF2.1-Wildtyp-Binden in Anwesenheit des Liganden durch weiße Balken angezeigt. Jeder Balken repräsentiert den jeweils aus mindestens drei (Interaktion) oder mindestens vier (Transaktivierung) Experimenten erhaltenen Mittelwert; die Standardabweichungen sind angezeigt. Beachten Sie, dass die absoluten Werte für die TIF2.1-Wildtyp-Aktivität um ±16% variierten, wenn mit GAL-hERa(EF) cotransfiziert, und um ±34%, wenn mit GAL-mRXRa(DE) cotransfiziert. Bei den in-vitro-Interaktionsassays variierte die Affinität des TIF2.1-Wildtyp-Standards um weniger als ±25%. Die Expressionsniveaus der TIF2-Mutanten in den Zellen wurden

9(a-c). Kartierung der TIF2-Aktivierungsfunktion-1 (AF-1) und Interaktion der AF-1-Domäne mit CBP.

(a) Angleichung der TIF2-AF-1 mit der entsprechenden Region von SRC-1 (SEQ ID NO:3) und P/CIP (SEQ ID NO:9). Beschreibung der TIF2-AF-1-Deletionsmutanten und ihrer Eigenschaften. Die Regionen von TIF2 und hSRC-1, die vorhergesagt wurden, zu α-Helices zu falten, sind umrahmt (PHD-Programm). Die GAL-TIF2-Konstrukte, die positiv oder negativ für die Transaktivierung eines GAL4-Reporters bewerten, werden rechts jeweils durch „+"- und „-"-Zeichen identifiziert; nd, nicht bestimmt.
(b) Transkriptionsaktivierung von TIF2-AF-1-Mutanten. Cos-1- und HeLa-Zellen wurden mit 3 μg von Plasmiden, die verschiedene Mutanten der TIF2-AF-1 exprimieren, die mit der DNA-bindenden Domäne des Hefe-Transkriptionsfaktors GAL4 fusioniert ist, zusammen mit 1 μg des (17m)₅-G-CAT-Reporterplasmids cotransfiziert. Das Vielfache der Induktion oberhalb der Aktivierung die mit GAL4-DBD alleine gesehen wird sind angezeigt. Die Werte repräsentieren den Mittelwert von mindestens drei Experimenten. Beachten Sie, dass alle GAL4-TIF2-Fusionsproteine zu ähnlichen Niveaus exprimiert wurden, wie durch Western-Blot mit gegen GAL4-DBD gerichteten Antikörpern offenbart wurde (Daten nicht gezeigt).
(c) Interaktion von TIF2-AF-1-Mutanten mit CBP in vitro. GST-Pulldown-Experimente wurden mit ³⁵S-markierten in-vitro-translatierten GAL-TIF2-Fusionsproteinen und bakteriell hergestellter GST und GST-CBP durchgeführt. Beachten Sie, dass die GAL4-DBD für sich allein nicht mit der GST-CBP-Affinitätsmatrix interagiert.

10(a-c). Identifizierung von TIF2-AF-1-Mutanten, die sowohl in der Transkriptionsaktivierung als auch in der Interaktion mit CBP beeinträchtigt sind.

(a) Die Transkriptionsaktivierung durch TIF2.13 und TIF2.13-Mutanten. Cos-1-und HeLa-Zellen wurden mit 3 μg von Plasmiden, die die TIF2.13-Region und die angezeigten TIF2.13-Mutanten exprimieren, die mit der DNA-bindenden Domäne des Hefe-Transkriptionsfaktors GAL4 fusioniert sind, zusammen mit 1 μg des (17m)-G-CAT-Reporterplasmids cotransfiziert. Das Vielfache der Induktion über dem 1-fachen Wert von GAL4-DBD ist angezeigt. Der aus mindestens vier Experimenten erhaltene Mittelwert und die Standardabweichung sind gezeigt. Die Expressionsniveaus der GAL4-TIF2.13-Fusionsproteine wurden durch Western-Blotting bestätigt (Daten nicht gezeigt).
(b) Die durch Zwei-Hybrid-Analyse offenbarte Interaktion von TIF2.13-Wildtyp und TIF2.13-Mutanten mit CBP in Säugetierzellen. HeLa-Zellen wurden mit 0.2 μg von GAL4 oder GAL-CBP-Expressionsvektoren zusammen mit 0.2 μg von VP16 oder VP16-TIF2.13-Expressionsvektoren in der Anwesenheit von 1 μg von (17m)₅-TATA-CAT-Reporterplasmid transfiziert. Die Daten sind als Vielfaches der Induktion der mit GAL-CBP alleine gesehenen Aktivität dargestellt. Der aus zehn Experimenten erhaltende Mittelwert und die Standardabweichung sind gezeigt. Die Expressionsniveaus wurden durch Western-Blotting mit gegen GAL4-DBD und VP16-AAD gerichteten Antikörpern bestätigt (Daten nicht gezeigt).
(c) Interaktion von TIF2.13-Wildtyp und TIF2.13-Mutanten mit CBP in vitro. GST-Pulldown-Experimente wurden mit ³⁵S-markierten in-vitro-translatierten VP16-TIF2.13-Polypepetiden und bakteriell hergestellter GST und GST-CBP durchgeführt. Beachten Sie, dass die VP16-Aktivierungsdomäne alleine nicht mit GST-CBP interagiert.

11. Das TIF2.1-Coaktivator-Fragment stimuliert effizient die Ligandenabhängige AF-2 von ER, RAR und RXR in Hefe. Keine stimulatorische Wirkung von TIF2.1 auf die isolierte AF-1 von ER (HE15) ist beobachtbar. Plasmide, die verschiedene Regionen von hERa (weiß), hRARa (grau) und mRXRa (schwarz) exprimieren, die mit der ER-DBD (hERα(C)) fusioniert sind, wurden in den Hefe-Reporterstamm PL3(α) zusammen mit TIF2.1 eingebracht, wie angezeigt. Weiße Boxen repräsentieren die Sequenzen von Transformanten, die in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 10^–6 M des verwandten Liganden (Östradiol für ER, all-trans-Retinolsäure für RAR, 9-cis-Retinolsäure für RXR) gezüchtet wurden. Die zu jedem zellfreien Extrakt ermittelten OMP-Decase-Aktivitäten sind in nmol/min/mg Protein ausgedrückt; der Mittelwert und die Standardabweichung von mindestens vier Experimenten sind gezeigt.
12(a-d). Die isolierte nuclearer Rezeptor-Interaktionsdomäne (NID) von TIF2 wirkt dominant-negativ auf die Transkriptionsaktivierung durch die ER, RXR- und RAR-LBDs. Der Mittelwert der Induktion, der aus der Quantifizierung von mindestens drei Experimenten (relativ zu der jeweiligen Rezeptor-LBD-Aktivität in Abwesenheit von rekombinantem TIF2) erhalten wurde, ist unter jeder Tafel angezeigt. Die Expressionsniveaus von TIF2, TIF2.1 und TIF2.5 wurden routinemäßig durch Western-Blot mit dem monoklonalen Antikörper 3Ti3C11 der Maus, der gegen eine Region von TIF2.5 gerichtet ist, verifiziert (nicht gezeigt).

(a) Die Überexpression des TIF2.5-Fragments, das die isolierte NID enthält, kehrt die stimulatorische Wirkung des starken Coaktivator-Fragments TIF2.1 um. Cos-1-Zellen wurden mit 1 μg des (17m)₅-TATA-CAT-Reporters und 0.2 μg GAL-ERα(EF)-Expressionsvektor in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 10^–6 M Östradiol cotransfiziert. Wo angezeigt, wurden 0.1 μg von TIF2.1 und 2.5 μg von TIF2.5-Expressionsvektoren zusätzlich cotransfiziert.
(b-d) Volllängen-TIF2 und das Coaktivator-Fragment TIF2.1 erhöhen die Aktivität der ER, RXR- und RAR-LBDs, während die nuclearer Rezeptor-Interaktionsdomäne TIF2.5 die Aktivität der ER, RXR- und RAR-LBDs blockiert. Cos-1- und HeLa-Zellen wurden mit 1 μg des (17m)₅-TATA-CAT-Reporters und 0.2 μg des Expressionsvektors, der die jeweilige GAL-DBD-Verbindung von hERα(EF), mRXRα(DE) oder mRARα(DEF) codiert, cotransfiziert. In der Anwesenheit oder Abwesenheit von 10^–6 M Ligand (E2, Östradiol; 9C-RA, 9-cis-Retinolsäure; T-RA, alltrans-Retinolsäure), zusammen mit 0.25 μg oder 2.5 μg von TIF2, TIF2.1 und TIF2.5-Expressionsvektoren.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuremoleküle bereit, die ein Polynucleotid umfassen, das den transkriptionalen intermediären Faktor-2 (TIF2) codiert, dessen Aminosäuresequenz in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt wird. Das TIF2-Protein der vorliegenden Erfindung teilt die Sequenzhomologie mit dem menschlichen Steroidrezeptor-Coaktivator SRC-1 (SEQ ID NO:3) (3). Die in 1 gezeigte Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) wurde durch Sequenzierung eines cDNA-Klons erhalten, der am 14. Juni 1996 bei der ATCC hinterlegt und dem die Zugangsnummer 97612 gegeben wurde.
Nucleinsäuremoleküle
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die das TIF2-Protein codieren. Die Sequenzähnlichkeiten zwischen TIF2 und SRC-1 (Onate et al., Science 270:1354 (1995)) zeigen die Existenz einer neuen Genfamilie von NR-Transkriptionsmediatoren an. Unter Verwendung der hierin bereitgestellten Information wie der Nucleotidsequenz in 1 (SEQ ID NO:1) oder dem voranstehend beschriebenen hinterlegten Klon kann ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, das ein TIF2-Polypeptid codiert, unter Verwendung von Standardklonierung und Durchmusterungsprozeduren erhalten werden. Veranschaulichend für die Erfindung wurde das in 1 beschriebene Nucleinsäuremolekül (SEQ ID NO:1) in einer cDNA-Expressionsbank von menschlichem Plazenta-Gewebe entdeckt. Die TIF2-cDNA der vorliegenden Erfindung codiert ein Protein von etwa 159 kDa (1,464 Aminosäuren), das N-terminale nucleare Lokalisierungssignale (NLSs), eine Gln- und drei Ser/Thr-reiche Regionen und zwei geladene Cluster beinhaltet (3). TIF2 wird weitgehend exprimiert, da das entsprechende Transkript in mehreren menschlichen Geweben gefunden wurde, einschließlich in Pankreas, Niere, Muskel, Leber, Lunge, Plazenta, Gehirn und Herz (2c).
Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können in der Form von RNA, wie mRNA, oder in der Form von DNA sein, einschließlich zum Beispiel cDNA und genomische DNA, die durch Klonierung erhalten oder synthetisch hergestellt wird. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Einzelsträngige DNA oder RNA kann der codierende Strang sein, auch als der Sense-Strang bekannt, oder sie kann der nicht codierende Strang sein, auch als Antisense-Strang bezeichnet.
Durch (ein) „isolierte(s)" Nucleinsäuremolekül(e) ist ein Nucleinsäuremolekül beabsichtigt, DNA oder RNA, das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wurde. Zum Beispiel werden in einem Vektor enthaltene rekombinante DNA-Moleküle für Zwecke der vorliegenden Erfindung als isoliert angesehen. Zusätzliche veranschaulichende Beispiele von isolierten DNA-Molekülen umfassen rekombinante DNA-Moleküle, die in heterologen Wirtszellen beibehalten werden, und aufgereinigte (teilweise oder wesentlich) DNA-Moleküle in Lösung. Isolierte RNA-Moleküle umfassen in vitro-RNA-Transkripte der DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sowie teilweise oder wesentlich aufgereinigte mRNA-Moleküle. Isolierte Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen weiterhin solche Moleküle die synthetisch hergestellt wurden.
Nucleinsäuremoleküe der vorliegenden Erfindung schließen DNA-Moleküle ein, die ein offenes Leseraster (ORF) mit einem Startcodon an Position 163-165 der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) umfassen; und DNA-Moleküle, die eine Sequenz umfassen, die sich deutlich von der voranstehend beschriebenen unterscheidet, aber die auf Grund der Entartung des genetischen Codes das TIF2-Protein noch codiert. Natürlich ist der genetische Code auf dem Fachgebiet gut bekannt. Demnach würde es für einen Fachmann Routine sein, die voranstehend beschriebenen degenerierten Varianten herzustellen.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Nucleinsäuremoleküle bereit, die das TIF2-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codieren, wie durch den cDNA-Klon codiert, der als ATCC-Hinterlegungsnummer 97612 am 14. Juni 1996 hinterlegt wurde (American Type Culture Collection, (ATCC) Rockville, MD). Die Erfindung stellt weiter ein Nucleinsäuremolekül bereit mit der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) oder der Nucleotidsequenz der TIF2-cDNA, die in dem voranstehend beschriebenen Klon enthalten ist, oder ein Nucleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die komplementär zu einer der voranstehenden Sequenzen ist. Solche Nucleinsäuremoleküle, vorzugsweise DNA-Moleküle, sind brauchbar als Sonden zur Genkartierung durch in situ-Hybridisierung mit Chromosomen und zum Nachweis der Expression des TIF2-Gens in menschlichem Gewebe, zum Beispiel durch Northern-Blot-Analyse.
In einem anderen Aspekt wird ein Nucleinsäuremolekül beschrieben, das unter stringenten Bedingungen mit den voranstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülen hybridisiert. Wie hierin verwendet, sind unter „stringenten Bedingungen", als ein nicht begrenzendes Beispiel, eine Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die 50% Formamid, 5×SSC (150 mM NaCl, 15mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7.6), 5× Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA umfasst, gefolgt durch Waschen der Filter in 0.1×SSC bei etwa 65°C zu verstehen. Vorzugsweise wird solch „ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen hybridisiert" mindestens 15 bp, vorzugsweise mindestens 20 bp, bevorzugter mindestens 30 bp und am meisten bevorzugt mindestens 50 bp lang sein.
Wie hierin verwendet, versteht man unter „Fragmente" eines DNA-Moleküls mit der Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNA oder der Nucleotidsequenz, wie in 1 (SEQ ID NO:1) gezeigt, DNA-Fragmente einer Länge von mindestens 15 bp, bevorzugter von mindestens 20 bp und am meisten bevorzugt von mindestens 30 bp, die brauchbar sind als diagnostische Sonden und Primer, wie voranstehend und ausführlicher nachstehend besprochen. Größere DNA-Fragmente, bis zu zum Beispiel 500 bp Länge sind auch als Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbar. Unter einem Fragment von mindestens 20 bp Länge sind zum Beispiel, Fragmente zu verstehen, welche 20 oder mehr aufeinanderfolgende Basen aus der Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNA oder der Nucleotidsequenz, wie in 1 (SEQ ID NO:1) gezeigt, umfassen. Wie angezeigt, sind solche Fragmente entweder als Sonde gemäß konventioneller DNA-Hybridisierungsmethoden oder als Primer zur Amplifizierung einer Zielsequenz durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) diagnostisch brauchbar.
Da das Gen hinterlegt wurde und die in 1 (SEQ ID NO:1) gezeigte Nucleotidsequenz bereitgestellt wurde, würde das Herstellen solcher DNA-Fragmente für den Fachmann auf dem relevanten Fachgebiet Routine sein. Die Restriktionsendonuclease-Spaltung oder das Scheren durch Ultraschallbehandlung können zum Beispiel leicht verwendet werden, um Fragmente von verschiedenen Größen herzustellen. Anderenfalls können die DNA-Fragmente der vorliegenden Erfindung synthetisch hergestellt werden gemäß der bekannten und für Fachmänner erhältlichen Verfahren und Methoden. Zehn exprimierte Sequenzmarker („tags") mit Homologie zu einem Teil der TIF-2-Nucleotidsequenz wurden von den Erfindern in GenBank identifiziert: GenBank Zugangsnummern T77249, R77864, T77464, R77770, R08880, T85560, R25318, T85561, R08986 und R26517.
Darüber hinaus werden Varianten der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung beschrieben, die für Fragmente, Analoga oder Derivate des TIF2-Proteins codieren, z.B. Polypeptide, die eine zu dem beschriebenen TIF2-Protein im wesentlichen ähnliche biologische Aktivität haben. Varianten können natürlich vorkommen, wie Isoformen und allelische Varianten. Nicht natürlich vorkommende Varianten können unter Verwendung einer beliebigen der Mutagenese-Methoden hergestellt werden, die den Fachmännern bekannt und erhältlich sind.
Solche Varianten beinhalten jene, die durch Nucleotidsubstitutionen, -deletionen oder -additionen hergestellt werden. Die Substitutitionen, Deletionen oder Additionen können ein oder mehr Nucleotide einbeziehen. Die Varianten können in den codierenden oder nicht-codierenden Regionen oder in beiden geändert werden. Änderungen in den codierenden Regionen können konservative oder nicht konservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen herstellen. Besonders bevorzugt unter diesen sind stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die nicht die Eigenschaften und Aktivitäten des TIF2-Proteins oder des Fragments davon ändern. Auch besonders in diesem Zusammenhang bevorzugt sind konservative Substitutionen.
Die vorliegende Erfindung ist weiter auf Nucleinsäuremoleküle gerichtet, die ein cytoplasmatisches TIF2-Polypetid codieren. Volllängen-TIF2 ist ein nucleares Protein auf Grund der Anwesenheit von N-terminalen nuclearen Lokalisierungssignalen (NLSs) (3). Unter einem „cytoplasmatisches TIF2-Polypetid" ist ein TIF2-Polypetid zu verstehen, das hauptsächlich in dem Cytoplasma gefunden wird, nachdem es rekombinant in Säugetierzellen exprimiert wird. Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäuremolekülen, die ein cytoplasmatisches TIF2-Polypetid codieren, beinhalten Mutieren oder Deletieren der NLSs-codierenden N-terminalen Region der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1). Beispiele von NLS-Sequenzen umfassen Aminosäuren 13-20 und 31-39 und Nucleotide 199-222 und 253-279 von 1 (S. auch 3). Passende Mutationen an der NLSs-codierenden N-terminalen Region beinhalten Substitutionen, Deletionen und Insertionen, die zu einem Nucleinsäuremolekül führen, das ein TIF2-Polypetid codiert, dem die nucleare Lokalisierungsfunktion fehlt. Verfahren zur Herstellung solcher Mutationen werden für den Fachmann leicht ersichtlich werden und sind beschrieben, zum Beispiel, in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, herausgegeben von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Vorzugsweise werden die Nucleinsäuremoleküle, die ein cytoplasmatisches TIF2-Polypetid codieren, Fragmente mit einer Deletion in allen oder einem Teil der N-terminalen NLSs codierenden Region sein. Verfahren zur Herstellung solcher Fragmente werden nachstehend beschrieben. Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten solche Nucleinsäurefragmente weiter N-terminate Deletionen, die sich außerhalb der NLSs codierenden Region erstrecken, und können auch C-terminale Deletionen beinhalten. Zum Beispiel haben die anwesenden Erfinder ein Nucleinsäuremolekül hergestellt, das das cytoplasmatische TIF2.1-Polypetid (Aminosäuren 624 bis 1287 in 1 und 3 (SEQ ID NO:2)) codiert, das wie das nucleare Volllängen-TIF2 auf eine Agonisten-abhängige Weise mit den nuclearen Rezeptoren interagiert und die durch den nuclearen Rezeptorvermittelte Transkriptionsaktivierung erhöht. Die gegenwärtigen Erfinder stellten auch ein Nucleinsäuremolekül her, das das cytoplasmatische TIF2.5-Polypeptid (Aminosäuren 624-869 in den 1 und 3 (SEQ ID NO:2)) codiert, das mit der NID-Domäne von nuclearen Rezeptoren interagiert, aber nicht die Transkription erhöht. Auch wurden Nucleinsäuremoleküle hergestellt, die die cytoplasmatischen TIF2.8- und TIF 2.12-Polypeptide (jeweils die Aminosäuren 1010-1179 und Aminosäuren 940-1131 in den 1 und 3 (SEQ ID NO:2)) codieren, die die Transkription erhöhen, aber nicht an nucleare Rezeptoren binden. Demnach werden durch die Erfindung Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die die cytoplasmatischen TIF2-Polypeptide codieren, die auf eine Agonisten-abhängige Weise mit nuclearen Rezeptoren interagieren und die durch nucleare Rezeptoren vermittelte Transkriptionsaktivierung erhöhen. Auch werden cytoplasmatische TIF2-Polypeptide bereitgestellt, die an nucleare Rezeptoren binden, aber nicht die Transkription erhöhen, während cytoplasmatische TIF2-Polypeptide bereitgestellt werden, die die Transkription erhöhen, aber nicht an nucleare Rezeptoren binden. Wie der Fachmann erkennen wird, kann die Länge solcher Nucleinsäuremoleküle variieren.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung beinhalten isolierte Nucleinsäuremoleküle, die ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz umfassen, die mindestens zu 90% identisch und bevorzugter zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist zu: (a) der Nucleotidsequenz der als ATCC 97612 hinterlegten cDNA; (b) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1); (c) der Nucleotidsequenz der als ATCC 97612 hinterlegten cDNA, die das TIF2-Protein von ganzer Länge codiert; (d) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das Volllängen-TIF2-Protein codiert; (e) der Nucleotidsequenz der als ATCC 97612 hinterlegten cDNA, die das funktionelle Coaktivator-TIF2.1-Protein codiert; (f) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das funktionelle Coaktivator TIF2.1-Protein codiert; (g) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.0-Polypeptid codiert; (h) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.2-Polypeptid codiert; (i) die in 1 gezeigte Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.3-Polypeptid codiert; (j) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.4-Polypeptid codiert; (k) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.5-Polypeptid codiert; (l) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.6-Polypeptid codiert; (m) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.7-Polypeptid codiert; (n) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.8-Polypeptid codiert; (o) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.9-Polypeptid codiert; (p) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.10-Polypeptid codiert; (q) der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die das TIF2.12-Polypeptid codiert und (r) einer Nucleotidsequenz, die komplementär zu einer beliebigen der Nucleotidsequenzen in (a-q) ist.
Ob zwei beliebige Nucleinsäuremoleküle Nucleotidsequenzen haben, die mindestens zu 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% „identisch" sind, kann konventionell unter Verwendung bekannter Computeralgorithmen wie des „fastA"-Programms ermittelt werden zum Beispiel unter Verwendung der Standardparameter (Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)). Die vorliegende Anmeldung ist auf solche Nucleinsäuremoleküle gerichtet mit einer Nucleotidsequenz, die mindestens zu 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identisch zu der Nucleotidsequenz der voranstehend vorgetragenen Nucleinsäuremoleküle ist, unabhängig davon ob sie ein Polypeptid mit TIF2-Aktivität codieren. Dies deshalb, weil sogar wenn ein bestimmtes Nucleinsäuremolekül nicht ein Polypeptid mit TIF2-Aktivität codiert, ein Fachmann noch wissen würde, wie das Nucleinsäuremolekül als Sonde verwendet wird. Verwendungen von Nucleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung, die nicht ein Polypeptid mit TIF2-Aktivität codieren, beinhalten unter anderem (1) Isolieren des TIF2-Gens oder allelische Varianten davon in einer cDNA-Bank; (2) in situ-Hybridisierung (FISH) zur Chromosomenspreitung in der Metaphase, um den genauen Ort des TIF2-Gens auf dem Chromosom zu liefern, wie beschrieben in Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); und Northern-Blot-Analyse zum Nachweis der TIF2-mRNA-Expression in spezifischen Geweben, wie dem Plazenta-Gewebe.
Jedoch werden Nucleinsäueremoleküle bevorzugt mit einer Nucleotidsequenz, die mindestens zu 90% und bevorzugter zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit der Nucleotidsequenz der voranstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülen ist, die tatsächlich ein Polypeptid mit mindestens einer TIF2-Protein-Aktivität codieren. Wie hierin verwendet, sind unter „ein Polypeptid mit einer TIF2-Protein-Aktivität", Polypeptide zu verstehen, die eine ähnliche, aber nicht notwendigerweise identische Aktivität aufweisen, wie mindestens eine biologische Aktivität des TIF2-Proteins, wie in einem besonderen biologischen Assay gemessen wird. Zum Beispiel interagiert das TIF2-Protein der vorliegenden Erfindung direkt auf eine Agonisten-abhängige Weise mit den Liganden bindenden Domänen von mehreren nuclearen Rezeptoren. Außerdem erhöht das TIF2-Protein der vorliegenden Erfindung die Transkription über CBP-abhängige und CBP-unabhängige Routen, wenn es rekombinant in Säugetierzellen exprimiert wird.
Demnach beinhaltet „ein Polypeptid mit einer TIF2-Protein-Aktivität" Polypetide mit einer oder mehr der folgenden Aktivitäten: Interaktion mit der LBD von einem oder mehr NRs auf eine Agonisten-abhängige Weise; Verstärkung von CBP-abhängiger Transkriptionsaktivierung oder Verstärkung von CBP-unabhängiger Transkriptionsaktivierung.
Durchmusterungsassays zur Ermittlung, ob ein Kandidaten-Polypeptid TIF2-Protein-Aktivität hat, werden ausführlich in den Beispielen 1, 3, 4 und 6, nachstehend, beschrieben. Zum Beispiel entdeckten die Erfinder beim Durchführen solcher Assays, dass das funktionelle Coaktivator-Fragment TIF2.1 (Aminosäuren 624 bis 1287 in den 1 und 3 (SEQ ID NO:2)) „ein Polypeptid mit einer TIF2-Protein-Aktivität" ist. Die gegenwärtigen Erfinder entdeckten auch, dass das Fragment TIF2.5 (Aminosäuren 624-869) an die LBD von NRs ohne Aktivierung der Transkription bindet und „ein Polypeptid mit einer TIF2-Protein-Aktivität" ist. Auch entdeckt wurde das Fragment TIF2.2 (Aminosäuren 1288-1464, wie in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt), das die CBP-unabhängige Transkription erhöht. Demnach ist TIF2.2 „ein Polypeptid mit einer TIF2-Protein-Aktivität". Ein anderes Fragment wurden von den Erfindern entdeckt, TIF 2.8 (Aminosäuren 1010-1179, wie in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt) ist „ein Polypeptid mit einer TIF2-Protein-Aktivität", da es die CBP-abhängige Transkription aktiviert.
Auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes wird ein normaler Fachmann sofort erkennen, dass eine große Anzahl von Nucleinsäuremolekülen mit einer Nucleotidsequenz, die mindestens zu 90%, vorzugsweise mindestens zu 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identisch mit der Nucleotidsequenz der voranstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle ist, „ein Polypeptid mit einer TIF2-Protein-Aktivität" codieren wird. Tatsächlich wird dies dem Fachmann sogar ohne Durchführung des voranstehend beschriebenen Durchmusterungsassays deutlich werden, da die degenerierten Varianten alle das gleiche Polypeptid codieren. Es wird von den Fachmännern weiter erkannt werden, dass für solche Nucleinsäuremoleküle, die nicht degenerierte Varianten sind, eine angemessene Anzahl auch ein Polypeptid mit einer TIF2-Protein-Aktivität codieren wird. Dies deshalb, weil der Fachmann jede mögliche Aminosäuresubstitution kennt, welche die Proteinfunktion entweder weniger wahrscheinlich oder nicht wahrscheinlich signifikant beeinflusst (z.B. Austauschen von einer aliphatischen Aminosäure mit einer zweiten aliphatischen Aminosäure).
Die Anleitung hinsichtlich der Herstellung von phänotypisch „stillen" Aminosäuresubstitutionen wird zum Beispiel bereitgestellt in J.U. Bowie et al., „Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990), worin die Autoren anzeigen, dass es zwei hauptsächliche Herangehensweisen zum Studieren der Toleranz einer Aminosäuresequenz gegenüber deren Austausch gibt. Das erste Verfahren beruht auf dem Evolutionsprozess, bei dem Mutationen durch die natürliche Selektion entweder angenommen oder abgelehnt werden. Die zweite Herangehensweise verwendet die Gentechnik, um einen Aminosäureaustausch an spezifischen Positionen eines klonierten Gens einzubringen, und Selektionen oder Durchmusterungen, um Sequenzen zu identifizieren, die die Funktionalität beibehalten. Wie die Autoren feststellten, offenbarten diese Studien, dass Proteine überraschenderweise tolerant gegenüber Aminosäuresubstitutionen sind. Die Autoren zeigen weiter an, welcher Aminosäureaustausch wahrscheinlich tolerant an einer bestimmten Position des Proteins ist. Zum Beispiel benötigen die meisten verdeckten Aminosäurereste unpolare Seitenketten, während einige Merkmale der Oberflächenseitenketten allgemein konserviert sind. Andere solche phänotypisch stillen Substitutionen sind beschrieben in Bowie et al., oben, und in den darin zitierten Literaturhinweisen.
Vektoren und Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Vektoren, die die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung beinhalten, Wirtszellen, die mit den rekombinanten Vektoren genetisch manipuliert werden, und die Herstellung von TIF2-Polypeptiden oder Fragmenten davon, wie TIF2.1, durch rekombinante Methoden.
Rekombinante Konstrukte können in Wirtszellen unter Verwendung gut bekannter Methoden eingebracht werden wie Infektion, Transduktion, Transfektion, Transvection, Elektroporation und Transformation. Der Vektor kann zum Beispiel ein Phage, ein Plasmid, ein viraler oder ein retroviraler Vektor sein. Retrovirale Vektoren können replikationsbefähigt oder replikationsgestört sein. In dem letzteren Fall wird die virale Fortpflanzung allgemein nur in ergänzenden Wirtszellen vorkommen.
Die Polynucleotide können mit einem Vektor verbunden werden, der einen selektierbaren Marker zur Fortpflanzung in einem Wirt enthält. Allgemein wird ein Plasmidvektor in ein Präzipitat eingebracht, wie Calciumphosphatpräzipitat, oder in einen Komplex mit einem geladenen Lipid. Wenn der Vektor ein Virus ist, kann er in vitro unter Verwendung einer geeigneten Verpackungszelllinie verpackt werden und dann in Wirtszellen transduziert werden.
Bevorzugt werden Vektoren, die cis-agierende Kontrollregionen zu dem Polynucleotid von Interesse umfassen. Geeignete trans-agierende Faktoren können vom Wirt, vom ergänzenden Vektor oder vom Vektor selbst beim Einbringen in den Wirt geliefert werden.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen in dieser Hinsicht gewährleisten die Vektoren die spezifische Expression, die induzierbar und/oder Zelltyp-spezifisch sein kann. Besonders bevorzugt unter solchen Vektoren sind jene, die durch umgebende Faktoren, die leicht zu manipulieren sind, wie Temperatur und Nährstoffzusätze, induzierbar sind.
In der vorliegenden Erfindung brauchbare Expressionsvektoren beinhalten chromosomal-, episomal- und Virus-abgeleitete Vektoren, z.B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, Bakteriophagen, Hefeepisomen, chromosomalen Elementen der Hefe, Viren, wie Baculoviren, Papovaviren, Vacciniaviren, Adenoviren, Fowlpoxviren, Pseudoarabiesviren und Retroviren, abgeleitet werden, und Vektoren, die aus Kombinationen davon abgeleitet werden, wie Cosmide und Phagemide.
Das DNA-Insert sollte funktionell mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, wie mit dem Phage-lambda-PL-Promotor, den lac-, trp- und tac-Promotoren von E. coli, den frühen und späten Promotoren von SV40 und den Promotoren der retroviralen LTRs, um einige zu nennen. Andere passende Promotoren werden dem Fachmann bekannt sein. Die Expressionskonstrukte werden weiter Stellen zum Transkriptionsstart, -stopp und in der transkribierten Region eine Ribosom bindende Stelle zur Translation enthalten. Der codierende Anteil der reifen Transkripte, die durch die Konstrukte exprimiert werden, werden vorzugsweise ein Translation startendes AUG am Anfang und ein Stoppcodon (UAA, UGA oder UAG), das geeigneterweise am Ende des zu translatierenden Polypeptids positioniert ist, beinhalten.
Wie angezeigt, werden die Expressionsvektoren vorzugsweise mindestens einen selektierbaren Marker beinhalten. Solche Marker beinhalten Dihydrofolat-Reduktase oder Neomycin-Resistenz für die eurkayontische Zellkultur und Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenzgene zum Züchten in E. coli und anderen Bakterien. Repräsentative Beispiele von geeigneten Wirten beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf, Bakterienzellen, wie E. coli-, Streptomyces- und Salmonella typhimurium-Zellen; Pilzzellen wie Hefezellen; Insektenzellen wie Drosophila S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; Tierzellen wie CHO, Cos und Bowes Melanomzellen; und Pflanzenzellen. Geeignete Kulturmedien und Bedingungen für die voranstehend beschriebenen Wirtszellen sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Veranschaulichende Beispiele von für die Verwendung in Bakterien bevorzugte Vktoren beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf, pA2, pQE70, pQE60 und pQE-9, erhältlich von Qiagen; pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, PNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A,, erhältlich von Stratagene; und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, erhältlich von Pharmacia. Bevorzugte eukaryontische Vektoren beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG, erhältlich von Stratagene; und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, erhältlich von Pharmacia. Andere geeignete Vektoren werden dem Fachmann leicht ersichtlich werden.
Unter den bekannten bakteriellen Promotoren, die passend für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind, befinden sich die lacI- und IacZ-Promotoren von E. coli, die T3- und T7-Promotoren, der gpt-Promotor, die lambda-PR- und PL-Promotoren und der trp-Promotor. Passende eukaryontische Promotoren beinhalten den unmittelbar frühen Promotor von CMV, den HSV-Thymidinkinase-Promotor, die frühen und späten SV40-Promotoren, die Promotoren der retroviralen LTRs, wie jene des Rous-Sarcomavirus („RSV") und Metallothionein-Promotoren, wie den Metallothionein-I-Promotor der Maus.
Das Einbringen des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, kationisches Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion oder anderen Verfahren bewirkt werden. Solche Verfahren sind in vielen Standard-Laborhandbüchern beschrieben, wie in Davis et al., Basic Methdods in Molecular Biology (1986).
Die Transkription der DNA, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch höhere Eukaryonten codiert, kann durch Einfügen einer Verstärkersequenz in den Vektor gesteigert werden. Verstärker sind cis-agierende Elemente der DNA, allgemein etwa 10 bis 300 bp an Größe, die wirken, um die Transkriptionsaktivität eines Promotors in einem gegebenen Wirtszelltyp zu steigern. Veranschaulichende Beispiele von Verstärkern beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf, den SV40-Verstärker, der an der späten Seite des Replikationsursprungs bei bp 100 bis 270 gelegen ist, der frühe Promotor-Verstärker des Cytomegalievirus, der Polyoma-Verstärker an der späten Seite des Replikationsursprungs und die Adenovirus-Verstärker.
Zur Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den Periplasmaraum oder in die extrazelluläre Umgebung können geeignete Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingebaut werden. Die Signale können zum Polypeptid endogen sein oder sie können heterologe Signale sein.
Das Polypeptid kann in einer modifizierten Form exprimiert werden, wie ein Fusionsprotein, und kann nicht nur Sekretionssignale, sondern auch zusätzliche heterologe funktionelle Regionen beinhalten. Demnach kann zum Beispiel eine Region von zusätzlichen Aminosäuren, besonders von geladenen Aminosäuren, zu dem N-Terminus des Polypeptids angefügt werden, um die Stabilität und Persistenz in der Wirtszelle während der Aufreinigung oder während der nachfolgenden Bearbeitung und Lagerung zu verbessern. Auch können Peptidteile an das Polypeptid angefügt werden, um die Aufreinigung zu erleichtern.
Das TIF2-Protein oder die Fraktion davon kann aus rekombinanten Zellkulturen durch gut bekannte Verfahren wieder hergestellt und aufgereinigt werden, einschließlich der Präzipitation mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, der sauren Extraktion, der Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, der Phosphocellulose-Chromatographie, der hydrophoben Interaktionschromatographie, der Affinitätschromatographie, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Lectin-Chromatographie. Am meisten bevorzugt wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie („HPLC") zur Aufreinigung verwendet.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf natürlich aufgereinigte Produkte, Produkte von chemischen synthetischen Prozeduren und Produkte, die durch rekombinante Methoden aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt hergestellt werden, einschließlich zum Beispiel Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen- Insekten- und Säugetierzellen. Abhängig von dem in einer rekombinanten Herstellungsprozedur verwendeten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung posttranslational modifiziert (z.B. glycosyliert, phosphoryliert, farnesyliert usw.) werden. Zusätzlich können die Polypeptide der Erfindung auch einen anfänglichen modifizierten Methioninrest beinhalten, bei einigen Fällen als ein Ergebnis von Wirt-vermittelten Prozessen.
TIF2-Polypeptide und -Fragmente
Die Erfindung stellt weiter ein TIF2-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz bereit, die durch die hinterlegte cDNA codiert wird, oder der Aminosäuresequenz, wie in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt, oder ein Fragment davon. Bevorzugte Polypeptid-Fragmente werden eine TIF2-Protein-Aktivität haben. Um für ein TIF2-Polypeptidfragment auf eine Agonisten-abhängige Weise mit den nuclearen Rezeptoren zu interagieren und die durch den nuclearen Rezeptor vermittelte Transkriptionsaktivierung zu erhöhen, sollten solche TIF2-Polypeptidfragmente mindestens die Aminosäurereste 624 bis 1131 beinhalten, wie in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt, oder Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen davon, die nicht signifikant nachteilig für die Fähigkeit der Polypeptide sind, auf eine Agonisten-abhängige Weise mit den nuclearen Rezeptoren zu interagieren und die durch den nuclearen Rezeptor vermittelte Transkriptionsaktivierung zu erhöhen. Um für ein TIF2-Polypeptidfragment mit der LBD eines NR ohne Aktivierung der Transkription zu interagieren, sollten die TIF2-Polypeptidfragmente mindestens die Aminosäuren 624-869 beinhalten, wie in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt, oder Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen davon, die nicht signifikant nachteilig für die Fähigkeit der Polypeptide sind, mit der LBD eines NRs zu interagieren. Um für ein TIF2-Polypeptidfragment die CBP-abhängige Transkription zu aktivieren, sollte das TIF2-Polypeptid mindestens die Aminosäurereste 1010-1131 beinhalten, wie in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt, oder Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen davon, die nicht signifikant nachteilig für die Fähigkeit der Polypeptide sind, die CBP-abhängige Transkription zu aktivieren. Um für ein TIF2-Polypetid die CBP-unabhängige Transkription zu aktivieren, sollte das TIF2-Polypeptid mindestens die Aminosäurereste 1288-1464 beinhalten, wie in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt, oder Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen davon, die nicht signifikant nachteilig für die Fähigkeit der Polypeptide sind, die CBP-unabhängige Transkription zu aktivieren.
Beispielhafte TIF2-Polypeptidfragmente gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten cytoplasmatische TIF2-Polypeptide mit mindestens einer Mutation oder Deletion in einer N-terminalen NLS-Region, die die nucleare Lokalisierungsfunktion beeinträchtigt. Verfahren zur Herstellung von cytoplasmatischen TIF2-Polypeptiden sind voranstehend beschrieben.
Wie hierin verwendet, ist unter einem „isoliertes" Polypeptid oder Protein ein Polypeptid oder Protein zu verstehen, das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wurde, wie rekombinant hergestellte Polypeptide und Proteine, die in Wirtszellen exprimiert werden, und natürliche oder rekombinante Polypeptide, die durch eine beliebige passende Methode wesentlich aufgereinigt wurden (z.B. das Einzelschritt-Aufreinigungsverfahren, das in Smith und Johnson, Gene 67:31-40 (1988) bekannt gegeben wird, das hierin durch Literaturhinweis berücksichtigt wird). Isolierte Polypeptide oder Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten weiter solche synthetisch hergestellten Verbindungen.
Die gegenwärtigen Erfinder entdeckten, dass das Volllängen-TIF2-Protein ein Protein von etwa 1464 Aminosäureresten ist mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 160 kDa. Es wird von den Fachmännern erkannt werden, dass manches der Aminosäuresequenz des TIF2-Protein ohne signifikante Wirkung auf die Struktur oder die Funktion des Proteins variiert werden kann. Wenn solche Unterschiede in der Sequenz betrachtet werden, sollte daran gedacht werden, dass es entscheidende Bereiche an dem Protein geben wird, die die Aktivität bestimmen, wie die voranstehend beschriebene Region, die von den Erfindern als entscheidend für die Fähigkeit des Proteins, die nuclearer Rezeptor-vermittelte Transkriptionsaktivierung zu erhöhen, bestimmt wurde. Im Allgemeinen ist es oft möglich, Reste zu ersetzen, die die Tertiärstruktur bilden, vorausgesetzt dass die Reste venrwendet werden, die eine ähnliche Funktion durchführen. Bei anderen Umständen kann der Typ des Rests vollständig unwichtig sein, wenn die Änderung in einer nicht-entscheidenden Region des Proteins vorkommt.
Demnach beinhaltet die vorliegende Offenbarung weiter Variationen des TIF2-Polypeptids, die wesentliche TIF2-Polypeptid-Aktivität zeigen oder die Regionen des TIF2-Proteins umfassen, wie die nachstehend besprochenen Proteinfragmente. Solche Mutanten beinhalten Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungen und Typsubstitutionen (zum Beispiel Austausch eines hydrophilen Rests mit einem anderen, aber in der Regel nicht stark hydrophilen für einen stark hydrophoben). Kleine Änderungen oder solche „neutralen" Aminosäuresubstitutionen werden allgemein kaum Wirkung auf die Aktivität haben.
Typisch als konservative Substitutionen betrachtet werden Austausche, eine für eine andere, unter den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile; Austausch der Hydroxylreste Ser und Thr; Austausch der sauren Reste Asp und Glu, Substitution zwischen den Amidresten Asn und Gln, Austausch der basischen Reste Lys und Arg und Austausche unter den aromatischen Resten Phe und Tyr.
Wie voranstehend ausführlich darauf hingewiesen wurde, kann eine weitere Anleitung hinsichtlich darauf, welche Aminosäureänderungen wahrscheinlich phänotypisch still sind, (d.h. bei welchen es nicht wahrscheinlich ist, dass sie eine signifikant schädliche Wirkung auf eine Funktion haben) gefunden werden in Bowie et al., „Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990)).
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung beinhalten Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, wie durch die hinterlegte cDNA codiert, einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:2 gezeigt, sowie einer Aminosäuresequenz, die mindestens zu 90% identisch und bevorzugter zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist zu der von der hinterlegten cDNA codierten Aminosäuresequenz, zu der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:2 gezeigt oder zu der Aminosäuresequenz eines voranstehend beschriebenen Polypeptidfragments. Ob zwei Polypeptide eine Aminosäuresequenz haben, die mindestens 90% oder 95% identisch ist, kann unter Verwendung eines Computeralgorithmus ermittelt werden, wie voranstehend beschrieben.
Wie nachstehend ausführlich beschrieben, sind die Nucleinsäuremoleküle und Polypeptide der vorliegenden Erfindung brauchbar bei Durchmusterungsassays zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten einer NR-AF2-vermittelten Transaktivierung. Zum Beispiel zeigen in Halachmi, S., et al., Science 264: 1455 (1994) die Autoren, dass Tamoxifen, das wachstumshemmende Wirkungen bei Brustkrebs hat, die Bildung eines Komplexes, der den Östrogenrezeptor und ERAP160 beinhaltet, unterbricht. Demgemäß sind die Nucleinsäuremoleküle und Polypeptide der vorliegenden Erfindung brauchbar in Assays zum Identifizieren von Arzneistoffen, die in der Lage sind, nuclearer Rezeptor-vermittelte Signalwege zu verstärken oder zu hemmen.
Die Nucleinsäuremoleküle und Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind brauchbar bei Durchmusterungsassays zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten der TIF2-AD1-Aktivität, und in Durchmusterungsassays zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten der TIF2-AD2-Aktivität, wie nachstehend ausführlich beschrieben.
Durchmusterungsverfahren
Nucleare Rezeptoren (NRs) sind Mitglieder einer Superfamilie von Liganden induzierbaren transkriptionalen regulatorischen Faktoren, die Steroidhormon, Thyroidhormon, Vitamin D3 und Retinoidrezeptoren beinhalten (Leid, M., et al., Trends Biochem. Sci. 17:427-433 (1992); Leid, M. et al., Cell 68:377-395 (1992); und Linney, E. Curr. Top. Dev. Biol., 27:309-350 (1992)). NRs weisen eine modulare Struktur auf, die die Existenz von mehreren unabhängigen funktionellen Domänen widerspiegelt. Auf Grundlage der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz zwischen dem Östrogenrezeptor des Huhns, dem menschlichen Östrogen- und Glucocorticoidrezeptor und dem v-erb-A-Onkogen definierten Krust, A. et al., EMBO J: 5:891-897 (1986), sechs Regionen, A, B, C, D, E und F (s. 6), die verschiedene Ausmaße evolutionärer Konservierung unter verschiedenen Mitgliedern der nuclearer Rezeptor-Superfamilie darstellen. Die hoch konservierte Region C enthält zwei Zinkfinger und entspricht dem Kernstück der DNA-bindenden Domäne (DBD), die für die spezifische Erkennung der verwandten Response-Elemente verantwortlich ist. Region E ist funktionell komplex, da sie zusätzlich zur Liganden-bindenden Domäne (LBD) eine Liganden-abhängige Aktivierungsfunktion (AF-2) und eine Dimerisierungsgrenzfläche enthält. Eine unabhängige transkriptionale Aktivierungsfunktion (AF-1) ist in den nicht-konservierten N-terminalen A/B-Regionen der Steroidrezeptoren vorhanden. Interessanterweise weisen sowohl AF-1 als auch AF-2 der Steroidrezeptoren unterschiedliche Transkriptionsaktivierungseigenschaften auf, die sowohl für den Zelltyp als auch für den Promotorzusammenhang spezifisch erscheinen (Gronemeyer, H. Annu. Rev. Genet. 25:89-123 (1991)).
Die all-trans (T-RA)- und 9-cis (9C-RA)-Retinolsäure-Signale werden von zwei Familien von nuclearen Rezeptoren transduziert, RAR α, β und γ (und ihre Isoformen) werden von sowohl T-RA als auch 9C-RA aktiviert, während RXR α, β und γ ausschließlich von 9C-RA aktiviert werden (Allenby, G. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:30-34 (1993)). Die drei RAR-Typen unterscheiden sich in ihren B-Regionen, und ihre hauptsächlichen Isoformen (α1 und α2, β1-4 und γ1 und γ2) haben unterschiedliche N-terminale A-Regionen (Leid, M. et al., Trends Biochem. Sci. 17:427-433 (1992)). Gleichermaßen unterscheiden sich die RXR-Typen in ihren A/B-Regionen (Mangelsdorf, D.J. et al., Genes Dev. 6:329-344 (1992)).
Es wurde auch gezeigt, dass die E-Region der RARs und RXRs eine Dimerisierungsgrenzfläche enthalten (Yu, V.C. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 3:597-602 (1992)). Am interessantesten war; dass gezeigt wurde, dass RAR/RXR-Heterodimere viel effizienter als Homodimere von beiden Rezeptoren in vitro mit einer Anzahl von RA Response-Elementen (RAREs) binden (Yu, V.C. et al., Cell 67: 1251-1266 (1991); Berrodin, T.J. et al., Mol. Endocrinol 6:1468-1478 (1992); Bugge, T.H. et al., EMBO J. 11:1409-1418 (1992); Hall, R. K. et al., Mol. Cell. Biol. 12: 5527-5535 (1992); Hallenbeck, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5572-5576 (1992); Husmann, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1558-1564 (1992); Kliewer, S.A. et al., Nature 355:446-449 (1992b); Leid, M. et al., Cell 68:377-395 (1992); Marks, M. S. et al., EMBO J. 11:1419-1435 (1992); Zhang, X. K, et al., Nature 355:441-446 (1992)). RAR- und RXR-Heterodimere werden auch vorzugsweise in vitro in Lösung gebildet (Yu, V.C. et al., Cell 67:1251-1266 (1991); Leid, M. et al., Cell 68:377-395 (1992); Marks, M. S. et al., EMBO J. 11:1419-1435 (1992)), obwohl die Zugabe von 9C-RA die Bildung von RXR-Homodimeren in vitro zu erhöhen scheint (Lehman, J.M. et al., Science 258:1944-1946 (1992); Zhang, X.K. et al., Nature 358: 587-591 (1992b)). Dass RAR-RXR-Heterodimere, eher als die entsprechenden Homodimere, vorzugsweise an die RAREs in gezüchteten Zellen in vivo binden, wurde durch Experimente stark gestützt, die in Durand, B. et al., Cell 71:73-85 (1992) beschrieben sind.
Da bekannt ist, dass Retinolsäure die proliferativen und difterentiativen Funktionen von mehreren Säugetier-Zelltypen reguliert (Gudas, L.J. et al., (1994) In Sporn, M.B., Roberts, A.B. und Goodman, D.S. (Hrsg.), The Retinoids, 2. Auflage, Raven Press, New York, S. 443-520), werden Retinoide bei einer Vielfalt von chemopreventiven und chemotherapeutischen Einstellungen verwendet. Die Prävention von oralem, Haut- und Kopf- und Halskrebs bei Patienten, die für diese Tumoren gefährdet sind, wurde berichtet (Hong, W.K. et al., N. Engl. J. Med. 315:1501-1505 (1986); Hong, W. K. et al., N. Engl. J. Med. 323:795-801 (1990); Kraemer, K. H. et al., N. Engl. J. Med. 318:1633-1637 (1988); Bollag, W. et al., Ann. Oncol. 3:513-526 (1992); Chiesa, F. et al., Eur. J. Cancer B. Oral Oncol. 28:97-102 (1992); Costa, A. et al., Cancer Res. 54: Suppl. 7, 2032-2037 (1994)), und Retinoide werden bei der Therapie von akuter promyelocytischer Leukämie verwendet (Huang, M.E. et al., Blood 72: 567-572 (1988); Castaigne, S. et al., Blood 76:1704-1709 (1990); Chomienne, C. et al., Blood 76:1710-1717 (1990); Chomienne, C. et al., J. Clin. Invest. 88:2150-2154 (1991); Chen Z. et al., Leukemia 5:288-292 (1991); Lo Coco, F. et al., Blood 77:165701659 (1991); Warrell, R.P., Jr. et al., N. Engl. J. Med. 324: 1385-1393 (1991), Plattenepithelkarzinom der Zervix und der Haut (Verma, A. K., Cancer Res. 47:5097-5101 (1987); Lippman S. M. et al., J. Natl Cancer Inst. 84:235-241 (1992); Lippman S. M. et al., J. Natl Cancer Inst. 84:241-245 (1992)) und Kaposi-Sarkom (Bonhomme, L. et al., Ann. Oncol. 2:234-235 (1991)).
Zum Beispiel wird in Chen, J-Y et al., EMBO J. 14(6):1187-1197 (1995) eine Anzahl von dissoziierenden synthetischen Retinoiden charakterisiert, die die in der LBD von RARβ (βAF-2) anwesende AF-2 Aktivierungsfunktion selektiv induzierten. Die Autoren berichten auch, dass diese synthetischen Retinoide, wie RA, das Wachstum unabhängig von der Verankerung von Onkogen-transformierten 3T3-Zellen hemmen kann. Weiter wird der Promotor des menschlichen Interleukin-6 (IL-6)-Gens, dessen Produkt bei der Regulation der Hämatopoese, den Immunreaktionen und der Entzündung einbezogen wird (Kishimoto, T. et al., Science 258:593-597 (1992)), durch die RA induziert, aber nicht durch die ,dissoziierenden^` Retinoide, die seine Aktivität unterdrückten.
Neben den Retinoid-Rezeptoren wurden auch Verbindungen mit agonistischen und antagonistischen Eigenschaften auf Funktionen der Steroidrezeptoren gemeldet. Zum Beispiel wurde in Meyer, M-E. et al., EMBO J. 9(12):3923-3932 (1990) eine vorübergehende Expression/ein Gel-Retardations-System verwendet, um die Wirkungen von RU486 und R5020 auf die Glucocorticoid- und Progesteron-Rezeptor-Funktion zu studieren. Weiter wurde in Halachimi, S. et al., Science 264:1455-1458 (1994) gezeigt, dass Tamoxifen das Estradiol-induzierte ERAP160-Binden an den Östrogenrezeptor kompetitiv hemmt, was einen Mechanismus für seine wachstumshemmende Wirkungen bei Brustkrebs vorschlägt. Demgemäß gibt es wegen ihrer klinischen Wichtigkeit ein großes Interesse in der Entwicklung von Durchmusterungsverfahren, die in der Lage sind, den Agonisten und Antagonisten der Transaktivierung des nuclearen Rezeptors zu identifizieren.
Wie angezeigt, klonierten die gegenwärtigen Erfinder ein Gen, das TIF2 codiert, und zeigten, dass TIF2 und ein cytoplasmatisches Fragment davon auf eine Agonisten-abhängige Weise an alle analysierten nuclearen Rezeptoren binden – RAR, RXR, ER, TR, VDR, GR und AR. Weiter zeigten die gegenwärtigen Erfinder, dass TIF2-Polypeptide Transkiptionsmediatoren des nuclearen Rezeptors AF-2 sind. Demnach stellt die vorliegende Erfindung weiter ein Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren eines nuclearen Rezeptor (NR)-Antagonisten bereit, der umfasst: (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle, die rekombinante Gene enthält, die ein Polypeptid, das eine NR-Liganden-bindende Domäne (LBD) umfasst, und ein Polypeptid, das transkriptionalen intermediären Faktor-2 (TIF-2) oder ein TIF-2-Fragment umfasst, exprimieren, wobei, in Anwesenheit eines Agonisten, der TIF-2 und das TIF-2-Fragment die NR-LBD binden; (b) das Verabreichen eines Kandidaten-Antagonisten an die Zelle; und (c) das Ermitteln, ob der Kandidaten-Antagonist entweder: (1) das TIF-2- oder TIF-2-Fragment-Binden an die AF-2 der NR-LBD, verglichen mit dem Binden in Abwesenheit des Kandidaten-Antagonisten; oder (2) die TIF-2- oder TIF-2-Fragment-stimulierte NR-LBD-AF-2-vermittelte Transaktivierung, verglichen mit der Transaktivierung in Abwesenheit des Kandidaten-Antagonisten reduziert.
In einem weiteren Aspekt wird ein Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren eines nuclearen Rezeptor (NR)-Agonisten bereitgestellt, der umfasst: (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle, die rekombinante Gene enthält, die ein Polypeptid, das eine NR-Liganden-bindende Domäne (LBD) umfasst, und ein Polypeptid, das transkriptionalen intermediären Faktor-2 (TIF-2) oder ein TIF-2-Fragment umfasst, exprimieren, wobei, in Anwesenheit eines Agonisten, der TIF-2 und das TIF-2-Fragment die NR-LBD binden; (b) das Verabreichen eines Kandidaten-Agonisten an die Zelle; und (c) das Ermitteln, ob der Kandidaten-Agonist entweder: (1) das TIF-2- oder TIF-2-Fragment-Binden an die AF-2 der NR-LBD, verglichen mit dem Binden in Abwesenheit des Kandidaten-Agonisten; oder (2) die TIF-2- oder TIF-2-Fragment-stimulierte NR-LBD-AF-2-vermittelte Transaktivierung, verglichen mit der Transaktivierung in Abwesenheit des Kandidaten-Agonisten erhöht.
Unter „einer Wirtszelle, die rekombinanten Gene umfasst" sind Wirtszellen zu verstehen, in die ein oder mehr der hierin beschriebenen rekombinanten Konstrukte eingebracht wurden, oder an ein Abkömmling solcher Wirtszellen.
Der Kandidaten-Antagonist und -Agonist gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten ,dissoziierende' Liganden für die nuclearen Rezeptoren wie jene, die beschrieben sind in Chen et al., EMBO J. 14:1187-1197 (1995) und Ostrowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1812-1816 (1995). Progesteron- und Glucocorticoid-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten sind beschrieben in Meyer et al., EMBO J. 9 (12): 3923-3932 (1990). Ein Östrogenrezeptor-Antagonist ist beschrieben in Halachmi et al., Science 264:1455-1458 (1994). Demnach sind auf dem Fachgebiet Verfahren zur Entwicklung von Kandidaten für Agonisten und -Antagonisten der nuclearen Rezeptoren zum Durchmustern gemäß der vorliegenden Erfindung bekannt. Zum Beispiel wurde die Kristallstruktur der Liganden bindenden Domänen von bestimmten nuclearen Rezeptoren beschrieben. Insbesondere ist die Kristallstruktur der RXR-LBD beschrieben in Bourguet et al., Nature 375:377-382 (1995); die Kristallstruktur der RAR-LBD ist beschrieben in Renaud et al., Nature 378: 681-689 (1995); und die Kristallstruktur eines Thyroidhormonrezeptors ist beschrieben in Wagner et al., Nature 378:690-697 (1995). Unter Verwendung der Information aus der Kristallstruktur eines nuclearen Rezeptors sind Computerprogramme zur Konstruktion der Struktur des Kandidaten-Agonisten und – Antagonisten, die wahrscheinlich an die Liganden bindende Domäne binden würden, erhältlich. Passende Computerprogrammpakete für diesen Zweck beinhalten WHAT IF (Vriend G., J. Mol. Graphics 8:52-56 (1990)) und GRID (Goodford, J. Med. Chem. 28:849-857 (1985)).
Rekombinante Gene, die ein Polypeptid codieren, das TIF2 oder ein TIF2-Fragment umfasst, die in der Lage sind, nucleare Rezeptoren auf eine Agonistenabhängige Weise zu binden, sind voranstehend beschrieben. Rekombinante Gene, die ein Polypeptid codieren, das eine NR-LBD umfasst, wurden sehr ausführlich auf dem Fachgebiet beschrieben. Verfahren zur Ermittlung, ob ein Kandidaten-Agonist oder -Antagonist das Binden von TIF-2- oder TIF-2-Fragment an einen NR erhöht oder beeinträchtigt, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel kann die Wirkung eines Kandidaten-Agonisten oder -Antagonisten auf das Binden von TIF2- oder TIF2-Fragment an eine NR-LBD unter Verwendung des Glutathion-S- Transferase (GST)-Interaktionsassays durch Markieren der NR-LBDs mit GST untersucht werden, wie ausführlich in dem experimentellen Abschnitt nachstehend und in Le Douarin et al., EMBO J 14: 2020-2033 (1995) beschrieben.
Wo die Wirkung eines Kanidaten-Agonisten oder -Antagonisten auf die NR-AF-2-Transaktivierung untersucht werden muss, werden die rekombinanten Gene vorzugsweise ein chimäres Polypeptid codieren, das eine NR-LBD umfasst, die mit einer DNA bindenden Domäne von einem Transaktivator-Protein fusioniert ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Wirtszelle, die die rekombinanten Gene exprimiert, auch ein Reportergen exprimieren. Zum Beispiel wurden in Chen et al., EMBO J. 14(6):1187-1197 (1995) drei ,Reporter'-Zelllinien etabliert, bei denen RARα-, RARβ- oder RARγ-Agonisten die Luciferase-Aktivität induzieren, die in den intakten Zellen unter Verwendung einer Einzelphoton-zählende Kamera gemessen werden kann. Diese Zelllinien exprimieren beständig chimäre Proteine, die die DNA-bindende Domäne des Hefe-Transaktivators GAL4, der mit den EF-Regionen (die die LBD und die AF-2-Aktivierungsfunktion enthalten) von RARa (GAL-RARa), RARß (GAL-RARß) oder RARγ (GAL-RARγ) fusioniert ist, und ein Luciferase-Reportergen, das von einem Pentamer der GAL4-Erkennungssequenz (,17m') vor dem β-Globin-Promotor (17mx5-G-Luc) angesteuert wird, enthalten. Das Reportersystem ist unempfindlich gegenüber endogenen Rezeptoren, die die GAL4-Bindungsstelle nicht erkennen können. Weitere Beispiele von Reportergenen und Reporter-Expressionsvektoren für die Anwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, um den Kandidaten-Agonisten und -Antagonisten von Retinoid-Rezeptoren zu durchmustern, werden in 6 bereitgestellt.
Die ER-Expressionsvektoren HEO, HE19 und HE15, die GR-Expressionvektoren HG1 und HG3 und die PR-Expression cPR1 und cPR3 sind beschrieben in Kumar et al., Cell 51: 941-951 (1987) und Gronemeyer et al., EMBO J. 6:3985-3994 (1987). Der GR-Expressionsvektor HG8 und der PR-Expressionsvektor cPR5A sind beschrieben in Bocquel et al., Nucl. Acids Res. 17:2581-2595 (1989). Reportergene für die voranstehend beschriebenen ER-, GR- und PR-Expressionsvektoren beinhalten MMTV-CAT (in dem Fall von PR und GR; Cato et al., EMBO J. 5:2237-2240 (1986)) und vit-tk-CAT (in dem Fall von ER; Klein-Hitpass et al., Cell 41: 1055-1061 (1986)).
Der TR-Expressionsvektor LexA-TR ist beschrieben in Lee et al., Nature 374:91-94 (1995), worin auch die Verwendung des Hefe-Zweihybridsystems beschrieben ist, um Verbindungen zu identifizieren, die die TR-Transaktivierung beeinflussen.
Noch weitere Literaturhinweise, die die Reporterplasmide offenbaren, die ein Reportergen und einen Expressionsvektor, der eine NR-LBD codiert, enthalten, beinhalten Meyer et al., Cell 57:433-442 (1989); Meyer et al., EMBO J. 9(12):3923-3932 (1990); Tasset et al., Cell 62:1177-1187 (1990); Gronemeyer, H. und Laudet, V., Protein Profile 2:1173-1308 (1995); Webster et al., Cell 54:199-207 (1988); Strähle et al., EMBO J. 7:3389-3395 (1988); Seipel et al., EMBO J. 11:4961-4968 (1992); und Nagpal et al., EMBO J. 12:2349-2360 (1993). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Wirkung eines Kandidaten-Agonisten oder – Antagonisten auf die NR-AF-2-vermittelte Transaktivierung untersucht gemäß des Verfahrens, das in der Legende zu 5 voranstehend beschrieben ist.
Die gegenwärtigen Erfinder identifizierten eine Aktivierungsdomäne von TIF2, AD1 (Aminosäuren 1010-1131, wie in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt), die die CBP-abhängige Transkriptionsaktivierungsfunktion von TIF2 vermittelt. Weiter zeigten die gegenwärtigen Erfinder, dass Polypeptide, die diese Aktivierungsdomäne enthalten, in der Lage sind, die Transkription über einen CBP-abhängigen Signalweg zu aktivieren, wenn sie mit einer DNA-bindenden Domäne eines Transkriptionsaktivators fusioniert sind. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung weiter ein Durchmusterungsverfahren bereit, um einen Agonisten der Aktivität der TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne zu identifizieren, das umfasst: (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle, die ein rekombinantes Gen oder Gene enthält, die ein Polypeptid, das eine Transkriptionsaktivator-DNA-bindende Domäne (DBD) und eine TIF-2-AD1-Aktivierungsdomäne 1 umfassen, exprimieren; (b) das Verabreichen eines Kandidaten-Agonisten an die Zelle; und (c) das Ermitteln, ob der Kandidaten-Agonist die Aktivität der TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne erhöht.
Die Erfindung liefert weiter ein Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren eines Antagonisten der Aktivität der TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne, das umfasst: (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle, die ein rekombinantes Gen oder Gene enthält, die ein Polypeptid, das eine Transkriptionsaktivator-DNA-bindende Domäne (DBD) und eine TIF-2-AD1-Aktivierungsdomäne 1 umfasst, exprimieren; (b) das Verabreichen eines Kandidaten-Antagonisten an die Zelle; und (c) das Ermitteln, ob der Kandidaten-Antagonist die Aktivität der TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne hemmt.
Unter „Transkriptionsaktivator" sind Moleküle zu verstehen, die den Transkriptionsstart durch RNA-Polymerase B (II) erhöhen. Transkriptionsaktivatoren beinhalten Hefe-Transkriptionsaktivatoren, wie GAL4 und GCN4; den Herpes simplex-Aktivator, VP16; und Mitglieder der nuclearer Rezeptor-Familie, die RAR, RXR, ER, TR, VDR, GR und AR beinhaltet.
Rekombinante Gene, die ein Polypeptid codieren, das eine TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne umfasst, werden nachstehend beschrieben. Rekombinante Gene, die ein Polypeptid codieren, das eine Transkriptionsaktivator-DBD umfasst, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Verfahren zum Ermitteln, ob ein Kandidaten-Agonist oder -Antagonist die Transkription erhöht oder beeinträchtigt, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel kann die Wirkung eines Kandidaten-Agonisten oder -Antagonisten auf die Aktivität der TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne unter Verwendung der CAT-Assays ermittelt werden, wie nachstehend und in Gronemeyer et al. (1987) und Bocquel et al., Nucl. Acids Res. (1989) beschrieben.
Wo die Wirkung eines Kandidaten-Agonisten oder -Antagonisten der Aktivität der TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne ermittelt werden muss, werden vorzugsweise rekombinante Gene ein chimäres Polypeptid codieren, das eine Transkriptionsaktivator-DBD umfasst, die mit einem TIF2-Polypeptid fusioniert ist, das die AD1-Aktivierungsdomäne umfasst. In einer weiteren Ausführungsform wird die Wirtszelle, die die rekombinanten Gene exprimiert, auch ein Reportergen exprimieren. Beispiele von Reportergenen sind voranstehend beschrieben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Wirkung eines Kandidaten-Agonisten oder -Antagonisten der Funktion der TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne ermittelt werden, wie in der Legende zu 7(c) beschrieben.
Die gegenwärtigen Erfinder identifizierten auch eine zweite Aktivierungsdomäne von TIF2, AD2 (Aminosäuren 1288-1464, wie in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigt), die die CBP-unabhängige Transkriptionsaktivierung vermittelt. Weiter zeigten die gegenwärtigen Erfinder, dass die Polypeptide, die diese Aktivierungsdomäne enthalten, in der Lage sind, die Transkription über einen CBP-unabhängigen Weg zu aktivieren, wenn sie mit einer DNA-bindenden Domäne des Transkriptionsaktivators fusioniert sind. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Durchmusterungsverfahren bereit, um einen Agonisten der Aktivität der TIF2-AD2-Aktivierungsdomäne zu identifizieren, das umfasst: (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle, die ein rekombinantes Gen oder Gene enthält, die ein Polypeptid exprimieren, das eine Transkriptionsaktivator-DNA-bindende Domäne (DBD) und eine TIF-2-AD2-Aktivierungsdomäne umfasst; (b) das Verabreichen eines Kandidaten-Agonisten an die Zelle; und (c) das Ermitteln, ob der Kandidaten-Agonist die Aktivität der TIF2-AD2-Aktivierungsdomäne erhöht.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren eines Antagonisten der Aktivität der TIF2-AD2-Aktivierungsdomäne zur Verfügung, das umfasst: (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle, die das rekombinante Gen oder Gene enthält, die ein Polypeptid exprimieren, das eine Transkriptionsaktivator-DNA-bindende Domäne (DBD) und eine TIF-2-AD2-Aktivierungsdomäne umfasst; (b) das Verabreichen eines Kandidaten-Antagonisten an die Zelle; und (c) das Ermitteln, ob der Kandidaten-Antagonist die Aktivität der TIF2-AD2-Aktivierungsdomäne hemmt.
Rekombinante Gene, die ein Polypeptid codieren, das eine TIF2-AD2-Aktivierungsdomäne umfassen, werden nachstehend beschrieben. Rekombinante Gene, die ein Polypeptid codieren, das eine Transkriptionsaktivator-DBD umfasst, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Verfahren zur Ermittlung, ob ein Kandidaten-Agonist oder -Antagonist die Transkription erhöht oder beeinträchtigt, sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Wo die Wirkung eines Kandidaten-Agonisten oder -Antagonisten der Aktivität der TIF2-AD2-Aktivierungsdomäne ermittelt werden muss, werden vorzugsweise rekombinante Gene ein chimäres Polypeptid codieren, das eine Transkriptionsaktivator-DBD umfasst, die mit einem TIF2-Polypeptid fusioniert ist, das die AD2-Aktivierungsdomäne umfasst. Die Transkriptionsaktivatoren sind voranstehend beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform wird die Wirtszelle, die die rekombinanten Gene exprimiert, auch ein Reportergen exprimieren. Beispiele von Reportergenen sind voranstehend beschrieben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Wirkung eines Kandidaten-Agonisten oder -Antagonisten der Aktivität der TIF2-AD2-Aktivierungsdomäne ermittelt werden, wie in der Legende zu 7(c) beschrieben.
TIF-2-Antikörper und Verfahren
TIF2-Antikörper werden auch durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, da sie spezifisch für ein TIF2-Protein, ein TIF2-Polypeptid, ein TIF2-Proteinfragment oder ein TIF2-Polypeptidfragment sind. Unter dem Begriff „Antikörper" sind zu verstehen, dass sie polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), chimäre Antikörper, anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper bis Antikörper, die in löslicher oder gebundener Form markiert werden können, sowie die Fragmente davon beinhalten, die durch eine bekannte Methode bereitgestellt werden, wie, aber nicht begrenzt auf enzymatische Spaltung, Peptidsynthese oder rekombinante Methoden. Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren von den mit Antigen immunisierten Tieren abgeleitet werden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine wesentlich homogene Population von Antikörpern, die spezifisch für Antigene sind, deren Population im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen enthalten. MAbs können durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden. S. zum Beispiel Kohler und Milstein, Nature 256:495-497 (1975); U.S.-Patent No. 4,376,110; Ausubel et al. Hrsg., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Assoc. und Wiley Interscience, N.Y., (1987-1996); und Harlow und Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Colligan et al., Hrsg., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. und Wiley Interscience, N.Y., (1992-1996), die Inhalte, von denen die Literaturhinweise vollkommen durch Literaturhinweis berücksichtigt sind.
Solche Antikörper können von einer beliebigen Immunglobulin-Klasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und einer beliebigen Unterklasse davon. Ein Hybridom, das einen mAb der vorliegenden Erfindung produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Erzeugung von hohen Titern der mAbs in vivo oder in situ macht dies zum derzeit bevorzugten Verfahren der Herstellung.
Chimäre Antikörper sind Moleküle, von denen verschiedene Anteile aus verschiedenen Tierarten abgeleitet werden, wie jene mit einer variablen Region, die aus einem Maus-mAb und einer menschlichen konstanten Immunoglobulin- Region abgeleitet werden, die hauptsächlich verwendet werden, um die Immunogenität bei der Anwendung zu reduzieren und die Ausbeuten bei der Herstellung zu steigern. Zum Beispiel, wo Maus-mAbs höhere Ausbeuten von Hybridomen haben, aber höhere Immunogenität bei Menschen, so dass chimäre mAbs des Menschen/der Maus verwendet werden. Chimäre Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind auf dem Fachgebiet bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Europäische Patentanmeldung 125023 (publiziert am 14. November 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., Europäische Patentanmeldung 171496 (1985); Morrison et al., Europäische Patentanmeldung 173494 (1986); Neuberger et al., PCT Application WO 86/01533, (1986); Kudo et al., Europäische Patentanmeldung 184187 (1986); Morrison et al., Europäische Patentanmeldung 173494 (1986); Robinson et al., PCT Publication PCT/US86/02269 (1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); und Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Diese Literaturhinweise sind durch Bezugnahme vollkommen hierin berücksichtigt.
Ein anti-idiotypischer (anti-ID) Antikörper ist ein Antikörper, der einzelne Determinanten erkennt, die allgemein mit der Antigen-bindenden Stelle des Antikörpers verbunden sind. Ein Id-Antikörper kann durch Immunisieren eines Tiers derselben Art und desselben genetischen Typs (z.B. Mausstamm) als Quelle des mAb mit dem mAb präpariert werden, an dem ein Anti-Id präpariert wird. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und auf sie durch Herstellung eines Antikörpers gegen diese idiotypischen Determinanten (den Anti-Id-Antikörper) reagieren. Siehe zum Beispiel U.S. patent No. 4,699,880, das hierin vollkommen durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Der Anti-Id-Antikörper kann auch als ein „Immunogen" verwendet werden, um eine Immunantwort in noch einem anderen Tier, das einen so genannten Anti-anti-ID-Antikörper herstellt, zu induzieren. Der Anti-anti-ID muss epitopisch identisch zu dem ursprünglichen mAb sein, der den Anti-Id induzierte. Demnach ist es unter Verwendung von Antikörpern gegen die idiotypischen Determinanten eines mAb möglich, andere Klone zu identifizieren, die Antikörper von identischer Spezifität exprimieren. Die Anti-Id-mAbs haben demnach ihre eigenen idiotypischen Epitope oder „Idiotope", die strukturell ähnlich zu dem Epitop sind, das evaluiert wird, wie das G RB-Protein-α.
Unter dem Begriff „Antikörper" ist auch verstehen, dass er beide intakten Immunglobulinmoleküle sowie Fragmente davon beinhaltet, wie zum Beispiel Fab und F(ab')₂, die in der Lage sind, Antigen zu binden. Den Fab und F(ab')₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie kommen schneller aus dem Kreislauf frei und können weniger unspezifische Gewebebindung haben als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Es wird geschätzt werden, dass Fab und F(ab')₂ und andere Fragmente der in der vorliegenden Erfindung brauchbaren Antikörper für den Nachweis und die Quantifizierung eines TIF2 gemäß der hierin offenbarten Verfahren für intakte Antikörpermoleküle verwendet werden können. Solche Fragmente werden normalerweise durch proteolytische Spaltung unter Verwendung von Enzymen wie Papain (um Fab-Fragmente herzustellen) oder Pepsin (um F(ab')₂-Fragmente herzustellen) hergestellt.
Ein Antikörper gilt als „in der Lage zum Binden" eines Moleküls, wenn er in der Lage ist, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Begriff „Epitop" bezieht sich auf den Anteil eines beliebigen Moleküls, der in der Lage ist, von einem Antikörper, der auch von dem Antikörper erkannt werden kann, gebunden zu werden. Epitope oder „antigene Determinanten" bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie Aminosäuren- oder Zucker-Seitenketten und haben spezifische dreidimensionale strukturelle Merkmale sowie spezifische Ladungsmerkmale.
Ein „Antigen" ist ein Molekül oder ein Anteil eines Moleküls, das in der Lage ist, von einem Antikörper gebunden zu werden, das zusätzlich in der Lage ist, ein Tier zu induzieren, den Antikörper herzustellen, der in der Lage ist, an ein Epitop dieses Antigens zu binden. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop haben. Die spezifische Reaktion auf die voranstehend Bezug genommen wird ist so zu verstehen, dass das Antigen auf eine hoch selektive Weise mit seinem entsprechenden Antikörper reagieren wird und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, die durch andere Antigene hervorgerufen werden können.
Die in der vorliegenden Erfindung brauchbaren Antikörper oder Fragmente der Antikörper können verwendet werden, um quantitativ oder qualitativ ein TIF2-Protein, -Polypeptid oder -Fragment in einer Probe nachzuweisen oder die Anwesenheit von Zellen nachzuweisen, die einen TIF2 der vorliegenden Erfindung exprimieren. Dies kann durch Immunfluoreszenz-Methoden erreicht werden, die einen fluoreszenzmarkierten Antikörper (s. nachstehend) anwenden, der mit lichtmikroskopischem, durchflusscytometrischem oder fluorometrischem Nachweis gekoppelt ist.
Die in der vorliegenden Erfindung brauchbaren Antikörper (oder Fragmente davon) können histologisch verwendet werden, wie in Immunfluoreszenz- oder Immun-Elektronenmikroskopie, zum in situ-Nachweis eines TIF2-Proteins, -Polypeptids oder -Fragment der vorliegenden Erfindung. Der in situ-Nachweis kann durch Entfernen einer histologischen Probe von einem Patienten und dem Bereitstellen eines markierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung zu solch einer Probe durchgeführt werden. Der Antikörper (oder das Fragment) wird vorzugsweise durch Anwenden oder durch Überlagern des markierten Antikörpers (oder Fragments) mit einer biologischen Probe bereitgestellt. Durch die Anwendung einer solchen Prozedur ist es möglich, nicht nur die Anwesenheit eines TIF2-Proteins, -Polypeptids oder -Fragments, sondern auch seine Verteilung in dem untersuchten Gewebe zu ermitteln. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung wird der durchschnittliche Fachmann leicht erkennen, dass eine beliebige der weiten Vielfalt von histologischen Verfahren (wie Färbeprozeduren) modifiziert werden kann, um einen solchen in situ-Nachweis zu erzielen.
Solche Assays für ein TIF2-Protein, -Polypeptid oder -Fragment der vorliegenden Erfindung umfasst normalerweise das Inkubieren einer biologischen Probe, wie einer biologische Körperflüssigkeit, eines Gewebeextrakts, frisch geernteter Zellen wie Lymphozyten oder Leukozyten, oder Zellen, die in Gewebekultur inkubiert wurden, in Anwesenheit eines nachweisbar markierten Antikörpers, der in der Lage ist, ein TIF2-Protein, -Polypeptid oder -Fragment zu identifizieren und den Antikörper durch eine beliebige einer Anzahl von auf dem Fachgebiet gut bekannten Methoden nachzuweisen.
Die biologische Probe kann mit einer Festphasen-Unterstützung oder einem Festphasen-Träger wie Nitrocellulose, oder einer/einem anderen festen Unterstützung oder Träger, die/der in der Lage ist, Zellen, Zellpartikel oder lösliche Proteine zu immobilisieren, behandelt werden. Die Unterstützung oder der Träger kann dann mit passenden Puffern gewaschen werden, gefolgt durch die Behandlung mit einem nachweisbar markierten TIF2-spezifischen Antikörper. Die Festphasen-Unterstützung oder der Festphasen-Träger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Menge des gebundenen Markers auf der festen Unterstützung oder dem festen Träger kann dann durch konventionelle Mittel nachgewiesen werden.
Mit „Festphasen-Unterstützung", „Festphasen-Träger", „feste Unterstützung", „fester Träger", „Unterstützung" oder „Träger" ist eine beliebige Unterstützung oder ein beliebiger Träger beabsichtigt, der/die in der Lage ist, ein Antigen oder Antikörper zu binden. Gut bekannte Unterstützungen oder Träger beinhalten Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylonamylasen, natürliche und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit. Die Beschaffenheit des Trägers kann entweder zu einem gewissen Ausmaß löslich oder für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unlöslich sein. Das Unterstützungsmaterial kann praktisch eine beliebige mögliche strukturelle Anordnung haben, solange das gekoppelte Molekül in der Lage ist, an ein Antigen oder einem Antikörper zu binden. Demnach kann die Anordnung der Unterstützung oder des Trägers spherisch, wie in einem Kügelchen, oder zylindrisch, wie in der inneren Oberfläche eines Teströhrchen oder der äußeren Oberfläche eines Stabs, sein. Anderenfalls kann die Oberfläche flach sein wie bei einem Blatt, Teststreifen usw. Bevorzugte Unterstützungen oder Träger beinhalten Polystyrol-Kügelchen. Der Fachmann wird viele andere passende Träger zum Binden von Antikörper oder Antigen kennen oder werden das Gleiche durch Verwendung von Routine-Experimentieren herausfinden können.
Die Bindungsaktivität einer gegebenen Menge von Anti-TIF2-Antikörpern kann gemäß gut bekannten Verfahren ermittelt werden. Der Fachmann wird die wirksamen und optimalen Assay-Bedingungen für jede Bestimmung durch Anwenden von Routine-Experimentieren ermitteln können. Andere solche Schritte wie Waschen, Rühren, Schütteln, Filtern und desgleichen können den Assays angefügt werden, wie es für die besondere Situation gebräuchlich oder notwendig ist.
Einer der Wege, bei denen ein TIF2-spezifischer Antikörper nachweisbar markiert werden kann, ist durch Verbinden desselben mit einem Enzym und die Verwendung in einem Enzymimmunoassay (EIA). Wenn es später einem geeigneten Substrat ausgesetzt wird, wird dieses Enzym wiederum mit dem Substrat derart reagieren, dass es einen chemischen Rest erzeugt, der zum Beispiel durch spektrophotometrische, fluorometrische oder durch visuelle Mittel nachgewiesen werden kann. Enzyme, die verwendet werden können, um den Antikörper nachweisbar zu markieren, beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf, Malatdehydrogenase, Staphylococcen-Nuclease, delta-5-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, alpha-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphat-Isomerase, Meerrettich-Peroxidase, Alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuclease, Unease, Katalase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase. Der Nachweis kann durch colorimetrische Verfahren erreicht werden, die ein chromogenes Substrat für das Enzym verwenden. Der Nachweis kann auch durch visuellen Vergleich des Ausmaßes der enzymatischen Reaktion eines Substrats im Vergleich mit ähnlich präparierten Standards erreicht werden.
Der Nachweis kann durch Verwendung eines beliebigen von einer Vielfalt von anderen Immunoassays erreicht werden. Zum Beispiel ist es durch Radioaktivitätsmarkierung der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, die R-PTPase durch die Verwendung eines Radioimmunoassays (RIA) nachzuweisen. Eine gute Beschreibung des RIA kann gefunden werden in Laboratory Techniques and Bio chemistry in Molecular Biology, von Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) mit einem besonderen Literaturhinweise zu dem Kapitel, mit dem Titel "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von Chard, T., hierin berücksichtigt durch Literaturhinweis. Das radioaktive Isotop kann durch solche Mittel wie die Verwendung eines γ-Zählers oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie nachgewiesen werden.
Es ist auch möglich, einen Anti-TIF2-Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn der fluoreszenzmarkierte Antikörper Licht von geeigneter Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine Anwesenheit auf Grund der Fluoreszenz nachgewiesen werden. Unter den meisten allgemein verwendeten Verbindungen für die Fluoreszenzmarkierung sind Fluorescein Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Der Antikörper kann auch nachweisbar unter Verwendung von Fluoreszenzemittierenden Metallen wie ¹⁵²EU oder andere der Lanthanidenreihe nachgewiesen werden. Diese Metalle können an den Antikörper unter Verwendung von solchen Metallchelat-bildenden Gruppen wie Diethylentriaminpentaessigsäure (EDTA) angehängt werden.
Der Antikörper kann auch nachweisbar durch Kopplung mit einer chemilumineszierenden Verbindung markiert werden. Die Anwesenheit eines chemilumineszent-markierten Antikörpers wird dann durch Nachweis der Anwesenheit von Lumineszenz ermittelt, die während des Verlaufs einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele von besonders brauchbaren chemilumineszentmarkierenden Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
Ebenso kann eine biolumineszente Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art der Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen gefunden wird, bei denen ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion steigert. Die Anwesenheit eines biolumineszenten Proteins wird durch Nachweis der Anwesenheit von Lumineszenz ermittelt. Wichtige biolumineszente Verbindungen für Markierungszwecke sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Ein Antikörpermolekül der vorliegenden Erfindung kann für den Gebrauch in einem immunometrischen Assay angepasst werden, auch bekannt als „Two-Site" oder „Sandwich"-Assay. In einem typischen immunometrischen Assay wird eine Anzahl von unmarkierten Antikörper (oder Antikörperfragment) an eine feste Unterstützung oder einen festen Träger gebunden und eine Anzahl von nachweisbar markierten löslichen Antikörper wird zugegeben, um den Nachweis und/oder die Quantifizierung des ternären Komplexes, der zwischen Festphasen-Antikörper, Antigen und markiertem Antikörper gebildet wird, zu erlauben.
Typische und bevorzugte immunometrische Assays beinhalten „Forward" Assays, bei denen der an die feste Phase gebundene Antikörper zuerst mit der zu testenden Probe in Kontakt gebracht wird, um das Antigen aus der Probe durch Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplex zu extrahieren. Nach einer passenden Inkubationsdauer wird die feste Unterstützung oder der feste Träger gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe zu entfernen, einschließlich nicht umgesetztes Antigen, wenn überhaupt, und dann mit der Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge des markierten Antikörpers (der als ein „Reportermolekül" fungiert) enthält. Nach einer zweiten Inkubationsdauer, um dem markierten Antikörper zu ermöglichen, einen Komplex mit dem an die feste Unterstützung oder an den festen Träger durch den unmarkierten Antikörper gebundenen Antigen zu bilden, wird die feste Unterstützung oder der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um den nicht reagierten markierten Antikörper zu entfernen.
In einem anderen Typ von „Sandwich-"Assay, der auch mit den Antigenen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, werden die so genannten „simultanen" und „reversen" Assays verwendet. Ein „simultaner" und ein „reverser" Assay werden verwendet. Ein simultaner Assay umfasst einen einzelnen Inkubationsschritt, indem der an die feste Unterstützung oder den festen Träger gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide zu derselben Zeit zu der zu testenden Probe zugegeben werden. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, wird die feste Unterstützung oder der feste Träger gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe und nicht komplexierten markierten Antikörper zu entfernen. Die Anwesenheit des markierten Antikörpers, verbunden mit der festen Unterstützung oder dem festen Träger, wird dann ermittelt, wie in einem konventionellen „Forward" Sandwich-Assay.
Bei dem „reversen" Assay wird die schrittweise Zugabe erst einer Lösung von markiertem Antikörper zu der flüssigen Probe, gefolgt durch die Zugabe von nicht markiertem Antikörper, der an eine feste Unterstützung oder einen festen Träger gebunden ist, nach einer passenden Inkubationsdauer angewendet. Nach einer zweiten Inkubation wird die feste Phase auf konventionelle Art und Weise gewaschen, um sie von dem Rest der zu testenden Probe und der Lösung von nicht umgesetzten markierten Antikörpern zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers verbunden mit einer festen Unterstützung oder einen festen Träger wird dann ermittelt wie in den „simultanen" und „Forward" Assays.
Nach allgemeiner Beschreibung der Erfindung wird dieselbe durch Verweis zu den folgenden Beispielen, die durch Veranschaulichung bereitgestellt werden und nicht als Begrenzung beabsichtigt sind, leichter verstanden werden.
Beispiel 1: TIF2-Klonierung und -Expression
In Übereinstimmung mit früheren Berichten (Halachmi, S. et al., Science 264:1455-1458 (1994); Cavailles, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10009-10013 (1994); Kurokawa, R. et al, Nature 377:451-454 (1995)), beobachteten wir in vitro ein Agonisten-abhängiges Binden von einem 160-kDa-Protein von ³⁵S-markierten Gesamtzellextrakten (HeLa, Cos-1, P19.6, MCF-7) mit den Glutathion-S-Transferase (GST)-markierten LBDs von Retinolsäure (RAR)- und Östrogen (ER)-Rezeptoren (2a). Ein cDNA-Klon, der durch Durchmustern von 340,000 Klone der menschlichen Plazenta-cDNA-Expressionsbibliothek mit einer Estradiol (E2)-gebundenen ³²P-markierten ER(DEF)-Sonde identifiziert wurde, codierte ein Proteinfragment (TIF2.1), das auf Far-Western-Blots mit drei unterschiedlichen ³²P-markierten NR-LBDs (ER, RAR, RXR) auf eine Agonisten-abhängige Weise interagierte (nicht gezeigt), und könnte daher dem voranstehenden 160-kDa-Protein entsprechen. Die TIF2 codierende Sequenz (3a), vorausgegangen durch in-Raster-Stopp-Codons 5' des Initiators AUG, wurden beim Wieder-Durchmustern mit einer TIF2.1-cDNA-Sonde erhalten. Menschliche TIF2-cDNA codiert ein 159,160 Da-Protein (1,464 Aminosäuren), das N-terminale vermeintliche nucleare Lokalisierungssignale (NLSs), eine Gln- und drei Ser/Thr-reiche Regionen und zwei geladenen Cluster beinhaltet (3). Einige Regionen von TIF2 zeigen signifikante Sequenzähnlichkeiten mit dem neulich beschriebenen (Onate, S.A. et al., Science 270:1354-1357 (1995)) Steroidrezeptor-Coaktivator SRC-1 (3). TIF2 scheint weit exprimiert zu werden, da das entsprechende Transkript in mehreren menschlichen Geweben gefunden wurde, obgleich zu einem viel niedrigeren Niveau in der Niere (2c und nicht gezeigt).
Immunodepletion-Studien unterstützen stark, dass TIF2 eine 160-kDa-Proteinspezies ist, die auf eine Agonisten-abhängige Weise mit den NR-LBDs interagiert (s. voranstehend und Halachmi, S. et al., Science 264:1455-1458 (1994); Cavailles, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10009-10013 (1994); und Kurokawa, R. et al., Nature 377:451-454 (1995)). Das Western-Blotting mit einem Kaninchen-Antiserum (pα-TIF2), das gegen bakteriell exprimiertem TIF2.1 ansprach, offenbarte überwiegend ein 160-kDa-HeLa-Zellprotein, das mit dem Agonist gebundenen GST-ER(DEF) interagierte (2b, Spuren 1 und 2; s. auch die Legende zu 2b). Die Immunodepletion mit einem monoklonalen TIF2-Antikörper der Maus (mα-TIF2) vor der Affinitätsaufreinigung führte zu einer spezifischen Abnahme von TIF2-, aber nicht von TIF1-Mengen (Le Douarin, B. et al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995)), die an E2-gebundenem GST-ER(DEF) zurückgehalten wurden (2b, vgl. Spuren 2 mit 4 und 6 mit 8). Wichtigerweise offenbarte die nachfolgende Far-Western-Analyse mit einer E2-gebundenen ³²P-GST-ER(DEF)-Sonde die 160-kDa-Spezies nur in der Kontrolle, aber nicht in den TIF2-immunodepletierten Extrakten (2b, vgl. Spuren 10 und 12).
Vorübergehend exprimiertes TIF2 von ganzer Länge war nuclear und hauptsächlich mit diskreten Körpern verbunden (4a). Da das überexprimierte TIF2.1-Fragment im Wesentlichen cytoplasmatisch war (was die voranstehende Zuordnung eines N-terminalen TIF2-NLS stützt), konnte die Interaktion von TIF2.1 mit NRs in Säugetierzellen unter Verwendung von nuclearen Co-Translokalisierungsassays untersucht werden. Bei Abwesenheit des Liganden blieb TIF2.1 cytoplasmatisch und die NRs waren nuclear (für RARa, ER und PR, s. 4b, 4d, 4g). Die Agonisten-Aussetzung führte jedoch bei allen drei Fällen zu nuclearer Colokalisierung von TIF2.1 und NR, was die NR-TIF2-Interaktion in vivo anzeigte (4c, 4e, 4h). Agonisten-abhängige Interaktion von TIF2.1 mit NRs wurde für alle anderen analysierten Rezeptoren (RXR, TR, VDR, GR und AR; nicht gezeigt) beobachtet. Interessanterweise wurde keine Interaktion zwischen ER und TIF2.1 in Anwesenheit des ER-AF-2-Antagonisten Hydroxytamoxifen (OHT) (4f) nachgewiesen, und der PR-AF-2-Antagonist RU 486 kehrte die R5020-induzierte PR-TIF2.1-Interaktion um (4i).
In Übereinstimmung mit den Far-Western-Blot-Experimenten interagierten NRs und TIF2 direkt, wie das aufgereinigte gebundene TIF2.1-Protein in vitro in der Anwesenheit eines Agonisten mit GST-ER(DEF), GST-RARa(DEF), GST-RXRa(DE) und GST-TR(DE) (4k, 4l, 4m, Spuren 3 und 4; 4n, Spuren 5 und 6). Wie erwartet, geschah das TIF2-Binden an GST-RXRα(DE) mit 9cis-RA (9C-RA), aber nicht mit all-trans-RA (T-RA) (4n, Spuren 1 und 2), und OHT verhinderte das E2-abhängige Binden von TIF2 an GST-ER(DEF) (4n, Spuren 7-9). Die Integrität des konservierten Kernstücks der ER, RARα und RXRα-AF-2 aktivierenden Domänen (AF-2 AD), von denen gezeigt wurde, dass sie entscheidend für die AF-2- Aktivität sind (Le Douarin, B. et al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995); Danielian, P.S. et al., EMBO J. 11:1025-1033 (1992); Durand, B. et al., EMBO J. 13:5370-5382 (1994); und Gronemeyer, H. und Laudet, V., Protein Profile 2:1173-1308 (1995) und darin), wurde für die TIF2-Interaktion in vitro benötigt. Die meisten AF-2-AD-Kernstückmutanten, die die AF-2-Aktivität verloren (ER, 4k, Spuren 5-8; RARa, 4l; Spuren 5-10; RXRa, 4m, Spuren 5-8), assoziierten nicht nachweisbar oder nur schwach mit TIF2, während die GST-LBD-Verbindung der RXRα-Mutante E461Q, deren AF-2 nur teilweise geschwächt ist (Le Douarin, B. et al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995)), noch eine signifikante RA-abhängige Interaktion mit TIF2.1 in vitro aufwies (4m, Spuren 9 und 10). Keine signifikante Interaktion von TIF2.1 wurde mit entweder GST-VP16 (saure Aktivierungsdomäne), GST-TBP, GST-TFIIB oder einer Reihe von GST-TAFs (hTAF_II18, hTAF_II20, hTAF_II28 und hTAF_II55; s. Jacq, X. et al., Cell 79:107-117 (1994); Mengus, G. et al., EMBO J. 14:1520-1531 (1995)) beobachtet (nicht gezeigt).
Bezeichnenderweise könnte ein TIF, der in der Lage ist, die Transkriptionsaktivität eines verwandten AF zur Transkriptionsmaschinerie zu vermitteln, selbst ein Aktivator sein, wenn er mit einer heterologen DNA-bindenden Domäne fusioniert ist. Interessanterweise transaktivierte in vorübergehend transfizierten HeLa-Zellen TIF2.1, der mit der GAL4-DNA-bindenden Domäne fusioniert ist, stark einen GAL4-Reporter (5a). Demnach kann TIF2 einem der hypothetischen begrenzenden Faktoren) entsprechen, die früher vorgeschlagen wurden, bei der/dem NR transkriptionalen Interferenz/Squelching einbezogen zu sein (Meyer, M.-E. et al., Cell57:433-442 (1989); Bocquel, M.-T. et al., Nucl. Acids. Res. 17:2581-2595 (1989); Tasset, D. et al., Cell 62:1177-1187 (1990)). Unter Unterstützung dieser Möglichkeit zeigten „Anti-Squelching"-Experimente, dass die Expression von TIF2.1 in ER-transfizierten Zellen die transkriptionale Autointerferenz zumindest teilweise umkehren konnten (Bocgel, M.-T. et al., Nucl. Acids. Res. 17:2581-2595 (1989)), die durch Exprimieren erhöhter Mengen von ER erzeugt wurde (5b; beachten Sie die markierte Verschiebung der glockenförmigen Aktivierungskurve zu höheren ER-Konzentrationen in der Anwesenheit von TIF2.1). Bei hohen ER-Expressionsniveaus nahm die TIF2.1-stimulierte Transaktivierung ab, möglicherweise auf Grund von Squelching oder anderer vermeintlicher Mediatoren (Jacq, X. et al., Cell 79:107-117 (1994); Lee, J.W. et al., Nature 374:91-94 (1995); Le Douarin, B. et al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995); vom Baur, E. et al., EMBO J. 15:110-124 (1996); Lee, J.W. et al., Endocrinology 9:243-254 (1995); Cavailles, V. et al., EMBO J. 14:3741-3751 (1995); Onate, S.A. et al., Science 270:1354-1357 (1995)) und/oder Transkriptionsfaktoren.
Wie erwartet, führte die Coexpression von TIF2.1 mit Antagonist-gebundenem NR nicht zu einer beliebigen Stimulation der Transaktivierung, die durch AF-1 in der Anwesenheit von reinen AF-2-Antagonisten bewirkt wird (Berry, M. et al., EMBO J. 9:2811-2818 (1990); Meyer, M.E. et al., EMBO J. 9:3923-3932 (1990)), die weiter stützen, dass TIF2 AF-2-spezifisch ist (5b und 5e für ER, OHT; 5d für PR, RU486). Die TIF2-Expression steigerte auch die AF-2/Agonisten-vermittelte Transaktivierung durch die Androgen (AR)- und Progesteron (PR)-Rezeptoren, aber nicht die Transaktivierung durch GAL-VP16 und GAL-AP2 (5c). Unter ähnlichen Bedingungen waren die Transaktivierungen durch GAL-RAR, GAL-RXR, GAL-VDR, GAL-TR und GAL-GR durch TIF2 unbeeinflusst (5c, und nicht gezeigt), was vorschlägt, dass für diese NRs entweder TIF2 nicht entscheidend bei der Vermittlung ihrer AF-2-Aktivitäten einbezogen wird oder endogene TIF2-Mengen ausreichend sind, um die Transaktivierung optimal zu unterstützen, weil TIF2 zum Beispiel eine höhere Affinität zu diesen Rezeptoren hat. Die TIF2-Stimulation wird zu einigem Ausmaß durch die Promotorumgebung des reagierenden Gens beeinflusst, wie die TIF2-Wirkung auf die PR/5020-induzierte Transaktivierung für einen Komplex (MMTV) größer war als für einen minimalen (GRE-TATA) Promotor, obwohl der letztere auch reproduzierbar stimuliert wurde (5d). Wie von den unterschiedlichen Niveaus der TIF2-Transkripte in verschiedenen Geweben erwartet (2c), war die Wirkung von TIF2 Zelltyp-abhängig, da TIF2 eine viel stärkere Wirkung auf die PR- und ER-induzierte Transaktivierungen in Cos-1 als in HeLa-Zellen hatte (5d, 5e).
Das Squelching (Meyer, M.-E. et al., Cell 57: 433-442 (1989); Bocquel, M.-T. et al., Nucl. Acids Res. 17:2581-2595 (1989); Tasset, D. et al., Cell 62: 1177-1187 (1990)) und strukturelle Studien (Bourguet, M. et al., Nature, 375:377-382 (1995); Benaud, J.-P. et al., Nature 378: 681-689 (1995); Wagner, R.L. et al., Nature 378:690-697 (1995); Wurtz, J.-M. et al., Nature Struct. Biol. 3:87-94 (1996)) stützten ein Modell, bei dem das Binden des Liganden an die LBD der NRs zu Konformationsänderungen führt, die die Oberfläche(n) erzeugten, die für die Interaktion mit den transkriptionalen intermediären Faktoren (TIFs/Mediatoren), die die AF-2-Aktivität zur Transkriptionsmaschinerie übertragen, benötigt werden. Begreifenderweise sollten solche Mediatoren die folgenden Eigenschaften aufweisen: (i) sie sollten an Agonist-, aber nicht an Antagonist-gebundene NR-LBDs binden, (ii) ihr Binden sollte durch Mutationen, die die AF-2-Aktivität aufheben, vermieden werden, (iii) sie sollten gemeinsam (eine) Transaktivierungsfunktion(en) aufweisen, (iv) ihre Expression sollte das AF-2-Autosquelching erleichtern, und (v) ihre Überexpression sollte die Aktivität von AF-2 stimulieren, wann immer sie in begrenzenden Mengen anwesend sind. Die vorliegende Studie ist der erste Bericht eines echten Mediators von NR AF-2, der alle diese Eigenschaften aufweist.
Beispiel 2: Herstellung von TIF2-Antikörpern
Die folgenden TIF2-Antikörper wurden unter Verwendung bekannter Methoden hergestellt, wenn nicht andererseits nachstehend spezifiziert. S. z.B. Ausubel et al., Hrsg. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Assoc. und Wiley Interscience, N.Y., (1987-1996); Harlow und Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988); und Colligan et al., Hrsg., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. und Wiley Interscience, N.Y., (1992-1996), die Inhalte, von denen die Literaturhinweise hierin vollkommen durch Literaturhinweis berücksichtigt sind.
Polyklonale Antikörper.
Die TIF2.1 codierende Sequenz (Aminosäuren 624-1287) wurde in pET15b kloniert und das resultierende Plasmid in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) transformiert. Nach Überexpression des (His)₆-TIF2.1-Proteins wurden die Bakterien lysiert und das Protein aus dem Rohextrakt über Affinitätschromatographie auf einer chelatbildenden HiTrap-Säule (Pharmacia) aufgereinigt, wie beschrieben (s. Bourguet et al., Prot. Expr. Purif. 6:604-608 (1995) für technische Details). Aliquots des gereinigten Proteins (50μg) in Emulsion (Freundsches Adjuvans) wurden (nur einmal) in ein Neuseeland-Kaninchen unter Verwendung eines Multisite-intradermalen Injektionsprotokolls injiziert. Antiseren, die von fortlaufenden Bleeds erhalten wurden, offenbarten eine einzelne Bande von etwa 160 kDa auf den Western-Blots der Extrakte aus Cos-1 Zellen, die mit einem TIF2-Expressionsvektor von ganzer Länge transformiert wurden.
Monoklonale Antikörper.
Ein 20mer-Aminosäurepeptid von TIF2 (mit einem angefügten C-terminalen Cystein) wurde auf der Grundlage seiner möglichen immunogenen Merkmale in Begriffen von hydrophiler Eigenschaft, Flexibilität, Oberflächenwahrscheinlichkeit und des ,antigenen Indexes' gemäß den Software-Programmen Plot und Peptidestructure aus dem GCG-Paket ausgewählt.
Das ausgewählte Peptid entspricht dem N-terminalen Fragment, das von einer anfänglich isolierten TIF2-Teil-cDNA codiert wurde (die die Aminosäuren 624 bis 1287 codiert) und entspricht den Aminosäuren 624 bis 643 des gesamten Proteins (SEQ ID NO:2):
Das Peptid wurde an Ovalbumin über das zusätzliche Cystein unter Verwendung des MBS heterobifunktionalen Crosslinkers gekoppelt. Die Injektionen wurden in BALB/c-Mäusen intraperitoneal und intravenös durchgeführt.
Milzzellen von den immunisierten Mäusen wurden mit Sp2/0 Ag14-Myelom fusioniert. Wachsende Hybridome wurde zuerst durch ELISA unter Verwendung des rekombinanten TIF2.1-Proteins und des freien Peptids durchmustert. Positive Kulturen wurden dann durch Immunozytofluoreszenz auf Cos-Zellen, die mit TIF2.1 (in dem pSG5-Vektor) transfiziert waren, sowie durch Western-Blot unter Verwendung der transfizierten Cos-Zellextrakte und nuclearen HeLa-Extrakte getestet. Die positiven Kulturen wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, das TIF2.1-Protein aus den Cos-transfizierten Zellen zu immunopräzipitieren.
Kulturen wurden zweimal auf weichem Agar kloniert. 5 Hybridome wurden etabliert, 4, die IgG₁, κ und 1 der IgG_2a, κ-Antikörper absonderten, wie in der Tabelle gezeigt:
Beispiel 3: Identifizierung von TIF2-NID
Die ganze rekombinante DNA-Arbeit wurde gemäß Standardprozeduren durchgeführt (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1993)). Die GST-Verbindungen der nuclearen Rezeptoren wurden aus den folgenden früher beschriebenen Plasmiden exprimiert: GST (pGEX2T; Pharmacia), GST-ER (pGEX2T-hERα(DEF), auch pGEX2THE14G genannt, Aminosäuren 282-295), GST-RXR (pGEX2T-mRXRa(DE), Aminosäuren 205-467) und GST-RAR (pGEX2T-hRARα(DEF), Aminosäuren 153-462) (alle LeDourain, B. et al., EMBO J. 14:2020-2033 (1995a)).
Um die TIF2-NR-Interaktionsdomäne (NID) weiter zu beschreiben, studierten wir die Interaktion zwischen einer Reihe von TIF2-Deletionsmutanten und den ER- oder RARa-LBDs unter Verwendung von GST-Fusionsprotein-basierten in vitro-Assays. In beiden Fällen wurde eine NID auf die zentrale Region von TIF2 abgebildet (Aminosäuren 624-869 in der Mutante TIF2.5; s. 7a und 7b). Keine zusätzliche NID konnte in den N- oder C-Termini von TIF2 identifiziert werden (7a und 7b; Mutanten TIF2.0, TIF2.2 und TIF2.7). Beachten Sie, dass dagegen SRC-1, ein Paralog von TIF2, offenbar zwei unterschiedliche nichtaufeinanderfolgende NIDS beherbergt, die in den zentralen und C-terminalen Regionen gelegen sind (Oñate, S.A. et al., Science 270:1354-1357 (1995); Yao, T.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10626-10631 (1996); Zhu, Y. et al., Gene Expression 6: 185-195 (1996)).
Um die TIF2-NID weiter einzugrenzen, wurde TIF2.5 C-terminal zu Pro 775 gekürzt, was TIF2.34 ergab, der auch mit den ER und RARa-LBDs auf eine Liganden-abhängige Weise interagierte (8a und 8c). Auf weitere Kürzung zu Ser697 interagierte die resultierende Mutante noch sowohl mit den ER- als auch mit RARa-LBDs, aber überraschenderweise wurde eine Liganden-abhängige Interaktion auch mit TIF2.36 (8a und 8c) gefunden, das demnach anzeigt, dass die TIF2-NID aus mindestens zwei unabhängigen NO-interagierenden Molekülen zusammengesetzt ist.
Eine Angleichung der TIF2-NID-Aminosäuresequenz, die im TIF2.34 vorhanden ist, mit der entsprechenden Region von SRC-1 (Oñate, S.A. et al., Science 270:1354-1357 (1995)) offenbarte drei hoch konservierte Regionen (8a). Interessanterweise enthalten alle drei das Motiv LxxLL (SEQ ID NO:12)(8b), das ursprünglich in der so genannten „nuclearer Rezeptor-Box" (NR-Box) von TIF1α identifiziert wurde, wie das LxxLLL (SEQ ID NO:13)-Motiv, das auch in RIP140 anwesend war (Cavailles, V. et al., EMBO J. 14:3741-3751 (1995)) und TRIP3 (Lee, J.W. et al. (1995)) (s. LeDouarin, B. et al., EMBO J. 15:6701-6715 (1996) und 8b). Wichtigerweise waren die 10-Aminosäuren-Sequenzen, die die TIF1α- oder RP140-NR-Boxen umfassten, ausreichend für die funktionelle Interaktion mit RXR auf eine Liganden- und AF-2-AD-Integrität-abhängige Weise, und die Mutation der Leucine an Position 4 und 5 (LL → AA) des LxxLLL (SEQ ID NO:13)-Motivs von TIF1α hob die TIF1α-RXR-Interaktion auf (LeDouarin, B. et al., EMBO J. 15: 6701-6715 (1996)). Die Funktionalität der RIP140-NR-Box wurde neulich bestätigt (Heery, D.M. et al., Nature 387:733-736 (1997)).
Um die funktionelle Bedeutung dieser drei Motive in der TIF2-NID zu erforschen, wurde die voranstehende LL → AA-Mutation in TIF2.1 eingebracht, entweder in jedes Motiv alleine oder in allen möglichen Kombinationen der drei Motive (TIF2.1m1 zu m123 in 8a; die Zahlen, die „m" folgen, verweisen auf die mutierten Motive). Die Mutation aller drei NR-Boxen wurden benötigt, um sowohl das Binden an ER, RARα und RXRα (8d, Quantifizierung in 8e, weiße Balken), als auch die TIF2-abhängige Stimulation der Liganden-induzierte Transaktivierung durch ER und RXRα-AF-2s (8e, schwarze Balken und Daten nicht gezeigt; in dem Fall von RARα-AF-2 war die Stimulation schwach und wurde nicht quantifiziert) aufzuheben. Die TIF2.1-Konstrukte, bei denen zwei NR-Box-Motive mutiert waren, wiesen noch das ER-Binden und die Stimulation der AF-2-Aktivität auf, insbesondere, wenn das NR-Box-Motiv II intakt war, was vorschlägt, dass die drei NR-Box-enthaltenden Module mindestens teilweise funktionell überflüssig sind (8d und 8e; TIF2.1m12, m13 und m23). Diese Überflüssigkeit war deutlich, wenn nur ein NR-Box-Motiv mutiert war; im Gegensatz zu TIF1α, der nur eine NR-Box enthält (LeDouarin, B. et al., EMBO J. 15:6701-6715 (1996)), hob die Mutation einer einzelnen TIF2-Box das ER-Binden und die Stimulation der ER-AF-2-Aktivität nicht auf. Alle drei Mutanten (TIF2.1m1 bis m3) banden an ER und stimulierten die Estradiol-abhängige Transaktivierung durch den ER mit ähnlicher Effizienz wie TIF2.1 selbst (8d und 8e). In dem Fall von RARα und RXRα hatten die Mutationen allgemein eine schädlichere Wirkung auf das Rezeptor-LBD-Binden und die Stimulation der AF-2-Aktivität als in dem Fall von ER (8d und 8e). Dies kann möglicherweise eine schwächere Interaktion zwischen TIF2 und entweder RARα oder RXRα als mit ER widerspiegeln. Jedoch waren trotz des allgemeinen Aufweisens von geringer Aktivität die Muster des NR-Bindens und der Stimulation von AF-2-Aktivität der NR-Box-Mutanten ähnlich für ER und RARα und RXRα, wie die Mutation von Motiv II immer schädlicher in Doppelmutanten war als die Mutation der Motive I und III (s. 8e). Wichtigerweise gab es sowohl für ER als auch RXRα eine gute Korrelation zwischen der Wirkung einer beliebigen der verschiedenen Mutationen an das TIF2.1-Rezeptor-Binden in vitro und der TIF2.1-vermittelten Stimulation der AF2-Aktivität (8e), was einen Mechanismus stützt, wodurch die Stimulation der AF-2-Aktivität durch TIF2 die TIF2-NO-Interaktion durch das/die NR-holo-LBD-TIF2-NR-Box-Zwischenstück(e) einbezieht.
Unsere vorliegende Struktur-Funktion-Analyse offenbart, dass TIF2 eine einzelne nuclearer Rezeptor-Interaktionsdomäne (NID) enthält. Beachten Sie im Gegensatz zu dem anderen TIF2-Familienmitglied SRC-1, von dem berichtet wurde, nur zwei NIDs zu enthalten (Oñate, S.A. et al., Science 270:1354-1357 (1995); Yao, T.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10626-10631 (1996); Zhu, Y. et al., Gene Expression 6: 185-195 (1996)). Beachten Sie jedoch, dass eine der zwei SRC-1-NID am wahrscheinlichsten homolog zu der hier charakterisierten TIF2-NID ist (s. 8a). Die TIF2-NID ist aus drei Modulen zusammengesetzt, und jedes kann unabhängig auf eine Liganden-abhängige Weise an die in dieser Studie gestesteten NRs binden. Interessanterweise enthalten diese Module das NR-Box-Motiv LxxLL (SEQ ID NO:12), das ursprünglich (als das Motiv LxxLLL (SEQ ID NO:13), 8b) innerhalb eines 10-Aminosäure-NR-bindenden Modul von TIF1α aufgenommen wurde, das gefunden wurde, konserviert in der NID von RIP140 und auch in TRIP3 anwesend zu sein (LeDouarin, B. et al., EMBO J. 15:6701-6715 (1996) und Literaturhinweise darin). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die TIF1α- und RIP140-Module funktionell mit den NRs interagieren (LeDouarin, B. et al., EMBO J. 15:6701-6715 (1996)). Die Auswirkung der NR-Box-Motive beim NO-Coaktivator-Binden und ihre Anwesenheit in einen Anzahl von verschiedenen Coaktivatoren wurde in neuen Berichten aufgezeigt (Heery, D.M. et al., Nature 387:733-736 (1997); Torchia, J. et al., Nature 387:677-684 (1987); LeDouarin, B. et al., EMBO J. 15:6701-6715 (1996)). Beachten Sie, dass alle drei hier beschriebenen TIF2-NR-Box-Motive in dem neulich entdeckten TIF2-Paralog p/CIP konserviert sind (Torchia, J. et al., Nature 387:677-684 (1987)). Im Gegensatz zu TIF1α, für den die Mutation von Leucinen zu Alanin an den Positionen 4 und 5 seines einzelnen NR-Box-Motivs (LL → AA) das NR-Binden aufhebt, wird die Mutation von allen drei Motiven in der TIF2-NID benötigt, um das NR-Binden aufzuheben, was anzeigt, dass jedes dieser Motive zu einer TIF2-Oberfläche, die mit einer verwandten Oberfläche der NR-holo-LBDs interagiert, beitragen kann. Dass die NR-Boxen von TIF2 funktionelle Überflüssigkeit aufweisen, wird durch die Beobachtung gestützt, dass die LL → AA-Mutation in einem beliebigen der drei TIF2-NID-Motive offenbar nicht (in dem Fall des ER) oder nur schwach (in dem Fall von RARα, RXRα) die Effizienz der NR-Interaktion reduziert. Darüber hinaus war in der TIF2.1-Umgebung ein beliebiges einzelnes intaktes NR-Box-Motiv für sich allein (d.h., wenn die zwei anderen Motive mutiert waren) ausreichend für die Interaktion mit der holo-ER-LBD, obwohl nur Motiv II für sich allein eine fast Wildtyp-NR-Bindungseffizienz bewirken konnte. Dagegen waren für die RARα- und RXRα-Interaktion die Mutanten mit einzelnen intakten NR-Boxen 5mal (Box II) bis 20mal (Box I oder III) weniger effizient als der Wildtyp-TIF2, der die drei NR-Boxen enthält. Kristallographie-Studien werden notwendig sein, um zwischen den zwei möglichen Modellen zu unterscheiden, bei denen die drei NR-Box-Motive (i) zu der Bildung einer dreiteiligen NID-Oberfläche beitragen, die spezifisch eine verwandte holo-NO-LBD-Oberfläche erkennt, oder (ii) zu unabhängigen Oberlächen gehört, von denen jede, wenn auch mit unterschiedlichen Effizienzen, mit derselben holo-NO- Oberfläche interagieren kann. Beachten Sie, dass jedoch das zweite Modell TIF2 erlauben könnte, kooperativ mit beiden Partnern der NR-Homo- oder Heterodimere zu interagieren, die demnach die Transaktivierung durch NRs erbringen, die empfindlich zu kleinen Variationen in den TIF2-Niveaus sind. Beachten Sie auch, dass für sowohl BR als auch RXRα die Wirkungen der NR-Box-Mutationen auf das NR-Binden und die Stimulation der AF-2-Aktivität korreliert wurden, was weiter die Feststellung stützt, dass die Transkriptionswirkung von TIF2 die Bildung eines NR-Box-NO-LBD-Interaktionszwischenstücks einbezieht.
Das Motiv LxxLL (SEQ ID NO:12) wurde in einer Anzahl von anderen NR-Coaktivatoren gefunden (s. voranstehend), was demnach einige Ähnlichkeit in der Art und Weise der NO-Coaktivator-Interaktionen vorschlägt. Dies schließt jedoch nicht die NO-spezifische Modulation dieser Interaktionen aus, da die NR-Box umgebenden Sequenzen hoch variabel sind. In dieser Hinsicht beachten Sie auch, dass vorhergesagt wird, dass die TIF2-NR-Boxen II und III α-Helices bilden, während vorhergesagt wird, dass die NR-Box I in eine β-Faltblatt-Struktur faltet (Strukturvorhersaagen gemäß SOPMA; Geourjdon und Deleage, 1994).
Beispiel 4: Identifizierung der AD1- und AD2-Aktivierungsdomänen von TIF2
Vorübergehende Transfektionsassays mit einem GAL4-Reporterplasmid und Chimäre, die verschiedene TIF2-Fragmente enthielten, die mit der GAL4-DNA-bindenden Domäne (DBD) verbunden sind, zeigten die Anwesenheit von zwei unabhängigen Transkriptionsaktivierungsdomänen in den C-terminalen 460 Aminosäuren vor TIF2, AD1 und AD2 genannt (beschrieben durch die Mutanten TIF2.8, TIF2.12 und TIF2.2 in 7a und 7c). Vorübergehende Transfektionen von HeLa- und Cos-1-Zellen wurden durchgeführt, wie beschrieben (Gronemeyer et al., (1987); Bocquel, M.T. et al., Nucl. Acids. Res. 17:2581-2595 (1989)).
Die N-terminale AD1 (Aminosäuren 1010-1131), die in TIF2.1 vorhanden ist, zeigte eine stärkere Aktivität als die C-terminale AD2 (Aminosäuren 1288-1464) (vgl. TIF2.8 und TIF2.12 mit TIF2.2 in 7a und 7c). Beachten Sie, dass jedoch die schwächere Aktivität von AD2 (relativ zu AD1) auf Grund eines geringeren Expressionsniveaus des GAL-TIF2.2-Fusionsproteins sein könnte (vgl. mit GAL- TIF2.8 und GAL-TIF2.12 in 7c). Beide TIF2-Aktivierungsfunktionen waren in Cos-1- und HeLa-Zellen aktiv (7c). Besonders die minimalen AD1 (TIF2.8)- und AD2 (TIF2.2)-Konstrukte wiesen einige zellspezifische Aktivitäten auf, weil GALTIF2.8 aktiver in HeLa- als in Cos-Zellen war, während das Gegenteil für GAL-TIF2.2 (7c) beobachtet wurde. Interessanterweise konnte die Glutamin-reiche Region von TIF2 weder die Transkription für sich alleine aktivieren, wenn sie mit der GAL4-DBD (7a und 7c; Mutante TIF2.6) fusioniert war, noch wurde sie für die Transkriptionsaktivierung durch AD1 oder AD2 benötigt. Keine Aktivierungsfunktion konnte in dem N-terminalen Teil von TIF2 nachgewiesen werden (s. 7a und 7c; Mutante TIF2.0).
Wir schließen aus diesen Daten, dass die nuclearer Rezeptor-interagierende Domäne (NID) und die zwei Transkriptionsaktivierungsfunktionen von TIF2 den unterschiedlichen modularen Domänen entsprechen, da TIF2.5 an die NRs binden kann, aber nicht die Transkription aktivieren kann, während TIF2.2 und TIF2.8 nicht an die NRs binden können, aber die Transkription aktivieren können (7a).
Beispiel 5: Charakterisierung der TIF2-AD1- und -AD2-Aktivierungsdomänen
Neulich wurde gezeigt, dass CBP und p300, die ursprünglich als Coaktivatoren des Transkriptionsfaktors CREB identifiziert wurden, als allgemeine Integratoren von mehreren Signalwegen wirken, einschließlich der Aktivierung über die Agonistgebundenen RARa und TR (für Reviews und Literaturhinweise s. Eckner, R. Biol. Chem. 377:685-688 (1996); Janknecht & Hunter, (1996); Glass, C.K. et al., Current Opin. Cell Biol. 9:222-232 (1997); Shikama, N. et al., Trends in Cell Biol. 7:230-236 (1997)). Darüber hinaus wurde berichtet, dass SRC-1, das zu derselben Genfamilie wie TIF2 gehört, mit CBP und p300 interagiert (Kamel, Y. et al., Cell 85:403-414 (1996); Yao, T.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10626-10631 (1996); Hanstein, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11540-11545 (1996)). Unter Verwendung der GST-Fusionsprotein-basierten Interaktion und Tierzell-basierten Zwei-Hybrid-Assays analysierten wird daher, ob TIF2 auch mit CBP interagieren könnte. In dem Zwei-Hybrid-System bewertete nur das zentrale TIF2.1-Fragment, aber nicht das N-terminale TIF2.0- oder das C-terminale TIF2.2-Fragment (7a) positiv für die Interaktion mit GAL-CBP (das die Aminosäuren 18722-2165 von CBP enthält, das die SRC-1 interagierende Domäne von CBP umfasst; 7e). Ein GST-CBP-Fusionsprotein wurde in E. coli exprimiert und für Pulldown-Assays mit in vitro translatierten TIF2-Polypeptiden (7d) verwendet. TIF2 interagierte mit CBP und interessanterweise überlappte die CBP-interagierende Domäne (CID) offensichtlich die AD1-Aktivierungsdomäne von TIF2 (vgl. 7a, 7c und 7d; Mutanten TIF2.8 und TIF2.12). Die Interaktion von TIF2 mit CBP war direkt, da ein aufgereinigtes E.coli-exprimiertes TIF2.1-Protein auch mit GST-CBP interagierte (Daten nicht gezeigt). Nur diese Region von TIF2 interagierte signifikant mit dem GST-CBP-Fusionsprotein, was demnach vorschlägt, dass die TIF2-AD1-Aktivität aus der Rekrutierung von CBP entstehen kann. Abführer N-terminale Regionen ( 7a und 7d; Mutanten TIF2.10 und TIF2.4) oder die C-terminale AD2-Aktivierungsdomäne (7a und 7d; Mutante TIF2.2) zeigten kein Binden an GST-CBP. Beachten Sie, dass TIF2.2 auch nicht mit CBP ganzer Länge interagierte (Daten nicht gezeigt), was vorschlägt, dass die Aktivität von TIF2-AD durch (einen) Faktoren) vermittelt wird, der/die von CBP unterschiedlich ist/sind.
Um zu erforschen, ob die CID von TIF2 von der AD1-Aktivierungsdomäne getrennt werden könnte, wurde die Fähigkeit einer Reihe von GAL-TIF2-Kürzungsmutanten, einen GAL4-Reporter zu aktivieren, mit ihrer Fähigkeit verglichen, mit dem GST-CBP-Protein in vitro zu interagieren (9). TIF2.13 (der Pro₁₀₁₁ bis Ser₁₁₂₂ umfasst) wies eine starke Transkriptionsaktivität auf, vergleichbar mit der eines größeren TIF2-Fragments (vgl. 7 und 9). Das Entfernen von 26 C-terminalen (TIF2.15) oder 20 N-terminalen (TIF2.18) Aminosäureresten reduzierte die Transkriptionsaktivität nur schwach (9a und 9b). Beachten Sie, dass TIF2.13 auch mit CBP in vivo interagierte, wie durch Verwendung eines Zwei-Hybrid-Assays bei transfizierten Säugetierzellen gezeigt (10b).
Während die interne Deletion der Reste Aspios₁₀₆₁ bis Ala₁₀₇₀ (TIF2.19) nur eine geringe Wirkung auf die Fähigkeit von TIF2.13 hatte, zu transaktivieren, reduzierte die Deletion des Abschnitts von Glu₁₀₇₁ bis Leu₁₀₈₀ (Mutante TIF2.20) signifikant die Transkriptionsaktivität von TIF2-AD1. In besonderem Maße gehören diese Reste zu einer Sequenz, die vorhergesagt wurde, in eine amphipathische α-helicale Struktur zu falten, die zwischen TIF2 und SRC-1 hoch konserviert ist (9a). Die Einbeziehung dieser Region in die Transaktivierung wurde durch Analyse der Mutanten TIF2.21 bis TIF2.32 bestätigt (9a und 9b). Alle Konstrukte, die die TIF2-Wildtyp-Sequenz von Asp₁₀₇₅ bis Leu₁₀₈₇ enthielten, stimulierten die Transkription, während selbst eine Deletion von nur einigen dieser Reste die Transkriptionsaktivierung signifikant reduzierte. Jedoch für sich allein transaktivierte dieses α-helicale Peptid sehr schlecht und musste in zusätzliche Stromaufwärts- und/oder Stromabwärts-TIF2-Sequenzen eingebaut werden, um signifikante Transkriptionsaktivität zu erzeugen (9a und 9b; vgl. Mutanten TIF2.13, TIF2.21 und TIF2.32). Wichtigerweise deckte sich in allen Fällen die ADD-Aktivität mit der CBP-Interaktion, da transkriptional inaktive Konstrukte nicht mit CBP interagierten (TIF2.24, TIF2.27 und TIF2.29 in 9a-9c), während transkriptional aktive Mutanten auch CBP banden. Außerdem korrelierte die Stärke der in vitro-Interaktion mit GST-CBP offensichtlich mit der Transaktivierungseffizienz (9a-9c; z.B., vgl. TIF2.21 und TIF2.31).
Um zu erforschen, ob die Integrität der vermeintlichen amphipathischen α-helicalen Region sowohl für die AD1-Transkriptionsaktivität als auch für die Interaktion mit CBP benötigt wird, brachten wir Punktmutationen in TIF2.13 ein; die drei konservierten hydrophoben Leu- oder die hydrophilen Asp-Glu-Reste wurden mit Alaninen getauscht [9a; TIF2.13(LLL) und TIF2.13(DQ)]. Interessanterweise hob die Mutation der drei Leucinreste fast vollständig die AD1-Aktivität auf, während die Mutation der Asp-Glu-Sequenz eine sehr geringe Wirkung, wenn überhaupt, hatte (10a). Wieder waren AD1-Aktivität und Interaktion mit CBP in vitro (10c), sowie in vivo (10b), strengstens korreliert, da GAL-TIF2.13(DQ), der so effizient wie der Wildtyp GAL-TIF2.13 transaktivierte, stark mit CBP interagierte, während der transkriptional inaktive GAL-TIF2.13(LLL) sehr schwach mit CBP interagierte. Zusammen zeigen diese Ergebnisse an, dass (i) CBP die AD1-Aktivität von TIF2 vermittelt, (ii) ein vermeintliches amphipathisches α-Helix-Motiv, das innerhalb der AD1-Domäne gelegen ist, entscheidend in, aber nicht ausreichend für effizientes/effiziente CBP-Binden/Transaktivierung einbezogen wird und (üi) die Amphiphilizität des Motivs für die AD1-Aktivität und das CBP-Binden nicht benötigt wird.
Die zwei TIF2-Aktivierungsfunktionen AD1 und AD2 operieren offensichtlich durch verschiedene Transkriptionsaktivierungskaskaden. Während die TIF2-AD1-Aktivierungsdomäne durch Mutationsanalyse von der TIF2-Domäne, die in vitro und in vivo mit einer Region der CBP-Oberfläche interagiert, die auch das SRC-1-Binden vermittelt (Kamel, Y. et al., Cell 85:403-414 (1996)), nicht getrennt werden konnte, interagierte weder diese Region noch CBP von ganzer Länge mit TIF2-AD2. Dass die zwei TIF2-Aktivierungsfunktionen durch unterschiedliche Wege operieren können, wird auch durch die unterschiedliche Zellspezifität der minimalen Fragmente, die AD1-Aktivität (z.B. TIF2.8, TIF2.7, TIF2.9, TIF2.12) und AD2-Aktivität (TIF2.2) aufweisen, vorgeschlagen. Während TIF2.2 in Cos-1-Zellen aktiver ist als in HeLa-Zellen, sind alle der minimalen Fragmente, die AD1 enthalten, aktiver in HeLa-Zellen. Analog führte das Entfernen in TIF2.3 von Sequenzen, die N-terminal von TIF2.8 sind, zu einer jeweils 10-fachen und 2-fachen erhöhten Transaktivierung in HeLa- und Cos-1-Zellen, und das Entfernen in TIF2.1 von Sequenzen, die C-terminal von TIF2.3 sind, ergaben jeweils eine 9-fache und 3-fache höhere Transaktivierung in HeLa- und Cos-1-Zellen. Dies schlägt vor, dass die deletierten Sequenzen entweder eine intra- oder intermolekulare Hemmung auf die TIF2-AD1-Aktivität/CBP-Interaktion ausüben könnten. Zusätzlich kann die Coaktivator-Aktivität von TIF2 zellspezifisch durch die unterschiedliche Effizienz seiner zwei ADs und Faktoren, die mit den Sequenzen N- und C-terminal der AD1-Aktivierungsfunktion interagieren, moduliert werden.
Es ist wert, zu beachten, dass das Kernstück von AD1 (TIF2.32) für sich allein ein sehr schwacher Transaktivator und CBP-Binder ist, und zusätzliche umgebende Sequenzen benötigt, um eine vollständig aktive (d.h. effiziente CBP-bindende) Oberfläche zu erzeugen. Jedoch offenbart die Mutationsanalyse des AD1-Kernstücks in dem Zusammenhang eines starken Aktivatorfragments (TIF2.13) die entscheidende Wichtigkeit für die Transaktiverung das das CBP-Binden in vivo und in vitro von drei Leucinresten (10). Diese Leucine gehören zu einem konservierten LLxxLxxxL (SEQ ID NO:14)-Motiv bei allen drei Mitgliedern der TIF2-Coaktivatorfamilie (9a; Torchia, J. et al., Nature 387:677-684 (1987)), das von dem LxxLL (SEQ ID NO:12) NR-Box-Motiv verschieden ist. In besonderem Maße, obwohl diese Leucine in einer vorhergesagten amphipathischen α-Helix eingebettet sind, wird die Amphiphilizität für die Funktion nicht benötigt, da eine Mutation der hydrophilen Reste (vgl. TIF2.13 mit TIF2.13(DQ)) nicht die Transaktivierung/das CBP-Binden beeinflusst.
TIF2 kann offensichtlich mindestens zwei Mediatorfunktionen erfüllen, (i) als ein „Brücke schlagender Faktor" zwischen der AF-2-Funktion von nuclearen Rezeptoren und CBP über seine AD1-Aktivierungsdomäne und (ii) als ein Transkriptionsmediator durch (eine) bisher unbekannte CBP-Bindungs-unabhängige Route(n) über seine AD2-Funktion. Zur Zeit haben wir keinen Beweis, dass TIF2 eine intrinsische enzymatische Aktivität besitzen könnte; keines der bakteriell exprimierten aufgereinigten TIF2-Fragmente, insbesondere TIF2.1, das gezeigt wurde, bei NR- und CBP-Interaktionen in vitro vollständig befähigt zu sein, wies eine beliebige Histonacetylase-Aktivität unter Bedingungen auf, wo bakteriell exprimiertes aufgereinigtes Hefe-GXNS hoch aktiv war (unsere nicht publizierten Ergebnisse).
Beispiel 6: TIF2-Verstärkung der NR-AF2-Aktivifät
Die Beobachtung, dass Transkriptionsaktivatoren vom Tier, wie der menschliche ER (Metzger, D. et al., Nature 334:31-36 (1988)) auch in der Hefe Saccharomyces cerevisiae aktiv sind, zeigte, dass die grundlegenden Prinzipien der Transkriptionsverstärkung von der Hefe zum Menschen konserviert wurden. Wir erforschten daher, ob TIF2 die Transkriptionsaktivierung durch verschiedene NR-Konstrukte, die in S. cerevisiae exprimiert werden, erhöhen könnte. Sowohl NRs als auch TIF2.1 wurden aus Multikopie-Plasmiden in dem Hefestamm PL3(α) exprimiert, der ein URA3-Reportergen unter der Kontrolle von drei Östrogen-Response-Elementen enthält (ERE)₃-URA3; Pierrat, B. et al., Gene 119:237-245 (1992)).
In der Hefe wurden die hERα-Konstrukte aus den folgenden YEp90-basierenden Plasmiden exprimiert: HEGO (hERα, YEp90-HEG19, Aminosäuren 1-595) HE15 (Yep90-HE15; Aminosäuren 1-282) und HEG19 (Yep90-HEG19, Aminosäuren 179-595) (alle Pierrat, B. et al., Gene 119:237-245 (1992)), HE179-338 (YEp90-HE179-338; Pierrat, B. et al., Gene 143:193-200 (1994)). Aus dem Hefe-Multikopie-Plasmid pBL1 (LeDouarin, B. et al., Nucleic Acids Res. 23:876-878 (1995b)), das für ER(F)-Epitop-markierte ER(C)-Verbindungen codiert, wurden die folgenden Plasmide exprimiert: ER(C)-RAR(DEF) (pBL1-hRARa(DEF), Aminosäuren 154-462) und ER(C)-RXR(DE) (pBL1-mRXRα(DE), Aminosäuren 205-467) (beide vom Baur, E. et al., EMBO J. 15:110-124 (1996)). TIF2 wurde in Hefe aus dem Multikopie-Plasmid pAS3 (Geschenk von B.LeDouann) exprimiert, das ein Derivat von YEp90 ist, das den LEU2-Marker enthält. Hefe-PL3(α)-Transformanten (Pierrat, B. et al., Gene 119:237-245 (1992)) wurden exponentiell in der Anwesenheit oder Abwesenheit des Liganden für etwa fünf Generationen in selektivem Medium gezüchtet, das Uracil enthielt. Hefeextrakte wurden präpariert und nach OMP-Decase-Aktivität untersucht, wie früher beschrieben (Pierrat, B. et al., Gene 119:237-245 (1992)).
Wie aus früheren Studien erwartet (Metzger, Nucl. Acids. Res. (1992); Pierrat, B. et al., Gene 119:237-245 (1992); Pierrat, B. et al., Gene 143:193-200 (1994)), induzierte der ER (HEGO) von ganzer Länge die Aktivität der Orotidin-5'-Monophosphat-Decarboxylase (OMP-Decase) auf eine Liganden-abhängige Weise (11, Spuren 1 und 3). Interessanterweise wurde die Transkriptionsaktivität von ER durch Coexpression des TIF2.1-Fragments weiter erhöht (11, vgl. Spuren 3 und 4). In der Abwesenheit von Hormon hatte TIF2.1 keine signifikante Wirkung auf die ER-induzierte Transkriptionsaktivierung (11, vgl. Spuren 1 und 2). Im Wesentlichen wurden die gleichen Ergebnisse für HEG19 beobachtet, das frei von der N-terminalen Region A/B ist, was anzeigt, dass TIF2 seine Wirkung auf die Liganden-abhängige ER-AF-2 ausübt (11, Spuren 5-8). Dagegen wurden weder die AF-1-Aktivität von HE15, (das die ER-Regionen A, B und C umfasst; Kumar & Chambon, Cell 55: 145-156 (1988)), noch die AF-2a-Aktivität des HE179-338-Konstrukts (Pierrat, B. et al., Gene 143:193-200 (1994)) durch coexprimierendes TIF2.1 stimuliert (11 Spuren 9-12). Dies ist in Übereinstimmung mit den in Säugetierzellen erhaltenen Ergebnissen und mit der Beobachtung, dass eine intakte LBD für TIF2.1 benötigt wird, um mit dem ER zu interagieren (Voegel, J.J. et al., EMBO J. 15:3667-3675 (1996)).
TIF2.1 stimulierte auch die AF-2-Aktivität der ligandierten RXRα(DEF)-Region in der Hefe (11, vgl. Spuren 19 und 20). Diese Verstärkung war Ligandenabhängig; keine Aktivierung über die RXRα(DEF)-Region wurde beobachtet, wenn die ER(C)-RXRα(DEF)-Chimäre mit TIF2.1 in der Abwesenheit des Liganden coexprimiert wurde (11, vgl. Spuren 18 und 20). Wieder liefen diese Beobachtungen parallel zu jenen, die bei HeLa- und Cos-1-Zellen gemacht wurden (s. 12c).
Überraschenderweise erhöhte TIF2.1 sogar in Abwesenheit des Liganden und im Gegensatz mit den mit ER und RXRα gemachten Beobachtungen sehr effizient die Transaktivierung durch die RARα-LBD (11, Spuren 13 und 14). Die Zugabe von Retinolsäure steigerte weiter diese Transkriptionsaktivierung (11, Spuren 14 und 16). Beachten Sie, dass, wie früher berichtet (Heery, D.M. et al., Nature 387:733-736 (1997)), sowohl RARα als auch RXRα-AF-2 für sich alleine die Transkription von dem URA3-Reporter schlecht aktivierten.
Die Verstärkung der AF-2-Aktivität, die besonders stark in Hefezellen war, wurde auch neulich für GRIP1, dem Maushomolog von TIF2 beobachtet (Hong, H. et al., Mol. Cell Biol. 17:2735-2744 (1997)). Diese Beobachtungen schlagen vor, dass Hefezellen Coaktivatoren enthalten, die nur schlecht die Wirkung der Säugetier-NR-Coaktivatoren imitieren. Da Hefezellen offensichtlich kein CBP-Homolog enthalten, wird es interessant werden, zu erforschen, welcher Hefefaktor die Aktivität von TIF2 vermittelt. Beachten Sie in dieser Hinsicht, dass GAL-TIF2.1 ein starker Transkativator in der Hefe ist (unsere nicht publizierten Ergebnisse).
Interessanterweise führte die Expression von TIF2 in Hefe zu einer merklichen Stimulation der Transaktivierung durch den nicht ligandierten ER(C)-RARα(DEF), die nicht mit nicht ligandierten LBDs von ER oder RXRα beobachtet wurde. Strukturuntersuchungen offenbarten, dass das Binden des Liganden zu einer Konformationsänderung der LBD führt, die die Oberfläche(n) für das Coaktivator-Binden erzeugt (Renaud, J.P. et al., Nature 378:681-689 (1995)). Daher schlägt unser vorliegendes Ergebnis vor, dass ein hohes Niveau von Coaktivatoren in der Abwesenheit von Ligand die LBD einiger Rezeptoren in eine holo-LBD-ähnliche Konformation treibt, die demnach zur Liganden-unabhängigen Transkriptionsaktivität führt. Bei Analogie könnte einer spekulieren, dass hohe Niveaus von Coexpressoren die NR-LBDs in die apo-LBD-Konformation „einschließen" könnte. Es würde daher interessant sein, zu erforschen, ob Niveaus von Coregulatoren zu einer aufbauenden Aktivität (sogar in Anwesenheit von Antagonisten) oder umgekehrt zum Mangel der Induzierbarkeit von nuclearen Rezeptoren in einigen pathologischen Zuständen führen.
Beispiel 7: TIF2-NID-Hemmung der NR-AF-2-Aktivität
Die Überexpression des TIF2.1-Fragments, das sowohl die NID als auch die AD1-Aktivierungsfunktion enthält, stimuliert vorübergehend die ER-AF-2-Aktivität der ER-LBD in Cos-1-Zellen (12a, Spuren 2 und 3; Voegel, J.J. et al., EMBO J. 15:3667-3675 (1996)). Dass diese Stimulation auf eine direkte Interaktion zwischen der ER-LBD und der NID von TIF2 beruhte, wurde stark durch die Beobachtung vorgeschlagen, dass die Überexpression der TIF2.5-Mutante, die die isolierte NID enthält, der aber AD1 fehlt (s. 7a), die stimulatorische Wirkung von TIF2.1 verhinderte (12a, vgl. Spuren 3 und 4). Beachten Sie, dass in der Abwesenheit von TIF2.1 die TIF2.5-Überexpression auch die Transaktivierung durch die ER-AF-2 verringerte, die vermutlich durch Cos-1-endogene Coaktivatoren vermittelt wurde (12a, vgl. Spur 4 mit Spur 2), was demnach vorschlägt, dass diese Cos-1-Mediatoren entweder endogenen TIF2s entsprechen oder mit der ER-holo-LBD durch Oberflächen interagieren, die identisch mit oder in direkter Nachbarschaft von der TIF2-NID-Interaktionsoberfläche sind.
Wir berichteten früher über eine Agonisten-abhängige Interaktion von TIF2 mit RAR- und RXR-LBDs, die abhängig von der Integrität des NR-AF-2-AD-Kernstücks war, aber versagten, eine stimulatorische Wirkung von TIF2 auf die Transkriptionsaktivierung eines (17m)₅-Globin-Promotor-CAT-Reporter durch die Fusionsproteine GAL-RAR-LBD oder GAL-RXR-LBD zu beobachten (Voegel, J.J. et al., EMBO J. 15:3667-3675 (1996)). Da der Misserfolg wahrscheinlich auf der Anwesenheit von ausreichenden Mengen von endogenen Mediatoren zur Ausführung maximaler Transaktivierung aus diesem Reportergen beruhte, modifizierten wir die Transfektionsbedingungen und verwendeten ein Reporterkonstrukt, das einen minimalen Promotor trug. Eine deutliche TIF2 und TIF2.1 stimulatorische Aktivität für RXRα-AF2 wurde bei HeLa- und Cos-1-Zellen während der Verwendung des (17m)₅-TATA-CAT-Reporters beobachtet (12c, vgl. Spuren 3-6 und 11-14). Diese stimulatorische Wirkung war weniger merklich mit RARα-AF-2 und konnte reproduzierbar nur mit dem TIF2.1-Fragment in Cos-1-Zellen beobachtet werden (12d, vgl. Spur 10 mit Spuren 13 und 14; beachten Sie, dass TIF2.1 bei > 10-fach höheren Niveaus als TIF2 exprimiert wird; Daten nicht gezeigt). Die Reporterplasmide (17m)₅-TATA-CAT (May, M. et al., EMBO J. 15:3093-3104 (1996)) und 17M5-G/CAT ((17m)₅-β-Globin-CAT; Durand, B. et al., EMBO J. 13:5370-5382 (1994)) enthalten jeweils fünf Kopien des GAL4-Response-Elements jeweils vor einem einfachen TATA-Motiv oder einem β-Globin-Promotor stromaufwärts von dem CAT-Reportergen.
Angenommen, dass TIF2 oder Coaktivatoren, die die TIF2 interagierende Oberfläche auf NR-LBDs erkennen, allgemein die AF-2-Funktion von NRs vermitteln, sollte die TIF2.5 enthaltenden NID ihre vorherrschende negative Aktivität nicht nur auf ER, sondern auch auf andere NRs, unabhängig von dem zellulären Zusammenhang, ausüben. Wir analysierten daher die Wirkung von TIF2.5 auf die AF-2-Aktivität von ER, RXRα und RARα in HeLa- und in Cos-1-Zellen ( 12b-12d). Bei allen Fällen führt die TIF2.5-Expression zu einer Dosis-abhängigen Hemmung der NR-AF-2-Aktivität, was anzeigt, dass die endogen vorhandenen Mediatoren von der isolierten überexprimierten TIF2-NID verdrängt wurden, und was stark vorschlägt, dass TIF2 oder transkriptionale intermediäre Faktoren, die die gleiche oder überlappende Oberflächen erkennen, die NR-AF-2-Aktivität in diesen transfizierten Zellen vermitteln (12b-12d, vgl. Spur 2 mit Spuren 7 und 8; Spur 10 mit Spuren 15 und 16).
Es ist wichtig zu betonen, dass unsere vorliegenden Daten zeigen, dass TIF2 mit NRs durch eine Oberfläche (NID) interagiert, die entscheidend für die NR-AF-2-Aktivität ist, da die Expression von TIF2.5, der die NID umfasst, die Ligandeninduzierte Aktivität von allen getesteten NR-AF-2s blockierte. Diese Beobachtung, die deutlich festlegt, dass, mindestens in transfizierten Zellen, TIF2 oder andere Coaktivatoren, die mit einer überlappenden, wenn nicht identischen, holo-LBD-Oberfläche interagieren, entscheidend sind, um die NR-AF-2-Aktivierungsfunktion zu vermitteln. Dies ist im Einklang mit der Anwesenheit von drei NR-Box-Motiven in der TIF2-NID und von mindestens einem konservierten LxxLL (SEQ ID NO:12) NR-Box-Motiv in allen bis heute beschriebenen Coaktivatoren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die die Aminosäuren 1 bis 1464 von SEQ ID NO: 2 codiert; (b) einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die die Aminosäuresequenz codiert, wie sie durch die cDNA codiert wird, die ein TIF2-Polypeptid mit TIF2-Aktivität codiert, das an die Liganden-bindende Domäne eines nuclearen Rezeptors, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97612 enthalten ist, bindet; (c) einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein cytoplasmatisches Fragment eines Polypeptids codiert, das von einem Polynucleotid gemäß einem von (a) bis (b) codiert wird, wobei das cytoplasmatische Fragment die Aktivität hat, die das Binden an die Ligandenbindende Domäne eines nuclearen Rezeptors ist; (d) einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die die Aminosäuren 624 bis 1287 von SEQ ID NO: 2 codiert; (e) einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die aus den Nucleotiden 163 bis 4554 oder 2032 bis 4023 von SEQ ID NO: 1 besteht; (f) einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz mit mindestens 90% Identität zu der Nucleotidsequenz gemäß einem der Polynucleotide von (a) bis (e) umfasst, wobei das Polynucleotid ein TIF2-Polypeptid mit TIF2-Aktivität, die das Binden an die Liganden-bindende Domäne eines nuclearen Rezeptors ist, codiert; (g) einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die eine Aminosäuresequenz codiert, die zu mindestens 90% identisch zu der Aminosäuresequenz eines Polypeptids ist, das durch ein Polynucleotid gemäß einem von (a) bis (e) codiert wird, wobei das Polynucleotid ein TIF2-Polypeptid mit TIF2-Aktivität, die das Binden an die Liganden-bindende Domäne eines nuclearen Rezeptors ist, codiert; (h) einem Polynucleotid, das aus einer Nucleotidsequenz besteht, die die Aminosäurereste 624 bis 1287 von SEQ ID NO: 2 codiert; (i) einem Polynucleotid, das aus einer Nucleotidsequenz mit mindestens 90% Identität zu der Nucleotidsequenz des Polynucleotids von (h) besteht, wobei das Polynucleotid ein TIF2-Polypeptid mit TIF2-Aktivität, die das Binden an die Liganden-bindende Domäne eines nuclearen Rezeptors ist, codiert; (j) einem Polynucleotid, das aus einer Nucleotidsequenz besteht, die eine Aminosäuresequenz codiert, die zu mindestens 90% identisch zu der Aminosäuresequenz eines Polypeptides ist, das durch ein Polynucleotid von (h) codiert wird, wobei das Polynucleotid ein TIF2-Polypeptid mit TIF2-Aktivität, die das Binden an die Liganden-bindende Domäne eines nuclearen Rezeptors ist, codiert; (k) einem Polynucleotid, das aus einer Nucleotidsequenz mit 500 Nucleotiden von SEQ ID NO: 1 besteht; und (l) einem Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die komplementär zu der Nucleotidsequenz von einem der Polynucleotide von (a) bis (k) ist.
Polynucleotid gemäß Anspruch 1, das DNA oder RNA ist.
DNA gemäß Anspruch 2, die genomische DNA ist.
Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Vektors, das das Einfügen eines Polynucleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in einen Vektor umfasst.
Vektor, der das Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält oder der durch das Verfahren gemäß Anspruch 4 hergestellt wird.
Vektor gemäß Anspruch 5, in dem das Polynucleotid funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft ist, die das Exprimieren in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben.
Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Wirtszelle, das das Einbringen eines Vektors gemäß Anspruch 5 oder 6 in eine Wirtszelle umfasst.
Wirtszelle, die mit dem Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder dem Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6 genetisch manipuliert ist, oder die durch das Verfahren gemäß Anspruch 7 hergestellt wurde.
Verfahren zur Herstellung eines TIF2-Polypeptids, das umfasst: das Züchten der Wirtszelle gemäß Anspruch 8 und das Gewinnen des Polypeptids, das durch das Polynucleotid codiert wird, aus der Kultur.
Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch das Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird, oder das durch das Verfahren gemäß Anspruch 9 erhältlich ist.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid gemäß Anspruch 10 bindet.
Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren eines nuclearer Rezeptor(NR)-Antagonisten, das umfasst: (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle, die rekombinante Gene umfasst, die ein Polypeptid, das eine NR-Liganden-bindende Domäne (LBD) umfasst, und ein Polypeptid, das transkriptionalen intermediären Faktor-2 (TIF-2) von SEQ ID NO: 2 oder ein TIF-2-Fragment umfasst, exprimieren, wobei, in Anwesenheit eines Antagonisten, der TIF-2 und das TIF-2-Fragment die NR-LBD binden; (b) das Verabreichen eines Kandidaten-Antagonisten an die Zelle; und (c) das Ermitteln, ob der Kandidaten-Antagonist entweder: (l) das TIF-2- oder TIF-2-Fragment-Binden an die Aktivierungsfunktion-2 (AF-2) der NR-LBD, verglichen mit dem Binden in Abwesenheit des Kandidaten-Antagonisten; oder (2) die TIF-2- oder TIF-2-Fragment-stimulierte NR-LBD-AF-2-vermittelte Transaktivierung, verglichen mit der Transaktivierung in Abwesenheit des Kandidaten-Antagonisten reduziert.
Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren eines nuclearer Rezeptor(NR)-Agonisten, das umfasst: (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle, die rekombinante Gene umfasst, die ein Polypeptid, das eine NR-Liganden-bindende Domäne (LBD) umfasst, und ein Polypeptid, das transkriptionalen intermediären Faktor-2 (TIF-2) von SEQ ID NO: 2 oder ein TIF-2-Fragment umfasst, exprimieren, wobei, in Anwesenheit eines Agonisten, der TIF-2 und das TIF-2-Fragment die NR-LBD binden; (b) das Verabreichen eines Kandidaten-Agonisten an die Zelle; und (c) das Ermitteln, ob der Kandidaten-Agonist entweder: (l) das TIF-2- oder TIF-2-Fragment-Binden an die Aktivierungsfunktion-2 (AF-2) der NR-LBD, verglichen mit dem Binden in Abwesenheit des Kandidaten-Agonisten; oder (2) die TIF-2- oder TIF-2-Fragment-stimulierte NR-LBD-AF-2-vermittelte Transaktivierung, verglichen mit der Transaktivierung in Abwesenheit des Kandidaten-Agonisten erhöht.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei die Wirtszelle ferner ein Reportergen exprimiert.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei die Wirtszelle ein Polypeptid exprimiert, das eine NR-LBD und GAL4 umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei das TIF-2- oder TIF-2-Fragment-Binden an die AF-2 der NR-LBD unter Verwendung eines Glutathion-S-Transferase(GST)-Interaktionsassays ermittelt wird.