DE69737062T2

DE69737062T2 - Gentherapie für kongestives herzversagen

Info

Publication number: DE69737062T2
Application number: DE69737062T
Authority: DE
Inventors: Kirk H. La Jolla HAMMOND; A. Paul San Diego INSEL; Peipei Louisville PING; R. Steven San Diego POST; Meihua San Diego GAO
Original assignee: University of California; Collateral Therapeutics Inc
Current assignee: University of California
Priority date: 1996-09-05
Filing date: 1997-09-05
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2017-09-06
Also published as: CN1234835A; EA199900261A1; CA2262406A1; EP0934422B1; DE69737062D1; AU4251997A; JP2002514908A; ATE347606T1; AU741931B2; CA2262406C; WO1998010085A2; WO1998010085A3; EP0934422A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Steigerung der Herzfunktion in Säugerherzen. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung Techniken und Polynukleotidkonstrukte zur Steigerung der myokardialen β-adrenergen Antwortfähigkeit unter Anwendung von in vivo-Gentherapie.
Hintergrund
Es ist berichtet worden, dass 3-4 Millionen Erwachsene in den Vereinigten Staaten kongestives Herzversagen (hierin abgekürzt als "CHF") aufweisen; und dass das Auftreten von CHF zunimmt (siehe z. B. Baughman, K., Cardiology Clinics 13: 27-34, 1995). In U.S.-Krankenhäusern ist CHF jährlich die häufigste nicht-wahlfreie Zugangs- und Entlassungs-Diagnose für 500 000 Patienten. Sobald Symptome des Herzversagens mäßig ernsthaft sind, ist die Prognose schlimmer als bei den meisten Krebsarten, dahingehend, dass 50 % derartiger Patienten innerhalb von 2 Jahren sterben (Braunwald, E. (Hrsg.), in: Heart Disease, W. B. Saunders, Philadelphia, Seite 471-485, 1988). Obwohl die medizinische Therapie anfänglich die Symptome von Herzversagen (Ödem, Atemlosigkeit, Flüssigkeit in den Lungen) abschwächen und in einigen Fällen das Leben verlängern kann, ist die Prognose bei dieser Erkrankung, sogar bei medizinischer Behandlung, erschreckend (siehe z. B. Baughman, K.; Cardiology Clinics 13: 27-34, 1995).
CHF wird als abnormale Herzfunktion definiert, welche zu einer ungenügenden Herz-Ausstossleistung für metabolische Anforderungen führt (Braunwald, E. (Hrsg.), in: Heart Disesase, W.B. Saunders, Philadelphia, Seite 426, 1988). Die Symptome schließen Atemlosigkeit, Müdigkeit, Schwäche, Schwellung der Beine und Belastungsintoleranz ein. Bei einer Körperuntersuchung neigen Patienten mit Herzversagen dazu, Erhöhungen hinsichtlich der Herz- und Atmungsraten, Atem- bzw. Rasselgeräusche (ein Anzeichen von Flüssigkeit in den Lungen), Ödem, Jugularvenen-Aufblähung und im Allgemeinen vergrößerte Herzen aufzuweisen. Die häufigste Ursache für CHF ist Atherosklerose, welche Blockierungen in den Blutgefäßen (Herzkranzarterien) verursacht, welche den Blutstrom zum Herzmuskel bereitstellen. Letztendlich können solche Blockierungen myokardialen Infarkt (Tod des Herzmuskels) mit anschließendem Absinken der Herzfunktion und resultierendem Herzversagen verursachen. Andere Ursachen von CHF schließen Herzklappenfehler, Hypertension, virale Infektionen des Herzens, Alkohol und Diabetes ein. Manche Fälle von Herzversagen finden ohne klare Ätiologie statt und werden als idiopathisch bezeichnet.
CHF wird typischerweise ebenfalls von Änderungen ein einem oder mehreren Aspekten der β-adrenergen neurohumoralen Funktion begleitet; siehe z. B. Bristow, MR, et al., N. Engl. J. Med. 307: 205-211, 1982; Bristow, MR, et al., Circ. Res. 59: 297-309, 1986; Ungerer, M., et al., Circulation 87: 454-461, 1993; Feldman, AM, et al., J. Clin. Invest 82: 189-197, 1988; Bristow, MR, et al., J. Clin. Invest 92: 2737-2745, 1993; Calderone, A., et al., Circ. Res. 69: 332-343. 1991; Marzo, KP, et al., Circ. Res. 69: 1546-1556, 1991; Liang, C.-S., et al., J. Clin. Invest 84: 1267-1275, 1989; Roth, DA, et al., J. Clin. Invest 91: 939-949, 1993; Hadcock, JR, und Malbon, CC: Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5021-5025, 1988; Hadcock, JR, et al., J. Biol. Chem. 264: 19928-19933, 1989; Mahan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 129-133, 1985; Hammond, HK, et al., Circulation 85: 269-280, 1992; Neumann, J., et al., Lancet 2: 936-937, 1988; Urasawa K, et al., in: G Proteins: Signal Transduction and Disease, Academic Press, London. 44-85, 1992; Bohm, M., Mol. Cell. Biochem., 147: 147-160, 1995; Eschenhage, T., et al., Z. Kardiol., 81 (Ergänzungsband 4): 33-40, 1992; und Yamamoto, J., et al., J. Mol. Cell., 26: 617-626, 1994. Siehe auch die zahlreichen zusätzlichen Referenzen bezüglich verschiedener Adenylylcyclase-Enzyme z. B. von Fujita, M., et al., Circulation, 90: (Nr. 4, Teil 2), 1994; Yoshimura, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6716-6720, 1992; Krupinski, J., et al., J. Biol. Chem, 267: 24858-24862, 1992; Ishikawa, Y., et al., J. Biol. Chem, 267: 13553-13557, 1992; Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest, 93: 2224-2229, 1994; Katsushika, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8774-8778, 1992; Wallach, J., et al., FEBS Lett., 338: 257-263, 1994; Watson, PA et al., J. Biol. Chem, 269: 28893-28898, 1994; Manolopoulos, V.G., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 208: 323-331, 1995; Yu, HJ, et al., FEBS Lett., 374: 89-94, 1995; und Chen, Z., et al., J. Biol. Chem, 270: 27525-27530, 1995.
Als ein Ergebnis dieser und anderer Untersuchungen, haben sich Bemühungen zum Behandeln von CHF auf die Verabreichung von pharmakologischen Mitteln konzentriert, wie Catecholaminen und anderen β-adrenergen Agonisten, als Methode zum Stimulieren von β-adrenergen Antworten in dysfunktionalen Herzen. Derartige therapeutische Vorgehensweisen sind lediglich teilweise erfolgreich gewesen. Darüber hinaus kann die langfristige Exposition an Catecholamine schädlich sein. Insbesondere neigt das Herz dazu, weniger antwortfähig gegenüber β-adrenerger Stimulation zu werden, und eine derartige Nicht-Antwortfähigkeit ist typischerweise mit hohen Spiegeln an Catecholaminen im Plasma assoziiert, einem Faktor, welcher im Allgemeinen mit einer schlechten Prognose verknüpft ist.
Derzeitige Behandlungen für CHF schließen pharmakologische Therapien, koronäre Revaskularisierungs-Vorgehensweisen (z. B. Herzkranzarterien-Bypass-Chirurgie und Angioplastie) und Herztransplantation ein. Pharmakologische Therapien richteten sich auf die Erhöhung der Kontraktionskraft des Herzens (durch Verwendung von inotropen Mitteln, wie Digitalis und β-adrenergen Rezeptoragonisten), das Reduzieren von Fluidakkumulation in den Lungen und andernorts (durch Verwendung von Diuretika) und die Reduzierung der Arbeit bzw. Tätigkeit des Herzens (durch Verwendung von Mitteln, welche den systemischen Gefäßwiderstand senken, wie Angiotensin-Converting-Enzym-Inhibitoren). β-adrenerge Rezeptor-Antagonisten sind ebenfalls getestet worden. Obgleich derartige pharmakologische Mittel Symptome verbessern und möglicherweise das Leben verlängern können, bleibt die Prognose in den meisten Fällen bedrückend.
Manche Patienten mit Herzversagen aufgrund einer assoziierten Herzkranzarterien-Erkrankung, können zumindest vorübergehend von Revaskularisierungs-Vorgehensweisen, wie Herzkranzarterien-Bypass-Chirurgie und Angioplastie, profitieren. Derartige Vorgehensweisen sind von potenziellem Nutzen, wenn der Herzmuskel nicht tot ist, aber aufgrund von unangemessenem Blutstrom dysfunktional sein kann. Wenn der normale koronäre Blutstrom wiederhergestellt wird, kann sich der lebensfähige, dysfunktionale Herzmuskel in stärker normaler Weise kontrahieren, und die Herzfunktion kann sich verbessern. Allerdings stellt eine Revaskularisierung selten die Herzfunktion zu normalen oder beinahe-normalen Spiegeln in Patienten mit CHF wieder her, selbst obwohl mäßige Verbesserungen manchmal bemerkt werden.
Schließlich kann Herztransplantation eine geeignete Option für Patienten sein, die keine anderen dies vereitelnden Krankheiten aufweisen und die relativ jung sind, aber dies ist eine Option nur für eine kleine Anzahl von Patienten mit Herzversagen, und nur bei großen Kosten. Zusammengefasst weist CHF eine sehr schlechte Prognose auf und spricht schlecht auf derzeitige Therapien an.
Weiterhin erschwerend für die mit CHF assoziierten physiologischen Bedingungen sind verschiedene natürliche Adaptationen, welche tendenziell in Patienten mit dysfunktionellen Herzen auftreten. Obwohl diese natürlichen Antworten anfänglich die Herzfunktion verbessern können, führen sie letztendlich zu Problemen, welche CHF verschlimmern können, die Behandlung vereiteln können und nachteilige Auswirkungen auf das Überleben aufweisen. Es gibt drei derartige adaptive Antworten, welche üblicherweise in CHF beobachtet werden: (i) Volumen-Retention, induziert durch Änderungen in der Natrium-Reabsorption, welche das Plasmavolumen ausdehnt und anfänglich die Herz-Ausgangsleistung verbessert; (ii) Herz-Vergrößerung (durch Dilatation und Hypertrophie), welche das Schlagvolumen erhöhen kann, während eine relativ normale Wandspannung aufrechterhalten wird; und (iii) erhöhte Norepinephrin-Freisetzung aus adrenergen Nerven-Enden, welche auf das Herz auftreffen, welche durch Wechselwirken mit β-adrenergen Rezeptoren des Herzens dazu neigen, die Herzgeschwindigkeit und Kontraktionskraft zu erhöhen, wodurch der Herzausstoß gesteigert wird. Allerdings neigt jede dieser drei natürlichen Adaptionen letztendlich dazu, aus verschiedenen Gründen zu versagen. Insbesondere neigt die Fluidretention dazu, zu Ödem und zurückgehaltener Flüssigkeit in den Lungen zu führen, welche das Atmen behindert; eine Herzvergrößerung kann zu einer schädlichen Remodellierung des linken Ventrikels mit anschließender schwerer Dilatation und erhöhter Wandspannung führen, wodurch CHF verschlimmert wird; und die Langzeit-Exposition des Herzens an Norepinephrin neigt dazu, das Herz gegenüber adrenerger Stimulation nicht-antwortfähig zu machen und ist mit einer schlechten Prognose verknüpft.
Die kontrollierte Verwendung von pharmakologischen Mitteln, wie β-adrenergen Agonisten und anderen modulatorischen Arzneimitteln bleibt daher eine der Hauptformen zur Behandlung trotz ihrer Nachteile, einschließlich ihres potenziell nachteiligen Effekts auf das Überleben. Forscher, die DNA-Sequenzen analysiert und in manchen Fällen kloniert haben, welche individuelle Komponenten codieren, beteiligt am β-adrenergen Rezeptor-Weg, haben die Verwendung derartiger Komponenten zum Identifizieren neuer Klassen von Arzneistoffen vorgeschlagen, welche sich als brauchbarer bei der Behandlung von CHF erweisen könnten. Zum Beispiel klonierten Ishikawa et al. DNA, codierend zwei unterschiedliche Isoformen von Adenylylcyclase (AC_V und AC_VI), welche bekannterweise im Säugerherzgewebe prädominant sind, und schlugen die Verwendung der DNA und/oder des rekombinanten Proteins zum Identifizieren neuer Klassen von Arzneistoffen vor, welche adrenerge Wege stimulieren könnten (siehe z. B. American Cyanamid, WO 93/05061, 18. März 1993, und EP 0 529 662, 03 . März 1993; und Ishikawa, U.S.-Patent 5 334 521, erteilt am 02. August 1994). In anderen Berichten, in welchen klonierte Komponenten des adrenergen Stimulationsweges untersucht wurden, erzeugten die Autoren transgene Mäuse, welche bestimmte Komponenten (einschließlich Herz-β₂-adrenerger Rezeptoren, G_Sα- und G-Protein-Rezeptorkinase-Inhibitoren) überexprimieren, und erhielten einige Daten, welche nahelegten, dass β-adrenerge Stimulation in transgenen Mäusen gesteigert sein kann (siehe z. B. Gaudin, C., et al., J. Clin. Invest. 95: 1676- 1683, 1995; Koch, W. J., et al., Science 268, 1350-1353, 1995; und Bond, R. A., et al., Nature 364: 272-276, 1995). Keiner dieser Berichte zeigte, dass Herzfunktion in effektiver Weise in Tieren mit Herzversagen wiederhergestellt werden konnte, noch zeigten sie, dass adrenerge Antwortfähigkeit in Großtiermodellen gesteigert werden konnte, welche als aussagefähig für die Vorhersage des Erfolgs bei der Behandlung von CHF in Menschen angesehen werden.
Tatsächlich folgerte ein jüngerer Übersichtsartikel bei der Reflexion der beobachteten Schwierigkeiten, welche assoziiert sind mit der klinischen Verwendung von β-adrenergen Agonisten (wie Dopamin und Dobutamin), dass Stimulation mit β-adrenergen Mitteln schädlich zu sein scheint; und dass, im Gegensatz dazu, β-Rezeptor-"Blocker" oder-Antagonisten nützlicher zur Verbesserung der Krankhaftigkeits- und Sterblichkeits-Raten sein können (siehe z. B. Baughman, K., Cardiology Clinics 13: 27-34, 1995). Während einige Mittel die Symptome verbessern können, bleibt die Prognose für Patienten, welche solche pharmakologischen Mittel empfangen, bedrückend.
Ping et al., (1995) Circulation 92, 8, Ergänzungsband I, Abstract 2727, berichtet, dass Überexpression von Adenylylcyclase VI (AC_VI) das von β-adrenergen Rezezeptor stimulierte cAMP in Herzmuskelzellen bzw.-myozyten aus neugeborenen Ratten erhöht.
Die WO 96/08260 beschreibt eine Mutanten-aktivierte AC2 zur Verwendung als ein therapeutisches Mittel.
Die EP-A-0543134 beschreibt die Klonierung und Charakterisierung einer Herz-AC.
Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung betrifft und überwindet Probleme, welche mit dem Stand der Technik assoziiert sind, durch Bereitstellen von Techniken, durch welche die Herzfunktion effektiv in vivo ohne Verabreichung von β-adrenergen Agonisten-Arzneimitteln gesteigert werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A zeigt ein Schema der Konstruktion eines beispielhaften, replikationsdefekten rekombinanten Adenovirusvektors, der für Gentransfer in Zellen und in das Herz nützlich ist, wie nachstehend beschrieben in Beispiel 5-1.
1B zeigt eine schematische Darstellung eines Klons, verwendet in der Konstruktion eines beispielhaften replikationsdefekten rekombinanten Adenovirusvektors, der nützlich für Gentransfer in Zellen und in das Herz ist, wie beschrieben im unten stehenden Beispiel 5-2.
2 zeigt ein Schema des β-adrenergen-Gs-Adenylylcyclase-Weges an der Zelloberfläche. Durch diesen Weg wird es bewirkt, dass β-adrenerge Stimulation intrazelluläres cAMP erhöht, wodurch die Antwortfähigkeit der Herzgeschwindigkeit und die Kontraktionskraft beeinflusst werden. Der Weg beinhaltet einen β-adrenergen Rezeptor, ein stimulatorisches GTP bindendes Protein (GS), welches Rezeptorbesetzung mit der cAMP-Produktion koppelt, und eine Adenylylcyclase, wie es nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
3 zeigt Daten aus Experimenten unter Verwendung von Forskolin-stimulierter cAMP-Produktion zur Überprüfung der Funktion von Adenylylcyclase in linksventrikulären Membranen aus normalen Schweinen und aus Schweinen mit schwerem Herzversagen, unter Verwendung eines Modells für Herzversagen mit sehr hoher Übereinstimmungs-Genauigkeit zu menschlichem klinischen dilatatierten Herzversagen, wie beschrieben in Beispiel 3.
4 zeigt Daten, welche darauf hinweisen, dass der AC-Gehalt der β-AR-vermittelten Signaltransduktion in Herzmuskelzellen eine Grenze setzt, wie beschrieben in Beispiel 8-1.
5 zeigt Daten, welche anzeigen, dass der Gentransfer eines AC_VI-Transgens in kultivierte ventrikuläre Myocyten von neugeborener Ratte die Spiegel von cAMP erhöhte, welche nach Stimulation entweder mit Isoproterenol (10 μM) oder Forskolin (3 μM) erhalten werden, wie beschrieben in Beispiel 8-1.
6 zeigt Daten aus einer Northern-Analyse, welche die Gegenwart von Transgen-mRNA in Herzmuskelzellen anzeigen, wie beschrieben in Beispiel 8-2.
7 zeigt Daten aus einer Western-Analyse, welche die Gegenwart von Transgen-Protein in Herzmuskelzellen anzeigen, wie beschrieben in Beispiel 8-2.
8A zeigt Daten aus einer Forskolin-Bindungsuntersuchung, welche anzeigen, dass die Netto-GTPγ-simulierte Forskolin-Bindung nach AC_VI-Gentransfer erhöht war (die Daten sind Mittelwerte aus drei Experimenten), wie beschrieben in Beispiel 8-2.
8B zeigt Daten aus einer cAMP-Produktionsuntersuchung, welche anzeigen, dass Herzmuskelzellen, welche das Transgen-AC_VI exprimieren, eine erhöhte adrenerge Antwortfähigkeit nicht nur gegenüber Forskolin-Stimulierung aufweisen, was erhöhte Mengen an AC widerspiegelt, sondern auch gegenüber Isoproterenol, was nahe legt, dass neu synthetisiertes AC funktionell gekoppelt ist mit und rekrutierbar ist durch β-AR-Stimulation, wie beschrieben in Beispiel 8-2. Gezeigt sind Mittelwerte aus drei Experimenten.
8C zeigt die beobachtete Beziehung zwischen AC_VI-Gehalt und cAMP-Produktion, wie beschrieben im Beispiel 8-2. Die Grafik veranschaulicht drei Messungen bzw. Maße der veränderten adrenergen Signalleitung (Forskolin-Bindung und Isoproterenol- und Forskolinstimulierte cAMP-Produktion). Diese Daten weisen darauf hin, dass eine proportionale Erhöhung im AC-Gehalt und eine gesteigerte adrenerge Signalleitung stattgefunden haben.
9 zeigt die Ergebnisse einer Isoproterenol-Stimulations-Untersuchung, wie beschrie ben in Beispiel 8-2. Herzmuskelzellen aus neugeborenen Ratten durchliefen einen Gentransfer unter Verwendung von rekombinantem Adenovirus, welcher lacZ oder AC_VI exprimierte. Nach Gentransfer mit AC_VI (gegenüber lacZ), besteht eine offensichtliche Erhöhung hinsichtlich des hergestellten cAMP über einen weiten Bereich von Isoproterenol-Konzentrationen hinweg. Der EC50 für Isoproterenol-stimulierte cAMP-Produktion war unverändert.
10 zeigt Daten, welche die Effekte von in vivo-Gentransfer von AC_VI auf die Herzgeschwindigkeit in Schweinen zusammenfassen, wie beschrieben in Beispiel 13. Diese Daten demonstrieren erstmalig, dass in vivo-Gentransfer effektiv die adrenerge Antwortfähigkeit in einem großen Säugerherz erhöhen kann.
11 zeigt Ergebnisse eines in vivo-Gentransfers von AC_VI auf das linksventrikuläre (LV) dP/dt in einem normalen Schwein, wie beschrieben in Beispiel 13. Diese Daten demonstrieren ferner, dass in vivo-Gentransfer eines adrenergen Signalleitungs-Elements (in diesem Fall AC_VI) effektiv die Kontraktionsfunktion des intakten Herzens in einem Großtiermodell steigern kann, welches als in hohem Maße voraussagend für die menschliche Herzfunktion angesehen wird.
12A zeigt die Nukleotidsequenz aus humanem AC_VI, wie beschrieben in Beispiel 5-3. Das -X- zeigt eine Lücke von etwa 0,5 kb innerhalb der gezeigten Sequenz an.
12B zeigt die Aminosäuresequenz, welche der in 12A gezeigten Nukleotidsequenz entspricht, wie beschrieben in Beispiel 5-3.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung sieht die Verwendung eines Vektors vor, umfassend ein Gen, codierend eine Adenylylcyclase (AC), operativ verbunden mit einen Promotor, für die Herstellung eines Medikamentes zur Steigerung der Herzfunktion in einem Säuger mit kongestivem Herzversagen, mittels Zuführen dieses Vektors an das Herz des Säugers. Vorzugsweise wird der Vektor in ein Blutgefäß eingebracht, welches Blut zum Herzmuskel bzw. Myokardium des Herzens zuführt, so dass der Vektor an Herzmuskelzellen zugeführt wird; stärker bevorzugt wird der Vektor in das Lumen einer Herzkranzarterie, eines Vena-Saphena-Transplantats oder eines inneren Brustarterien-Transplantats eingeführt. Am stärksten bevorzugt wird der Vektor in das Lumen sowohl der linken als auch der rechten Herzkranzarterie eingeführt. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Säuger um einen Menschen.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Vektor ein Gen, codierend ein β-adrenerges Signalleitungsprotein (β-ASP), welches von der AC verschieden ist, das operativ mit einem Promotor verbunden ist. Alternativ dazu wird ein zweiter Vektor, umfassend ein Gen, codierend ein β-ASP, operativ verbunden mit einem Promotor, in den Säuger eingeführt, wobei das β-ASP von dem AC verschieden ist.
In einer bevorzugten hierin beschriebenen Ausführungsform umfasst der Vektor ein Gen, welches eine Herz-AC codiert, wie AC-Isoform II, AC-Isoform V oder AC-Isoform VI, weiter bevorzugt AC-Isoform VI.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Vektor ein Gen, codierend die AC, operativ verbunden mit einem heterologen konstitutiven Promotor oder einem heterologen induzierbaren Promotor. Ein bevorzugter heterologer konstitutiver Promotor ist ein CMV-Promotor, welcher auch einen Enhancer einschließt. In hierin beschriebenen anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der Promotor ein gewebespezifischer Promotor, vorzugsweise ein herzspezifischer Promotor, weiter bevorzugt ein Ventrikelmyocyten-spezifischer Promotor. Bevorzugte Beispiele von Ventrikelmyocyten-spezifischen Promotoren schließen einen ventrikulären Myosin-Leichtkette-2-Promotor und einen ventrikulären Myosin-Schwerkette-Promotor ein. Das für die AC codierende Gen kann auch mit einem heterologen Enhancer, wie den CMV-Enhancer, operativ verbunden sein. Vorzugsweise ist das für die AC codierende Gen auch mit einem Polyadenylierungssignal operativ verbunden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor ein viraler Vektor oder ein lipidbasierender Vektor, vorzugsweise ein viraler Vektor. Der Vektor kann ein zielgelenkter Vektor, speziell ein zielgelenkter Vektor, welcher preferenziell an ventrikuläre Myocyten bindet, sein. Derzeitig bevorzugte virale Vektoren sind aus Adenovirus (AD) oder adeno-assoziiertem Virus (AAV) abgeleitet. Sowohl humane als auch nicht-humane virale Vektoren können verwendet werden, aber vorzugsweise ist der rekombinante virale Vektor in Menschen replikationsdefekt. Falls der Vektor ein Adenovirus ist, umfasst er vorzugsweise ein Polynukleotid, aufweisend einen Promotor, operativ verbunden mit einem Gen, welches eine Adenylylcyclase codiert, und ist in Menschen replikationsdefekt. Derzeitig bevorzugte replikationsdefekte adenovirale Vektoren weisen Deletionen auf, welche die E1A- und E1-B-Gene entfernen, oder weisen Deletionen auf, welche die E1A-, E1B- und E4-Gene entfernen. Vorzugsweise etwa 10⁷ bis 10¹³ Adenovirus-Vektorpartikel, weiter bevorzugt etwa 10⁹ bis 10¹² Vektorpartikel werden in ein Blutgefäß eingeführt, vorzugsweise ein Blutgefäß, welches den Herzmuskel versorgt, wie oben beschrieben. Für AAV-Vektoren umfasst der Vektor vorzugsweise ein Polynukleotid, aufweisend einen Promotor, operativ verbunden mit einem Gen, das eine Adenylylcyclase codiert, und vorzugsweise wird das Gen, welches eine AC codiert, von invertierten terminalen AAV-Wiederholungseinheiten (ITRs, inverted terminal repeats) flankiert. Vor zugsweise ist der AAV-Vektor in Menschen replikationsdefekt. Derzeitig bevorzugte replikationsdefekte AAV-Vektoren weisen Deletionen auf, welche eine oder mehrere AAV-Replikations- oder Einkapselungs-Sequenzen betreffen. Alternativ dazu kann der Vektor ein lipid-basierender Vektor sein, umfassend ein Gen, welches eine Adenylylcyclase codiert, wie hierin beschrieben.
Bei der Ausführung der Erfindung kann Folgendes angewandt werden:
Ein rekombinantes replikationsdefektes virales Partikel, das ein Gen umfasst, codierend eine Adenylylcyclase, welches operativ mit einem Promotor verbunden ist. Vorzugsweise ist der Promotor ein heterologer konstitutiver oder induzierbarer Promotor. Der Vektor kann auch ein Gen umfassen, welches eine andere β-ASP codiert. Bevorzugte virale Vektoren werden aus Adenovirus (AD) oder Adeno-assoziiertem Virus (AAV) abgeleitet. Sowohl humane als auch nicht-humane virale Vektoren können verwendet werden, aber vorzugsweise ist der rekombinante virale Vektor in Menschen replikationsdefekt. Falls der Vektor ein Adenovirus ist, umfasst er vorzugsweise ein Polynukleotid, aufweisend einen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Gen, welches eine Adenylylcyclase codiert, und ist in Menschen replikationsdefekt. Derzeitig bevorzugte replikationsdefekte adenovirale Vektoren weisen Deletionen auf, welche die E1A- und E1B-Gene entfernen, oder weisen Deletionen auf, welche die E1A-, E1B- und E4-Gene entfernen. Für AAV-Vektoren umfasst der Vektor vorzugsweise ein Polynukleotid, aufweisend einen Promotor, operativ verbunden mit einem Gen, codierend eine Adenylylcyclase, und vorzugsweise ist das Gen, welches die AC codiert, von invertierten endständigen Wiederholungseinheiten (ITRs) von AAV flankiert. Vorzugsweise ist der AAV-Vektor in Menschen replikationsdefekt. Vorliegend bevorzugte replikationsdefekte AAV-Vektoren weisen Deletionen auf, welche eine oder mehrere Replikations- oder Einkapselungs-Sequenzen von AAV beeinflussen. Andere Vektoren der vorliegenden Erfindung schließen auf Lipid basierende Vektoren (wie Liposomen) ein, die ein Gen umfassen, welches eine Adenylylcyclase codiert, wie hierin beschrieben.
Eine Säugerzelle, welche mit einem rekombinanten replikationsdefekten viralen Partikel oder einem anderen Vektor gemäß einer der vorangehenden Ausführungsformen transfiziert ist.
Eine filtrierte injizierbare Adenovirus-Partikel-Präparation, welche umfasst: (i) ein rekombinantes replikationsdefektes Adenovirus-Partikel, wie oben beschrieben, und (ii) einen Träger. Der Träger ist vorzugsweise ein pharmazeutisch annehmbarer Träger. Vorzugsweise ist der Adenovirus-Vektor durch einen 0,1-0,5-Mikrometer-Filter filtriert worden.
Ein Verfahren zur Erzeugung eines rekombinanten replikationsdefekten viralen Partikels, wie oben beschrieben, umfassend die folgenden Schritte in der aufgeführten Reihenfolge:

(i) Einführen von ersten und zweiten Plasmiden in eine replikations-permissive Säugerzelle, wobei ein oder mehrere Adenovirus-Gene, welche Replikationskompetenz vermitteln, exprimiert werden, wobei das erste Plasmid ein Gen umfasst, welches eine Adenylylcyclase codiert, operativ verbunden mit einem Promotor, und ferner ein Replikations-defizientes bzw. replikationsdefektes Adenovirusgenom umfasst, und wobei das zweite Plasmid ein Replikations-profizientes Adenovirusgenom umfasst und ferner eine zusätzliche Polynukleotidsequenz umfasst, welche das zweite Plasmid zu groß sein lässt, um in einem Adenoviruspartikel eingekapselt zu werden, wodurch eine Rescue-Rekombination bzw. Rettungs-Rekombination zwischen dem ersten Plasmid und dem zweiten Plasmid stattfindet, um ein rekombinantes adenovirales Genom zu erzeugen, welches das Gen, codierend die AC, umfasst, dem jedoch ein oder mehrere adenovirale Replikationsgene fehlen, wobei das rekombinante adenovirale Genom ausreichend klein ist, um in einem Adenovirus-Partikel eingekapselt zu werden;
(ii) Identifizieren von erfolgreichen rekombinanten viralen Vektoren in Zellkultur; und
(iii) Vermehren eines resultierenden rekombinanten viralen Partikels in replikationspermissiven Säugerzellen, welche die fehlenden adenoviralen Replikationsgene exprimieren, um ein rekombinantes, replikationsdefektes virales Partikel zu erzeugen.

Der Einführungs-Schritt kann durch Cotransfektion des ersten und zweiten Plasmids in die permissive Säugerzelle bewerkstelligt werden. Das Verfahren kann des Weiteren umfassen, vor dem Schritt des Einführens des ersten und zweiten Plasmids, den Schritt des Klonierens eines Gens, welches eine AC codiert, in ein Plasmid, enthaltend einen Promotor und partielle Adenovirus-Sequenzen des linken Endes eines replikationsdefekten Adenovirusgenoms, so dass das Gen, welches die AC codiert, operativ mit dem Promotor verbunden ist. Vorzugsweise umfasst das Verfahren ferner, nach dem Vermehrungs- bzw. Propagierungs-Schritt, den Schritt des Reinigens der vermehrten viralen Partikel, und schließt vorzugsweise auch das Filtrieren der gereinigten viralen Partikel durch einen 0,1- bis 0,5-Mikrometer-Filter ein. Ein beispielhaftes erstes Plasmid, wie oben beschrieben, ist das Plasmid pAC1 oder das Plasmid ACCMVPLPA, umfassend ein Gen, welches eine AC codiert. Der oben beschriebene Identifizierungsschritt umfasst vorzugsweise die folgenden Schritte: (i) Überwachen von transfizierten Zellen hinsichtlich Anzeichen eines cytopathischen Effekts; (ii) Isolieren von viraler Nukleinsäure aus dem Zellüberstand von Kulturen der transfizierten Zellen, welche einen cytophathischen Effekt aufweisen, Behandeln des Zellüberstands aus Zellkulturen, welche einen cytophathischen Effekt aufzeigen, mit einer Proteinase (wie Proteinase K), gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung; (iii) Identifizieren von erfolgreichen Re kombinanten mit PCR unter Verwendung von Primern, komplementär zu dem Promotor, der operativ verbunden ist mit dem AC-Gen, und Primern, welche komplementär zu Adenovirus-Sequenzen sind, und (iv) Reinigen der rekombinanten viralen Partikel durch Plaque-Reinigung (vorzugsweise während mindestens zwei Runden). Virale Nukleinsäure kann isoliert werden durch Behandlung des Zellkulturüberstandes, der im Verdacht steht, rekombinante virale Partikel zu enthalten, mit einer Proteinase (wie Proteinase K), gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion des proteinase-behandelten Überstandes zum Entfernen von Proteinen, und letztendlich, Ethanol-Fällung des Lysats zum Erhalten von viraler DNA.
Der Reinigungsschritt, wie oben beschrieben, umfasst vorzugsweise folgende Schritte: (i) Vermehren der resultierenden Rekombinanten in Zellen, transformiert mit den Replikationskompetenz vermittelnden Genen, bis zu Titern im Bereich 10¹⁰-10¹² Virenpartikeln; und (ii) Reinigen der vermehrten Rekombinanten (vorzugsweise durch doppelte CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation).
Ein rekombinantes provirales Plasmid, umfassend ein Gen, codierend eine AC, operativ verbunden mit einem Promotor, und ferner umfassend ein replikationsdefektes virales Genom. Vorzugsweise handelt es sich bei der AC um Adenylylcyclase-Isoform VI. Beispielartige replikationsdefekte Genome schließen ein Adenovirusgenom und ein AAV-Genom ein. Falls das rekombinante replikationsdefekte virale Genom ein Adenovirusgenom ist, kann das Adenovirus entweder ein humanes oder ein nicht-humanes Säugtier-Adenovirus (vorzugsweise nicht-humaner Säuger) sein, aber ist in jedem Fall vorzugsweise in Menschen replikationsdefekt. Vorzugsweise weist das rekombinante replikationsdefekte Adenovirusgenom Deletionen auf, welche die E1A- und E1B-Gene entfernen, oder Deletionen, welche die E1A-, E1B- und E4-Gene entfernen. Falls das rekombinante replikationsdefekte virale Genom ein AAV-Genom ist, besitzt das AAV-Genom vorzugsweise Deletionen, welche eine oder mehrere Replikations- oder Einkapselungssequenzen von AAV beeinflussen.
Eine Zelle, welche ein rekombinantes provirales Plasmid gemäß einer der vorangehenden Ausführungsformen umfasst.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen
Ein "Polynukleotid" bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide, oder Analoge davon. Dieser Begriff bezieht sich auf Primärstruktur des Moleküls und schließt somit doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA ein. Er schließt des Weiteren modifizierte Polynukleotide ein, wie methylierte und/oder gecappte Polynukleotide.
"Rekombinant", wie angewandt auf ein Polynukleotid, bedeutet, dass das Polynukleotid das Produkt verschiedener Kombinationen von Klonierungs-, Restriktions- und Ligationsschritten ist, und anderer Vorgehensweisen, welche zu einem Konstrukt führen, welches von einem Polynukleotid verschieden ist, das in der Natur gefunden wird.
Ein "Gen" bezieht sich auf ein Polynukleotid oder einen Abschnitt eines Polynukleotids, umfassend eine Sequenz, welche ein Protein codiert. Für die meisten Situationen ist es wünschenswert für das Gen, ebenfalls einen Promotor zu umfassen, welcher operativ mit der codierenden Sequenz verbunden ist, um die Transkription effektiv zu fördern. Enhancer, Repressoren und andere regulatorische Sequenzen können ebenfalls eingeschlossen sein, um die Aktivität des Gens zu modulieren, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist (siehe z. B. die nachstehend zitierten Referenzen).
Die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden austauschbar verwendet, um Bezug auf Polymere von Aminosäuren beliebiger Länge zu nehmen. Diese Begriffe schließen ebenfalls Proteine ein, welche posttranslational durch Reaktionen modifiziert werden, die Glycosylierung, Acetylierung und Phosphorylierung beinhalten.
Eine "heterologe" Komponente bezieht sich auf eine Komponente, welche eingeführt wird in oder hergestellt wird innerhalb eines Wesens, das zu demjenigen unterschiedlich ist, in welchem sie natürlicherweise lokalisiert ist. Zum Beispiel ist ein Polynukleotid, das aus einem Organismus abgeleitet und durch gentechnische Verfahrensweisen eingebracht wird in einen unterschiedlichen Organismus, ein heterologes Polynukleotid, welches, falls exprimiert, ein heterologes Polypeptid codieren kann. In ähnlicher Weise ist ein Promotor oder Enhancer, welcher aus seiner nativen codierenden Sequenz entfernt wurde und an eine unterschiedliche codierende Sequenz operativ verknüpft wurde, ein heterologer Promotor oder Enhancer.
Ein "Promotor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, welche die Transkription eines Gens oder einer codierenden Sequenz, an welche(s) sie operativ verknüpft ist, reguliert. Eine große Anzahl von Promotoren, einschließlich konstitutiver, induzierbarer und reprimierbarer Promotoren, aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Quellen, ist im Fachgebiet allgemein bekannt und verfügbar als oder innerhalb von klonierten Polynukleotidsequenzen (z. B. aus Hinterlegungsstellen, wie der ATCC, sowie anderen kommerziellen oder individuellen Quellen).
Ein "Enhancer", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, welche die Transkription eines Gens oder einer codierenden Sequenz, mit welcher sie operativ verbunden ist, steigert. Eine große Anzahl von Enhancern, aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Quellen, ist im Fachgebiet allgemein bekannt und verfügbar als oder innerhalb von klonierten Polynukleotidsequenzen (z. B. von Hinterlegungsstellen, wie der ATCC sowie anderen kommerziellen oder individuellen Quellen). Eine Anzahl von Polynukleotiden, welche Promotorsequenzen umfassen (wie dem allgemein verwendeten CMV-Promotor), umfasst ebenfalls Enhancer-Sequenzen.
"Operativ verbunden" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, in welcher die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, welche ihnen gestattet, in ihrer beabsichtigten Weise zu funktionieren. Ein Promotor ist operativ verbunden mit einer codierenden Sequenz, wenn der Promotor die Transkription der codierenden Sequenz reguliert. Obwohl ein operativ verbundener Promotor im Allgemeinen stromaufwärts der codierenden Sequenz lokalisiert ist, ist er nicht notwendigerweise daran angrenzend. Ein Enhancer ist operativ mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn der Enhancer die Transkription der codierenden Sequenz erhöht. Operativ verbundene Enhancer können stromaufwärts, innerhalb oder stromabwärts von codierenden Sequenzen lokalisiert sein. Eine Polyadenylierungssequenz ist operativ mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn sie am stromabwärtigen Ende der codierenden Sequenz lokalisiert ist, so dass die Transkription durch die codierende Sequenz in die Polyadenylierungssequenz hinein verläuft.
Ein "Replikon" bezieht sich auf ein Polynukleotid, umfassend einen Replikationsursprung, welcher die Replikation des Polynukleotids in einer geeigneten Wirtszelle gestattet. Beispiele schließen Replikons einer Zielzelle ein, in welche eine heterologe Nukleinsäure integriert werden könnte (z. B. nukleäre und mitochondriale Chromosomen), sowie extrachromasomale Replikons (wie replizierende Plasmide und Episomen).
"Genzuführung", "Gentransfer" und dergleichen, wie hierin verwendet, sind Begriffe, welche sich auf die Einbringung eines exogenen Polynukleotids (manchmal bezeichnet als ein "Transgen") in eine Wirtszelle beziehen, ungeachtet des für die Einführung angewandten Verfahrens. Solche Verfahren schließen eine Vielzahl von allgemein bekannten Techniken ein, wie vektor-vermittelten Gentransfer (z. B. durch virale Infektion/Transfektion oder verschiedene andere proteinbasierende oder lipid-basierende Genzuführungskomplexe) sowie Techniken, welche die Zuführung bzw. Einbringung von "nackten" Polynukleotiden erleichtern (wie Elektroporation, "Gen-Kanonen"-Zuführung und verschiedene andere Techniken, die für die Einbringung von Polynukleotiden verwendet werden). Das eingebrachte Polynukleotid kann in der Wirtszelle stabil oder vorübergehend aufrechterhalten werden. Eine stabile Aufrechter haltung erfordert typischerweise, dass das eingeführte Polynukleotid entweder einen Replikationsursprung enthält, der mit der Wirtszelle kompatibel ist, oder in ein Replikon der Wirtszelle integriert, wie ein extrachromosomales Replikon (z. B. ein Plasmid) oder ein nukleäres oder mitochondriales Chromosom. Eine Anzahl von Vektoren ist bekanntermaßen in der Lage, den Transfer von Genen in Säugerzellen zu vermitteln, wie es im Fachgebiet bekannt und hierin beschrieben ist.
"In vivo"-Genzuführung,-Gentransfer,-Gentherapie und dergleichen, wie hierin verwendet, sind Begriffe, welche auf die Einbringung eines Vektors, der ein exogenes Polynukleotid umfasst, direkt in den Körper eines Organismus, wie eines Menschen oder eines Nicht-Mensch-Säugtiers, Bezug nehmen, wodurch das exogene Polynukleotid zu einer Zelle eines derartigen Organismus in vivo eingeführt wird.
Ein "Vektor" (manchmal bezeichnet als ein Genzuführungs- oder Gentransfer-"Vehikel") bezieht sich auf ein Makromolekül oder einen Komplex von Molekülen, umfassend ein Polynukleotid, das zu einer Wirtszelle zugeführt werden soll, entweder in vitro oder in vivo. Das zuzuführende Polynukleotid kann eine codierende Sequenz von Interesse bei der Gentherapie umfassen. Vektoren schließen zum Beispiel virale Vektoren (wie Adenoviren ("Ad"), adenoassoziiierte Viren (AAV) und Retroviren), Liposomen und andere lipidhaltige Komplexe und sonstige makromolekulare Komplexe ein, die fähig zur Vermittlung einer Zuführung eines Polynukleotids in eine Wirtszelle sind. Vektoren können des Weiteren andere Komponenten oder Funktionalitäten umfassen, welche die Genzuführung und/oder Genexpression weiter modulieren, oder welche den angezielten Zellen anderweitig vorteilhafte Eigenschaften bereitstellen. Wie nachstehend beschrieben und in größerer Ausführlichkeit veranschaulicht, schließen derartige andere Komponenten, zum Beispiel, Komponenten ein, welche die Bindung oder das Abzielen auf/an Zellen beeinflussen (einschließlich Komponenten, welche zelltyp- oder gewebe-spezifische Bindung vermitteln); Komponenten, welche die Aufnahme der Vektornukleinsäure durch die Zelle beeinflussen; Komponenten, welche die Lokalisierung des Polynukleotids innerhalb der Zelle nach einer Aufnahme beeinflussen (wie Mittel, welche die Zellkernlokalisierung vermitteln), und Komponenten, welche die Expression des Polynukleotids beeinflussen. Solche Komponenten könnten ebenfalls Marker einschließen, wie detektierbare und/oder selektierbare Marker, welche verwendet werden können, um Zellen zu detektieren oder selektieren, welche die von dem Vektor zugeführte Nukleinsäure aufgenommen haben und selbige exprimieren. Derartige Komponenten können als ein natürliches Merkmal des Vektors bereitgestellt werden (wie die Verwendung bestimmter viraler Vektoren, welche Komponenten oder Funktionalitäten aufweisen, welche die Bindung und Aufnahme vermitteln), oder Vektoren können modifiziert werden, um derartige Funktionalitäten bereitzustellen. Eine große Vielzahl derartiger Vektoren ist im Fachgebiet bekannt und allgemein verfüg bar (siehe z. B. die verschiedenen, nachstehend zitierten Bezugsstellen).
Ein "rekombinanter viraler Vektor" bezieht sich auf einen viralen Vektor, umfassend ein oder mehrere heterologe Gene oder Sequenzen. Da viele virale Vektoren Größen-Beschränkungen aufzeigen, welche mit der Verpackung assoziiert sind, werden die heterologen Gene oder Sequenzen typischerweise durch Ersetzen von einem oder mehreren Bereichen des viralen Genoms eingeführt. Derartige Viren können replikationsdefekt werden, was es erforderlich macht, die deletierten Funktion(en) in trans während der viralen Replikation und Einkapselung bereitzustellen (z. B. durch Verwendung eines Helfervirus oder einer Verpackungszelllinie, welche für Replikation und/oder Einkapselung notwendige Gene trägt) (siehe z. B. die nachstehenden Referenzen und Veranschaulichungen). Modifizierte virale Vektoren, in welchen ein zuzuführendes Polynukleotid auf der Außenseite des viralen Partikels getragen wird, sind ebenfalls beschrieben worden (siehe z. B. Curiel, DT, et al., PNAS 88: 8850-8854, 1991).
Virale "Verpackung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Reihe von intrazellulären Ereignissen, welche zur Synthese und Assemblierung eines viralen Vektors führen. Eine Verpackung beinhaltet typischerweise die Replikation des "pro-viralen Genoms" oder eines rekombinanten Pro-Vektors, der typischerweise als ein "Vektorplasmid" bezeichnet wird (welches ein rekombinantes Polynukleotid ist, das in einer zu einem viralen Genom analogen Weise verpackt werden kann, typischerweise als ein Ergebnis davon, dass es von geeigneten viralen "Verpackungssequenzen" flankiert wird), gefolgt von Einkapselung oder einer anderen Umhüllung der Nukleinsäure. Daher, wenn ein geeignetes Vektorplasmid in eine Verpackungszelllinie unter geeigneten Bedingungen eingeführt wird, kann es repliziert und zu einem viralen Partikel assembliert werden. Virale "rep"- und "cap"-Gene, welche in vielen viralen Genomen gefunden werden, sind Gene, welche Replikations- bzw. Einkapselungsproteine codieren. Ein "replikationsdefekter" oder "replikations-inkompetenter" viraler Vektor bezieht sich auf einen viralen Vektor, in welchem ein oder mehrere Funktionen, notwendig für Replikation und/oder Verpackung fehlen oder verändert sind, was den viralen Vektor unfähig macht, virale Replikation im Anschluss an die Aufnahme durch eine Wirtszelle zu initiieren. Um Stammlösungen derartiger replikationsdefekter viraler Vektoren herzustellen, kann das Virus oder die provirale Nukleinsäure in eine "Verpackungszelllinie" eingeführt werden, welche modifiziert worden ist, um Gene zu enthalten, codierend die fehlenden Funktionen, (welche in trans bereitgestellt werden können). Beispielsweise können derartige Verpackungsgene stabil in ein Replikon der Verpackungszelllinie integriert sein oder sie können durch Transfektion mit einem "Verpackungsplasmid" oder Helfervirus, welches Gene trägt, die die fehlenden Funktionen codieren, eingeführt werden.
Ein "nachweisbares Markergen" ist ein Gen, welches gestattet, dass Zellen, die das Gen tragen, spezifisch nachgewiesen werden (z. B. von Zellen unterschieden werden, welche das Markergen nicht tragen). Eine große Vielzahl derartiger Markergene ist im Fachgebiet bekannt. Bevorzugte Beispiele davon schließen nachweisbare Markergene eine, welche Proteine codieren, welche auf Zelloberflächen erscheinen, wodurch eine vereinfachte und rasche Detektion und/oder zelluläre Sortierung vereinfacht wird. Zur Veranschaulichung kann das lacZ-Gen, welches β-Galactosidase codiert, als ein detektierbarer Marker verwendet werden, der gestattet, dass mit einem Vektor, welcher das lacZ-Gen trägt, transduzierte Zellen durch Färbung nachgewiesen werden, wie es nachstehend beschrieben wird.
Ein "selektierbares Markergen" ist ein Gen, welches gestattet, dass Zellen, die das Gen tragen, spezifisch positiv oder negativ selektiert werden in Gegenwart eines entsprechenden selektiven Mittels. Zur Veranschaulichung kann ein Antibiotikumresistenzgen als ein positives selektierbares Markergen verwendet werden, welches zulässt, dass eine Wirtszelle in Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums positiv selektiert wird. Selektierbare Marker können positiv, negativ oder bifunktional sein. Positive selektierbare Marker gestatten die Selektion hinsichtlich Zellen, welche den Marker tragen, wohingegen negative selektierbare Marker es gestatten, dass Zellen, die den Marker tragen, selektiv eliminiert werden. Eine Vielzahl solcher Markergene ist beschrieben worden, einschließlich bifunktioneller (d. h. positiv/negativ) Marker (siehe z. B. WO 92/08796, veröffentlicht am 29. Mai 1992, und WO 94/28143, veröffentlicht am B. Dezember 1994). Derartige Markergene können eine zusätzliche Kontrollmaßnahme vorsehen, welche im Zusammenhang mit Gentherapie vorteilhaft sein kann.
"β-adrenerge Signalleitung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf β-adrenerge rezeptorvermittelte Signalleitung, welche über β-adrenerge Rezeptoren ("β-ARs") vermittelt wird, die auf Zelloberflächen vorhanden sind. Von besonderer Relevanz im Kontext der vorliegenden Erfindung sind Rezeptoren, die auf der Oberfläche von β-adrenergisch stimulierten Zellen im Herzmuskel von Säugerherzgewebe vorhanden sind. Wie es nachstehend beschrieben ist, wird β-adrenerge Signalleitung innerhalb von Herzmuskelgewebe anfänglich durch Agonistenbindung an β-AR vermittelt, gefolgt von G_S-vermittelter Signaltransduktion zu Adenylylcyclase (AC). Aktivierte AC katalysiert dann die Synthese von cyclischem AMP (cAMP), und erhöhte intrazelluläre Konzentrationen an cAMP vermitteln erhöhte cytosolische Calciumübergänge, welche sowohl die Geschwindigkeit als auch die Kraft der Herzkontraktion steigern (bezeichnet als positive Chronotrophie bzw. positive Inotrophie). Verschiedene β-adrenerge Signalleitungsproteine und andere Faktoren, welche β-adrenerge Signalleitung beeinflussen, sind im Fachgebiet beschrieben und werden hierin weiter veranschaulicht.
Ein "β-adrenerges Signalleitungsprotein" (hierin manchmal abgekürzt als "β-ASP") oder "β- adrenerges Signalelement" bezieht sich auf ein Protein, welches fähig zur Steigerung der β-adrenergen rezeptor-vermittelten Signalleitung ist, wenn es in Säugergewebe exprimiert wird, vorzugsweise (für die Zwecke der vorliegenden Erfindung), wenn es in Säugetier-Herzmuskelgewebe exprimiert wird. β-adrenerge Signalleitungsproteine schließen somit "β-adrenerge Signaltransducer"-Proteine ein, welche β-adrenerge Signalleitung vermitteln oder transduzieren, vorzugsweise in Säuger-Herzmuskelzellen, sowie Proteine, welche derartige Transducer-Proteine entweder stimulieren können oder welche Inhibitoren derartiger Transducer-Proteine inaktivieren oder damit konkurrieren können (wodurch indirekt die Signaltransduktion gesteigert wird). Eine Vielzahl derartiger Proteine, welche mit der von β-adrenergen Rezeptoren vermittelten Signalleitung in Säuger-Herzgewebe assoziiert sind, sind identifiziert worden (siehe z. B. die verschiedenen Referenzen unter Bezugnahme auf β-adrenerge Antwortfähigkeit, wie oben zitiert) und werden hierin veranschaulicht. Beispiele für β-ASPs spielen bekanntermaßen eine Rolle in der β-adrenergen Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Säuger-Herzgewebe, wie etwa die verschiedenen Proteine, die assoziiert sind mit dem "β-AR-Gs-AC"-Weg, umfassend einen β-adrenergen Rezeptor ("βAR"), einen G_S-Protein-Transducer und einen Adenylylcyclase ("AC")-Effektor, sowie Proteine, welche die Aktivität von derartigen β-AR-Gs-AC-Proteinen erhöhen, wie es ausführlicher hierin und im zitierten Stand der Technik beschrieben wird. Neuere Daten haben demonstriert, dass G_S-Protein im Allgemeinen bei einem viel höheren molaren Anteil als entweder βAR oder AC vorhanden ist. Besondere Beispiele für β-ASPs schließen Folgende ein: β-adrenerge Rezeptoren (wie β₁-adrenerge Rezeptoren oder β₂-adrenerge Rezeptoren, weiter bevorzugt β₁-adrenerge Rezeptoren), Adenylylcyclasen (vorzugsweise eine Herz-AC, wie AC_V oder AC_VI, weiter bevorzugt AC_VI); sowie Inhibitoren der Funktion von G-Protein-Rezeptorkinasen (welche im Allgemeinen hierin als "GRK"-Inhibitoren bezeichnet werden).
"β-adrenerge Rezeptoren" (abgekürzt "β-AR" oder "βAR") sind die Zelloberflächen-Rezeptoren, welche an der von β-adrenergem Rezeptor vermittelten Signalleitung über den β-AR-Gs-AC-Weg beteiligt sind. Innerhalb des Herzmuskels eines Säugerherzens sind βARs die Hauptrezeptoren für Norepinephrin (den sympathischen Neurotransmitter) und für Epinephrin (das Nebennierenhormon). Menschlicher Herzmuskel enthält sowohl β₁-adrenerge Rezeptoren als auch β₂-adrenerge Rezeptoren, aber β₁-ARs sind vorherrschend und sind am engsten mit der veränderten β-adrenergen Signalleitung assoziiert, welche bei Herzversagen beobachtet wird, wie nachstehend beschrieben.
"G_S-Protein" ist ein GTP-bindendes regulatorisches Protein, welches effektiv die Aktivierung einer Vielzahl von Zelloberflächenrezeptoren (einschließlich β-adrenergen Rezeptoren) an die Aktivierung von Adenylylcyclase koppelt, wie im Fachgebiet und hierin beschrieben.
"Adenylylcyclase" (EC 4.6.1.1, ebenfalls bezeichnet als "Adenylcyclase", "Adenylatcyclase" und "cAMP"-Synthease) ist ein Enzym, welches die Umwandlung von Adenosintriphosphat (ATP) zu 3':5'-cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) katalysiert. Adenylylcyclase (hierin abgekürzt als "AC") existiert Bekannterweise in einer Anzahl von unterschiedlichen Isoformen, welche bei variierenden Spiegeln in fast allen Säugergeweben gefunden werden. Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren, am stärksten bevorzugten Adenylylcyclasen sind "Herz-Adenylylcyclasen", welche Isoformen sind, welche festgestellterweise in Säugerherzgewebe vorherrschend sind, insbesondere in Herzmuskelzellen; wie es nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
"G-Protein-Rezeptorkinasen" (abgekürzt "GRK", aber im Fachgebiet ebenfalls bezeichnet als "β-adrenerge Rezeptorkinasen" oder "βARK") sind Kinaseproteine, welche die Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen, einschließlich β-adrenergen Rezeptoren ("βARs") katalysieren. Die Phosphorylierung von βARs durch GRK-Proteine führt zur Entkopplung der Rezeptoren und einer einhergehenden Verringerung hinsichtlich der Antwortfähigkeit gegenüber β-adrenerger Signalleitung.
"GRK-Inhibitoren", wie hierin verwendet, beziehen sich auf Proteine, welche die Funktion von G-Protein-Rezeptorkinasen inhibieren. Derartige Inhibitoren von GRK schließen modifizierte GRK-Proteine ein, in welchen Rezeptor-Bindungs-Aktivität von der Kinaseaktivität entkoppelt worden ist. Beispielhafte GRK-Inhibitoren schließen somit modifizierte GRKs ein, welche verkürzt worden sind (typischerweise durch Delektionen, beginnend am Aminoterminus), um die Kinasefunktion zu entfernen, während die Fähigkeit zum Binden an G-Proteingekoppelte Rezeptorproteine, wie βARs beibehalten wird. Solche verkürzten GRK-Proteine können daher effektiv mit normalen GRK kompetitieren oder selbige davon abhalten, an βAR zu binden, aber verursachen keine anschließende Inhibition der Rezeptoraktivität (da ihnen die Kinaseaktivität fehlt).
"Gefäßsystem" oder "vaskulär" sind Begriffe, welche sich auf das System von Gefäßen beziehen, welches Blut (sowie Lymphflüssigkeiten) überall im Säugerkörper trägt.
"Blutgefäß" bezieht sich auf jedwedes der Gefäße des Säugergefäßsystems, einschließlich Arterien, Arteriolen, Kapillaren, Venulen, Venen, Höhlen und Vasa vasorum.
"Arterie" bezieht sich auf ein Blutgefäß, durch welches Blut vom Herzen weg läuft. Herzkranzarterien versorgen die Gewebe des Herzens selbst, während andere Arterien die restlichen Organe des Körpers versorgen. Die allgemeine Struktur einer Arterie besteht aus einem Lumen, umgeben von einer mehrschichtigen arteriellen Wand.
Ein "Individuum", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen großen Säuger, am stärksten bevorzugt einen Menschen.
"Behandlung" oder "Therapie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Verabreichung, an einen individuellen Patienten, von Mitteln, welche in der Lage sind, einen prophylaktischen, kurativen oder sonstigen nutzbringenden Effekt in dem Individuum hervorzurufen.
"Gentherapie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Verabreichung von Vektoren, welche ein therapeutisches Gen umfassen, an einen individuellen Patienten.
Ein "therapeutisches Polynukleotid" oder "therapeutisches Gen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, welche in der Lage ist, wenn sie in ein Individuum überführt wird, eine prophylaktische, kurative oder sonstige nutzbringende Wirkung in dem Individuum zu bewirken.
Bezugsstellen
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, außer, es ist anderweitig angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie und dergleichen anwenden, welche innerhalb des Kenntnisstands auf dem Fachgebiet liegen. Derartige Techniken werden vollständig in der Literatur erläutert; siehe z. B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., Hrsg., 1987 und neuere Ausgaben); Essential Molecular Biology (T. Brown, Hrsg., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel, Hrsg., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al., Hrsg., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology (R. Wu et al., Hrsg., Academic Press 1989); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Cell Culture for Biochemists (R. Adams, Hrsg., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos Hrsg., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler, Hrsg., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard et al., Hrsg., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2. Ausgabe (R. Freshney et al., Hrsg., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al., Hrsg., Wiley-Liss 1990); die Artikelreihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz, Hrsg., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, Hrsg.); Cellular and Molecular Immunology (A. Abbas et al., W.B. Saunders Co. 1991, 1994); Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al., Hrsg. 1991); die Artikelreihe Annual Review of Immunology; die Artikelreihe Ad vances in Immunology; Oligonucleotide Synthesis (M. Gait, Hrsg., 1984); and Animal Cell Culture (R. Freshney Hrsg., IRL Press 1987).
Zusätzliche Bezugsstellen, welche die Zuführung und Logistik der chirurgischen Behandlung beschreiben, die in der vorliegenden Erfindung angewandt werden kann, schließen die Folgenden ein: Topol, EJ (Hrsg.), The Textbook of Interventional Cardiology, 2. Ausgabe (W. B. Saunders Co. 1994); Rutherford, RB, Vascular Surgery, 3. Ausgabe (W. B. Saunders Co. 1989); Wyngaarden JB et al. (Hrsg.), The Cecil Textbook of Medicin, 19. Ausgabe (W. B. Saunders, 1992); und Sabiston, D., The Textbook of Surgery, 14. Ausg. (W. B. Saunders Co., 1991).
Weitere Bezugsstellen, welche Zelltypen, welche in den Blutgefäßen gefunden werden, und die Struktur des Gefäßsystems beschreiben, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, schließen die Folgenden ein: W. Bloom & D. Fawcett, A Textbook of Histology, 10. Ausg. (W. B. Saunders Co. 1975).
Verschiedene Veröffentlichungen haben Vorschläge über die Anwendungen von Gentransfer zur Behandlung oder Verhinderung von Krankheit, einschließlich Herzkrankheit, gemacht; siehe z. B. Methods in Molecular Biology, Band 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (Hrsg.), Humana Press, Clifton, N. J. (1991); Mazur et al., Molecular and Cellular Pharmacology, 21: 104-111, 1994; French, Herz 18: 222-229, 1993; Williams, American Journal of Medical Sciences 306: 129-136, 1993; und Schneider und Freneh, Circulation 88: 1937-1942, 1993.
Quellen und strukturelle/funktionelle Merkmale von Vektoren und verschiedenen AC-Proteinen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, werden in den verschiedenen Berichten angegeben, wie überall in dieser Patentschrift zitiert, und werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Beschreibung von verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen
Verschiedene bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachstehend zusammengefasst und in den anschließenden ausführlichen Beschreibungen und Beispielen weiter beschrieben und veranschaulicht.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, CHF zu behandeln, wobei ein oder mehrere AC-Proteine in vivo in einem Patienten synthetisiert werden, durch Abzielen auf den Herzmuskel mit einem Vektorkonstrukt, enthaltend ein Gen, das eine AC codiert. Die bevorzugten Aspekte verwenden Vektorkonstrukte, welche zur lokalisierten Expression der AC führen, welche relativ auf den Herzmuskel des Patienten begrenzt ist. Die vorliegend bevorzugten Adenylylcyclasen ("AC"s) schließen Herz-AC, wie AC_II, AC_V oder AC_VI, weiter bevorzugt AC_VI ein.
Bevorzugte Vektoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen virale Vektoren, lipid-basierende Vektoren und andere Vektoren ein, welche zur Zuführung von DNA an nicht-teilende Zellen in vivo in der Lage sind. Vorliegend bevorzugt sind virale Vektoren, insbesondere replikationsdefekte virale Vektoren (einschließlich zum Beispiel replikationsdefekter Adenovirusvektoren und adeno-assoziierten Virus (AAV)-Vektoren). Für die Einfachheit der Herstellung und Anwendung in der vorliegenden Erfindung werden vorliegend replikationsdefekte Adenovirusvektoren am stärksten bevorzugt.
Die vorliegend bevorzugte Methode zur in vivo-Zuführung (speziell für Vektorkonstrukte, welche nicht anderweitig zielgelenkt werden für Zuführung und/oder Expression, welche auf den Herzmuskel begrenzt ist), besteht in der Injektion des Vektors direkt in ein Blutgefäß, welches den Herzmuskel versorgt, vorzugsweise mittels Injektion in eine Herzkranzarterie. Eine solche Injektion wird vorzugsweise erzielt durch einen Katheter, welcher im Wesentlichen (typischerweise mindestens etwa 1 cm) innerhalb des Ostiums bzw. der Mündung von einer oder beiden Herzkranzarterien oder einer oder mehreren Vena-Saphena- oder inneren Brustarterien-Transplantaten oder anderen Kanälen bzw. Adern, welche Blut an den Herzmuskel zuführen, eingeführt wird.
Durch Injizieren der Vektor-Stammlösung, welche vorzugsweise kein Wildtypvirus enthält, tief in das Lumen einer oder beider Herzkranzarterien (oder Implantate oder sonstigen Gefäßkanäle), vorzugsweise sowohl in die rechte als auch linke Herzkranzarterie (oder Implantate oder andere Gefäßkanäle) und vorzugsweise in einer Menge von 10⁷-10¹³ Virenpartikeln, wie bestimmt durch optische Densitometrie (weiter bevorzugt 10⁹-10¹¹ Virenpartikel), ist es möglich, eine gewünschte Anzahl von Zellen, speziell Herzmuskelzellen, mit Genen lokal zu transfizieren, welche Proteine codieren, die β-adrenerge Signaltransduktion im betroffenen Herzmuskel erhöhen, wodurch die therapeutische Effektivität des Gentransfers maximiert und unerwünschte Effekte an extrakardialen Stellen und die Möglichkeit einer entzündlichen Antwort auf virale Proteine minimiert werden. Vektorkonstrukte, welche spezifisch auf den Herzmuskel abzielen, wie Vektoren, die Herzmuskel-spezifische Bindungs- oder Aufnahmekomponenten beinhalten; und/oder welche AC-Transgene beinhalten, die unter der Steuerung von Herzmuskel-spezifischen transkriptionellen regulatorischen Sequenzen (z. B. Ventrikelmyocyten-spezifischen Promotoren) stehen, können anstelle von, oder vorzugsweise zusätzlich zu, derartigen gerichteten Injektionstechniken als Methode zur weiteren Eingrenzung der Expression auf den Expression auf den Herzmuskel, speziell die ventrikulären Myocyten, verwendet werden. Für Vektoren, welche eine Immunantwort hervorrufen können, wird es bevorzugt, den Vektor direkt in ein Blutgefäß zu injizieren, welches den Herzmuskel versorgt, wie oben beschrieben, obwohl die zusätzlichen Techniken zum Einschränken des Potenzials für eine extrakardiale Expression ebenfalls angewandt werden können.
Wie nachstehend ausführlich beschrieben, haben wir gezeigt, dass die Anwendung derartiger Techniken mit Vektoren, welche AC-Transgene tragen, effektiv die endogene β-adrenerge Antwortfähigkeit verstärken und innerhalb des Herzmuskels eines Großsäugerherzens funktionieren kann, ohne irgendeinen beobachteten Effekt auf Nicht-Herz-Gewebe und ohne Erzeugen irgendeiner wesentlichen Immunreaktion.
Ebenfalls beschrieben wird eine filtrierte, injizierbare Adenovirusvektor-Präparation, umfassend einen rekombinanten Adenovirusvektor, vorzugsweise bei einem letztendlichen Virentiter von 10⁷-10¹⁴ viralen Teilchen, wobei der Vektor kein Wildtypvirus enthält und eine partielle Adenovirussequenz umfasst, aus welcher ein oder mehrere erforderliche Adenovirusgene, welche Replikationskompetenz vermitteln, zum Beispiel die E1A/E1B-Gene, deletiert worden sind, und ein Transgen, codierend für eine AC, wie AC_VI, AC_V oder andere Adenylylcyclase, angetrieben von einem Promotor, flankiert von der partiellen Adenovirussequenz; und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Ebenfalls beschrieben werden Verfahren für die Erzeugung von rekombinanten Viren-Stammlösungen, fähig zur Bewirkung einer Expression einer AC in vivo im Herzmuskel, umfassend die Schritte des Klonierens eines Transgens, codierend eine AC (wie AC_VI, AC_V oder eine andere Adenylylcyclase) in ein Plasmid, welches einen Promotor und einen Polylinker enthält, flankiert von partiellen Adenovirussequenzen eines Adenovirusgenoms, aus welchem ein oder mehrere Adenovirus-Gene, erforderlich für Replikationskompetenz (allgemein bezeichnet als virale Replikations- oder "rep"-Gene, wie die E1A/E1B-Gene des humanen Adenovirus-5-Genoms deletiert worden sind; des Co-Transfizierens des Plasmids in Säugerzellen, welche mit den fehlenden Replikationsgenen transformiert wurden, zusammen mit einem Plasmid, welches ein vollständiges Adenovirusgenom und ein zusätzliches Insert, welches das Plasmid zu groß macht, um eingekapselt zu werden, enthält, wodurch eine Rescue-Rekombination zwischen dem Transgen-inserierten Plasmid und dem Plasmid mit dem gesamten Adenovirusgenom stattfindet, sodass ein rekombinantes Genom erzeugt wird, enthaltend das Transgen ohne die deletierten viralen Replikationsgene, wobei das rekombinante Genom ausreichend klein ist, um eingekapselt zu werden; des Identifizierens erfolgreicher Rekombinanten in Zellkulturen; des Vermehrens der resultierenden Rekombinanten in Säugerzellen, umfassend oder transformiert mit den viralen Replikationsgenen; und des Reinigens der vermehrten Rekombinanten, sodass der rekombinante Vektor, ohne Wildtypvirus, darin enthalten ist, und vorzugsweise des Hindurchleitens des gereinigten Vektors durch einen Filter, vorzugsweise einen 0,1- bis 0,5-Mikrometer-Filter, weiter bevorzugt einen 0,3-Mikrometer-Filter, um eine gereinigte, gefilterte rekombinante Virus-Stammlösung zu erhalten.
Diese und andere Aspekte werden nachstehend beschrieben und veranschaulicht.
Transgene, welche β-adrenerge Signalleitungs-Elemente codieren
Die vorliegende Erfindung verwendet Gene, codierend Protein- oder Peptidelemente, welche β-adrenerge Signalleitung erhöhen, und deshalb in der Lage sind, die Antwortfähigkeit auf endogene β-adrenerge Stimulation innerhalb von dysfunktionalen Regionen eines Säugerherzens zu steigern. Derartige Proteine werden hierin als "β-adrenerge Signalleitungsproteine" (oder "β-ASPs") bezeichnet. Der Ausdruck β-ASP bezieht sich auf ein Protein, welches fähig zur Steigerung der β-adrenergen Signalleitung ist, wenn es in Säugergewebe exprimiert wird, vorzugsweise (für die Zwecke der vorliegenden Erfindung), wenn es in Säuger-Herzmuskelgewebe exprimiert wird.
β-adrenerge Signalproteine schließen β-adrenerge Signaltransducerproteine ein, welche β-adrenerge Signalleitung vermitteln oder transduzieren bzw. umwandeln, vorzugsweise in Säuger-Herzmuskel-Zellen, sowie Proteine, welche derartige Transducer-Proteine entweder stimulieren können oder welche Inhibitoren derartiger Transducer-Proteine inaktivieren oder damit kompetitieren können (wodurch die Signaltransduktion indirekt gesteigert wird). Viele solche Proteine, welche mit β-adrenerger Signalleitung in Säuger-Herzgewebe assoziiert sind, sind identifiziert worden (siehe z. B. die verschiedenen Bezugsstellen unter Bezugnahme auf β-adrenerge Antwortfähigkeit, welche oben zitiert sind) und werden hierin veranschaulicht.
Die Erfindung verwendet ein AC-Gen. Bevorzugte zusätzliche β-ASPs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, sind diejenigen, welche bekanntermaßen eine Rolle in der β-adrenergen Signaltransduktion in Säugerherzgewebe spielen, wie die verschiedenen Proteine, assoziiert mit dem "β-AR-Gs-AC"-Weg, umfassend einen β-adrenergen Rezeptor ("βAR"), einen G_S-Proteintransducer und einen Adenylylcyclase("AC")-Effektor, wie ausführlicher hierin und im zitierten Fachgebiet beschrieben wird. Neuere Daten haben demonstriert, dass G_S-Protein im Allgemeinen bei einem viel höheren molaren Anteil vorhanden ist als entweder βAR oder AC.
β-adrenerge Signalleitung innerhalb von Herzmuskelgewebe wird anfänglich vermittelt durch Agonistenbindung an βAR gefolgt von G_S-vermittelter Signaltransduktion an AC. Aktivierte AC katalysiert dann die Synthese von cyclischem AMP, und erhöhte intrazelluläre Konzentration von cAMP vermitteln erhöhte cytosolische Calcium-Übergänge, welche sowohl die Rate als auch die Kraft der Herzkontraktion steigern (bezeichnet als positive "Chronotrophie" bzw. positive "Inotrophie").
Beispiele von besonders bevorzugten zusätzlichen β-ASPs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen daher Folgende ein: β-adrenerge Rezeptoren (wie β₁-adrenerge Rezeptoren oder β₂-adrenerge Rezeptoren, vorzugsweise β₁-adrenerge Rezeptoren) sowie Inhibitoren der Funktion von G-Protein-Rezeptorkinasen (welche im Allgemeinen hierin als "GRK"-Inhibitoren bezeichnet werden).
β-adrenerge Rezeptoren (abgekürzt "β-AR" oder "βAR") sind Zelloberflächenrezeptoren, die an β-adrenerger Signalleitung über den βAR-Gs-AC-Weg beteiligt sind. Innerhalb des Herzmuskels eines Säugerherzens sind βARs die Hauptrezeptoren für Norepinephrin (dem sympathischen Neurotransmitter) und für Epinephrin (das Nebennierenhormon). Humaner Herzmuskel enthält sowohl β₁-adrenerge Rezeptoren als auch β₂-adrenerge Rezeptoren, aber β₁-ARs sind vorherrschend und sind am engsten mit der veränderten β-adrenergen Signalleitung assoziiert, welche bei Herzversagen beobachtet wird.
G_S Protein ist ein GTP-bindendes regulatorisches Protein, welches effektiv die Aktivierung einer Vielzahl von Zelloberflächenrezeptoren (einschließlich β-adrenergen Rezeptoren) an die die Aktivierung von Adenylylcyclase koppelt, wie es im Fachgebiet und hierin beschrieben wird.
Adenylylcyclase (ebenfalls bezeichnet als "Adenylylcyclase" und abgekürzt als "AC") ist ein Enzym, welches die Umwandlung von Adenosintriphosphat (ATP) zu 3':5'-zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) katalysiert. Adenylylcyclase existiert bekanntermaßen in einer Anzahl von unterschiedlichen Isoformen, welche bei variierenden Spiegeln in fast allen Säugergeweben gefunden werden. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten, am stärksten bevorzugten Adenylylcyclasen sind "Herz-Adenylylcyclasen", welche Isoformen sind, die festgestelltermaßen in Säugerherzgewebe vorherrschend sind, insbesondere in Herzmuskelzellen; wie es nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
G-Protein-Rezeptorkinasen (abgekürzt "GRK", jedoch im Fachgebiet ebenfalls bezeichnet als "β-adrenerge Rezeptorkinasen" oder "βARK") sind Kinaseproteine, welche die Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen katalysieren, einschließlich β-adrenergen Rezeptoren ("βARs"). Die Phosphorylierung von βARs durch GRK-Proteine führt zur Inaktivierung der Rezeptoren und einer einhergehenden Senkung in der Antwortfähigkeit gegenüber β-adrenerger Signalleitung.
GRK-Inhibitoren, wie hierin verwendet, beziehen sich auf Peptidinhibitoren der Funktion von G-Protein-Rezeptorkinasen. Peptidinhibitoren von GRK beinhalten modifizierte GRK-Proteine, in welchen die Rezeptorbindungsaktivität von der Kinaseaktivität entkoppelt worden ist. Beispielhafte GRK-Inhibitoren schließen somit modifizierte GRKs ein, welche verkürzt worden sind (typischerweise durch Deletionen, beginnend am Aminoterminus), um Kinasefunktion zu entfernen, während die Fähigkeit, an G-Protein-gekoppelte Rezeptorproteine, wie βARs, zu binden, beibehalten wird. Solche verkürzten GRK-Proteine können daher effektiv mit normalem GRK kompetitieren oder selbiges daran hindern, an βAR zu binden, jedoch ohne eine anschließende Inhibition der Rezeptoraktivität zu verursachen.
Gene, welche derartige β-adrenergen Signalleitungsproteine codieren, einschließlich bevorzugten Genen, codierend βARs, AC-Isoformen und Inhibitoren von GRK-Proteinen, sind im Fachgebiet bekannt und allgemein verfügbar (siehe z. B. die oben zitierten Bezugsstellen in Hinsicht auf β-adrenerge Signalleitungskomponenten). Darüber hinaus, da die diese Komponenten dazu neigen, relativ hoch konserviert zu sein, können neue Homologe (oder Isoformen) von bekannten Genen im Allgemeinen ohne Weiteres erhalten werden durch Screening einer cDNA- oder genomischen Bibliothek von Interesse (z. B. einer gewebespezifischen cDNA-Bibliothek), unter Verwendung von Techniken, welche heutzutage im Fachgebiet relativ gut bekannt sind (siehe z. B. die hierin zitierten Molekularbiologie-Bezugsstellen).
Die am stärksten bevorzugten Adenylylcyclasen der vorliegenden Erfindung sind "Herz-Adenylylcyclasen", welche Isoformen sind, die festgestelltermaßen im Säugerherzgewebe vorherrschend sind, insbesondere in Herzmuskelzellen. Derzeitig bevorzugte Herz-ACs schließen AC-Isoform V (abgekürzt "AC_V") und AC-Isoform VI (abgekürzt "AC_VI") ein, wobei AC_VI aus hierin beschriebenen Gründen vorliegend am stärksten bevorzugt wird. Obwohl diese verschiedenen AC-Isoformen hinsichtlich DNA- und Proteinsequenz unterschiedlich sind, und typischerweise in einer gewebespezifischen An exprimiert. werden, sind bestimmte der Isoformen zueinander nah homolog, und die Säuger-Isoformen besitzen im Allgemeinen ein gemeinsames topographisches Merkmal, umfassend Transmembran-überspannende Regionen, welche mit großen cytoplasmatischen Schleifen assoziiert sind. Darüber hinaus neigt die Aminosäurezusammensetzung der cytoplasmatischen Schleifen dazu, unter Isoformen konserviert zu sein. Typischerweise wird klonierte DNA, welche derartige Adenylylcyclasen codiert, bereits in Form von Plasmiden verfügbar sein, obwohl Polynukleotide, welche die Enzyme codieren, ebenfalls unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion(PCR)-Methodik erhalten werden können, wie im Fachgebiet beschrieben (siehe z. B. PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press bei Oxford University Press 1991)). Der Nachweis, die Reinigung und die Charakterisierung von Adenylylcyclasen, einschließlich Assays zum Identifizieren und Charakterisieren neuer Adenylylcyclasen, welche in einem gegebenen Zelltyp effektiv sind, ist ebenfalls in einer Anzahl von Veröffentlichungen beschrieben worden (siehe z. B. die hierin zitierten Bezugsstellen von Ishikawa et al. und Krupinski et al., in Hinsicht auf AC-Isoformen).
Wie nachstehend ausführlicher beschrieben und veranschaulicht wird, haben wir Gentherapie-Techniken erfolgreich eingesetzt, um AC codierende Vektoren in den Herzmuskel eines Großtiermodells zuzuführen, von welchem bestimmt wurde, für die Herzfunktion beim Menschen voraussagend zu sein. Wir haben des Weiteren gezeigt, dass Genzuführung der AC zu einer gesteigerten Herzfunktion in den getesteten Tieren führte, was darauf hinweist, dass die Erfindung wahrscheinlich effektive Alternativen zu derzeitigen Behandlungen für kongestives Herzversagen bereitstellt.
Vektoren für Genzuführung in vivo
Im Allgemeinen wird das Gen von Interesse in vivo in das Herz überführt, einschließlich Herzmuskelzellen, und steuert die Produktion des codierten Proteins. Vorzugsweise ist eine derartige Produktion verhältnismäßig konstitutiv. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Gentransfervektoren, einschließlich viralen sowie nicht-viralen Systemen, kann angewandt werden, um Transgene zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zuzuführen (siehe z. B. die oben zitierten Referenzen). Wie nachstehend veranschaulicht, haben wir festgestellt, dass das Helfer-unabhängige, replikationsdefekte humane Adenovirus-5-System effektiv verwendet werden kann, um einen großen Prozentsatz von Herzmuskelzellen in vivo durch eine einzelne intrakoronäre Injektion zu transfizieren. Wir haben des Weiteren gezeigt, dass eine derartige Zuführungstechnik angewandt werden kann, um mit Vektoren effektiv auf den Herzmuskel eines Groβ-Säugetierherzens abzuzielen. Zusätzliche Methoden zum Ziellenken von Vektoren zu jeweiligen Zellen oder Gewebetypen werden nachstehend und im Fachgebiet beschrieben.
In verschiedenen nachstehend beschriebenen Veranschaulichungen haben wir rekombinante Adenovirusvektoren verwendet, basierend auf dem humanen Adenovirus 5 (wie beschrieben von McGrory, WJ., et al., Virology 163: 614-617, 1988), denen essenzielle "early"-Gene aus dem Adenovirusgenom fehlen (üblicherweise E1A/E1B) und welche deshalb nicht in der Lage sind, zu replizieren, außer sie werden in permissiven Zelllinien herangezogen, welche die fehlenden Genprodukte in trans bereitstellen. Anstelle der fehlenden genomischen Adenovirussequenzen kann ein Transgen von Interesse in Gewebe/Zellen kloniert und exprimiert werden, infiziert mit dem replikationsdefekten Adenovirus. Obwohl Adenovirus-basierender Gentransfer im Allgemeinen nicht zu einer stabilen Integration des Transgens in das Wirtsgenom führt (weniger als 0,1 % Adenovirus-vermittelte Transfektionen führen zu Transgen-Einbau in Wirts-DNA), können Adenovirus-Vektoren bei hohem Titer vermehrt werden und nicht-replizierende Zellen transfizieren; und dies ist, obwohl das Transgen nicht auf Tochterzellen weitergegeben wird, geeignet für einen Gentransfer zu adulten Herzmuskelzellen, welche sich nicht aktiv teilen. Retrovirusvektoren sehen einen stabilen Gentransfer vor, und hohe Titer sind nun durch Retrovirus-Pseudotypisierung erhältlich (Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 8033-8037, 1993), aber derzeitige Retrovirusvektoren sind im Allgemeinen nicht in der Lage, nicht-replizierende Zellen effizient zu transduzieren.
Ein mit sich nicht teilenden Zellen, wie Myocyten, assoziierter Vorteil besteht darin, dass der virale Vektor nicht ohne Weiteres durch Wirtszell-Teilung "ausverdünnt" wird. Um die Dauer einer Transgen-Expression im Herzen weiter zu steigern, ist es jedoch ebenfalls möglich, verschiedene Adenovirusvektoren der zweiten Generation zu verwenden, welche sowohl E1- als auch E4-Deletionen aufweisen, welche im Zusammenhang mit Cyclophosphamid-Verabreichung verwendet werden können (siehe z.. Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92: 1401-1405, 1995). Um das Ausmaß des anfänglichen Gentransfers weiter zu erhöhen, können auch Mehrfachinfusionen oder Infusion in einem isolierten Koronär-Ader verwendet werden.
Humane 293-Zellen, bei welchen es sich um humane embryonische Nierenzellen handelt, transformiert mit Adenovirus E1A/E1B-Genen, sind beispielhaft für brauchbare permissive Zelllinien für die Produktion derartiger replikationsdefekter Vektoren. Allerdings können auch andere Zelllinien, welche die Vermehrung von replikationsdefekten Adenovirusvektoren darin zulassen, wie HeLa-Zellen, verwendet werden.
Bezugsstellen, welche eine Vielzahl von anderen Genzuführungsvektoren beschreiben, sind im Fachgebiet bekannt, von welchen einige hierin zitiert werden. Solche anderen Vektoren schließen zum Beispiel andere virale Vektoren (wie adenoassoziierte Viren (AAV), Liposomen und andere lipid-enthaltende Komplexe, sowie andere makromolekulare Komplexe, die fähig zur Vermittlung der Zuführung eines Polynukleotids an eine Wirtszelle sind) ein. Wie oben und in den zitierten Bezugsstellen beschrieben, können Vektoren auch andere Komponenten oder Funktionalitäten umfassen, welche Genzuführung und/oder Genexpression weiter modulieren, oder welche anderweitig vorteilhafte Eigenschaften an die angezielten Zellen vermitteln. Derartige andere Komponenten schließen zum Beispiel Komponenten, welche Bindung an oder Abzielen auf Zellen beeinflussen (einschließlich Komponenten, welche zelltyp- oder gewebespezifische Bindung vermitteln); Komponenten, welche die Aufnahme der Vektornukleinsäure durch die Zellen beeinflussen; Komponenten, welche die Lokalisierung des Polynukleotids innerhalb der Zelle nach der Aufnahme beeinflussen (wie Mittel, welche eine Zellkern- bzw. nukleäre Lokalisierung vermitteln); und Komponenten, welche die Ex pression des Polynukleotids beeinflussen, ein. Derartige Komponenten könnten auch Marker, wie detektierbare und/oder selektierbare Marker, einschließen, welche verwendet werden können, um Zellen zu detektieren oder für selbige zu selektieren, welche die von dem Vektor zugeführte Nukleinsäure aufgenommen haben und selbige exprimieren. Derartige Komponenten können als ein natürliches Merkmal des Vektors bereitgestellt werden (wie bei der Verwendung von bestimmten viralen Vektoren, welche Komponenten oder Funktionalitäten aufweisen, die Bindung und Aufnahme vermitteln), oder Vektoren können modifiziert werden, um derartige Funktionalitäten bereitzustellen. Selektierbare Marker können positiv, negativ oder bifunktional sein. Positive selektierbare Marker gestatten die Selektion hinsichtlich Zellen, welche den Marker tragen, wohingegen negative selektierbare Marker ermöglichen, dass Zellen, welche den Marker tragen, selektiv eliminiert werden. Eine Vielzahl derartiger Markergene ist beschrieben worden, einschließlich bifunktioneller (d. h. positiver/negativer) Marker (siehe z. B. Lupton, S., WO 92/08796, veröffentlicht am 29. Mai 1992; und Lupton, S., WO 94/28143, veröffentlicht am B. Dezember 1994). Solche Markergene können eine zusätzliche Kontrollmaßnahme bereitstellen, welche im Zusammenhang mit Gentherapie vorteilhaft sein kann. Eine große Vielzahl derartiger Vektoren sind im Fachgebiet bekannt und sind allgemein verfügbar (siehe z. B. die verschiedenen oben zitierten Bezugsstellen).
Zusätzliche Referenzen, welche Adenovirusvektoren und andere virale Vektoren beschreiben, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, schließen die Folgenden ein: Horwitz, M. S., Adenoviridae and Their Replication, in Fields, B., et al. (Hrsg.) Virology, Band 2, Raven Press New York, S. 1679-1721, 1990); Graham, F., et al., S. 109-128, in Methods in Molecular Biology, Band 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (Hrsg.), Humana Press, Clifton, N.J. (1991); Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Schreier, H., Pharmaceutica Acta Helvetiae 68: 145-159, 1994; Schneider und French, Circulation 88: 1937-1942, 1993; Curiel, D.T., et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992; Graham, F.L., et al., WO 95/00655 (5. Januar 1995); Falck-Pedersen, E. S., WO 95/16772 (22. Juni 1995); Denefle, P., et al., WO 95/23867 (8. September 1995); Haddada, H., et al., WO 94/26914 (24. November 1994); Perricaudet, M., et al., WO 95/02697 (26. Januar 1995); Zhang, W., et al., WO 95/25071 (12. Oktober 1995). Eine Vielzahl von Adenovirus-Plasmiden ist ebenfalls aus kommerziellen Quellen erhältlich, einschließlich z. B. Microbix Biosystems of Toronto, Ontario (siche, z. B. das Microbix-Produkt-Informationsblatt: Plasmids for Adenovirus Vector Construction, 1996).
Zusätzliche Bezugsstellen, welche AAV-Vektoren beschreiben, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, schließen die Folgenden ein: Carter, B., Handbook of Parvoviruses, Band I, S. 169-228, 1990; Berns, Virology, S. 1743-1764 (Raven Press 1990); Carter, B., Curr. Opin. Biotechnol., 3: 533-539, 1992; Muzyczka, N., Cur rent Topics in Microbiology and Immunology, 158: 92-129, 1992; Flotte, T. R., et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356, 1992; Chatterjee et al., Ann. NY Acad. Sci., 770: 79-90, 1995; Flotte, T. R., et al., WO 95/13365 (18. Mai 1995); Trempe, J. P., et al., WO 95/13392 (18. Mai 1995); Kotin, R., Human Gene Therapy, 5: 793-801, 1994; Flotte, T. R., et al., Gene Therapy 2: 357-362, 1995; Allen, J. M., WO 96/17947 (13. Juni 1996); und Du et al., Gene Therapy 3: 254-261, 1996.
Weitere Bezugsstellen, welche nicht-virale Vektoren beschreiben, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, beinhalten die Folgenden: Ledley, FD, Human Gene Therapy 6: 1129-1144, 1995; Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Chonn, A., et al., Curr. Opin. in Biotech. 6: 698-708, 1995; Schofield, JP, et al., British Med. Bull. 51: 56-71, 1995; Brigham, K. L., et al., J. Liposome Res. 3: 31-49, 1993; Brigham, K. L., WO 91/06309 (16. Mai 1991); Felgner, P. L., et al., WO 91/17424 (14. November 1991); Solodin et al., Biochemistry 34: 13537-13544, 1995; WO 93/19768 (14. Oktober 1993); Debs et al., WO 93/25673; Felgner, P. L., et al., U.S.-Patent 5 264 618 (23. November 1993); Epand, R. M., et al., U.S.-Patent 5 283 185 (1. Februar 1994); Gebeyehu et al., U.S.-Patent 5 334 761 (2. August 1994); Felgner, P. L., et al., U.S.-Patent 5 459 127 (17. Oktober 1995); Overell, R.W., et al., WO 95/28494 (26. Oktober 1995); Jessee, WO 95/02698 (26. Januar 1995); Haces und Ciccarone, WO 95/17373 (29. Juni 1995); Lin et al., WO 96/01840 (25. Januar 1996).
Konstruktion von rekombinanten viralen Vektoren
Für die Zwecke der Veranschaulichung einer vektor-vermittelten Genzuführung von AC in den Herzmuskel wählen wir einen grundlegenden (d. h. "Erstgenerations-") Adenovirusvektor, welcher durch die Rescue-Rekombinationstechnik konstruiert werden kann, wie beschrieben in McGrory, WJ, et al., Virology 163: 614-617, 1988. Kurz gesagt, wird das Transgen von Interesse in einen Shuttle-Vektor kloniert, welcher einen Promotor, einen Polylinker und partielle flankierende Adenovirussequenzen, aus denen E1A/E1B-Gene deletiert worden sind, enthält.
Veranschaulichende Shuttle-Vektoren schließen z. B. das Plasmid "pAC1" (Virology 163: 614-617, 1988) (oder ein Analog) ein, welches Bereiche des linken Endes des humanen Adenovirus-5-Genoms codiert, aber welchem die "Early"-Protein-Region fehlt, umfassend E1A- und E1B-Sequenzen, welche essenziell für die virale Replikation sind, und das Plasmid "ACCMVPLPA" (J. Biol. Chem. 267: 25129-25134, 1992) ein, welches einen Polylinker, einen CMV-Promotor und ein SV40-Polyadenylierungssignal, flankiert von partiellen Adenovirus-Sequenzen, aus welchen die E1A/E1B-Gene deletiert worden sind, enthält. Die Ver wendung von Plasmiden, wie pAC1 oder ACCMVPLA kann somit das Klonierungsverfahren vereinfachen.
Der Shuttle-Vektor kann dann, zusammen mit einem Plasmid, umfassend das gesamte humane Adenovirus-5-Genom (jedoch mit einer zu großen Länge, um eingekapselt zu werden) in geeignete Wirtszellen, wie humane 293-Zellen, cotransfiziert werden. Die Cotransfektion kann durch Kalziumphosphat-Präzipitation oder Lipofektion durchgeführt werden (siehe z. B. Biotechniques 15: 868-872, 1993).
Als ein veranschaulichendes Plasmid für die Cotransfektion codiert das Plasmid "JM17" das gesamte humane Adenovirus-5-Genom sowie Teile des Vektors pBR322, einschließlich des Gens für Ampicillinresistenz (4,3 kb) (Giordano et al., Nature Medicine 2: 534-539, 1996). Obwohl JM17 alle Adenovirus-Proteine codiert, welche notwendig sind, um reife virale Partikel herzustellen, ist es zu groß, um eingekapselt zu werden (40 kb gegenüber 36 kb für den Wildtyp).
In einer kleinen Untergruppe von cotransfizierten Zellen findet "Rescue-Rekombination" zwischen dem Transgen enthaltenden Shuttle-Vektor (wie Plasmid pAC1) und dem Plasmid, welches das gesamte Adenovirus-5-Genom aufweist (wie Plasmid pJM17) statt, welche ein rekombinantes Genom erzeugt, das das Transgen von Interesse anstatt der deletierten E1A/E1B-Sequenzen enthält, und das in sekundärer Weise die zusätzliche Sequenz (wie pBR322-Sequenzen) während der Rekombination verliert, wodurch es klein genug ist, um eingekapselt zu werden (siehe z. B. Giordano et al., Nature Medicine 2: 534-539, 1996). Eine Veranschaulichung eines derartigen Vektors wird präsentiert in 1. Das CMV-gesteuerte β-Galactosidase-Gen in Adenovirus-HCMVSP1lacZ (Nature Medicine 2: 534-539, 1996) kann verwendet werden, um die Effizienz des Gentransfers unter Verwendung von X-gal-Behandlung zu überprüfen.
Veranschaulichende Beispiele, welche die Herstellung und Verwendung derartiger Vektoren demonstrieren, sind nachstehend angegeben. Vorteile der Verwendung von Adenovirus-Vektoren schließen die Fähigkeit zur Bewirkung eines Hocheffizienz-Gentransfers (soviel wie 50 % der Zielorgan-Zellen werden in vivo transfiziert), die Leichtigkeit des Erhaltens von Hochtiter-Virenstammlösungen und die Fähigkeit dieser Vektoren, Gentransfer in Zellen wie Herzmuskelzellen, welche sich nicht teilen, zu bewirken, ein.
Eine Vielzahl von anderen Vektoren, geeignet für in vivo-Gentherapie kann ebenfalls ohne weiteres angewandt werden, um AC-Transgene gemäß der vorliegenden Erfindung zuzuführen. Derartige andere Vektoren schließen, zur Veranschaulichung, andere virale Vektoren, wie adeno-assoziierte Virus(AAV)-Vektoren; nicht-virale proteinbasierende Zuführungsplattformen; sowie lipidbasierende Vektoren (einschließlich z. B. kationischen Liposomen und analogen Genzuführungskomplexen) ein. Die Herstellung und Verwendung dieser und anderer Vektoren wird im Fachgebiet beschrieben (siehe z. B. die Referenzen in Hinsicht auf Genzuführungs-Vektoren, welche oben zitiert wurden).
Zielgerichtete AC-Vektor-Konstrukte
Die vorliegende Erfindung betrachtet die Verwendung von Zell-Targeting, nicht nur durch zum Beispiel Zuführung des Transgens in die Herzkranzarterie, sondern ebenfalls durch Verwendung von zielgelenkten Vektorkonstrukten, aufweisend Merkmale, welche dazu neigen, die Genzuführung und/oder Genexpression auf besondere Wirtszellen oder Wirtszelltypen (wie den Herzmuskel) zielzurichten. Derartige zielgelenkte Vektorkonstrukte werden daher zielgerichtete Zuführungsvektoren und/oder zielgerichtete Vektoren einschließen, wie ausführlicher nachstehend und im veröffentlichten Stand der Technik beschrieben wird. Die Eingrenzung von Zuführung und/oder Expression kann als eine Methode zur weiteren Fokussierung der potenziellen Effekte von Gentherapie sein. Die potenzielle Nützlichkeit von einer weiteren Eingrenzung von Zuführung/Expression hängt zu einem großen Teil von dem Typ des verwendeten Vektors und dem Verfahren und dem Ort der Einführung eines solchen Vektors ab. Wie hierin beschrieben, ist von der Zuführung viraler Vektoren mittels intrakoronärer Injektion in den Herzmuskel beobachtet worden, von sich aus eine in hohem Maße zielgelenkte Genzuführung bereitzustellen (siehe die nachstehenden Beispiele). Darüber hinaus, bei Verwendung von Vektoren, welche nicht zu einer Transgen-Integration in ein Replikon der Wirtszelle führen (wie Adenovirus und zahlreiche andere Vektoren), wird von Herzmuskelzellen erwartet, eine relative lange Transgen-Expression aufzuzeigen, da die Zellen keinem raschen Turnover unterliegen. Im Gegensatz dazu, wird die Expression in sich rascher teilenden Zellen dazu neigen, durch Zellteilung und Turnover verringert zu werden. Allerdings können auch andere Methoden zur Beschränkung von Zuführung und/oder Expression angewandt werden, zusätzlich zu oder anstelle von den veranschaulichten Zuführungsverfahren, wie hierin beschrieben.
Zielgerichtete Zuführungsvektoren schließen beispielsweise Vektoren ein (wie Viren, nicht-virale protein-basierende Vektoren und lipid-basierende Vektoren), aufweisend Oberflächenkomponenten (wie ein Mitglied eines Ligand-Rezeptor-Paares, dessen andere Hälfte auf einer anzuzielenden Wirtszellen gefunden wird) oder andere Merkmale, welche eine präferenzielle Bindung und/oder Genzuführung zu besonderen Wirtszellen oder Wirtszelltypen vermitteln. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, besitzt eine Anzahl von Vektoren. von sowohl viralem als auch nicht-viralem Ursprung inhärente Eigenschaften, welche eine derartige präferenzielle Bindung erleichtern, und/oder ist modifiziert worden, um ein präferenzielles Targeting bzw. Abzielen zu bewirken (siehe z. B. Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Chonn, A., et al., Curr. Opin. in Biotech. 6: 698-708, 1995; Schofield, J. P., et al., British Med. Bull. 51: 56-71, 1995; Schreier, H., Pharmaceutica Acta Helveliae 68: 145-159, 1994; Ledley, F. D., Human Gene Therapy 6: 1129-1144, 1995; Conary, J. T., et al., WO 95/34647 (21. Dezember 1995); Overell, R. W., et al., WO 95/28494 (26. Oktober 1995); und Truong, V. L., et al., WO 96/00295 (4. Januar 1996)).
Zielgelenkte Vektoren schließen Vektoren (wie Viren, nicht-virale protein-basierende Vektoren und lipid-basierende Vektoren) ein, bei welchen eine Zuführung zu einer Transgen-Expression führt, welche relativ beschränkt auf besondere Wirtszellen. oder Wirtszelltypen ist. Zur Veranschaulichung können gemäß der vorliegenden Erfindung zuzuführende AC-Transgene operativ an heterologe, gewebespezifische Promotoren verknüpft sein, wodurch die Expression auf Zellen in diesem besonderen Gewebe eingegrenzt wird.
Zum Beispiel können gewebespezifische Transkriptionssteuerungssequenzen, abgeleitet aus einem Gen, codierend aus dem linken Ventrikel stammende Myosin-Leichtkette-2 (MLC_2V) oder Myosin-Schwerkette (MHC), an ein AC-Transgen (wie das AC_VI-Gen) innerhalb eines Vektors, wie den oben beschriebenen Adenovirus-Konstrukten, fusioniert werden. Die Expression des Transgens kann deshalb auf ventrikuläre Herzmuskelzellen relativ eingeschränkt werden. Die Effektivität von Genexpression und das Ausmaß an Spezifität, bereitgestellt durch MLC_2V- und MHC-Promotoren mit lacZ, sind bestimmt worden (unter Verwendung eines rekombinanten Adenovirussystems, wie demjenigen, welches hierin beispielhaft angegeben wird); und eine herzspezifische Expression ist berichtet worden (siehe z. B. Lee et al., J. Biol. Chem. 267: 15875-15885, 1992).
Da der MLC_2V-Promotor nur etwa 250 bp umfasst, wird er ohne weiteres sogar in größenbegrenzte Zuführungsvektoren passen, wie dem Adenovirus-5-Verpackungssystem, welches hierin beispielhaft angegeben ist. Der Myosin-Schwerketten-Promotor, welcher bekanntermaßen ein starker Promotor der Transkription ist, sieht einen anderen alternativen herzspezifischen Promotor vor und umfasst weniger als 300 bp. Andere Promotoren, wie der Troponin-C-Promotor sehen keine derartige Gewebespezifität vor, obgleich sie in hohem Maße effektiv und ausreichend klein sind.
Vermehrung und Reinigung von viralen Vektoren
Rekombinante virale Vektoren, wie adenovirale Vektoren, können gemäß Standardverfahren Plaque-gereinigt werden. Zur Veranschaulichung können rekombinante adenovirale Virenvek toren in humanen 293-Zellen vermehrt werden (welche E1A- und E1B-Funktionen in trans bereitstellen), bis zu Titern im bevorzugten Bereich von etwa 10¹⁰-10¹² viralen Teilchen/ml.
Vermehrungs- und Reinigungstechniken sind für eine Vielzahl von viralen Vektoren beschrieben worden, welche im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Adenovirale Vektoren werden hierin als Beispiel angeführt, aber andere virale Vektoren, wie AAV, können ebenfalls verwendet werden. Für Adenovirus, können Zellen bei etwa 80 % Konfluenz infiziert und 48 Stunden später geerntet werden. Nach 3 Gefrier-Auftau-Zyklen können die Zelltrümmer durch Zentrifugation gesammelt werden, und das Virus durch CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation gereinigt werden (Doppel-CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation wird bevorzugt).
Vor einer in vivo-Injektion können die viralen Stammlösungen durch Gelfiltration durch Sepharose-Säulen, wie G25-Sephadex, entsalzt werden. Das Produkt kann dann durch einen 30-Mikrometer-Filter filtriert werden, wodurch das Potenzial für nachteilige Effekte verringert wird, welche mit einer intrakoronären Injektion von unfiltriertem Virus assoziiert sind. Die resultierende virale Stammlösung besitzt vorzugsweise einen letztendlichen Virentiter, welcher mindestens etwa 10¹⁰-10¹² virale Partikel/ml beträgt.
Vorzugsweise ist das rekombinante Adenovirus in hohem Maße aufgereinigt und ist im Wesentlichen frei von (potenziell replikationsfähigem) Wildtyp-Virus. Aus diesen Gründen können Vermehrung und Aufreinigung durchgeführt werden, um Kontaminanten und Wildtypvirus auszuschließen, beispielsweise durch Identifizieren von erfolgreichen Rekombinanten mit PCR unter Verwendung von passenden Primern, Durchführen von zwei Runden Plaque-Reinigung und Doppel-CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation. Zusätzlich haben wir gefunden, dass die mit Herz-Arrhythmien assoziierten Probleme, welche durch Adenovirus-Vektor-Injektionen in Patienten induziert werden können, im Wesentlichen vermieden werden können durch Filtration des rekombinanten Adenovirus durch einen passend bemessenen Filter vor der intrakoronären Injektion. Diese Strategie scheint auch Gentransfer und-expression wesentlich zu verbessern.
Zuführung von Vektoren, welche ein oder mehrere AC-Transgene tragen
Die Mittel und Zusammensetzungen, welche verwendet werden, um die Vektoren zuzuführen, welche AC-Transgene tragen, hängen von dem verwendeten jeweiligen Vektor ab, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Typischerweise jedoch kann ein Vektor in der Form einer injizierbaren Präparation vorliegen, welche pharmazeutisch annehmbaren Träger/Verdünnungsmittel enthält, wie zum Beispiel Kochsalzlösung.
Für virale Vektoren (wie Adenovirus) ist der Endtiter des Virus in der injizierbaren Präparation vorzugsweise im Bereich von etwa 10⁷-10³ viralen Partikeln, was einen effektiven Gentransfer ermöglicht. Andere pharmazeutische Träger, Formulierungen und Dosierungen sind nachstehend beschrieben.
Vektoren, welche AC-Transgene umfassen, können in den Herzmuskel durch direkte intrakoronäre (oder Transplantatgefäß)-Injektion unter Verwendung von perkutanen Katheterbasierenden Standardverfahren unter fluoroskopischer Führung zugeführt werden, und zwar in einer ausreichenden Menge, damit das Transgen exprimiert wird und ein therapeutischer Nutzen bereitgestellt wird. Eine derartige Injektion erfolgt bevorzugt tief in das Lumen (etwa 1 cm innerhalb des arteriellen Lumens) der Herzkranzarterien (oder eines Transplantat-Gefäßes) und wird vorzugsweise in beiden Herzkranzarterien vorgenommen (um eine allgemeine Verteilung auf alle Bereiche des Herzens bereitzustellen).
Durch Injizieren des Materials direkt in das Lumen der Herzkranzarterie durch Koronarkatheter ist es möglich, das Gen ziemlich effektiv zielzulenken, und den Verlust an den rekombinanten Vektoren zur proximalen Aorta während der Injektion zu minimieren. Wir haben festgestellt, dass Genexpression, bei Zuführung in dieser Weise, nicht in Hepatocyten stattfindet, und dass virale RNA nicht zu irgendeiner Zeit nach der intrakoronären Injektion im Urin gefunden werden kann. Darüber hinaus fanden wir unter Verwendung von PCR kein Anzeichen von extrakardialer Genexpression im Auge, der Leber oder dem Skelettmuskel zwei Wochen nach der intrakoronären Zuführung. Jedwede Varietät von Koronarkatheter kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Darüber hinaus können andere Techniken, welche dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt sind, für den Transfer von Genen zum Herz verwendet werden.
Tiermodell für kongestives Herzversagen
Wichtige Voraussetzungen zur Entwicklung jedweder Herz-Gentherapietechnik, welche für Menschen anwendbar sein soll, sind: (a) Konstitution eines Großtiermodells, welches auf klinisches kongestives Herzversagen anwendbar ist, und welches nützliche Daten in Hinsicht auf Mechanismen für veränderte β-adrenerge Signalleitung beim Szenario von Herzversagen bereitstellen kann, und (b) akkurate Auswertung der Effekte des Gentransfers. Es gibt keinen Stand der Technik, welcher effektiv eine Methode zur Behandlung von kongestivem Herzversagen unter Verwendung von in vivo-Gentherapie beschrieben und/oder demonstriert hat.
Für diese Erfindung verwendeten wir ein Schweinemodell für Herzversagen, welches humanes klinisches kongestives Herzversagen in einer Anzahl von bedeutenden Wegen nachahmt, einschließlich der klinischen Abnormalitäten, die mit β-adrenerger Signalleitung assoziiert sind. In unserem Schweinemodell führt anhaltende rasche Ventrikel-Erregung bzw. -Schrittmacherbehandlung in diesen großen Säugetieren (225 Schläge/min.) zu einer Vergrößerung der linken ventrikulären Kammer, erniedrigter systolischer Funktion und hämodynamischen Abnormalitäten, welche alle ein klinisches dilatiertes Herzversagen in Menschen nachahmen (siehe z. B. Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest 91: 939-949, 1993). Darüber hinaus ahmen, bei der eingehenden Analyse der veränderten β-adrenergen Signalleitung im Schweine-Modellherz, besonders Plasma- und Herzmuskel-Katecholamin-Spiegel, β-adrenerge Rezeptor-Herunterregulierung und-Entkopplung und Änderungen in der Adenylylcyclase-Funktion gleichermaßen Bedingungen nach, welche mit Herzversagen im Menschen assoziiert sind (Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest. 91: 939-949, 1993).
Die fundamentalen Befunde aus Untersuchungen, durchgeführt am Herzmuskel aus diesen Tiermodellen mit Herzversagen in Hinblick auf die vorliegende Erfindung schließen die Folgenden ein. Zum Ersten besteht eine 75 %ige Reduktion in der linksventrikulären β₁-adrenergen Rezeptor-Anzahl, mit einer ähnlichen Verringerung in der β₁-adrenergen Rezeptor-mRNA; wohingegen sich die β₂-adrenerge Rezeptor-Anzahl (und mRNA) nicht verändert. Dies spiegelt wider, was bei menschlichem Herzversagen beobachtet wird (siehe z. B. Bristow, M. R., et al., J. Clin. Invest. 92: 2737-2745, 1993). Zum Zweiten werden linksventrikuläre β-adrenerge Rezeptoren von Gs entkoppelt, und es besteht eine erhöhte Funktion und Expression von G-Protein-Rezeptorkinase. Diese Befunde sind ebenfalls vorhanden bei unter Versagen leidenden menschlichen Herzen (siehe z. B. Ungerer, M., et al., Circulation, 87: 454-461, 1993; Ungerer, M., et al., Circ. Res., 74: 206-213, 1994). Zum Dritten besteht eine Reduktion in der Funktion der linksventrikulären AC, welche assoziiert ist mit mRNA für AC_VI (Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest. 91: 939-949, 1993; siehe auch Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest, 93: 2224-2229, 1994).
Neuere Untersuchungen zeigen auch eine verringerte Forskolin-stimulierte cAMP-Produktion in Homogenaten von unter Versagen leidendem linkem Ventrikel, was eine beeinträchtigte AC-Funktion nahe legt (Bristow, M. R., et al., Mol. Pharm. 35, 295-303, 1989; Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994; Kiuchi, K., et al., J. Clin. Invest. 91, 907-914, 1993; Marzo, K. P., et al., Circ. Res. 69, 1546-1556, 1991; Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest. 91: 939-949, 1993). Ein Problem bei der Untersuchung der katalytischen Untereinheit von AC besteht darin, dass es derzeitig nur unvollständige Methoden gibt, um entweder seine Konzentration oder seine Funktion zu überprüfen. Das Diterpen Forskolin ist ein Aktivator von AC, und folglich war Forskolin-stimulierte cAMP-Produktion das am häufigsten angewandte Verfahren zur Überprüfung von dessen biologischer Aktivität. Da jedoch eine vollständige Antwort auf Forskolin eine Wechselwirkung von Gs, und AC beinhaltet, und da eine Aktivierung von Gsα die Forskolin-Antwort inhibiert (Darfler, F. J., et al., J. Biol. Chem. 257, 11901-11907, 1982), versagt die Forskolin-Stimulation darin, eine genaue Messung der AC-Funktion bereitzustellen. Es ist weithin anerkannt, dass AC dazu neigt, ziemlich labil zu sein, und im Allgemeinen außerhalb seiner normalen zellulären Umgebung instabil ist. Antikörper gegen AC sind nicht weithin verfügbar, und das Protein wird bei niedriger Häufigkeit exprimiert, was die Probleme der Quantifizierung und funktionellen Überprüfung dieses ausschlaggebenden transduzierenden Elements verschärft. Wegen dieser Probleme ist nur wenig über die genauen Änderungen hinsichtlich Quantität und Funktion von AC in pathophysiologischen Zuständen bekannt. Die Regulierung der zellulären Funktion durch AC wird ferner erschwert durch die neueren Beweise, dass mehrere Isoformen von AC existieren, von denen mindestens zwei gezeigtermaßen im Herz exprimiert werden (Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994; Iyengar, R., FASEB J. 7, 768-775, 1993; Katsusshika, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 89, 8774-8778, 1992; Krupinski, J., et al. J. Biol. Chem. 267, 24858-24862, 1992; Tang, W. J., und A. G. Gilman, Cell 70, 869-872, 1992; Taussig, R., et al., J. Biol. Chem. 269, 6093-6100, 1994). Untersuchungen aus unseren Laboratorien haben zwei Vorgehensweisen angewandt, um quantitative Information bezüglich der AC-Expression bereitzustellen. Zum Ersten wird Forskolin-Bindung verwendet, um die AC-Funktion zu quantifizieren (Alousi, A., et al., FASEB Journal 5: 2300-2303, 1991). Zum Zweiten werden RNase-Protektions-Assays eingesetzt, um eine quantitative Untersuchung von mRNA-Spiegeln für AC-Isoformen bereitzustellen (Ping, P., et al., Circulation 90: I-I-580, 1994; Ping, P., und Hammond, H. K., Am. J. Physiol. 267: H2079-H2085, 1994).
Unter Verwendung von degenerierten PCR-Primern für AC-Isoformen haben wir achtundzwanzig positive Klone isoliert. Anschließende Sequenzanalysen belegten, basierend auf früher berichteten Sequenzen von AC-Isoformen, dass mindestens drei AC-Isoformen im linken Ventrikel beim Schwein exprimiert werden. Frühere Berichte in Hinsicht auf AC-Isoform- Expression im Säugerherz unter Verwendung von Homogenaten des gesamten Ratten-Herzens und PCR identifizierten acht AC-Isoformen (Katsusshika, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 89, 8774-8778, 1992); obwohl die Zelltypen, welche die verschiedenen AC-Isoformen exprimieren, nicht identifiziert wurden. Anschließende Untersuchungen unter Verwendung von Northern-Blotting (mit Poly-(A)-Selektion) waren in der Lage, nur zwei Isoformen, AC_V und AC_VI, im Hundeherz zu identifizieren (Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994). Ishikawa et al. (Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994) bestätigten, dass AC_V- und AC_VI-Isoformen in RNA identifiziert werden konnten, welche aus isolierten Herz-Myocyten extrahiert worden war.
Wir haben, in Hinsicht auf das vorliegend verwendete Schwein-Modell, festgestellt, dass die AC-Isoformen II, V und VI nicht nur in aus Gesamtherz extrahierter RNA vorhanden sind, sondern auch in RNA, extrahiert aus einer reinen Population von adulten Schweine-Herzmuskelzellen des linken Ventrikels.
Eine frühere Untersuchung zeigte, dass schweres Herzversagen mit der Herabregulierung der mRNA der AC-Isoformen V und VI assoziiert war (Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994). Wir verwendeten ein Tiermodell, welches klinisches CHF nachahmt, um zu überprüfen, ob AC-Isoform-mRNA-Herabregulierung bei Herzversagen unter Isoformen gleichförmig ist. Obwohl unsere Befunde in Übereinstimmung mit einigen Aspekten von früheren Berichten stehen, einschließlich einer frühen Entkopplung von myokardialem βAR (Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994; Kiuchi, K., et al., J. Clin. Invest. 91, 907-914, 1993) gibt es auch Unterschiede. Zum Ersten identifizierten wir eine dritte AC-Isoform von Herzmuskelzellen-Ursprung (AC_II), und belegten, durch quantitative Messungen, den Expressionsspiegel dieser drei Isoformen im linken Ventrikel. Zum Zweiten, im Gegensatz zu Ishikawa et al. (Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994) stellten wir fest, dass die AC-Isoform-Herabregulierung isoform-spezifisch ist. Insbesondere scheint eine verringerte AC_VI-Expression mit einer beeinträchtigten β-adrenergen Antwortfähigkeit bei CHF assoziiert zu sein.
Zusammengefasst scheint, im normalen Herzen, die Menge an AC der β-adrenergen Antwortfähigkeit eine Grenze zu setzen. Bei Herzversagen, wobei AC-Herabregulierung die Transmembran-Signalleitung weiter beeinträchtigt, würde man davon erwarten, dass dies eine noch bedeutendere Einschränkung ist, welche die β-adrenerge Transmembran-Signalleitung beeinflusst.
Unsere Untersuchungen mit Schweinen, beschrieben und veranschaulicht in größerer Ausführlichkeit nachstehend, demonstrieren, dass eine Überexpression durch in vivo-Zuführung in den Herzmuskel die Herzfunktion in einem Großtiermodell, welches für Menschen als Voraussage dient, steigern kann. Es gibt keine früheren Veröffentlichungen, welche derartige Techniken zur Verwendung bei der Behandlung von Herzversagen beschreiben und/oder verdeutlichen. Unsere Untersuchungen stellten auch zusätzliche Bestätigung dafür bereit, dass der CHF-Phänotyp im Schweine-Schrittmachermodell sehr ähnlich zu demjenigen ist, welcher bei klinischem CHF bei Menschen beobachtet wird.
Unsere aufgezeigte Fähigkeit (unter Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung), die adrenerge Antwortfähigkeit im Schweine-Schrittmachermodell von CHF signifikant zu erhöhen, stellt daher eine ausschlaggebenden Fortschritt dar, nicht nur für das Verständnis der molekularen Mechanismen der adrenergen Herz-Signalleitung, sondern auch zur tatsächlichen Behandlung des klinischen Befundes.
Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, verwendeten wir normale Schweine, um anfänglich die Effektivität unserer Genzuführungs-Techniken zu untersuchen und Daten bereitzustellen, um zu zeigen, dass eine intrakoronäre Genzuführung eines rekombinanten Adenovirus, welcher AC_VI exprimiert, in positiver Weise die Herzfunktion beeinflussen kann. In diesen einleitenden Untersuchungen wurde ein rekombinantes Adenovirus, welches lacZ (als ein Reportergen, verwendet zum Dokumentieren eines erfolgreichen Gentransfers und der Genexpression) in die Herzkranzarterien von 5 Schweinen injiziert (wobei ungefähr 0,5 × 10¹¹ Virenpartikel verwendet wurden). Zwei Wochen später wurden die Tiere getötet, und Gewebeproben wurden untersucht.
Man verwendete PCR, um Adenovirus-DNA im Herzmuskel aus Tieren nachzuweisen, welche einen Gentransfer erhalten hatten. Ein effektiver Gentransfer wurde in den Herzen der Schweine dokumentiert und wurde nicht in anderen Geweben gefunden. Als eine weitere Bestätigung des Erfolgs dieser Techniken, wurde von Herzmuskelproben aus lacZ-infizierten Tieren gefunden, eine wesentliche β-Galactosidase-Aktivität bei histologischer Untersuchung aufzuzeigen.
Um Herz-Gentherapie unter Verwendung eines β-ASP-Transgens zu veranschaulichen, wurden Schweine einer in-vivo-Genzuführung von DNA, welche eine AC_VI-Isoform codierte, unterzogen. In Untersuchungen, welche an drei Tieren durchgeführt wurden, wurden physiologische Messungen der β-adrenergen Antwortfähigkeit vor und 5-10 Tage nach einer intrakoronären Injektion eines rekombinanten Adenovirus, welches das β-ASP-Transgen (codierend AC_VI) exprimiert, erhalten.
Unsere Ergebnisse enthüllten, dass die Herzgeschwindigkeits-Antwortfähigkeit gegenüber β- adrenerger Stimulation signifikant erhöht war nach einem Gentransfer gemäß der vorliegenden Erfindung.
Darüber hinaus wurde eines der Schweine weiter untersucht (sowohl vor als auch nach dem Gentransfer), um potenzielle Änderungen in der linksventrikulären dP/dt zu überwachen, was ein Maß der Geschwindigkeit des Anstiegs der Druckentwicklung, und ein weiterer Indikator der Herzfunktion, ist. Die Ergebnisse, nachstehend beschrieben, zeigten, dass Herz-Gentherapie gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls zu einer wesentlichen Erhöhung in der linksventrikulären dP/dt führte. Diese Daten lieferten somit eine weitere Bestätigung, dass die Techniken der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um die Herzfunktion in einem Großtiermodell zu steigern, welches CHF in Menschen nachahmt.
Unsere Daten demonstrierten, dass eine β-ASP, AC, effektiv durch in vivo-Gentherapie an ein Großtier-Herz zugeführt werden kann, und dass die β-adrenerge Antwortfähigkeit und Herzfunktion unter Anwendung eines solchen Verfahrens erhöht werden können. Zusätzliche bevorzugte β-ASP kann in einer analogen Weise zugeführt werden. Zur Veranschaulichung beschreiben wir in der folgenden Beschreibung und in den Beispielen zusätzliche Typen von β-ASPs, einschließlich eines β-adrenergen Rezeptors (β₁-AR) und eines GRK-Inhibitors. β₁-AR steht funktionell stromaufwärts von AC im βAR-G₅-AC-Weg, und von ihm wurde, wie bei AC, festgestellt, in Verbindung mit Herzversagen herunterreguliert zu werden.
Unter weiterer Bezugnahme auf die Vorhersagekraft des Schrittmacher-induzierten Modells für Herzversagen hinsichtlich klinischem Herzversagen beim Menschen ist es wichtig, zu bemerken, dass, obwohl die zwei Endzustände nicht auf die gleiche Weise herbeigeführt werden (d. h. in Hinsicht auf die Ätiologie und Geschwindigkeit der Entwicklung), die resultierenden Zustände des Herzversagens, welche eine Behandlung erfordern, ziemlich nah verwandt sind. So sind nicht nur beide Systeme durch erweiterte, sich schlecht kontrahierende Herzen und Mehrfach-Kammer-Vergrößerung gekennzeichnet, sondern die zwei Systeme zeigen, was am bedeutendsten ist, verblüffend ähnliche Abnormalitäten, welche mit der β₁-adrenergen Signalleitung assoziiert sind (siehe z. B. Bristow, M. R., et al., N. Engl. J. Med.: 307, 205-211, 1982; Bristow, M. R., et al., Mol. Pharm., 35: 295-303, 1989; Bristow, M. R., et al., J. Clin. Invest, 92: 2737-2745, 1993; Ishikawa, Y., et al., J. Clin. Invest. 93, 2224-2229, 1994; Kiuchi, K., et al., J. Clin. Invest, 91: 907-914, 1993; Marzo, K. P., et al., Circ. Res. 69: 1546-1556, 1991; Ping, P., et al., Am. J. Physiol., 267: H2079-H2085, 1994; Ping, P., et al., J. Clin. Invest., 95: 1271-1280, 1995; Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest. 91: 939-949, 1993; Ungerer, M., et al., Circulation, 87: 454-461, 1993; Ungerer, M., et al., Circ. Res., 74: 206- 213, 1994).
Die nachstehend beschriebenen Daten dokumentieren des Weiteren erstmalig, dass der Gehalt von GRK₅-Protein und-mRNA im Herzmuskel anfällig für eine Aufwärtsregulierung bei mildem und schwerem Herzversagen ist. Ohne dass gewünscht wird, durch eine Theorie gebunden zu sein, unterstützen unsere Daten die Vorstellung, dass eine erhöhte Expression von GRK₅ verantwortlich für die erhöhte GRK-Aktivität sein kann, welche in diesen klinischen Zuständen beobachtet wird. In jedem Fall unterstützen die derzeitigen Daten in starker Weise die Hypothese, dass eine erhöhte linksventrikuläre GRK-Expression zu einer verringerten adrenergen Signalleitung bei einem frühen Stadium während der Entwicklung von Herzversagen beiträgt. Die Rolle von GRK bei Herzversagen und die Verwendung von GRK-Inhibitoren als einem β-ASP zur Genzuführung werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Ohne dass gewünscht wird, durch Theorie gebunden zu sein, unterstützen unsere Daten die Vorstellung, dass eine erhöhte GRK-Expression eine frühe Änderung bei Herzversagen ist, welche Änderungen in der AC-Isoform-Expression vorausgeht; und dass eine beeinträchtigte hormonelle Stimulierung von AC, assoziiert mit βAR-Entkopplung, aus einer erhöhten βAR-Phosporylierung durch GRK resultieren kann, was möglicherweise aus einer erhöhten GRK₅-Expression folgt.
Die Verstärkung der β-adrenergen Antwortfähigkeit gemäß der vorliegenden Erfindung ist erwartungsgemäß nutzbringend zur Verstärkung der Herzfunktion in den zahlreichen Krankheitssituationen, in welchen Herzversagen mit Reduktionen in der β-adrenergen Signalleitung assoziiert ist. In dieser Hinsicht ist es bedeutsam, die Ätiologie von vermutlichen Interventions-Punkten aus zu unterscheiden, insbesondere in Situationen, wie derjenigen, in welcher ein molekularer Weg von stromaufwärts erfolgenden Signalleitungsereignissen zu stromabwärts liegenden Effektor-Ereignissen führt, und bei welcher Signalleitungskomponenten dazu neigen (hinsichtlich Anzahl oder Aktivität) verringert zu sein, ohne tatsächlich eliminiert zu sein (wodurch die Dysfunktion und die potenzielle Behandlung eine stärker quantitative Natur erhalten). Somit kann eine eingreifende Behandlung, wie diejenige, welche hierin beschrieben wird, auf die hauptsächliche molekulare Wirkungsstelle oder potenziell auf eine stromabwärts gelegene Stelle gerichtet sein, was dazu neigt, die Haupt-Einschränkung zu umgehen oder "zu by-passen". Zur Veranschaulichung kann, obwohl eine effektive Reduktion hinsichtlich des Spiegels eines β-adrenergen Rezeptors (β-AR) direkt behandelt werden kann, und vorzugsweise behandelt wird, durch Erhöhen des Spiegels desselbigen Proteins; selbige ebenfalls indirekt kompensiert werden, zum Beispiel durch Erhöhen der Aktivität der restlichen β-AR-Proteine oder Ausheben der Inhibition derartiger Proteine (z. B. unter Verwendung von GRK-Inhibitoren), durch Erhöhen der Aktivität eines analogen β-AR, und/oder durch Erhöhen der Verfügbarkeit von Stromabwärts-Signaltransduktoren (z. B. AC), um es wahrscheinlicher zu machen, dass anfängliche Signalleitungsereignisse zu einer Stromabwärts-Stimulation führen. Tatsächlich, obwohl unsere oben beschriebenen Analysen die Vorstellung unterstützen, dass β-AR-Anzahl und/oder-Aktivität bei schwerem Herzversagen signifikant beeinflusst werden, demonstrieren unsere Ergebnisse, beinhaltend Gentherapie in vivo gemäß der vorliegenden Erfindung (wie nachstehend beschrieben), dass sogar ein Eingreifen zur Erhöhung einer Stromabwärts-Komponente, wie AC, die Herzfunktion wesentlich steigern kann. Therapien, welche auf Stromaufwärts-Defizienzen gerichtet sind (unter Anwendung z. B. der Zuführung von β-AR- und/oder GRK-Inhibitoren) werden erwartungsgemäß ebenfalls einen wesentlichen Nutzen hinsichtlich der β-adrenergen Signalleitung und Herzfunktion bereitstellen. Wie nachstehend beschrieben, wird es möglich sein, ein oder mehrere derartige β-ASP-Transgene als Methode zur Steigerung der β-adrenergen Antwortfähigkeit und Herzfunktion im Zusammenhang mit kongestiven Herzversagen zuzuführen.
Therapeutische Anwendungen
Unsere Daten demonstrieren, dass Gentransfer einer AC in den Herzmuskel verwendet werden kann, um die Antwortfähigkeit des Herzens gegenüber endogener β-adrenerger Stimulation zu steigern. Unsere Technik, von welcher wir zeigen, dass sie erfolgreich in einem Großsäugermodell anwendbar ist, verwendet zum Nachahmen von klinischem kongestiven Herzversagen beim Menschen, wird erwartungsgemäß nützlich für die Behandlung von CHF in Menschen sein, wodurch eine stark benötigte Alternative für derzeitige Behandlungen bereitgestellt wird, wie die Verabreichung von exogenen β-adrenergen Stimulanzien, welche dazu neigen, das langfristige Überleben einzuschränken.
Wie hierin beschrieben, kann eine Anzahl unterschiedlicher Vektoren verwendet werden, um das AC-Transgen in vivo gemäß der vorliegenden Erfindung zuzuführen. Auf dem Weg der Veranschaulichung führen replikationsdefekte rekombinante Adenovirus-Vektoren, welche beispielhaft angegeben sind, zu einem in hohem Maße effizienten Gentransver in vivo ohne cytopathischen Effekt oder Entzündung in den Arealen der Genexpression.
Zusammensetzungen oder Produkte zur Verwendung in der Erfindung können zweckmäßig in der Form von Formulierungen bereitgestellt werden, geeignet zur Verabreichung in den Blutstrom (z. B. in eine Intrakoronar-Arterie). Ein geeignetes Verabreichungsformat kann am besten durch einen medizinischen Arzt für jeden Patienten individuell gemäß Standardvorgehensweise bestimmt werden. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger und ihre Formulierung werden in Standard-Formulierungs-Abhandlungsschriften beschrieben, z. B. Remington's Pharmaceuticals Sciences von E. W. Martin; siehe auch Wang, Y. J., und Hanson, M. A., "Parental Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Jour nals of Parental Sciences and Technology, Technischer Bericht, Nr. 10, Ergänzungsband 42:2S (1988). Vektoren der vorliegenden Erfindung sollten vorzugsweise in Lösung bei neutralem pH-Wert, beispielsweise etwa pH 6,5 bis etwa pH 8,5, weiter bevorzugt etwa pH 7 bis 8, mit einem Exzipienten formuliert werden, um die Lösung etwa bis auf Isotonizität zu bringen, beispielsweise 4,5 % Mannitol oder 0,9 % Natriumchlorid, pH-gepuffert mit im Fachgebiet bekannten Pufferlösungen, wie Natriumphosphat, welche im Allgemeinen als sicher angesehen werden, zusammen mit einem anerkannten Konservierungsstoff, wie Metacresol 0,1 % bis 0,75 %, weiter bevorzugt 0,15 % bis 0,4 % Metacresol. Das Erhalten einer gewünschten Isotonizität kann bewerkstelligt werden unter Verwendung von Natriumchlorid oder anderen pharmazeutisch annehmbaren Agenzien, wie Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglycol, Polyolen (wie Mannitol und Sorbitol) oder anderen anorganischen oder organischen Soluten bzw. gelösten Stoffen. Natriumchlorid wird bevorzugt, besonders für Puffer, welche Natriumionen enthalten. Falls gewünscht, können Lösungen der oben stehenden Zusammensetzungen auch hergestellt werden, um die Lagerungslebensdauer und Stabilität zu steigern. Therapeutisch nützliche Zusammensetzungen der Erfindung können hergestellt werden durch Mischen der Bestandteile unter Befolgung von allgemein akzeptierten Vorgehensweisen. Zum Beispiel können die ausgewählten Komponenten gemischt werden, um eine konzentrierte Mischung zu produzieren, welche dann auf die Endkonzentration und-viskosität durch Zugabe von Wasser und/oder einem Puffer zum Steuern des pH-Werts oder einem zusätzlichen gelösten Stoff zum Steuern der Tonizität eingestellt werden kann.
Zur Verwendung durch den Arzt können die Zusammensetzungen in Dosierungsform vorgesehen werden, enthaltend eine Menge an einem Vektor der Erfindung, welche effektiv in einer oder mehreren Dosen sein wird, um AC-Transgen-Zuführung/Expression bei einem gewünschten Spiegel zu induzieren. Wie vom Fachmann auf dem Gebiet erkannt wird, wird eine effektive Menge an therapeutischem Mittel mit vielen Faktoren variieren, einschließlich dem Alter und Gewicht des Patienten, dem körperlichen Zustand des Patienten und dem gewünschten Spiegel der Erhöhung der Herz-Funktion, sowie anderen Faktoren.
Für virale Vektoren wird die effektive Dosis der Verbindungen dieser Erfindung typischerweise im Bereich von mindestens etwa 10⁷ viralen Teilchen, vorzugsweise etwa 10⁹ viralen Teilchen und weiter bevorzugt etwa 10¹¹ viralen Teilchen liegen. Die Anzahl an viralen Teilchen kann 10¹⁴ übersteigen, tut dies jedoch vorzugsweise nicht. Wie bemerkt, wird die zu verabreichende exakte Dosis vom betreuenden Arzt bestimmt, liegt jedoch vorzugsweise in 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung vor.
Die derzeitig am stärksten bevorzugte Art zur Verabreichung im Fall von Herzkrankheit erfolgt durch intrakoronäre Injektion in eine oder beide Herzkranzarterien (oder ein oder mehre re Vena-Saphena- oder innere Brustarterien-Transplantate oder andere Adern) unter Verwendung eines passenden Koronarkatheters. Eine Vielzahl von Kathetern und Zuführungswegen können verwendet werden, um eine intrakoronare Zuführung zu erreichen, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Zum Beispiel ist eine Vielfalt von Mehrzweck-Kathetern, sowie modifizierte Katheter, welche zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, von kommerziellen Herstellern verfügbar, wie Advanced Cardiovascular Systems (ACS), Target Therapeutics und Cordis. Des Weiteren kann, falls eine Zuführung an den Herzmuskel durch direkte Injektion in eine Herzkranzarterie erzielt wird (was derzeitig am stärksten bevorzugt wird), eine Anzahl von Vorgehensweisen verwendet werden, um einen Katheter in die Herzkranzarterie einzuführen, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Zur Veranschaulichung kann ein Katheter zweckmäßigerweise in eine Femurarterie eingeführt und retrograd durch die Darmbein-Arterie und Abdominalaorta und in eine Herzkranzarterie hinein durchgeführt werden. Alternativ dazu kann ein Katheter zuerst eingeführt werden in eine Brachial- oder Carotis-Arterie und retrograd zu einer Herzkranzarterie geführt werden. Ausführliche Beschreibungen dieser und anderer Techniken können im Fachgebiet gefunden werden (siehe z. B. die oben zitierten Referenzen, einschließlich Topol, E. J. (Hrsg.), The Textbook of Internventional Cardiology, 2. Ausgabe (W. B. Saunders Co. 1994); Rutherford, R. B., Vascular Surgery, 3. Ausgabe. W. B. Saunders Co. 1989); Wyngaarden, J. B., et al. (Hrsg.), The Cecil Textbook of Medicine, 19. Ausgabe (W. B. Saunders, 1992); und Sabiston, D., The Textbook of Surgery, 14. Ausgabe (W. B. Saunders Co. 1991)).
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet weitere Hilfestellung zu gewähren. Diese Beispiele sind als veranschaulichend gedacht und sollten deshalb nicht als Einschränkungen der Erfindung angesehen werden. Eine Anzahl von exemplarischen Modifikationen und Variationen wird in dieser Anmeldung beschrieben, und andere werden dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein. Derartige Variationen sind so anzusehen, dass sie innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen, wie sie hierin beschrieben und beansprucht wird.
BEISPIELE
Beispiel 1: Allgemeine Verfahren
Beispiel 1-1: Tiere und chirurgische Vorgehensweisen
Die Tierverwendung erfolgte in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien. Sechzehn Yorkshire-Schweine (Sus scrofa) mit einem Gewicht von 42 ± 5 kg wurden für diese Untersuchung verwendet und wurden mit Ketamin (50 mg/kg, i.m. bzw. intramuskulär) und Atropinsulfat (0,1 mg/kg, i.m.), gefolgt von Natriumamytal (100 mg/kg, i.v. bzw. intravenös) betäubt. Nach einer endotrachealen Intubation wurde Halothan (0,5-1,5 %) durch einen Druck-zyklisierten Ventilator während des gesamten Vorgehens zugeführt. Bei der linken Thorakotomie wurden Katheter in die Aona, Lungenarerie und das linke Atrium platziert. Ein Konigsberg-Mikromanometer wurde in den linken ventrikulären Apex platziert, und eine epikardiale unipolare Leitung wurde 1,0 cm unterhalb der atrioventrikulären Furche in der lateralen Wand des linken Ventrikels platziert. Der Leistungsgenerator (Spectrax 5985; Medtronic Incorporated, Minneapolis, MN) wurde in eine subkutane Tasche im Abdomen inseriert. Das Perikardium wurde lose angenähert und die Brust wurde geschlossen.
Zehn Tage nach der Thoracotomie wurden Grundlinien-Messungen der Hämodynamik und der linksventrikulären Funktion vorgenommen. Dann wurde eine ventrikuläre Schrittmachung begonnen (225 bpm). Fünf dieser Tiere wurden einer Überprüfung der hämodynamischen und ventrikulären Funktion 96 Stunden nach Beginn der Schrittmachung unterzogen und wurden dann getötet. Sechs Tiere durchliefen wöchentliche Untersuchungen der Hämodynamik und Ventrikelfunktion und wurden achtundzwanzig Tage nach Beginn der Schrittmacherbehandlung getötet. Die fünf verbleibenden Tiere (Kontrollen) erhielten keine Schrittmacherbehandlung und wurden achtunddreißig Tage nach der Instrumenten-Ausrüstung getötet.
Beispiel 1-2: Hämodynamik-Untersuchungen
Hämodynamik-Daten wurden aus bewussten, nicht-sedierten Tieren erhalten, nachdem der Schrittmacher 1 Stunde lang inaktiviert worden war, und die Tiere in einem Grundzustand waren. Die Drücke wurden aus dem linken Atrium und der Aorta erhalten. Das linksventrikuläre dP/dt wurde erhalten aus dem hoch echtheitsgetreuen linksventrikulären Druck.
Beispiel 1-3: Echokardiographische Untersuchungen
Zweidimensionale und M-Modus-Bilder wurden unter Verwendung eines Hewlett-Packard-Sonos 1500-Bilderzeugungssystems erhalten. Die Bilder wurden aus einer rechten parasternalen Annäherung auf dem Niveau des mittleren papillaren Muskels erhalten und auf VHS-Band aufgezeichnet. Messungen wurden unter Anwendung der Kriterien der American Society of Echocardiography (Sahn, D. J., et al., Circulation 58: 1072-1083, 1978) vorgenommen. Die enddiastolische Abmessung bzw. Dimension (EDD) und endsystolische Abmessung (ESD) wurden bei mindestens fünf Herzschlägen gemessen und gemittelt. Die enddiastolische Abmessung wurde beim Ausbruch des QRS-Komplexes erhalten. Die endsystolische Abmessung wurde zum Zeitpunkt der maximalen lateralen Position des interventrikulären Septums oder am Ende der T-Welle erfasst. Die linksventrikuläre systolische Funktion wurde unter Anwendung einer fraktionelle Verkürzung [(EDD-ESD)/EDD] × 100 ausgewertet. Der Variations koeffizient für die enddiastolische Abmessung bei wiederholten Messungen belief sich auf < 5 %. Alle diese Messungen wurden mit inaktivierten Schrittmachern erhalten.
Beispiel 1-4: Terminale Thorakotomie
Nach vier Tagen (n = 5) oder achtundzwanzig Tagen (n = 6) fortwährender Schrittmacherbehandlung (oder einer ähnlichen post-operativen Dauer ohne Schrittmacherbehandlung für die fünf Kontrolltiere) wurden Schweine betäubt, und Mittellinien-Sternotomien wurden vorgenommen. Die Herzen wurden entfernt, in steriler Kochsalzlösung (4 °C) gespült, und die Herzkranzarterien wurden mit steriler Kochsalzlösung (4 °C) perfundiert. Transmurale Proben der linksventrikulären freien Wand wurden auf der Mitte des Weges von der Basis zum Apex entnommen, nahe dem Mittelbereich der linken anterioren absteigenden Herzkranzarterie. Herzmuskel-Proben wurden dann eingefroren (–80 °C). Die Zeit von der Herzentfernung bis zur Einbringung von Proben in flüssigen Stickstoff belief sich auf 5-10 min.
Beispiel 1-5: Membranüberprüfung und-Präparation
Gefrorene transmurale Proben (–80 °C) wurden in einem Mörser-und-Pistill aus nicht rostendem Stahl (ebenfalls –80 °C) pulverisiert, in Tris-Puffer eingebracht, Glas-Glas-homogenisiert, und kontraktionsfähige Proteine wurden extrahiert (0,5 M KCl, 20 min., 4 °C). Das Pellet einer 45000 × g-Zentrifugation wurde in Puffer resuspendiert. Proteinkonzentrationen wurden ermittelt durch das Verfahren von Bradford (Bradford, M. M., Anal. Biochem., 72: 248-254, 1976); die Proteinausbeute (mg Protein/mg Nassgewicht) wurde in allen Präparationen überprüft. Wir haben früher gezeigt, dass die Aktivität von p-Nitrophenyl-Phosphatase (Bers, D. M., Biochem. Biophys. Acta, 555: 131-146; 1979), einem sarcolemmalem, membranassoziierten Enzym, verwendet zur Überprüfung der Membranproteinausbeute pro mg Rohmembranhomogenat, in diesem Modell nicht verändert wird (Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest., 91: 939-949, 1993).
Beispiel 1-6: Adenylylcyclase-Assays
Verfahren zur Messung der AC-Aktivität wurden modifiziert aus Salomon (Salomon, Y., et al., Anal. Biochem., 58: 541-548, 1974), wie früher berichtet (Hammond, H. K., et al., Circulation 85: 269-280, 1992; Hammond, H. K., et al., Circulation 8: 666-679, 1992). Die folgenden Agenzien wurden verwendet, um die cAMP-Produktion zu stimulieren (Endkonzentrationen): Isoproterenol (10 μM), GTP (10 μM), Gpp[NH]p (100 μM), Forskolin (100 μM). Wir haben festgestellt, dass die cAMP-Produktion unter diesen Bedingungen in Hinsicht auf die Zeit und die Proteinkonzentration linear war, und dass 3-Isobutyl-2-methylxanthin (1,0 mM), Adenosindesaminase (5 U/ml), oder beide, keinen Effekt auf die basale oder maximal stimulierte cAMP-Produktion aufwiesen. Frühere Experimente bestätigten, dass AC-Aktivität sich nicht in den Überstand einer 45000 × g-Zentrifugation in unserer Membranpräparation hinein verteilt (Hammond, H. K., et al., Circulation 85: 269-280, 1992).
Beispiel 1-7: β-adrenerge Rezeptor-Bindungsuntersuchungen
Wie früher beschrieben (Hammond, H. K., et al., Circulation 8: 666-679, 1992) wurden βARs unter Verwendung des Radioliganden [¹²⁵I]-Iodcyanapindolol identifiziert. Die Agonistenaffinität wurde mittels Durchführung von kompetitiven Bindungsassays unter Verwendung von (–)Isoproterenol bestimmt (Hammond, H. K., et al., Circulation 8: 666-679, 1992).
Beispiel 1-8: Auswertung des Gsα- und Giα₂-Gehalts durch Immunoblotting
Die Überprüfung von αs- und αi-Untereinheiten von Gs bzw. Gi wurde unter Anwendung von Standard-SDS-PAGE und Immunoblotting-Techniken, wie früher beschrieben (Roth, D. A., et al., FEBS Lett, 29: 46-50, 1992) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden 100 μg Protein jeweils aus der Überstand- und Pelletfraktion einer 45000 × g-Zentrifugation von Rohherzmuskel-Homogenat, abgeleitet aus geeigneten transmuralen Proben, auf einem 10 %igen denaturierenden Ge1 4 Stunden lang bei 30 mA elektrophoretisch behandelt. Proteine wurden auf Nitrozellulosemembranen (Amersham, Großbritannien) während 14 Stunden, 70 Volt, 4 °C elektrogeblottet. Die Transfereffizienz wurde durch Fotokopien von Membranen aufgezeichnet, welche mit einer reversiblen Ponceau-Färbung gefärbt wurden, und die Gelretention wurde mit Coomasie-Blau-Färbung überprüft. Eine Hintergrund-Blockierung wurde bewerkstelligt durch Inkubieren von Membranen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS, pH 7,5) mit 2 % fettfreier Trockenmilch, während 2 Stunden bei 25 °C. Gereinigte primäre polyklonale Antikörper (NEN, Boston MA, Kaninchen-Anti-G-Proteine: RM/1 Gsα; AS/7, Transducin, Giα₁, Giα₂) wurden 1:600 in 15 ml TBS mit 0,05 % Tween-20 (TTBS, pH 7,5) und 1 % fettfreier Trockenmilch verdünnt, und Membranen wurden 14 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Der autoradiographische Nachweis von Banden wurde durchgeführt mittels Inkubieren von Membranen in 75 ml TTBS mit 1 % fettfreier Trockenmilch und 15 × 10⁶ cpm ¹²⁵I-Protein A (NEN, Boston, MA) während 2 Stunden, 25 °C, gefolgt von gründlichen aufeinanderfolgenden Waschungen in TTBS, und Platzieren gegen einen Röntgenfilm (Kodak X-OMAT AR) während 5 Tagen bei –70 °C. Die 45- und 40-kDa-Banden für Gsα und Gsα₂ wurde von den Membranen mit Hintergrundkontrollen für die Gamma-Zählung entfernt.
Beispiel 1-9: Auswertung des GRK₂- und GRK₅-Gehalts durch Immunoblotting
Die Auswertung des linksventrikulären GRK₂- und GRK₅-Gehaltes wurde durchgeführt unter Verwendung von Standard-SDS-PAGE- und Immunblotting-Techniken, wie früher berichtet (Ping, P., et al., J. Clin. Invest, 95: 1271-1280, 1995; Roth, D. A., et al., FEBS Lett, 29: 46- 50, 1992). Ein Antikörper, spezifisch für gereinigte Rinder-GRK₂, und gereinigte Rinder-GRK₂ wurden von Dr. Jeffrey L. Benovic zur Verfügung gestellt. Ein für GRK₅ spezifischer Antikörper wurde von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) erhalten. Transmurale linksventrikuläre Proben wurden in einen Lysispuffer gebracht, welcher 20 mM Tris HCl (pH 7,5), 2 mM EDTA, 10 μg/ml Benzamidin, 10 μg/ml Leupeptin, 100 μg/ml PMSF und 5 μg/ml Pepstatin A enthielt. Pulverförmige Proben wurden homogenisiert, dann zentrifugiert und durch Schallbehandlung in Lysispuffer resuspendiert. 80 μg Protein aus jeder linksventrikulären Probe wurden mit Laemmli-Puffer vermischt und gekocht, und dann auf einem 10 %igen denaturierenden Gel elektrophoretisch behandelt. Proteine wurden auf PVDF-Papier (Immobolin-P, Millipore) überführt; die Überführungseffizienz wurde durch Ponceau-Färbung bestimmt. Die Membran wurde 2 Stunden lang in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,1 % Tween-20 und 5 % fettfreie Trockenmilch, blockiert und durch herkömmliche Verfahren unter Anwendung von GRK₂- oder GRK₅-Antiserum, gefolgt von Exposition an mMeerettichperoxidase-verknüpftes Anti-Kaninchen-Immunglobulin (1:1000 in TBS) entwickelt. Die Blots wurden durch das ECL-Verfahren entwickelt, und Banden wurden nach Exponieren der Blots an Röntgenfilm visualisiert. Die Dichten von Banden, welche mit gereinigtem Rinder-GRK₂ comigrierten, wurden durch densitometrisches Scanning quantifiziert; für GRK₅ quantifizierten wir, dass die GRK₅-spezifische Band bei ungefähr (68 kD) wanderte.
Beispiel 1-10: G-Protein-Rezeptorkinase-Aktivität
Die enzymatische GRK-Aktivität wurde unter Verwendung von licht-abhängiger Phosphorylierung von Rhodopsin (Benovic, J. L., Methods Enzymology, 200: 351-363, 1991) ermittelt, wie wir es früher berichtet hatten (Ping, P., et al., J. Clin. Invest, 95: 1271-1280, 1995). Es ist kein GRK-Subtyp-spezifischer Aktivitäts-Assay verfügbar, so dass die Phosphorylierung von Rhodopsin die Aktivität von GRK₂ (βARK₁) und GRK₅ widerspiegelt, den vorherrschenden GRK-Isoformen im Herz (Inglese, J., et al., J. Biol. Chem., 268: 23735-23738, 1993). Wir reinigten Rhodopsin aus den äußeren Segmenten von Stäbchen, welche aus einer an Dunkelheit adaptierten Kälber-Retina erhalten wurden. Licht-abhängige Phosphorylierung von gereinigtem Rhodopsin wurde zuerst getestet durch Verwendung von rekombinanten GRK₂ (Geschenk von Dr. J. Benovic). Ein Gramm des linken Ventrikels wurde in 9 ml Lysispuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 10 μg/ml Benzamidin, 20 μg/ml Leupeptin, 40 μg/ml PMSF und 5 μg/ml Pepstin A) homogenisiert und dann 30 Minuten lang bei 45000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4 ml Lysispuffer mit 250 mM NaCl (verwendet zum Dissoziieren von membran-assoziierter GRK) resuspendiert und erneut in einem kraftgetriebenen Glasrotor homogenisiert (4 °C). Die Pellet-Suspension wurde dann erneut zentrifugiert, und Ionenaustauschsäulen (Amicon) wurden verwendet, um NaCl im Überstand der Pellet-Suspension zu entfernen. Sowohl der Überstand als auch der Überstand der Pellet-Suspension durchliefen dann eine Reinigung auf DEAE-Sephacel-Säulen, um endogene Kinasen zu eliminieren, welche die GRK-abhängige Phosphorylierung kontaminieren könnten (Ping, P., et al., J. Clin. Invest, 95: 1271-1280, 1995; Ungerer, M., et al., Circulation, 87: 454-461, 1993). Sowohl die Überstands- als auch die Pellet-Fraktionen wurden unabhängig über Säulen gereinigt.
Die GRK-abhängige Phosphorylierung wurde gemessen durch Inkubieren von 100 μg Protein aus jeder Fraktion mit 250 pMol Rhodopsin in Puffer, enthaltend 18 mM Tris-HC1, 1,8 mM EDTA, 4,8 mM MgCl₂, 73 µm ATP und 2,9 cpm/fMol [³²P]-ATP. Die GRK-abhängige Phosphorylierungsreaktion wurde bestätigt durch Zusetzen von Proteinkinase-A-Inhibitor (1 μM) und Heparin (10 μg/ml) in die Reaktion. Die Proteinkonzentration sowohl für Pellet als auch Überstand wurden ermittelt vor und nach der DEAE-Sephacel-Reinigung, und die letztendliche Enzymaktivität wurde ausgedrückt als pMol Phosphat/min./mg Protein sowie je Gramm Gewebe. Wir haben früher gezeigt, dass eine Zentrifugation bei 45000 × g (30 min.) einen Überstand bereitstellt, welcher weniger als 1 % der gesamten zellulären Aktivität an p-Nitrophenylphosphatase enthält (ein sarkolemmales membranassoziiertes Enzym), was eine ausgezeichnete Trennung von cytosolischen von Membran-Komponenten nahe legt (Roth, D.A., et al., FEBS Lett, 29: 46-50, 1992).
Beispiel 1-11: RNA-Extraktion
Gesamt-RNA wurde aus dem linken Ventrikel unter Verwendung einer Modifikation des Säure-Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsverfahrens (Chomczynski, P., et al., Anal. Biochem., 162: 156-159, 1987) extrahiert, wie früher beschrieben (Ping, P., et al., Am. J. Physiol., 267: H2079-H2085, 1994; Ping, P., et al., J. Clin. Invest, 95: 1271-1280, 1995). Gewebeproben wurden in 4,0 M Guanidiniumpuffer homogenisiert, zweimal mit saurem Phenol-Chloroform extrahiert und mit Isopropanol gefällt. Das letztendliche Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, in Diethylpyrocarbonat-behandeltem Wasser gelöst und bei –80 °C aufbewahrt. Die Integrität und Reinheit der RNA wurden durch Gelelektrophorese und das Ultraviolett-Extinktions-Verhältnis (260 nm/280 nm) bewertet; die Probe wurde verworfen, wenn das Verhältnis geringer als 1,5 war, oder wenn die visuelle Inspektion der Gel-Photografie eine Degradierung nahe legte.
Beispiel 1-12: Polymerasekettenreaktions-Klonierung
AC-Isoformen im linken Ventrikel aus Schwein wurden durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) isoliert. Schweine-Herz-RNA wurde isoliert und revers transkribiert in cDNA unter Verwendung von Reverse-Transkriptase aus AMV (Vogel-Myeloblastosis-Virus) (Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida). Degenerierte Primer, welche insgesamt 207 bp der vermeintlichen Nukleotidbindungsregion der AC-Gen-Familie überspannen (Krupinski, J., et al., J. Biol. Chem., 267: 24858-24862, 1992) wurden verwendet, um die SchweineherzcDNA-AC-Gene zu amplifizieren. Die verwendeten Primersequenzen schlossen ein:
(1) 5'-ACGTAGAATTCGG(AG)GA(CT)TGTTA(CT)TACTG-3' (Sine)
(2) 5'-ACGTTAAGCTTCCA(GC)AC(AG)TC(AG)AA(CT)TGCCA-3'(Antisinn)
Komplementäre DNA, abgeleitet aus 5 μg Gesamt-RNA, wurde amplifiziert mit 4 μM PCR-Primern in 10 mM Tris-HCl und 50 mM KCl enthaltendem Reaktionspuffer (pH 8,3). Taq-DNA-Polymerase (2,5 Units) wurde verwendet (Gibco BRL). Die Amplifikationsreaktion wurde während 30 Zyklen bei 95 °C (2 min.), 52 °C (2 min.) und 72 °C (2 min.) laufen gelassen, gefolgt von Verlängerung bei 72 °C während 10 Minuten.
Beispiel 1-13: Konstruktion von Schweine-Ribosonden
Die aus der obenstehenden Reaktion erhaltenen PCR-Fragmente wurden subkloniert in pGEM 4Z-Vektoren (Promega) und sequenziert. Unter den achtundzwanzig sequenzierten Klonen wurden sechzehn AC-Klone vom Typ VI, elf vom Typ V und einer vom Typ II identifiziert, basierend auf den veröffentlichten Sequenzen aus der Ratte (Krupinski, J., et al., J. Biol. Chem., 267: 24858-24862, 1992). Schweine- und Ratten-AC-Typen II und VI weisen identische vorhergesagte Aminosäuresequenzen auf. Schweine-AC-Typ V unterscheidet sich von Ratten-AC-Typ V nur an einer einzigen Aminosäure. Diese drei Schweine-AC-Isoformen haben 90 % Homologie mit der Ratte auf dem Nukleotidniveau gemeinsam (Krupinski, J., et al., J. Biol. Chem., 267: 24858-24862, 1992).
Die drei sequenzierten AC-Isoform-Plasmide wurden linearisiert, entweder mit HindIII, um die Kontroll-RNA zu erzeugen, oder mit EcoRI, um die Antisinn bzw. Antisense-Ribosonden für die AC-Typen II, V und VI zu erzeugen. Dann wurde eine in-vitro-Transkription ausgeführt unter Verwendung von entweder SP6- oder P7-Polymerase (Promega), um die Kontroll-RNA (214 bp) oder Antisinn-Ribosonden (219 bp) für anschließende RNase-Protektions-Assays zu erzeugen. In vitro synthetisierte Ribosonden enthalten die komplementären Se quenzen sowohl der mRNA als auch des pGEM 4Z-Vektors, und sind deshalb länger als das geschützte Banden-Fragment aus der Schweine-RNA-Sonde (nur mRNA). Die geschützte Bande aus Schweineherz besitzt eine Größe von 207 bp. Die größere Länge der Kontroll-RNA, ebenfalls abgeleitet aus der Extrasequenz aus dem pGEM 4Z-Vektor, schützt die in vitro synthetisierte Kontroll-mRNA vor einer Kontamination durch Proben-RNA.
Beispiel 1-14: RNase-Protektions-Assay
RNase-Protektions-Assay-Verfahren wurden ausgeführt, wie früher beschrieben (Ping, P., et al., Am. J. Physiol., 267: H2079-H2085, 1994; Ping, P., et al., J. Clin. Invest. 95: 1271- 1280, 1995). Eine in vitro-Transkription wurde ausgeführt, um [³²P]-markierte Ribosonden mit spezifischen Aktivitäten im Bereich von 1 × 10⁸ bis 5 × 10⁹ cpm/μg zu synthetisieren, wobei die oben beschriebenen Genkonstrukte angewandt wurden. Gesamt-RNA (20 μg) aus Gewebe und verschiedene Mengen von in vitro synthetisierter Sinnstrang-Kontroll-RNA wurden hybridisiert mit 2-8 × 10⁴ cpm Sonde (in 5-8fachem Überschuss an mRNA, wie bestimmt in vorbereitenden Experimenten) in 20 T1 von 80 % Formamid, 40 mM Hepes (pH 7,6), 400 mM NaCl und 1,0 mM EDTA während 12-16 Stunden (45 °C). Der Verdaupuffer (300 T1), enthaltend 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 20 μg RNase A und 3 Units T1-RNase pro μg Gesamt-RNA, wurde dann zugesetzt und 30 Minuten (37 °C) lang inkubiert. Nach Behandlung mit Proteinase K und Extraktion mit Phenol-Chloroform wurden die RNase-resistenten Hybride präzipitiert und auf einem 6 %igem Polyacrylamid-Harnstoff-Gel laufen gelassen. Die AC_II-, AC_V- und AC_VI-mRNA-Signale wurden quantifiziert durch Zählen der ausgeschnittenen Gelbande mittels eines β-Zählers. Nach dem Zählen konnten die cpm an Kontroll-RNA ausgedrückt werden als cpm/μg Kontroll-RNA. Diese Daten wurden dann verwendet, um mRNA-Spiegel im Herzmuskel-Gewebe (pMol spezifische mRNA/g Gesamt-RNA) zu quantifizieren. Der Herz-Gehalt an AC_II-, AC_V- und AC_VI-mRNA wurde berechnet aus dem Verhältnis von deren Signal zum Signal aus ihrer Sinnstrang-Kontroll-RNA in der gleichen Hybridisierungsreaktion. Eine Säuger-l8S-Ribosonde (400 cpm; Plasmidkonstrukt von Ambion) wurde zusammen mit AC_II-, AC_V- und AC_VI-Ribosonden in den Hybridisierungen verwendet, um die Beladungs- und Hybridisierungsbedingungen für jede Gewebeprobe zu überprüfen. Der hohe Ertrag und die sehr niedrige spezifische Aktivität der 18S-Ribosonde (5-8 × 10⁴ cpm/μg; Megascript, Ambion) wurden erhalten, um eine akkurate Messung des 18S-Transkripts aus 20 μg Gesamt-RNA sicherzustellen. RNase-Resistenz (< 1 %) und Ribosonden-Spezifität wurden durch vollständigen Verdau von einzelsträngiger Antisinn-Ribosonde plus 40 μg Transfer-RNA (Hefe) mit RNase A und T1 bestätigt.
Beispiel 1-15: Northern-Blot-Analyse von GRK₂
Ein Maus-GRK₂(βARK₁)-cDNA-Fragment, das von Dr. P. A. Insel bereitgestellt worden war, wurde verwendet um den GRK₂-mRNA-Gehalt in linksventrikulären Proben zu überprüfen. Zwanzig Mikrogramm Gesamt-RNA wurden gel-denaturiert und auf Nylonmembranen geblottet. Der Northern-Blot wurde hybridisiert mit einem [³²P]-markiertem statistisch-Primer-GRK₂-cDNA-Fragment (bp 1134-1688) während 24 Stunden bei 42 °C in einem Puffer, enthaltend 5X SSPE, 10X Denhardt-Lösung, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 50 % Formamid und 2 % SDS. Der Blot wurde mit 2X SSC/0,1 % SDS bei 27 °C während 15 min. gewaschen.
Beispiel 1-16: Northern-Blot-Analyse von GRK₅
Eine humane GRK₅-cDNA-Sonde (Marzo, K. P., et al., Circ. Res., 69: 1546-1556, 1991), bereitgestellt von Dr. J. Benovic, wurde verwendet, um den GRK₅-mRNA-Gehalt in linksventrikulären Proben zu bewerten. Zwanzig Mikrogramm Gesamt-RNA wurden über ein Gel denaturiert und auf Nylonmembran geblottet. Der Northern-Blot wurde hybridisiert mit einem [³²P]-markierten Zufallsprimer-GRK₅-cDNA-Fragment (bp 383-1540) während 24 Stunden bei 42 °C in einem Puffer, enthaltend 5X SSPE, 10X Denhardt-Lösung, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 50 % Formamid und 2 % SDS. Der Blot wurde mit 2X SSC/0,1 % SDS bei 27 °C während 30 min. gewaschen, gefolgt von einer Hochstringenz-Waschung mit 0,12X SSC/0,1 % SDS bei 42 °C während 30 min.
Beispiel 1-17: Isolierte Herzmuskelzellen
Adulte Schweineherzmuskelzellen wurden erhalten durch Collagenase-Perfusion der Herzkranzarterie; und die Zelllebensfähigkeit, Reinheit und Ausbeute wurden ermittelt, wie früher beschrieben (Spinale, F. G., et al., Circ. Res. 69: 1058-1067, 1991). Herzmuskelzellen, frei von anderen Zelllinien-Kontaminanten, wurden eingefroren und anschließend für eine RNA-Extraktion verwendet. RT-PCR unter Verwendung der AC-Isoform-Primer, welche oben beschrieben wurden, wurde durchgeführt. AC-Isoformen wurden durch Hybridisierung (Southern-Blot) mit spezifischen AC_II-, AC_V- und AC_VI-Isoform-Sonden identifiziert. Diese Sonden wurden kloniert und sequenziert aus Schweineherz-cDNA, wie oben beschrieben. Die Sondenspezifität wurde getestet, und es fand keine Kreuzhybridisierung zwischen AC_II-, AC_V- und AC_VI-Isoform-Sonden statt.
Beispiel 1-19: Statistische Analyse
Für die Anzeige der statistischen Signifikanz werden Daten im Allgemeinen als Mittelwert ± 1 SD bzw. Standardabweichung ausgedrückt. Spezifische Messungen wurden verglichen unter Verwendung von Varianzanalyse für wiederholte Messungen; post hoc-Tests wurden durchgeführt unter Anwendung des t-Test nach Student, mit der Bonferroni-Korrektur für mehrere Vergleiche zwischen Gruppen-Mittelwerten. Die Null-Hypothese wurde abgelehnt, wenn p < 0,05 war.
BEISPIEL 2: Ein Großtiermodell für kongestives Herzversagen
Der Weg, auf dem Herzmuskelzellen auf biologische Signale aus der internen Umgebung antworten, erfolgt durch strategisch platzierte Zelloberflächenrezeptoren. Hauptsächlich unter diesen Rezeptoren ist der β-adrenerge Rezeptor. Der Transduktionsweg, durch welchen ein Hormon oder Neurotransmitter, wechselwirkend mit einem β-adrenergen Rezeptor auf der Zelloberfläche, das intrazelluläre Verhalten verändert, ist als der β-adrenerge-Gs-Adenylylcyclase (oder "βAR:Gs:AC")-Weg bekannt, wie gezeigt in der 2. Es erfolgt über diesen Weg, dass β-adrenerge Stimulation intrazelluläres cAMP erhöht, wodurch die Herzgeschwindigkeits-Antwortfähigkeit und Kontraktionskraft beeinflusst werden. Der Weg schließt drei Hauptkomponenten ein: den β-adrenergen Rezeptor (βAR), das stimulatorische GTP-bindende Protein (Gs) und Adenylylcyclase (AC). Die molare Stöchiometrie von Komponenten innerhalb des βAR:Gs:AC-Wegs in Rattenventrikel-Myocyten, und vermutlich Herzmuskelzellen von anderen Säugern, beläuft sich angenommenermaßen jeweils auf etwa 1:70:1 (siehe z. B. Alousi et al., FASEB J. 5: 2300, 1991). β-adrenerge Signalleitung innerhalb von Herzmuskelgewebe wird anfänglich durch Agonistenbindung an βAR vermittelt, gefolgt von G₅-vermittelter Signaltransduktion zu AC. Aktivierte AC katalysiert dann die Synthese von zyklischem AMP, und erhöhte intrazelluläre Konzentrationen von cAMP vermitteln erhöhte cytosolische Calcium-Übergänge, welche sowohl die Geschwindigkeit als auch die Kraft der Herzkontraktion steigern (bezeichnet als positive "Chronotrophie" bzw. positive "Inotrophie".
Wir verwendeten ein Großtiermodell mit Vorhersagefähigkeit für Menschen, um die Möglichkeit zu untersuchen, dass eine oder mehrere Komponenten des βAR:Gs:AC-Wegs (wie gezeigt in 2) effektiv β-adrenerge Transmembran-Signalleitung in Herzmuskelzellen beschränken könnten, und dass eine Erhöhung der Expression von einem oder mehreren der Proteine in dem Weg zu einer gesteigerten Antwortfähigkeit gegenüber endogener β-adrenerger Signalgebung führen könnte. Als beispielhafte β-ASPs haben wir die Aufmerksamkeit anfänglich gerichtet auf AC, β-AR und GRK-Inhibitoren (welche β-AR-Aktivität indirekt steigern), wie es nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
Beispiel 2-1: Hämodynamik und linksventrikuläre Funktion
Wie gezeigt in der Tabelle 1, führte eine rasche ventrikuläre Schrittmacherbehandlung zu einer erhöhten basalen Herzgeschwindigkeit und mittlerem linksatrialen Druck vier Tage nach dem Beginn der Schrittmacherbehandlung. Daten wurden aus sechzehn Tieren (inaktivierte Schrittmacher) erhalten; die Werte repräsentieren den Mittelwert ± 1 Standardabweichung. Gruppen beinhalteten normale Tiere, welche keine Schrittmacherbehandlung erfuhren (Kontrolle, n = 5), Tiere mit mildem Herzversagen, induziert durch vier Tage Schrittmacherbehandlung (4d; n = 5) und Tiere mit schwerem Herzversagen, induziert durch achtundzwanzig Tage Schrittmacherbehandlung (28d, n = 6). LAP, mittlerer linksatrialer Druck; MAP, mittlerer arterieller Druck; EDD, enddiastolischer Druck; FS %, % fraktionelle Verkürzung. Eine Varianzanalyse (wiederholte Messungen), wurde angewandt, um zu bestimmen, ob die Dauer der Schrittmacherbehandlung eine spezifische Variable beeinflusste.
Nach vier Tagen zeigten die Tiere ebenfalls eine erhöhte enddiastolische Abmessung, reduzierte fraktionelle Verkürzung und ein vermindertes linksventrikuläres positives Peak-dP/dt. Diese Daten zeigen eine milde Verschlechterung der linksventrikulären Funktion vier Tage nach dem Beginn der kontinuierlichen raschen Schrittmacherbehandlung an.
Die Herzbedingungen verschlechterten sich beträchtlich nach achtundzwanzig Tage langer Schrittmacherbehandlung (Tabelle 1), was ein Modell für Herzversagen in einem Großtier bereitstellt, welches als in der Vorhersage aussagekräftig für Menschen angesehen wird. Zusätzliche Beweise, welche die Aussagekraft als Vorhersage dieses Schweine-Herzversagen-Modells für CHF in Menschen belegen, werden hierin und im Fachgebiet (siehe z. B. Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest. 91: 939-949, 1993, und verwandte Bezugsstellen, wie oben zitiert) beschrieben.
TABELLE 1 HÄMODYNAMIK UND LINKSVENTRIKULÄRE FUNKTION
Die Daten wurden aus sechzehn Tieren (inaktivierte Schrittmacher) erhalten; die Werte repräsentieren den Mittelwert ± 1 Standardabweichung. Die Gruppen schlossen normale Tiere ein, welche nicht mit Schrittmachern behandelt wurden (Kontrolle, n = 5), Tiere mit mildem Herzversagen, induziert durch vier Tage Schrittmacherbehandlung (4d; n = 5), und Tiere mit schwerem Herzversagen, induziert durch achtundzwanzig Tage Schrittmacherbehandlung (28d, n = 6). LAP, mittlerer linksatrialer Druck; MAP, mittlerer arterieller Druck; EDD, enddiastolischer Druck; FS %, % fraktionelle Verkürzung. Die Varianzanalyse (wiederholte Messungen) wurde angewandt, um zu bestimmen, ob die Dauer der Schrittmacherbehandlung eine spezifische Variable beeinflusste. Post hoc-Testen wurde durchgeführt unter Verwendung des t-Tests nach Student mit der Bonferroni-Korrektur: ^ap < 0,05; ^bp < 0,01; ^cp < 0,001 (gegenüber Kontrolle); ^dp < 0,05; ^ep < 0,01; ^fp < 0,001 (4d gegenüber 28d).
Beispiel 2-2: Nekropsie
In Tieren, welche vier Tage lang mit Schrittmachern behandelt wurden, war Aszites-Flüssigkeit vorhanden (mittlere Menge: 150 ml; Bereich 0-500 ml). Die Verhältnisse von Leber zu Körpergewicht, verglichen zu früher berichteten gewichts-angepassten Kontrollschweinen (Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest., 91: 939-949, 1993) stiegen nach vier Tagen Schrittmacherbehandlung (Kontrolle: 18 ± 3 g/kg, n = 15; 4d: 25 ± 2 g/kg, n = 5; p < 0,0001). Deshalb verursachte vier Tage lange Schrittmacherbehandlung eine mäßige Erhöhung in der systemischen Kongestion. Verhältnisse von linkem Ventrikel zum Körpergewicht, verglichen zu früher berichteten gewichts-angepassten Kontrollen (Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest., 91: 939-949, 1993) stiegen nicht an (Kontrolle: 2,7 ± 0,5 g/kg, n = 15; 4d: 3,0 ± 0,4 g/kg, n = 5; p = 0,24).
Nach achtundzwanzig Tagen Schrittmacherbehandlung waren die Leber-zu-Körpergewicht- Verhältnisse um das Zweifache erhöht (p < 0,0001), und Linksventrikel-zu-Körpergewicht-Verhältnisse waren unverändert, wie früher berichtet (Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest., 91: 939-949, 1993).
BEISPIEL 3: Die Rolle von Adenylylcyclase als ein β-adrenerges Signalprotein in einem Großtiermodell für kongestives Herzversagen
Die folgenden Daten zeigen, dass die Menge der exemplarischen β-ASP-Adenylylcyclase tatsächlich eine Grenze für die β-adrenerge Signalleitung über diesen Weg in Großtiermodellen darstellt, von welchen erwartet wird, in hohem Maße vorhersagend für die Herzfunktion und Dysfunktion im Menschen zu sein.
Beispiel 3-1: Adenylylcyclase-Aktivität (cAMP-Produktion) nach Herz-Schrittmacherbehandlung in Schweinen
Wir untersuchten die cAMP-Produktion, um die Funktion von Adenylylcyclase in linksventrikulären Membranen aus normalen Schweinen und aus Schweinen mit schwerem Herzversagen zu überprüfen, wobei ein Modell des Herzversagens mit einer sehr hohen Originalgetreue zum menschlichen klinischen dilatatierten Herzversagen verwendet wurde (wie beschrieben von Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest. 91: 939-949, 1993).
Nach nur vier Tagen der Schrittmacherbehandlung war die Isoproterenol-stimulierte cAMP-Produktion einigermaßen verringert (p < 0,05) in linksventrikulären Membranen. Forskolinstimulierte cAMP-Produktion, ein Indikator von AC-Aktivierung, unabhängig von β-AR-vermittelter Stimulation, war zu dieser Zeit nicht signifikant getroffen.
Im Gegensatz dazu führten achtundzwanzig Tage Schrittmacherbehandlung zu wesentlichen Reduktionen in allen Maßen bzw. Messungen der AC-Aktivität. Unsere Ergebnisse, wie gezeigt in 3 (welche Forskolin-stimulierte cAMP-Produktion darstellt), demonstrierten, dass es tatsächlich eine wesentliche Reduktion in der Aktivität der β-ASP-Adenylylcyclase in Assoziation mit schwerem Herzversagen in diesen Tieren gab.
Beispiel 3-2: Identifizierung von AC-Isoformen in Herzmuskelzellen-Proben
RT-PCR wurde verwendet, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, entsprechend der erwarteten Größe von AC aus Herzmuskelzellen-Proben, welche aus adulten Schweinen erhalten werden. Das DNA-Fragment war abwesend, als reverse Transkriptase aus der Reaktion weggelassen wurde.
Nach Hybridisierung mit verschiedenen AC-spezifischen Sonden, enthüllten Southern-Blots, dass adulte Schweine-Myocyten die AC-Isoformen II, V und VI exprimieren.
Beispiel 3-3: AC-mRNA-Expression im Schweine-Modell
Wir untersuchten Änderungen in den mRNA-Spiegeln der AC-Isoformen (II, V und VI) in normalen Schweinen und in Schweinen, welche Herzversagen aufzeigten.
Nach nur vier Tage langer Schrittmacherbehandlung bestanden keine signifikanten Veränderungen hinsichtlich des mRNA-Gehalts der drei AC-Isoformen.
Im Gegensatz dazu, wie gezeigt in der 3, war AC_VI-mRNA nach 28 Tagen Schrittmacherbehandlung im Herzversagen-Modell signifikant herunterreguliert (p = 0,002), wohingegen AC_II und AC_V relativ unverändert waren. Es bleibt möglich, dass Änderungen in den letztgenannten AC-Isoformen auf dem Proteinniveau ohne wesentliche Änderungen in der mRNA für diese Isoformen stattgefunden haben können.
Unsere Beobachtungen, dass Forskolin-stimulierte cAMP-Produktion relativ unverändert war, bis schweres Herzversagen vorhanden war, unterstützen indirekt die Vorstellung, dass AC-Proteinexpression während der anfänglichen Stadien der Herzdysfunktion relativ normal war. Allerdings zeigen unsere Daten in deutlicher Weise wesentliche Reduktionen in allen Messungen der AC-Aktivität, und die Herabregulierung von AC_VI-Protein und-mRNA, in Assoziation mit dem Ausbruch von schwererem Herzversagen.
BEISPIEL 4: Die Rolle von β-AR und GRK-Inhibitoren als β-adrenerge Signalproteine in einem Großtiermodell für kongestives Herzversagen
Wie in den folgenden Beispielen beschrieben wird, untersuchten wir ebenfalls die Rolle von β-adrenergen Rezeptorproteinen und GRK-Aktivität in der β-adrenergen Signalleitung im Schweinemodell für Herzversagen.
Beispiel 4-1: Linksventrikuläre β-adrenerge Rezeptoren und G-Protein-Gehalt
Trotz Änderungen in der linksventrikulären Funktion und der Kreislauf-Kongestion war eine vier Tage lange Schrittmacherbehandlung nicht mit signifikanten Änderungen in der linksventrikulären β-AR-Anzahl oder Änderungen hinsichtlich der stimulatorischen (Gsα) oder inhibitorischen (Giα₂) GT-bindenden Proteine assoziiert. Allerdings führten vier Tage der Schrittmacherbehandlung zu einem verringerten Anteil an linksventrikulären β-ARs, welche eine Hochaffinitätsagonistenbindung aufzeigten (p < 0,01), was eine Entkopplung des β-AR vom Gsα nahe legte.
Nach achtundzwanzig Tage langer Schrittmacherbehandlung im Herzversagen-Modell beobachteten wir eine wesentliche Herunterregulierung der linksventrikulären β-AR-Anzahl, zu einem Zeitpunkt, als sowohl Gsα als auch Giα₂ ebenfalls herunterreguliert sind (Roth, D. A., et al., J. Clin. Invest., 91: 939-949, 1993).
Beispiel 4-2: G-Protein-Rezeptorkinase-Aktivität
Sowohl cytosolische als auch Membranfraktionen der linksventrikulären Homogenate wurden säulengereinigt, und eine lichtabhängige Phosphorylierung von Rhodopsin wurde angewandt, um GRK-Aktivität zu messen.
Nach vier Tagen Schrittmacherbehandlung zeigten die Tiere Erhöhungen hinsichtlich der linksventrikulären GRK-Aktivität, welche nach weiteren vierundzwanzig Tagen der Schrittmacherbehandlung scheinbar keine weiteren Erhöhungen erfuhr (Tabelle 2). Ein wesentlicher Anteil (40 %) der myokardialen GRK-Aktivität war mit dem Sarkolemma assoziiert, und obwohl Gesamt-GRK-Aktivität in Zusammenhang mit dem Ausbruch von linksventrikulärer Dysfunktion zunahm, war die zelluläre Verteilung von GRK-Aktivität nicht verändert.
TABELLE 2 LINKSVENTRIKULÄRE G-PROTEIN-REZEPTORKINASE-AKTIVITÄT
G-Protein-Rezeptorkinase-Aktivität in linksventrikulären Membranen. Daten aus sechzehn Tieren; die Gruppen schlossen normale Tiere ein, welche nicht mit Schrittmacher behandelt wurden (Kontrolle, n = 5), Tiere mit mildem Herzversagen, induziert durch vier Tage Schrittmachung (4d; n = 5), und Tiere mit schwerem Herzversagen, induziert durch achtundzwanzig Tage Schrittmacherbehandlung (28d, n = 6). Bei den Werten handelt es sich um den Mittelwert ± 1 Standardabweichung, und sie repräsentieren ³²P-Einbau (fMol/mg/min). Eine Varianzanalyse (wiederholte Messungen) wurde angewandt, um zu bestimmen, ob die Dauer der Schrittmacherbehandlung eine spezifische Variable beeinflusste. Post hoc-Testen wurde mittels des t-Tests gemäß Student mit der Bonferroni-Korrektur durchgeführt: ^ap < 0,05; ^bp < 0,01 (gegenüber Kontrolle).
Beispiel 4-3: G-Protein-Rezeptorkinase₂-Proteingehalt
Eine Bande, welche geschätztermaßen 80 kD groß ist, welche mit gereinigtem Rinder-GRK₂ comigrierte, wurde mit dem GRK₂-Antikörper identifiziert. LV-Gesamt-GRK₂-Proteingehalt war bei mildem Herzversagen (4 Tage Schrittmacherbehandlung) unverändert, zeigte jedoch die Neigung zur Verringerung im LV bzw. linken Ventrikel aus Tieren mit schwerem Herzversagen (Kontrolle: 1,37 ± 0,17 du/μg; 4d bzw. 4 Tage: 1,58 ± 0,34 du/μg; 28d: 1,02 ± 0,07 du/μg; p < 0,02 mittels ANOVA). Allerdings zeigte die post hoc-Analyse, dass die einzigen Gruppen-Mittelwert-Vergleiche, welche statistisch signifikant waren, diejenigen von 4d gegenüber 28d waren (p < 0,03). Die GRK₂-Konzentration war im Überstand (p < 0,04) reduziert, aber nicht in der Pelletfraktion des LV-Homogenats bei schwerem Herzversagen.
Beispiel 4-4: G-Protein-Rezeptorkinase₅-Proteingehalt
Eine Bande, welche bei 68 kD wandert, was GRK₅ identifiziert, wurde unter Anwendung des GRK₅-Antikörpers detektiert. LV-Gesamt-GRK₅-Proteingehalt war bei mildem Herzversagen (4 Tage Schrittmacherbehandlung) erhöht und stieg weiter bei schwerem Herzversagen (Kontrolle: 0,62 ± 0,16 du/μg; 4d: 0,97 ± 0,16 du/μg; 28d: 1,33 ± 0,25 du/μg; p = 0,0004 mittels ANOVA; Kontrolle gegenüber 4d, p < 0,04; Kontrolle gegenüber 28d, p < 0,001).
Beispiel 4-5: G-Protein-Rezeptorkinase₂-mRNA-Gehalt
Eine schätzungsweise 3,8 kb große mRNA-Spezies wurde mit der GRK₂-Sonde identifiziert. Eine weitere Spezies von 2,4 kb wurde ebenfalls bemerkt. Der LV-GRK₂-mRNA-Gehalt war bei mildem Herzversagen (4 Tage Schrittmacherbehandlung) unverändert, aber war in LV aus Tieren mit schwerem Herzversagen reduziert (Kontrolle: 67 ± 11 du; 4d: 66 ± 16 du; 28d: 45 ± 13 du; p = 0,02 mittels ANOVA; Kontrolle gegenüber 28d, p = 0,02; 4d gegenüber 28d, p < 0,03). Wir waren nicht in der Lage, GRK₃(βARK₂)-Expression entweder mit PCR oder mittels Northern-Blotting nachzuweisen.
Beispiel 4-6: G-Protein-Rezeptorkinase₅-mRNA-Gehalt
Eine schätzungsweise 3,0 kb mRNA-Spezies wurde mit der GRK₅-Sonde identifiziert. Der LV-GRK₅-mRNA-Gehalt wurde innerhalb von 4 Tagen vom Beginn der Schrittmacherbehandlung ab hochreguliert, ein Befund, welcher während 28 Tagen andauerte (Kontrolle: 54 ± 4 du; 4d: 110 ± 28 du; 28d: 96 ± 17 du; p = 0,001 mittels ANOVA; Kontrolle gegenüber 4d, p = 0,003; Kontrolle gegenüber 28d, p = 0,01).
Beispiel 4-7: β-AR und GRK-Inhibitoren als β-adrenerge Signalleitungsproteine (β-ASPs)
Ergebnisse, welche in unserem Großtiermodell des Herzversagens erhalten wurden, bestätigten, dass eine verringerte β-AR-Antwortfähigkeit bei Herzversagen mit einer selektiven Herabregulierung von myokardialen β₁-AR- und β₁-AR-mRNA-Spiegeln assoziiert ist; β₂-AR-Expression und-mRNA-Gehalt verändern sich nicht (siehe z. B. Bristow, M. R., et al., J. Clin. Invest. 92: 2737-2745, 1993; Ping, P., et al., Am. J. Physiol., 267: H2079-H2085, 1994; Ungerer M., et al., Cireulation, 87: 454-461, 1993); und dass die verbleibenden β-ARs von Gs (dem stimulatorischen GTP-bindenden Protein, welches Rezeptor-Aktivierung mit AC-Stimulation koppelt) entkoppelt werden, wie reflektiert durch eine Reduktion in der Hochaffinitäts-Agonistenbindung (siehe z. B. Bristow, M. R., et al., Mol. Pharm. 35: 295-303, 1989; Bristow, M. R., et al., J. Clin. Invest., 92: 2737-2745, 1993). Mechanismen für die β-AR-Entkopplung in CHF sind nicht unumstößlich belegt worden. GRK, vorwiegend untersucht in Zellen mit β₂-ARs, phosphoryliert den β₂-AR nach einer adrenergen Aktivation (Hausdorff, W. P., et al., FASEB J., 4: 2881-2889, 1990; Inglese, J., et al., J. Biol. Chem., 268: 23735- 23738, 1993), und kann eine Rolle bei der β-AR-Desensitivierung bei den Umständen einer anhaltenden sympathischen Aktivation spielen, wie sie bei CHF stattfindet. Nach β₂-AR-Stimulation durch einen Agonisten, übersiedelt GRK₂ aus dem Cytosol ins Sarkolemma, phosphoryliert den β₂-AR und entkoppelt dadurch den β₂-AR und Gs, wodurch das Signal abgeschwächt wird (Hausdorff, W. P., et al., FASEB J., 4: 2881-2889, 1990; Inglese, J., et al., J. Biol. Chem., 268: 23735-23738, 1993). Eine Rolle für die GRK-vermittelte Phosphorylierung des β₁-AR ist kürzlich aufgezeigt worden, eine Phosphorylierung, welche sowohl von GRK₂ als auch GRK₅ vermittelt werden kann (Freedman, N. J., et al., J. Biol. Chem., 270: 17953-17961, 1995; Koch, W. J., et al., Science, 268: 1350-1353, 1995). Darüber hinaus führt die chronische Reduktion von β₁-AR-Aktivierung (Bisoprolol-Behandlung) zu einer Herabregulierung der GRK-Aktivität und einer gesteigerten adrenergen Signalleitung, was nahe legt, dass das Ausmaß der adrenergen Aktivierung die GRK-Expression beeinflussen kann (Ping, P., et al., J. Clin. Invest. 95: 1271-1280, 1995). Jüngere Untersuchungen haben nahe gelegt, dass GRK-Aktivität ebenfalls erhöht ist in der löslichen Fraktion von linksventrikulären Homogenaten von an Versagen leidenden menschlichen Herzen (Salomon, Y., et al., Anal. Biochem., 58: 541-548, 1974; Ungerer, M., et al., Circ. Res., 74: 206-213, 1994).
Unsere Befunde in Hinsicht auf die GRK-Aktivität im Schweine-Herzversagenmodell sind ebenfalls ähnlich zu denjenigen, welche berichtet wurden von Ungerer et al. (Ungerer, M., et al., Circulation, 87: 454-461, 1993), dahingehend, dass die linksventrikuläre GRK-Aktivität im versagenden linken Ventrikel erhöht ist. Allerdings gibt es mehrere Aspekte unserer Daten, welche in Hinsicht auf GRK-Expression bei der Situation eines Herzversagens ziemlich neuartig sind. Zum Ersten, anders als bei früheren Berichten, haben wir die GRK-Aktivität sowohl in löslichen als auch in partikulären bzw. teilchenförmigen Fraktionen gemessen. Obgleich Herzversagen nicht die sarkolemmale/cytosolische Verteilung von GRK-Aktivität beeinflusst, ist ein schweres Herzversagen mit einer erhöhten myokardialen GRK-Aktivität in beiden Fraktionen assoziiert. Ein zweiter neuer Befund besteht darin, dass die Erhöhung hinsichtlich Gesamt-GRK-Aktivität ein frühes Ereignis bei Herzversagen war, welches auftrat vor Änderungen in β-AR-Anzahl, G-Protein-Gehalt, oder AC-Isoform-Expression oder Katalysator-Aktivität. Zu dem Ausmaß, in welchem eine erhöhte GRK-Aktivität dazu dienen kann, Gs und den β-AR zu phosphorylieren und zu entkoppeln, haben wir auch ein potenzielles biochemisches Korrelat von erhöhter GRK-Aktivität aufgezeigt. Im Zusammenhang mit verringerten Anzahlen von β-ARs, welche Hochaffinitäts-Agonistenbindung aufzeigen, stellten wir eine reduzierte hormonelle Stimulation von cAMP fest, welche temporär mit einer erhöhten Gesamt-GRK-Aktivität korrelierte. Zum Dritten waren Gesamt-GRK₅-Protein- und-mRNA-Gehalt erhöht, auch bei diesem frühen Zeitpunkt, und diese Erhöhungen persistierten bei schwerem Herzversagen. Diese Daten unterstützen die Idee, dass eine erhöhte myokardiale GRK-Expression anderen Veränderungen in der adrenergen Signalleitung bei Herzversagen vorausgeht, und daher ein wichtiges frühes Ereignis in der Pathogenese zu sein schein. Eine frühere Studie ermittelte eine erhöhte GRK-Aktivität und erhöhte GRK₂-mRNA (unter Verwendung von PCR) in explantierten, an Versagen leidenden humanen linken Ventrikeln (Ungerer, M., et al., Circulation, 87: 454-461, 1993). Wir fanden jedoch verringerte LV-GRK₂-mRNA-Spiegel mittels Northern-Blotting. Die Diskrepanz in Hinsicht auf LV-GRK₂-mRNA-Spiegel in der vorliegenden Untersuchung gegenüber den Studien an Menschen kann eine Widerspiegelung der unterschiedlichen, zur Überprüfung von mRNA eingesetzten Verfahren, der verschiedenen angewandten Modelle oder der Schwierigkeit beim Erhalten von echtem bzw. wahrhaftigem Kontrollmaterial in den Studien an Menschen sein. Wir merken ebenfalls an, dass GRK₅ im zitierten Bericht nicht untersucht wurde. Obgleich wir eine Rolle für GRK₂ bei schwerem Herzversagen nicht ausschließen, unterstützen unsere Daten die Idee, dass GRK₅ eine wichtigere Rolle spielen kann.
Eine erhöhte GRK-Aktivität wurde in der löslichen Fraktion von LV-Membranen aus Tieren mit mildem Herzversagen nachgewiesen, wohingegen GRK₂- und GRK₅-Proteingehalt in der löslichen Fraktion nicht signifikant erhöht waren. Dies kann eine Ungleichheit bzw. Disparität zwischen der enzymatischen Aktivität und dem Proteingehalt anzeigen, oder kann methodische Unterschiede bei der Proteinverteilung in den Membranpräparationen, die für den en zymatischen Assay verwendet wurden, gegenüber Immunoblotting-Untersuchungen widerspiegeln.
Die vorliegende Untersuchung dokumentiert erstmalig, dass myokardiale GRK₅-Protein- und -mRNA-Gehalte für eine Hochregulierung bei mildem und schwerem Herzversagen anfällig sind. Ohne dass gewünscht wird, durch Theorie gebunden zu sein, unterstützen unsere Daten die Idee, dass eine erhöhte Expression von GRK₅ für die erhöhte GRK-Aktivität verantwortlich sein kann, welche in diesen klinischen Bedingungen beobachtet wird. In jedem Fall unterstützen die vorliegenden Daten in starkem Maße die Hypothese, dass eine erhöhte linksventrikuläre GRK-Expression zu einer verringerten adrenergen Signalleitung bei einem frühen Stadium während der Entwicklung von Herzversagen beiträgt.
BEISPIEL 5: Konstruktion eines Vektors zur Genzuführung von Adenylylcyclase
Als eine Veranschaulichung der Konstruktion eines Genzuführungsvektors zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung haben wir Konstrukte unter Anwendung eines Helferunabhängigen replikationsdefekten viralen Vektors, wie oben beschrieben, hergestellt. Insbesondere demonstrieren wir in diesem Beispiel die Erzeugung von replikationsdefekten adenoviralen Konstrukten, basierend auf dem humanen Adenovirus-5-System (siehe z. B. McGrory, W. J., et al., Virology 163: 614-617, 1988).
Am Anfang wählten wir ein Adenylylcyclase-Protein aus, im Besonderen Adenylylcyclase-Isoform VI (AC_VI). Wir konstruierten deshalb Vektoren, umfassend entweder AC_VI oder lacZ (als ein veranschaulichendes detektierbares Markergen, welches β-Galactosidase codiert). Das System, verwendet zum Erzeugen von rekombinanten Adenoviren (basierend auf diesen "Erstgenerations"-Vektoren) setzt Verpackungsbeschränkungen, welche angenommenermaßen zunehmen, wenn die Größe des Transgen-Inserts etwa 5 kb übersteigt. Im Falle von Steuerungselementen, wie einem CMV-Promotor und einem SV40-Polyadenylierungssignal (welche zusammen ungefähr 1 kb umfassen) macht das Transgen selbst (d. h. ohne zusätzliche Steuerungselemente) deshalb vorzugsweise weniger als etwa 4 kb aus. Obwohl kleinere Transgene deshalb bevorzugt werden, haben wir auch gezeigt, dass wesentlich größere Transgene nichtsdestoweniger verwendet werden können, selbst in diesen "Erstgenerations"-Vektoren. Zum Beispiel verwendeten wir, in einem ersten exemplarischen AC-Transgen, beschrieben in Beispiel 5-1, im Wesentlichen die gesamte transkribierte Region aus einem murinen Adenylylcyclase-Gen (ungefähr 5748 bp) zusammen mit einem heterologen CMV-Promotor (ungefähr 790 bp) und einem SV40-Polyadenylierungssignal (ungefähr 230 bp). Wie nachstehend ausführlich beschrieben, haben wir gezeigt, dass derartige Transgene (einschließend mehr als 6,7 kb, mit Steuerungselementen) nichtsdestoweniger eingebaut und ef fektiv mit diesen Erstgenerationsvektoren verwendet werden können.
Allerdings, in Hinsicht auf die bekannten Verpackungseinschränkungen dieser besonderen Vektoren, und als ein anderes beispielhaftes AC-Transgen, konstruierten wir ein verändertes Adenylylcyclase-Gen, in welchem eine untranslatierte Region des Transkripts deletiert war, um ein kürzeres AC-Transgen zu erzeugen. In der nachstehend in Beispiel 5-2 beschriebenen veranschaulichenden Ausführungsform wurde die 3'-untranslatierte Region aus dem AC_VI-Gen entfernt, und das resultierende Konstrukt wurde in einen Vektor zur Zuführung des Transgens zum Herzen eingebracht, wie hierin beschrieben. Wie es offensichtlich sein wird, hängt die Erwünschtheit der Verkürzung des Transgens (im Fall eines Größen-beschränkten viralen Vektors, wie Ad oder AAV) zum Teil von der Länge des nativen Gens ab, sowie von der Auswahl der verwendeten Steuerungselemente. Im Fall von Ad, bei welchem die Gesamt-Insert-Größe etwa 5 kb übersteigt, kann das Transgen verkürzt werden, vorzugsweise in der 3'-untranslatierten Region, was zu einem kürzeren Insert führt. Wie es ebenfalls offensichtlich ist, hängt das bevorzugte Ausmaß der Verkürzung von der Insert-Größe ab, beläuft sich aber typischerweise auf mindestens etwa 100 bp, weiter bevorzugt mindestens etwa 500 bp, noch weiter bevorzugt mindestens etwa 1000 bp (insbesondere, wenn die Gesamt-Insert-Größe noch größer als etwa 5 kb ist). Wir haben gezeigt, dass die gesamte 3'-untranslatierte Region ohne Weiteres aus der AC_VI-Isoform deletiert werden kann, was zu einem wesentlich kürzeren Transgen führt. Erstgenerations-AAV-Vektoren sind ebenfalls größenbeschränkt, und die Effizienz sinkt, bei Inserts, welche wesentlich größer als etwa 5 kb sind. Für diese und andere derartige Vektoren können jedoch "Zweitgenerations"-Derivate zusätzlichen Platz für Transgen-Verpackung bereitstellen. Andere virale Vektoren, sowie verschiedene nicht-virale Vektoren, können verwendet werden, um wesentlich größere Inserts aufzunehmen.
Das Beispiel 5-3 beschreibt die Identifizierung von Sequenzen, codierend ein humanes Adenylylcyclase-Gen. Wie hierin beschrieben, können derartige humane AC-Transgene erhalten werden durch Screening von humanen DNA-Bibliotheken (unter Verwendung von Sonden aus homologen Säugergenen), und derartige humane AC-Transgene können nützlicherweise im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Insbesondere wo das therapeutische Ziel ein menschliches Herz ist, wird es erwartet, dass die Verwendung von humanen AC-Transgenen zusätzliche Vorteile bereitstellen kann (einschließlich potenziell engerer Koordination mit anderen Komponenten des β-adrenergen Signalleitungsweges, sowie einer weiteren Minimierung der Möglichkeit einer Wirtsantwort auf nicht-humane Proteine). Die Isolierung und Sequenzierung eines beispielhaften humanen AC-Transgens wird nachstehend in Beispiel 5-3 beschrieben.
Beispiel 5-1: Erzeugung eines AC-Transgens unter Verwendung einer Volllängen-AC_VI-cDNA
Für die Erzeugung eines ersten exemplarischen AC-Transgens verwendeten wir eine cDNA, codierend murine AC_VI (eine Ca(2+)-inhibierbare AC aus murinen NCB-20-Zellen, wie berichtet von Yoshimura, M., und Cooper, D. M., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 6716-6720, 1992, welche in dem Artikel bezeichnet wird als "pAC-V", heutzutage bekannt als "pAC-VI"; siehe auch Krupinski, J., et al., J. Biol. Chem. 267: 24858-24862, 1992). Die Volllängen-AC_VI-cDNA wurde in den Polylinker des Plasmids ACCMVPLPA (J. Biol. Chem. 267: 25129-25134, 1992) kloniert, welches den CMV-Promotor und das SV40-Polyadenylierungssignal, flankiert von partiellen Adenovirussequenzen, aus denen die E1A- und E1B-Gene deletiert worden sind, welche essentiell für die Virenreplikation sind, enthält. Das resultierende Plasmid wurde (mittels Lipofektion) in humane 293-Zellen co-transfiziert mit dem Plasmid JM17 (Giordano et al., Nature Medicine 2: 534-539, 1996), welches das gesamte humane Adenovirus-5-Genom sowie ein zusätzliches 4,3 kb großes Insert enthält (wodurch pJM17 zu groß für eine Einkapselung gemacht wird).
Eine homologe Rescue-Rekombination führte zur Erzeugung von rekombinanten Adenovirus-Vektoren, enthaltend das Transgen (AC_VI oder lacZ) in Abwesenheit von E1A/E1B-Sequenzen (wie veranschaulicht in 1). Obwohl diese Rekombinanten in normalen Säugerzellen nicht-replikativ waren, können sie in humanen 293-Zellen vermehrt werden, welche mit E1A/E1B transformiert worden waren (und daher diese essenziellen Replikations-Genprodukte in trans bereitstellten).
Transfizierte humane 293-Zellen wurden nach Anzeichen eines cytopathischen Effektes, welcher üblicherweise 10-14 Tage nach der Transfektion auftrat, überwacht. Um erfolgreiche Rekombinanten zu identifizieren, wurde Zellüberstand aus Platten, welche einen cytopathischen Effekt aufzeigten, mit Proteinase K (50 mg/ml mit 0,5 % Natriumdodecylsulfat und 20 mM EDTA) bei 56 Grad C während 60 Minuten behandelt, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Erfolgreiche rekombinante virale Vektoren wurden dann mittels PCR unter Verwendung von Primern, welche komplementär waren zu den CMV-Promotor- und SV40-Polyadenylierungs-Sequenzen, um das Insert zu amplifizieren, und von Primern, entworfen, um gleichzeitig Adenovirus-Sequenzen zu amplifizieren (wie in Biotechniques 15: 868-872, 1993), identifiziert.
Erfolgreiche rekombinante virale Partikel wurden dann zwei Runden einer Plaque-Aufreinigung unterzogen. Virale Stammlösungen wurden ferner in humanen 293-Zellen bis zu Titern im Bereich zwischen 10¹⁰ und 10¹² viralen Partikeln vermehrt und wurden durch dop pelte CsCl-Gradientenzentrifugation vor der Anwendung unter Befolgung von Standardvorgehensweisen gereinigt. Kurz gesagt, wurden Zellen bei 80 % Konfluenz infiziert und bei 36- 48 Stunden abgeerntet; und, nach Einfrier-Auftau-Zyklen, wurden die Zelltrümmer durch Standard-Zentrifugation eingesammelt, und das Virus wurde weiter gereinigt durch doppelte CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation (diskontinuierlicher 1,33/1,45-CsCl-Gradient; Cäsium, zubereitet in 5 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7,8); 90000 × g (2 Stunden), 105000 × g (18 Stunden)).
Vor in vivo-Injektion wurden die viralen Stammlösungen typischerweise durch Gelfiltration durch Sepharosesäulen, wie G25-Sephadex, entsalzt. Die resultierende virale Stammlösung wies einen letztendlichen Virentiter im Bereich von 10¹⁰-10¹² viralen Teilchen auf. Die virale Präparation erwies sich als hochgereinigt, wobei im Wesentlichen kein replikatives Virus vorhanden war (wie bestimmt durch Abwesenheit eines cytopathischen Effekts nach Transfektion des Vektors in humane 293-Wirtszellen).
Beispiel 5-2: Erzeugung eines zweiten AC-Transgens unter Verwendung eines verkürzten Adenylylcyclase-Gens
Als ein anderes veranschaulichendes AC-Transgen konstruierten wir ein verändertes Adenylylcyclase-Gen, in welchem eine untranslatierte Region des normalen Transkripts entfernt worden war, um ein kürzeres β-ASP-Transgen zu erzeugen. Insbesondere entfernten wir im Wesentlichen die 3'-untranslatierte Region aus einem AC_VI-Konstrukt und bauten das resultierende verkürzte Transgen in einen viralen Vektor zur Genzuführung ein.
Plasmidkonstruktion und Produktion von rekombinantem Adenovirus. Eine murine AC_VI-cDNA ohne die 3'-untranslatierte Region wurde wie folgend konstruiert. Ein Subfragment, enthaltend den 3'-Bereich von AC_VI mit einer XhoI-Stelle an seinem 5'-Ende wurde unter Verwendung von zwei PCR-Primern erzeugt: AC_VIPX, welcher an AC_VI-cDNA an den Basen 2500-2521 annealt; und AC_VIp3'HA, welcher Sequenzen aus dem 3'-Ende von AC_VI und Sequenzen aus humanem Influenza-Hämagglutinin enthält. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und XbaI verdaut, welche in den Primern am 3'-Ende vorgesehen waren. Der 5'-Bereich des AC_VI-Fragments (Basenpaar –92 bis +2500) wurde erhalten durch EcoRI- und XhoI-Verdau der Volllängen-cDNA (wie oben beschrieben), und wurde auf einem Agarosegel isoliert. Zwei AC_VI-Fragmente wurden dann in einen EcoRI-XbaI-verdauten Adenovirusvektor (pAd5CI, ein Geschenk von Dr. Swang Huang, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) durch Drei-Molekül-Ligation subkloniert. Der pAd5/CI-Vektor enthält eine Cytomegalovirus-"immediate-early"-Enhancer/Promotor-Region (CMV-Promotor), ein chimäres Intron und eine Mehrfachklonierungsstelle, abgeleitet aus pCI-Plasmid-DNA (Promega, Madison, WI). Er enthält des Weiteren eine Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungs (Poly A)-Sequenz und partielle humane Adenovirus-5-Sequenzen. Die Einführung der zwei AC_VI-Fragmente in das EcoRI-XbaI-verdaute Plasmid, wie oben bemerkt, führte zur Erzeugung des Plasmids pADV5/AC_VI, welches in 1B abgebildet ist (Abkürzungen: AC VI – Adenylylcyclase VI; CMVp – Cytomegalovirus-"immediate-early"-Enhancer/Promotor-Region; HA-tag – Markierung bzw. "tag" mit Hämagglutinin-Protein des Influenzavirus; BGH-poly A – Rinderwachstumshormon-PolyA; Adv5 – Adenovirus 5).
Unter Befolgung der Verfahrensweisen, wie oben beschrieben, wurde der AC_VI-enthaltende Vektor co-transfiziert (Calciumphosphat) in eine humane embryonale Nierenzelllinie (H293) mit pJM17, welcher das Adenovirusgenom außer der E1-Region enthält. Nach der Rekombination wurden Plaques selektiert und in H293-Zellen expandiert bzw. vermehrt. H293-Zellen sind mit Adenovirus E1 transformiert worden und liefern deshalb diesen viralen Transkriptionsfaktor in trans. Die Expression von AC_VI wurde untersucht durch RT-PCR und Western-Blot-Analyse. Das Virus wurde durch Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation gereinigt und entsalzt durch Säulenfiltration über Sephadex G25, equilibriert mit PBS, wie oben beschrieben. Die Virenkonzentration wurde durch optische Densitometrie bei OD₂₆₀ bestimmt. Plaquebildende Einheiten (pfu) wurden durch Plaque-Titration unter Verwendung von H293-Zellen geassayt, welche mit Agarose-DMEM-Medium überschichtet waren.
Identifizierung von AC_VI exprimierenden Klonen. Um Adenovirus-Klone zu identifizieren, welche AC_VI exprimierten, wurden sechzehn Klone mittels RT-PCR unter Verwendung eines Paares spezifischer Primer (AC_VIPX und AC_VIp3'HA), welche an Transgen-AC_VI aber nicht endogene AC_VI in H293-Zellen hybridisieren, gescreent bzw. durchrastert. Das 512 bp große RT-PCR-Produkt wurde durch Verdau mit dem Restriktionsenzym ApaI bestätigt, um 312 bp und 200 bp große Fragmente herzustellen. Drei von sechzehn Klonen exprimierten AC_VI-mRNA. Ausgedrückt als Vielfaches der Erhöhung der cAMP-Produktion zeigten alle drei Klone eine erhöhte cAMP-Produktion in Antwort auf Stimulation mittels Isoproterenol (Klon 1, 22 fache Erhöhung; Klon 2, 15 fache Erhöhung; Klon 3, 12 fache Erhöhung) und Forskolin (Klon 1, 16 fache Erhöhung; Klon 2, 11 fache Erhöhung; Klon 3, 13 fache Erhöhung). Der Klon 1 wurde für zusätzliche Analysen unter Verwendung von Herzmuskelzellen, wie beschrieben in Beispiel 8-2, ausgewählt.
Beispiel 5-3: Erzeugung eines dritten AC-Transgens
Wie oben erörtert, existieren AC-Gene in vielen Säugergeweben, wobei unterschiedliche Isoformen typischerweise in gewissen Gewebetypen vorherrschen. Es besteht die Neigung zu einem Vorherrschen der Isoformen II, V und VI in Herzgewebe. Derartige Gene neigen eben falls dazu, ein ziemlich signifikantes Ausmaß an Sequenzkonservierung zwischen unterschiedlichen Säugetieren aufzuzeigen, insbesondere in Hinsicht auf die Isoformen, welche in einem spezifischen Gewebe, wie dem Herz, gefunden werden. DNA-Hybridisierung und assoziierte molekularbiologische Techniken können somit angewandt werden, um zusätzliche AC-Transgene zur Verwendung im Kontext der vorliegenden Erfindung zu identifizieren.
Zur Veranschaulichung haben wir Klone in einer humanen Herz-cDNA-Bibliothek identifiziert, welche homolog zu einem murinen AC_VI-cDNA-Fragment waren, als ein Mittel zum Erhalten des humanen AC_VI-Gens. Die Identifizierung der humanen Sequenz wird somit die Verwendung des entsprechenden humanen AC-Transgens gemäß den hierin beschriebenen Verfahren erlauben. Kurz gesagt, wurde eine humane Herz-cDNA-Bibliothek (kommerziell erhältlich von Clontech, #HL3026b) mit einem SphI-Fragment von etwa 1,9 kb aus der murinen AC_VI-cDNA unter Verwendung von standardmäßigen molekularbiologischen Techniken gescreent, wie beschrieben in den oben zitierten Bezugsstellen. Sechs positive Klone wurde in dem primären Screen identifiziert und in sekundären und tertiären Screens bestätigt. Drei von diesen Klonen (bezeichnet als Klone 1, 4 und 5) wurden in einen Vektor für die Sequenzierung subkloniert. Wir verwendeten den "Bluescript"-Vektor pBS-SK (kommerziell erhältlich von Stratagene). Die erste Sequenzierungsrunde wurde unter Verwendung von T3- und T7-Primern ausgeführt, und danach wurden interne Primer für anschließende Sequenzierung verwendet. Alle drei der Klone enthielten Sequenzen, welche hoch-homolog zu AC_VI-Genen von anderen Spezies, einschließlich Maus, waren. Diese Klone und Subfragmente davon wurden verwendet, um überlappende Klone, welche die verbleibende Sequenz enthielten, zu identifizieren. Aus den überlappenden Klonen erhielten wir die Nukleotidsequenz, gezeigt in 12A, welche mehr als 2 kb der vermuteten 3,4 kb großen codierenden Sequenz von humanem AC_VI entspricht. Das -X- zeigt eine Lücke von etwa 0,5 kb innerhalb der gezeigten Sequenz an. Die 12B zeigt die Aminosäuresequenz, entsprechend der in 12A abgebildeten Nukleotidsequenz. Aus der in 12A bereitgestellten Sequenzinformation kann die vollständige Nukleotidsequenz, codierend die humane Volllängen-AC_VI und Varianten davon, ohne weiteres unter Anwendung von standardmäßiger rekombinanter DNA-Methodik erhalten werden.
Polynukleotide, umfassend nah verwandte Sequenzen, können gleichermaßen erhalten werden, unter Anwendung von Techniken, wie Hybridisierung, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Derartige Sequenzen werden beispielsweise diejenigen einschließen, welche wenigstens 95 %, noch weiter bevorzugt wenigstens 99 % Sequenzidentität mit einer Nukleotidsequenz, umfassend diejenige, gezeigt in 12A, aufweisen. Isolierte Polynukleotide, welche bei hoher Stringenz an ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz von 12A hybridisieren, können somit ohne weiteres basierend auf standardmäßigen molekularbiologischen Techniken erhalten werden. Diese Polynukleotide können auch verwendet werden, um von den Polynukleotiden codierte, isolierte Polypeptide zu erhalten. Wie in diesem Zusammenhang verwendet, ist ein "isoliertes Polypeptid" oder Protein ein Polypeptid oder Protein, welches im Wesentlichen von jedweden zellulären Kontaminanten und Komponenten getrennt worden ist, welche natürlicherweise mit dem Protein in vivo assoziiert sind. Der Ausdruck umfasst ein Polypeptid, welches aus seiner natürlich vorkommenden Umgebung entfernt worden ist, und schließt rekombinantes Polypeptid und chemisch synthetisierte Analoga oder durch heterologe Systeme biologisch synthetisierte Analoga ein. Ein "isoliertes Polynukleotid" wird ähnlich definiert. Die Varianten werden allelische Varianten einschließen. Eine "allelische Variante" im Kontext einer Nukleinsäure oder eines Gens ist eine alternative Form (Allel) eines Gens, welches in mehr als einer Form in der Population existiert. Auf dem Polypeptid-Niveau unterscheiden sich "allelische Varianten" im Allgemeinen um lediglich eine oder höchstens einige wenige Aminosäure-Substitutionen voneinander. Es kann auch synthetische oder "unnatürliche" Varianten eines Gens geben, welche durch rekombinante biologische Techniken erzeugt werden. Vorzugsweise unterscheiden sich die Aminosäurerest-Positionen, welche in der Variante nicht identisch sind, durch konservative Aminosäuresubstitutionen ab. "Konservative Aminosäuresubstitutionen" bezieht sich auf die Austauschbarkeit von Resten, welche ähnliche Seitenketten aufweisen. Zum Beispiel besteht eine Gruppe von Aminosäuren, welche aliphatische Seitenketten aufweisen in Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Hydroxyl-Seitenketten besteht in Serin und Treonin; eine Gruppe von Aminosäuren mit amidhaltigen Seitenketten ist Asparagin und Glutamin; eine Gruppe von Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten ist Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan; eine Gruppe von Aminosäuren mit basischen Seitenketten besteht in Lysin, Arginin und Histidin; und eine Gruppe von Aminosäuren mit schwefelhaltigen Seitenketten besteht in Cystein und Methionin.
Die AC_VI-Polynukleotide, welche Varianten codieren, können auch stille Nukleotidsubstitutionen umfassen. Mit "stille" Substitution wird gemeint, dass das substituierte Nukleotid nicht zu einem Aminosäureaustausch auf dem Proteinniveau führt. Noch substanziellere Nukleotidaustausche können in Regionen eingebracht werden, welche die enzymatische Aktivität des codierten Adenylcyclase-Polypeptids nicht beeinflussen. Viele derartige Polynukleotide werden Polypeptide codieren, welche Adenylcyclase-enzymatische Aktivität beibehalten, was durch Routineverfahren, wie im Fachgebiet bekannt, getestet werden kann. "Hochstringenz"-Bedingungen für Polynukleotidhybridisierungen werden beschrieben z. B. in J. Sambrook et al., siehe oben, und beziehen sich typischerweise auf Bedingungen, in welchen die Salzkonzentration und die Temperatur so erhöht werden, dass nur Sequenzen mit einer substanziellen insgesamten Sequenzidentität (typischerweise über 90 %, weiter bevorzugt über 95 %) über Abschnitte von mehr als etwa 100 Nukleotiden hybridisiert bleiben.
Wie es vom Fachmann auf dem Gebiet richtig eingeschätzt werden wird, können kleine Fragmente der humanen AC_VI-Polynukleotidsequenz (einschließlich Fragmenten in der Größenordnung von etwa 15-50 Nukleotiden) als Primer oder Sonden verwendet werden, um Isoformen oder Varianten der nativen Polypeptide zu identifizieren und zu isolieren.
Isolierte Polypeptide, codiert von den Polynukleotiden der vorangehenden Ausführungsformen, schließen beispielsweise Polypeptide ein, umfassend eine Sequenz, in welcher mindestens etwa 300 Aminosäurereste zu wenigstens 95 % (vorzugsweise mehr als 99 %) identisch mit einer Sequenz von vergleichbarer Länge innerhalb von 12B sind.
BEISPIEL 6: Konstruktion eines Vektors für die Genzuführung eines β-adrenergen Rezeptorproteins (β₁-AR) als einem zweiten Typ von β-ASP
Wie oben beschrieben, schließen zusätzliche β-adrenerge Signalleitungsproteine zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung β-adrenerge Rezeptorproteine, insbesondere β₁-adrenerge Rezeptoren (β₁-AR), und GRK-Inhibitoren (welche indirekt β-AR-Aktivität erhöhen können, wie oben beschrieben) ein.
Genzuführungsvektoren, umfassend Transgene, welche derartige zusätzliche β-ASPs codieren, können ohne weiteres unter Anwendung von Techniken erzeugt werden, wie denjenigen, welche im vorangehenden Beispiel beschrieben sind.
Zur Veranschaulichung haben wir einen rekombinanten, replikationsdefekten Adenovirusvektor konstruiert, welcher einen humanen β-adrenergen Rezeptor exprimiert. Als einen beispielhaften β-AR verwendeten wir eine Volllängen-cDNA, die humanen β₁-AR (etwa 1,8 kb) codiert, wie beschrieben und sequenziert in Frielle et al., PNAS (USA) 84: 7920-7942, 1987).
Kurz gesagt, wurde das β₁-AR-cDNA-Fragment (welches in die EcoRI-Stelle von pSP65 kloniert worden war) in einen E1-deletierten rekombinanten humanen Adenovirus-5-Vektor unter Anwendung der im vorangehenden Beispiel beschriebenen Techniken inseriert, wodurch ein rekombinanter Vektor für die Zuführung eines Gens erzeugt wurde, codierend ein zweites bevorzugtes β-ASP (d. h. ein β-adrenerges Rezeptorprotein).
BEISPIEL 7: Veranschaulichende Konstruktion eines Vektors für Genzuführung eines GRK-Inhibitors als einem dritten Typ von β-ASP
Noch ein anderes veranschaulichendes Beispiel eines zusätzlichen β-adrenergen Signallei tungsproteins zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist ein G-Protein-Rezeptorkinase-Inhibitor (GRK-Inhibitor), welcher verwendet werden kann, um β-AR-Aktivität und deshalb β-adrenerge Antwortfähigkeit indirekt zu steigern. Genzuführungsvektoren, umfassend Transgene, codierend ein derartiges β-ASP, können ohne weiteres unter Anwendung von Techniken erzeugt werden, wie denjenigen, welche in vorangehenden Beispielen beschrieben sind.
Da die funktionellen Kinasedomänen von verschiedenen GRK-Proteinen identifiziert worden sind (und entsprechende Domänen in verwandten GRK-Proteinen durch Homologie identifiziert werden können), und die Mutation die Kinasefunktionalität nur beeinträchtigen muss (was unter Anwendung von Standardtechniken nachprüfbar ist), kann ohne weiteres eine Vielzahl von GRK-Inhibitoren hergestellt werden. Zur Veranschaulichung kann ein GRK-Inhibitor konstruiert werden, wie beschrieben für das "β-ARK1-Minigen" (Koch et al., Science 268: 1350-1353, 1995), oder ein analoges Konstrukt kann verwendet werden (in welchem eine GRK mutiert ist, um die Kinasefunktion effektiv zu deletieren oder zu beeinträchtigen, ohne die Rezeptor-Bindungsaktivität zu zerstören).
Kurz gesagt, kann das DNA-Fragment, codierend den GRK-Inhibitor, in einen E1-deletierten rekombinanten humanen Adenovirus-5-Vektor inseriert werden unter Anwendung der in den vorangehenden Beispielen beschriebenen Techniken oder unter Anwendung eines anderen Vektors, wie im Fachgebiet bekannt.
BEISPIEL 8: Rasches Screening von Vektorkonstrukten hinsichtlich β-ASP-Gentransfer und Expression unter Verwendung von ventrikulären Myocyten aus neugeborener Ratte in Zellkultur
β-ASP-Gentransfervektoren können anfänglich getestet werden durch Untersuchen der Fähigkeit der Vektoren, β-adrenerge Signalleitungsproteine an ventrikuläre Zellen zuzuführen, welche in Zellkultur gehalten werden. Derartige Zellkulturuntersuchungen können somit im Screening von vermeintlichen Gentransfervektoren (aufweisend z. B. besondere Kombinationen von β-ASP-Transgenen und Promotoren) hinsichtlich der Fähigkeit verwendet werden, exprimierbare Transgene zu Zellen von besonderen Typen zuzuführen, wie es hierin beispielhaft angegeben wird.
Die erste Runde eines derartigen Screenings kann zweckmäßigerweise bewerkstelligt werden unter Anwendung eines standardmäßigen detektierbaren Markergens (wie lacZ), so dass Genzuführung und Genexpression ohne weiteres und rasch quantifiziert werden können, wie es nachstehend veranschaulicht wird.
Vektoren, welche das Erstrunden-"Test"-Transgen (z. B. ein detektierbares Markergen) effektiv zuführen und dessen Expression verursachen, können dann einer zweiten Screeningrunde unter Anwendung eines β-ASP gemäß der vorliegenden Erfindung unterzogen werden.
Zur Veranschaulichung von solchen Vektor-Screening-Techniken wurden ventrikuläre Myocyten von neugeborenen Ratten mit einem Collagenase enthaltenden Perfundat gemäß Standardverfahren hergestellt. Stäbchen-förmige Zellen wurden auf mit Laminin beschichteten Platten kultiviert und wurden nach 48 Stunden mit einem Vektor, umfassend ein detektierbares Markergen (nämlich einem Adenovirus-Vektor, umfassend ein lacZ-Gen, wie beschrieben in den oben stehenden Beispielen) bei einer "Multiplizität der Infektion" von 1:1 (plaquebildende Einheiten:Zellen) infiziert. Nach einer weiteren 36-Stunden-Periode wurden die Zellen mit Glutaraldehyd fixiert und mit X-gal inkubiert.
Eine Untersuchung der Färbung enthüllte, dass im Wesentlichen alle exponierten Herzmuskelzellen das Produkt des lacZ-Transgens (d. h. β-Galactosidase) nach Infektion mit dem rekombinanten Adenovirus-Vektor in Zellkultur exprimierten.
Beispiel 8-1: Zuführung eines β-ASP-Transgens in Herz-Myocyten, abgeleitet aus Säuger-Ventrikeln
Es wurden dann Experimente durchgeführt, um die Fähigkeit der Gentransfervektoren zu untersuchen, ein β-adrenerges Signalleitungsprotein in die ventrikulären Myocyten zuzuführen und zu exprimieren. Achtundvierzig Stunden nach der Kultur wurden Myocyten mit rekombinanten Vektoren infiziert, wie in Beispiel 5, umfassend entweder ein β-ASP-Gen (AC_VI) oder ein detektierbares Markergen (lacZ).
Vierundzwanzig Stunden nach dem Gentransfer wurden Zellen mit und ohne Isoproterenol (10 μM) in Gegenwart von ³H-Forskolin inkubiert, um das Ausmaß von Forskolin-Bindung als ein Maß des AC-Protein-Gehalts zu überprüfen. In zusätzlichen Studien wurde der AC_VI-mRNA-Gehalt in Northern-Blots überprüft.
Wie gezeigt in 4, wiesen Zellen, exponiert an Vektoren, welche das β-ASP-Transgen AC_VI trugen, eine 2 fache Erhöhung hinsichtlich AC-Protein-Gehalt und-mRNA auf, was den erfolgreichen Gentransfer und die Expression von AC_VI in Herzmuskelzellen in vitro unter Verwendung viraler Vektoren bestätigt.
Zusätzliche Experimente wurden an kultivierten ventrikulären Myocyten aus neugeborenen Ratten durchgeführt, um cAMP-Produktion in Myocyten zu untersuchen, im Anschluss an die Zuführung des β-ASP-Transgens AC_VI. Achtundvierzig Stunden nach der Kultur durchliefen die Myocyten eine Infektion mit rekombinantem Adenovirus, welches entweder AC_VI oder lacZ exprimierte. Vierundzwanzig Stunden nach dem Gentransfer wurden die Zellen mit Isoproterenol (10 μM) oder Forskolin (3 μM) inkubiert und der cAMP-Gehalt wurde gemessen.
Wie gezeigt in 5, zeigten Zellen, exponiert an Vektoren, welche das β-ASP-Transgen AC_VI trugen, eine 2 fache Erhöhung hinsichtlich des Isoproterenol-stimulierten cAMP-Gehalts, und eine 3 fache Erhöhung hinsichtlich des Forskolin-stimulierten cAMP-Gehalts.
Diese Schnell-Screening-Techniken sind ebenfalls anwendbar auf das Testen anderer Vektoren, wie hierin beschrieben, einschließlich anderer Vektoren (z. B. anderer viraler Vektoren, wie AAV, sowie nicht-viraler Vektoren, einschließlich lipid-basierender Vektoren und verschiedener nicht-viraler Zuführungsplattformen), Vektoren, in welchen Transgene an verschiedene transkriptionelle Steuerungssequenzen verknüpft sind (wie ventrikel-spezifische Promotoren), sowie Vektoren, codierend andere β-ASP-Transgene, wie hierin beschrieben und veranschaulicht.
Beispiel 8-2: Zuführung eines verkürzten AC-Transgens an aus Säugtier-Ventrikeln abgeleitete Herzmuskelzellen
Als eine zusätzliche Veranschaulichung führten wir ein verkürztes AC-Transgen (konstruiert wie beschrieben in Beispiel 5-2) an Herzmuskelzellen zu, welche aus den Ventrikeln eines Säugerherzes abgeleitet worden waren, und überprüften die Expression des Transgens und des codierten Proteins in den behandelten Herzzellen.
Wir analysierten des Weiteren die physiologischen Auswirkungen der Transgenzuführung in die ventrikulären Myocyten (wie gemessen durch Änderungen in der Forskolin-Bindung und cAMP-Produktion) und untersuchten die β-adrenerge Rezeptor-Bindung in den Zellen (unter Verwendung von Radioliganden-Bindungs-Assays).
Herzmuskelzellen-Präparation und Gentransfer. Herzen aus 1 bis 2 Tage alten Sprague-Dawley-Ratten wurden entfernt, die Atrien bzw. Vorhöfe und großen Gefäße wurden verworfen und die Ventrikel wurden dreigeteilt. Der Herzmuskel wurde mit Collagenase II (Worthington) und Pancreatin (GibcoBRL Life Technology, Gaithersburg, MD) verdaut, und die Herzmuskelzellen-Suspension wurde durch Percoll-Stufen-Gradienten zentrifugiert, um Herzmuskelzellen von anderen Zellen zu trennen. Die Zellen wurden dann ausplattiert (4 × 104 Zellen/cm²) in Platten, welche im Voraus mit Gelatine beschichtet worden waren, und 24 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden dann mit serumfreien Medien gewaschen und in 2 % fötalem Rinderserum während 24 Stunden gehalten (wie beschrieben in Knowlton, K.U., et al., J. Biol. Chem. 266: 7759-7768, 1991). Adenovirus-vermittelter Gentransfer wurde 3 Tage nach der anfänglichen Isolation durch Zugeben von rekombinantem Adenovirus durchgeführt, welches AC_VI oder lacZ exprimiert (10 pfu/Zelle), und Inkubieren während 20 Stunden in DMEM, enthaltend 2 % fötales Rinderserum. Adenovirus wurde entfernt, und die Zellen wurden 24 Stunden lang gehalten und dann für eine Untersuchung verwendet. Das Ausmaß des Gentransfers wurde ausgewertet durch X-gal-Färbung von Zellen nach dem Gentransfer mit lacZ. Vorbereitende Untersuchungen belegten, dass bei Virustitern von 1, 10 und 100 pfu pro Zelle, 95-100 % der Herzmuskelzellen lacZ ohne Anzeichen einer Zytotoxizität exprimierten. Wir wählten 10 pfu/Zelle für unsere Untersuchungen. Der Proteingehalt pro Platte nach dem Gentransfer mit lacZ und AC_VI war ähnlich.
RT-PCR. RT-PCR wurde verwendet, um AC_VI-mRNA zu identifizieren. Die reverse Transkriptions-Reaktion wurde durchgeführt (SuperScript II, GibcoBRL Life Technology). Kurz gesagt, wurde 1 μg mRNA mit 100 ng des Primers AC_VI3'pHA in 11 µl gemischt, erhitzt (70 °C, 10 m) und rasch auf Eis abgekühlt. Vier Mikroliter 5 × Erst-Stamm-Puffer, 2 µl 0,1 M DTT und 1 µl 10 mqM dNTP wurden zugesetzt, und es wurde zugelassen, dass sich die Reaktionsmischung äquilibriert (37 °C, 2 m). Schließlich wurde 1 µl (200 Units) SuperScript II Rnase H-Reverse-Transkriptase zugegeben; die Reaktionsdauer belief sich auf 1 Stunde (37 °C).
Northern-Blot-Analyse. Gesamt-RNA wurde aus Herzmuskelzellen 48 Stunden nach dem Gentransfer unter Anwendung des Trizon-Reagenz (GIBCOBRL Life Technology) isoliert. Zwanzig Mikrogramm denaturierte Gesamt-RNA wurden in 1 × MOPS/EDTA-Puffer auf einem 1,0 %igen Agarosegel elektrophoretisch behandelt. Die RNA wurde auf eine Nylonmembran in 20 × SCC-Lösung überführt. RNA wurde immobilisiert (80 °C, 2 h); und die Membran wurde mit statistisch markierter ³²P-dCTP-Maus-AC_VI-cDNA-Sonde oder Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GADPH) hybridisiert. Die Hybridisierung wurde in Hood-Puffer (50 % Formamid, 5 × SSC, 20 mM NaHPO4, pH 6,7, 7 % SDS, 1 % PEG 15000-20000 und 0,5 % fettfreie Milch) bei 42 °C während 16 Stunden ausgeführt. Die Membran wurde einmal mit 2 × SSC-0,5 % SDS 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und 2-3 Mal bei 0,1 × SSC-0,1 % SDS während jeweils 30 Minuten (60-65 °C) gewaschen, und an Röntgenfilm exponiert.
Die resultierenden Northern-Blots zeigten eine Bande, kompatibel mit AC_VI-mRNA, in RNA, welche isoliert wurde aus Herzmuskelzellen, welche einen AC_VI-Gentransfer erhalten hatten (6). Die endogene Ratten-AC_VI-mRNA von geringer Häufigkeit war nach längerer Exposition in Zellen nachweisbar, welche einen lacZ-Gentransfer erhalten hatten. Gleiche RNA-Beladung wurde durch GADPH-Kontrollen dokumentiert. Diese Daten dokumentieren eine robuste Expression der Transgen-AC_VI-mRNA nach dem Gentransfer.
Western-Blot-Analyse. Zelllysate wurden aus Virus-infizierten Myozyten unter Verwendung von NP-40-Lysispuffer (20 mM Hepes pH 7,0, 120 mM HCl, 1 mM DTT, 5 mM Magnesiumacetat, 10 % Glycerol, 0,5 % NP-40 und Proteinase-Inhibitoren: jeweils 10 μg/ml Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin, und 1 mg/ml Pefabloc) während 10 Minuten auf Eis hergestellt. Die Proben wurden in einer Mikrozentrifuge bei voller Geschwindigkeit 15 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 × SDS-Puffer resuspendiert. Die Proben wurden gekocht (5 Minuten) und Zelllysate wurden auf ein 7,5 %iges SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) geladen. Protein wurde elektrophoretisch (1 h, 100 V, 4 °C) auf Nitrozellulosemembranen in Tris-Glycin-Puffer (25 mM Tris-HC1, pH 8,3, 150 mM Glycin und 10 % Methanol) überführt. Die Membranen wurden mit Blocking-Puffer behandelt, bestehend aus 5 % fettfreier Trockenmilch in Tris-Kochsalzlösung-Puffer (0,9 % NaCl und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5). Für den Nachweis von AC_VI-Protein wurden Membranen inkubiert mit Anti-ACV/VI-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), verdünnt 1:100 in Blocking-Puffer, während 1 Stunde (RT). Für den Nachweis von Gsα und Giα₂ wurden Membranen mit Anti-Gsα- oder Anti-Giα₂-Antikörper inkubiert, wie früher beschrieben (wie in Ping et al., J. Clin. Invest. 95: 1271-1280, 1995). Primäre Antikörper wurden nachgewiesen mit Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Meerrettichperoxidase-Konjugat (GIBCOBRL Life Technology) in Blocking-Puffer. Das Antigen wurde dann visualisiert mit chemolumineszenten Substraten A und B (Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) und an Röntgenfilm exponiert.
Die resultierenden Western-Blots enthüllten, dass endogenes Ratten-AC_VI-Protein nicht in Zellen nach Gentransfer nach lacZ detektiert werden konnte. Allerdings war, in Herzmuskelzellen, welche AC_VI-Gentransfer erhalten hatten, Transgen-AC_VI-Protein leicht nachweisbar als eine Bande von passender elektrophoretischer Mobilität (7). Diese Daten dokumentieren eine robuste Transgen-AC_VI-Protein-Expression nach dem Gentransfer.
Forskolin-Bindung. [³H]-Forskolin-Bindungs-Assays wurden durchgeführt unter Verwendung einer Modifikation von veröffentlichten Verfahren (Post, S. R., Biochemical Journal 311: 75-80, 1995). Kurz gesagt, wurden Myocyten entweder mit Adenovirus, exprimierend AC_VI oder lacZ infiziert, und 48 Stunden lang in 12-Vertiefungs-Kulturplatten kultiviert. Vor dem Assay wurde das Kulturmedium abgesaugt, und die Zellen wurden in Revers-Puffer (100 mM KCl, 20 mM NaCl, 1 mM NaH₂PO₄, 20 mM HEPES und 1 mM MgSO₄, pH 7,4) gewaschen. Bindungs-Assays wurden initiiert durch die Zugabe von Saponin (20 μg/ml, letzt endlich), 20 nM [³H]-Forskolin, 1 μM 1,9-Didesoxy-Forskolin (zum Verringern der Assoziation von radioaktiver Markierung mit Nicht-Adenylylcyclase-Molekülen) und den Zusätzen, welche in den Figuren-Legenden angegeben sind. Die Zellen wurden in einem Endvolumen von 0,5 ml während 15 Minuten bei 25 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Absaugen von Medien beendigt, und die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem Waschpuffer (50 mM Tris, 10 mM MgCl₂, pH 7,4) gewaschen. Die Menge an [³H]-Forskolin, assoziiert mit den Zellen, wurde bestimmt durch Extraktion von Zellen in 0,2 % Triton X-100 und Szintillations-Zählung des löslichen Zellextrakts.
Messungen von zyklischem AMP. Vor der Behandlung von Zellen wurde das Wachstumsmedium entfernt, und Zellen wurden 30 Minuten lang (Raumtemperatur) in Serum- und Natriumbicarbonat-freiem DMEM äquilibriert, welches mit 20 mM HEPES, pH 7,2, versetzt worden war. Anschließend wurden die Zellen 10 Minuten lang (Raumtemperatur) in frischem DMEM, enthaltend entweder 10 μM Isoproterenol oder 10 μM Forskolin, in Gegenwart von 0,1 mM Ascorbinsäure (zur Verhinderung von Oxidation) und 250 μM IBMX, einem Phosphodiesterase-Inhibitor, inkubiert. Die Reaktion wurde beendigt durch Absaugung des Mediums und Zugeben von 7,5 %iger eiskalter Trichloressigsäure (TCA). TCA-Extrakte wurden eingefroren (–20 °C), bis sie geassayt wurden. Intrazelluläre cAMP-Spiegel wurden durch Radioimmunoassay (Calbiochem, San Diego, CA) von TCA-Extrakten im Anschluss an Acetylierung gemäß des Protokolls, bereitgestellt vom Hersteller, bestimmt. Die Empfindlichkeit dieses Assays gestattete eine große Verdünnung von TCA-Extrakten, so dass die Ether-Extraktion von TCA unnötig war. Die Produktion von cAMP wurde an die Menge von säureunlöslichen Protein normiert, die durch den BioRad-Protein-Assay geassayt wurde.
Statistische Analyse. Für die Forskolin-Bindungs- und cAMP-Produktions-Untersuchungen sind Daten als Mittelwerte ± 1 Standardabweichung bzw. SD berichtet. Daten wurden verglichen unter Anwendung des t-Tests nach Student, und, wo angemessen, von Varianzanalysen. Die Null-Hypothese wurde abgelehnt, wenn p < 0,05.
Ergebnisse von Untersuchungen hinsichtlich Forskolin-Bindung und cAMP-Produktion. Forskolin-Bindungsuntersuchungen lieferten einen Weg, um die Menge an AC auszuwerten, welche für eine Aktivierung während hormonell stimulierter Signalleitung verfügbar war. Herzmuskelzellen, welche einen Gentransfer am gleichen Tag erhalten hatten, unter Verwendung des gleichen Klons, durchliefen parallele Untersuchungen, ausgelegt, um Forskolin-Bindung sowie hormonell stimulierte cAMP-Produktion zu messen. Die Leitlinie für diese Untersuchungen bestand darin, eine akkurate Überprüfung der Beziehung zwischen der Transgen-Proteinexpression und der cAMP-Produktion zu erhalten. Die GTPγS-stimulierte Netto-Forskolin-Bindung war erhöht nach AC_VI-Gentransfer (lacZ: 81 ± 24 cpm; AC_VI: 447 ± 113 cpm; p < 0,0001). Dies sind Mittelwerte aus drei Experimenten, welche dokumentieren, dass das Transgen AC_VI vorhanden und antwortfähig gegenüber Gs:AC-Wechselwirkung ist (8A).
Wir haben dann die Antwortfähigkeit von Herzmuskelzellen, welche AC_VI überexprimieren, gegenüber hormoneller Stimulation gemessen (8B). AC_VI-Gentransfer war assoziiert mit einer erhöhten cAMP-Produktion, falls stimuliert durch Isoproterenol (lacZ: 26 ± 3 pMol/μg; AC_VI: 136 ± 7 pMol/μg; p < 0,0001) und durch Forskolin (lacZ: 9 ± 2 pMol/μg; AC_VI: 66 ± 8 pMol/μg; p < 0,0001). Dies sind Mittelwerte aus drei Experimenten, welche dokumentieren, dass Herzmuskelzellen, die Transgen-AC_VI exprimieren, eine erhöhte adrenerge Antwortfähigkeit nicht nur gegenüber Forskolin-Stimulation aufweisen, was erhöhte Mengen an AC widerspiegelt, sondern auch gegenüber Isoproterenol, was anzeigt, dass neu synthetisierte AC funktionell gekoppelt und rekrutierbar ist durch βAR-Stimulation.
Die 8C zeigt drei Messungen von veränderter adrenerger Signalleitung (Forskolin-Bindung und Isoproterenol- und Forskolin-stimulierte cAMP-Produktion). Diese Daten zeigen, dass eine proportionale Erhöhung hinsichtlich AC-Gehalt und eine verstärkte adrenerge Signalleitung stattgefunden haben.
Die 9 zeigt cAMP-Produktion, wenn Herzmuskelzellen mit einer Auswahl von Isoproterenol-Konzentrationen stimuliert wurden. Nach dem Gentransfer mit AC_VI (gegenüber lacZ) bestand eine offensichtliche Erhöhung hinsichtlich cAMP, hergestellt durch einen großen Bereich von Isoproterenol-Konzentrationen. Der EC50 für Isoproterenol-stimulierte cAMP-Produktion war unverändert (lacZ: 16 ± 13 nM; AC_VI 32 ± 19 nM).
Um zu bestimmen, ob lacZ einen nachteiligen Effekt auf die cAMP-Produktion aufweist, untersuchten wir auch nicht-transfizierte Herzmuskelzellen. Diese Untersuchungen zeigten, dass untransfizierte Zellen von lacZ-infizierten Zellen hinsichtlich der cAMP-Produktion nicht unterscheidbar waren.
β-adrenerge Rezeptor-Bindungsstudien. βARs wurden in Radioliganden-Bindungsexperimenten identifiziert unter Verwendung von [¹²⁵I]-Iodcyanopindolol (ICYP; 30-240 pM); 10^–4 M Isoproterenol wurde verwendet, um nicht-spezifische Bindung zu definieren. Transfizierte Zellen (lacZ gegenüber AC_VI) wurden lysiert, und Membranen wurden für die Radioliganden-Bindung präpariert (wie in Ping et al., J. Clin. Invest. 95: 1271-1280, 1995); Experimente wurden mit Proben in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Daten sind berichtet als spezifisch gebundenes ICYP (fMol/mg).
Um zu bestimmen, ob ein erhöhter AC-Gehalt die βAR-Anzahl beeinflusste, führten wir Radioliganden-Bindungsassays durch. Diese Assays identifizierten ähnliche Mengen an spezifisch gebundenem ICYP pro mg Membranprotein in Platten von Herzmuskelzellen, infiziert mit Adenovirus, exprimierend lacZ (Bmax: 26 fMol/mg; Kd: 43 pM) oder AC_VI (Bmax: 29 fMol/mg; Kd: 78 pM). Diese Daten zeigen an, dass die βAR-Anzahl durch den Gentransfer von AC_VI unverändert war.
Gsα- und Giα₂-Gehalt. Um zu bestimmen, ob ein erhöhter AC-Gehalt den G-Protein-Gehalt beeinflusste, führten wir Immunoblotting-Untersuchungen mit Antikörpern durch, welche gegen Gsα und Giα₂ gerichtet waren. Diese Assays identifizierten ähnliche Mengen von Gsα und Giα₂. Diese Daten zeigen an, dass der Gehalt von Gsα und Giα₂ nicht durch den Gentransfer von AC_VI verändert wurde.
Zusammenfassung der Untersuchungen unter Beteiligung von AC-Transgenen
Die oben beschriebenen Experimente demonstrieren, dass AC-Transgene (einschließlich variante Transgene, in welchen untranslatierte Regionen verändert worden sind) ohne weiteres konstruiert und verwendet werden können, um AC-Genprodukte an Herzzellen zuzuführen, und bestätigen ferner, dass derartige Transgene verwendet werden können, um die funktionelle Antwortfähigkeit der Zellen zu verändern.
Eine Deletion der 3'-untranslatierten Region in dem veranschaulichenden AC-Konstrukt führte zu einem wesentlich kleineren Transgen, von welchem gefunden wurde, sogar noch effektiver bei der Vermittlung von Transgen-Expression und funktioneller Antwort im Anschluss an Zuführung an die ventrikulären Myocyten zu sein. Verkürzte Konstrukte, in welche untranslatierte Regionen aus dem Transgen entfernt sind (z. B. AC-Transgene, aus welchen die 3'-untranslatierten Regionen entfernt sind), können somit alternative, hoch-funktionelle Konstrukte zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bereitstellen. Im Vergleich zu dem "Parental-Typ"-Konstrukt, in welchem die native 3'-untranslatierte Region beibehalten wurde, führte das veränderte AC-Transgen zu einer ungefähr 4 fachen Erhöhung in der Forskolinstimulierten cAMP-Produktion, und einer ungefähr 9 fachen Erhöhung hinsichtlich der Isoproterenol-stimulierten cAMP-Produktion. Die Fähigkeit, Gene anzuwenden, welche unterschiedliche Expressionsspiegel aufweisen, liefert somit ein zusätzliches Werkzeug, welches verwendet werden kann, um die vorliegende Erfindung im Kontext von variierenden therapeutischen Anforderungen zu optimieren (abhängig von dem gewünschten Spiegel der Expression in den Zellen und dem Gewebe, welche(s) behandelt werden soll(en)). Alternativ dazu kann man durch Anwenden derartiger Hochexpressions-Konstrukte die vorliegende Erfindung ausüben unter Verwendung von entsprechend weniger Vektor, um eine äquivalente Wirkung zu erzielen. Tatsächlich, trotz unveränderter Zahlen von Zelloberflächenrezeptoren in diesen Experimenten, waren wir in der Lage, cAMP-Produktion durch βAR-Stimulation um das ungefähr 2- bis 100-fache unter Verwendung von AC-Transgenen, wie oben beschrieben und veranschaulicht, zu verstärken.
Ohne, dass gewünscht wird, durch Theorie gebunden zu sein, können die beobachteten Erhöhungen hinsichtlich der effektiven Expressionsspiegel unter Verwendung des veränderten Transgens auf einer Erhöhung in der Vektorverpackungseffizienz und/oder einer Erhöhung in der Botschafter- bzw. Message-Stabilität beruhen. In diesen Hinsichten kann die wesentlich reduzierte Größe des Transgenkonstrukts es diesem erlauben, wirksamer in den viralen Vektor verpackt zu werden, welcher in diesen Experimenten verwendet wird. Unsere Ergebnisse legen ebenfalls nahe, dass die resultierende mRNA häufiger war in transfizierten Zellen (ungefähr 25 fach höher im Vergleich zu dem Parental-Typ-Konstrukt), was das Ergebnis einer Erhöhung der Message-Stabilität sein kann. In Hinsicht auf das Letztgenannte haben wir ein potenzielles mRNA-destabilisierendes Element (UUAUUUA(UA)(UA)) in der 3'-untranslatierten Region des originalen ACVI-Konstrukts identifiziert. Die Entfernung derartiger Message-destabilisierender Elemente kann somit die effektive Expression von anderen β-ASP-Transgenen, welche derartige Elemente aufweisen, steigern.
Darüber hinaus legen unsere Beobachtungen, dass Zellen, welche AC_VI überexprimieren, eine verstärkte Antwortfähigkeit gegenüber βAR-vermittelter Stimulation (gegenüber Forskolin allein) zeigten, nahe, dass neu synthetisierte AC funktionell gekoppelt ist mit und rekrutierbar ist durch Stimulation durch Agonisten, welche normalerweise in vivo vorhanden sind.
BEISPIEL 9: Demonstration von in vivo-Gentransfer in den Herzmuskel in einem Schweinemodell für Herzversagen
Um den in vivo-Gentransfer in einem Großtiermodell zu untersuchen, welches vorhersagefähig für CHF in Menschen sein würde, demonstrierten wir anfänglich die Zuführung und Expression eines detektierbaren Marker-Transgens in Schweineherz-Herzmuskel unter Verwendung des β-Galactosidase codierenden Vektors, erzeugt, wie beschrieben in den obenstehenden Beispielen.
Kurz gesagt, wurde ein adenoviraler Vektor in permissiven humanen 293-Zellen vermehrt und mittels CsCl-Gradienten-Ultrazentrifugation gereinigt (mit einem letztendlichen viralen Titer von 1,5 × 10¹⁰ viralen Partikeln), basierend auf den Vorgehensweisen von Beispiel 5.
Ein betäubtes, beatmetes 40 kg schweres Schwein wurde einer Thorakotomie unterzogen.
Eine 26-Gauge-Schmetterlingsnadel wurde in die mittlere linke anteriore absteigende (LAD) Herzkranzarterie inseriert, und der Vektor (1,5 × 10¹⁰ virale Partikel) wurde in einem Volumen von 2 ml injiziert. Die Brust wurde dann geschlossen, und dem Tier wurde eine Erholung zugebilligt. Am vierten Tag nach der Injektion wurde das Tier getötet. Das Herz wurde mit Glutaraldehyd fixiert, dann geschnitten und 16,5 Stunden lang mit X-gal inkubiert. Nach Einbetten und Schneiden wurde das Gewebe mit Eosin gegengefärbt.
Mikroskopische Analysen von Gewebeschnitten (transmurale Schnitte des LAD-Bettes) enthüllten eine signifikante Größenordnung des Gentransfers in Zellen des LAD-Koronar-Bettes bei vielen Gewebeschnitten, welche mehr als 50-60 % der Zellen in positiver Färbung hinsichtlich β-Galactosidase aufzeigten. Vom LAD-Kreislaufbett bzw.-Aderbett fern liegende Areale des Herzmuskels zeigen keine X-gal-Färbung und dienten als eine Negativkontrolle, obgleich eine diffuse Expression des Gens in Myocyten und in endothelialen Zellen beobachtet wurde.
In zusätzlichen Untersuchungen unter Verwendung der intrakoronären Injektion bei geschlossener Brust, war eine substanzielle Aktivität 14 Tage nach dem Gentransfer vorhanden (n = 8).
Unter Anwendung dieser Techniken demonstrierten wir somit einen effektiven in vivo-Gentransfer und Expression in einem Großsäugerherz, ohne Anzeichen von Entzündung oder Nekrose in Arealen der Genexpression.
In Hinsicht auf unsere Demonstration der Wirksamkeit dieses Systems kann das in vivo-Vorgehen zur Überwachung der Zuführung und Expression von Transgenen im Schweinemodell für Herzversagen ebenfalls ohne weiteres angewandt werden, um andere in vivo-Genzuführungsvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung zu testen.
Wie in den nachstehenden Beispielen 10, 11 und 12 beschrieben, kann dieses in vivo-Vorgehen zur Überwachung der Zuführung und Expression von Transgenen im Schweineherzversagen-Modell auch ohne weiteres angewandt werden, um andere in vivo-Genzuführungsvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung zu testen, einschließlich zum Beispiel anderen in vivo-Zuführungsvektoren (z. B. andere virale Vektoren, wie AAV, sowie nicht-virale Vektoren, einschließlich Lipid-basierenden Vektoren und verschiedenen nicht-viralen Zuführungsplattformen), Vektoren, in welchen Transgene an verschiedene transkriptionelle Steuerungssequenzen verknüpft sind (wie ventrikelspezifische Promotoren), sowie Vektoren, welche andere β-ASP-Transgene codieren, wie hierin beschrieben und veranschaulicht.
Wie im nachstehenden Beispiel 13 beschrieben wird, haben wir auch aufgezeigt, dass eine Zuführung eines β-ASP-Transgens in den Herzmuskel gemäß der vorliegenden Erfindung, verwendet werden kann, um die Herzfunktion in diesem Großtiermodell für menschliches Herzversagen signifikant zu steigern.
BEISPIEL 10: Veranschaulichender in vivo-Gentransfer in den Schweine-Herzmuskel unter Anwendung anderer viraler Vektoren (AAV)
Andere Vektoren, einschließlich verschiedener viraler Vektoren (wie adeno-assoziiertem Virus (AAV)), Liposomen und anderen Lipid-enthaltenden Genzuführungskomplexen, und andere makromolekulare Komplexe (wie multifunktionale Genzuführungs-Fusionsproteine), welche zur Vermittlung der Zuführung eines Polypeptids an eine Säugerwirtszelle in vivo in der Lage sind, können verwendet werden, um AC-Transgene in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung an den Herzmuskel zuzuführen. So kann zum Beispiel AAV verwendet werden, um ein oder mehrere AC-Transgene in vivo an den Herzmuskel zuzuführen. Die allgemeinen Grundlagen der Präparation und Anwendung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren sind im Fachgebiet beschrieben worden (siehe z. B. Carter, B., Curr. Opin. Biotechnol., 3: 533-539, 1992; Kotin, R., Human Gene Therapy, 5: 793-801, 1994; und Flotte, T. R., et al., Gene Therapy 2: 357-362, 1995; und die anderen oben zitierten Bezugsstellen).
Zur Veranschaulichung wird ein oder mehrere AC-Transgene (vorzugsweise umfassend weniger als etwa 5 kb), wie hierin beschrieben, in einen rekombinanten AAV-Vektor kloniert, aus dem einige (vorzugsweise alle) der codierenden AAV-Sequenzen (d. h. AAV-rep- und cap-Gene) deletiert worden sind, welcher jedoch wenigstens die "inverted terminal repeats" (ITRs) von AAV beibehält. Durch Platzieren des AC-Transgens zwischen den "inverted terminal repeats" bzw. invertierten endständigen Wiederholungseinheiten und Einführen des Vektors in eine permissive Verpackungszelllinie, die fähig ist zur Bereitstellung oder modifiziert ist zum Bereitstellen der fehlenden AAV-Verpackungsfunktionen (d. h. Rep- und Cap-Proteine) in trans. Die Verpackungszelllinie kann dann verwendet werden, um den rekombinanten AAV-Vektor zu replizieren und einzukapseln in infektionsfähige (aber replikationsdefekte) AAV-Partikel, sobald die notwendigen AAV-Helfervirus-Funktionen bereitgestellt werden, wie im Fachgebiet beschrieben. Alternativ dazu kann der rekombinante AAV-Vektor eingeführt werden vor oder gleichzeitig mit der Einbringung des Helfervirus oder der Helfervirusfunktionen. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, kann eine Vielzahl von Helferviren (oder daraus abgeleitete genetische Funktionen) verwendet werden, um Helferaktivität für AAV bereitzustellen, einschließlich Adenoviren, Herpesviren und Pockenviren, wie Vaccinia. Das am häufigsten verwendete Helfervirus ist Adenovirus. Die deletierten AAV-Verpackungsfunktionen können stabil in das Genom der Verpackungszelle eingebracht werden oder sie können vorübergehend bereitgestellt werden (z. B. durch Transfektion mit einem Helferplasmid oder durch Ein schluss innerhalb des Helfervirus, wie Adenovirus). Rekombinante AAV-Partikel werden dann gereinigt, wie im Fachgebiet beschrieben (z. B. unter Verwendung von isopyknischer Ultrazentrifugation).
Wie in den Beispielen 5-7 oben beschrieben, werden verschiedene β-ASP-Transgene für Klonierung in rekombinante Vektoren, in diesem Fall AAV, erzeugt. Mit Erst-Generations-AAV-Vektoren sollte(n) das Transgen oder die Transgene weniger als etwa 5 kb umfassen, um effizient verpackt zu werden. Natürlich können unterschiedliche β-ASP-Transgene in separate Vektoren eingebracht werden.
Verfahren, wie diejenigen, veranschaulicht in Beispiel 8, können angewandt werden, um Vektorkonstrukte auszuwählen, welche die effiziente Zuführung von β-adrenergen Signalleitungsproteinen an ventrikuläre Zellen, welche in Zellkultur gehalten werden, vermitteln; und, wie veranschaulicht in Beispiel 9, kann ein detektierbares Markergen (wie lacZ verwendet werden, um Vektorkonstrukte auszuwählen, welche die effiziente Zuführung von Transgenen an den Herzmuskel in vivo vermitteln. Geeignete β-ASP-Vektorkonstrukte können dann verwendet werden (wie beschrieben in den nachstehenden Beispielen 12-13), um β-ASP-Transgene an den Herzmuskel in vivo zuzuführen.
BEISPIEL 11: Veranschaulichender in vivo-Gentransfer in Schweine-Herzmuskel unter Verwendung nicht-viraler Vektoren
Die hierin beschriebenen Beispiele unter Verwendung viraler Vektoren als veranschaulichenden Genzuführungsvehikeln können auch ohne weiteres auf die Verwendung von nicht-viralen Vektoren angewandt werden, wie Liposomen und anderen lipid-haltigen Genzuführungskomplexen sowie anderen makromolekularen Komplexen (wie multifunktionellen Genzuführungs-Fusionsproteinen), welche zur Vermittlung einer Zuführung eines Polynukleotids an eine Säugerwirtszelle in vivo in der Lage sind.
Zur Veranschaulichung können Liposomen und andere lipidhaltige Genzuführungskomplexe verwendet werden, um ein oder mehrere β-ASP-Transgene zuzuführen. Die Prinzipien der Präparation und Verwendung derartiger Komplexe für die Genzuführung sind im Fachgebiet beschrieben worden (siehe z. B. Ledley, F. D., Human Gene Therapy 6: 1129-1144, 1995; Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Chonn, A., et al., Curr. Opin. in Biotech. 6: 698-708, 1995; Schofield, J. P., et al., British Med. Bull. 51: 56-71, 1995; Brigham, K. L., et al., J. Liposome Res. 3: 31-49, 1993; und die anderen oben zitierten Bezugsstellen).
Kurz gesagt, wird ein oder mehrere β-ASP-Transgene, wie hierin beschrieben, in ein Liposom oder einen anderen lipidhaltigen Genzuführungskomplex unter Anwendung vom im Fachgebiet bekannten Techniken eingebracht. Verschiedene β-ASP-Transgene können erzeugt werden, wie beschrieben in den Beispielen 5-7, und dann in Liposomen oder andere lipidbasierende Vektoren eingebracht werden. Verfahren, wie jene, welche in Beispiel 8 veranschaulicht werden, können angewandt werden, um Vektoren zu selektieren, die eine effiziente Zuführung von β-adrenergen Signalleitungsproteinen an in Zellkultur gehaltene ventrikuläre Zellen vermitteln; und man kann, wie veranschaulicht in Beispiel 9, ein detektierbares Markergen (wie lacZ) verwenden, um Vektoren zu selektieren, welche eine effiziente Zuführung von Transgenen an den Herzmuskel in vivo vermitteln. Geeignete β-ASP-Vektorkonstrukte können dann verwendet werden (wie beschrieben in den nachstehenden Beispielen 12-13), um β-ASP-Transgene in vivo an den Herzmuskel zuzuführen.
BEISPIEL 12: Effekt von Gentransfer von β-ASP-Transgenen in vivo in Großtiermodellen, welche vorhersagekräftig für Herzversagen bei Menschen sind
Beispiel 12-1: In vivo-Gentransfer eines Adenylylcyclase-β-ASP-Transgens in den Herzmuskel
In Hinsicht auf die vorausgehenden Beobachtungen untersuchten wir die Fähigkeit, β-adrenerge Antwortfähigkeit in vivo zu steigern unter Anwendung von Gentherapie, um ein β-ASP-Transgen an den Herzmuskel unseres Großtiermodells zuzuführen.
Tiere beinhalteten 3 Hausschweine (mit einem Gewicht von 30-40 kg). Eine linke Thorakotomie wurde unter sterilen Bedingungen für die Instrumentierung durchgeführt (wie in Hammond et al., J. Clin. Invest. 92: 2644-2652, und Roth et al., J. Clin. Invest. 91: 939-949, 1993).
Katheter wurden in das linke Atrium und die Aorta platziert, wodurch ein Weg bereitgestellt wird, um die hoch echtheitsgetreue linksventrikuläre Druckmeßeinrichtung zu kalibrieren, was angewandt wird, um die Druckentwicklung zu messen, und Drücke zu verfolgen. Leitungen bzw. Drähte wurden auf dem linken Atrium angenäht, um eine EKG-Aufzeichnung und atriale Schrittmacherbehandlung zu gestatten.
Nach der Erholung von der chirurgischen Operation (10-14 Tage) wurden Schweine untersucht, um die β-adrenerge Antwortfähigkeit und die linksventrikuläre Abmessung und die Hämodynamik der Grundlinie zu bestimmen. Das wichtigste Element dieser Untersuchungen waren Herzgeschwindigkeitsantworten auf Isoproterenol-Infusion. Eines der Schweine wurde auch hinsichtlich linksventrikulären dP/dt-Messungen untersucht, welche vor und nach dem Gentransfer vorgenommen wurden, wie nachstehend beschrieben.
Das oben beschriebene veranschaulichende Adenovirusvektorsystem wurde verwendet, um Transgene durch in vivo-Genzuführung abzugeben. Als ein beispielhaftes β-ASP-Transgen verwendeten wir die AC_VI-Isoform, auf welche oben Bezug genommen wurde. Das in vivo injizierte Vektormaterial war hochgereinigt und enthielt kein (replikationskompetenten) Wildtyp-Adenovirus. Somit wurden Adenovirusinfektion und Entzündungs-Infiltration im Herz minimiert. Die Vektorpräparation wurde in das Lumen der Herzkranzarterie durch Koronarkatheter injiziert.
Die Einbringung der Vektorpräparation (4,0 ml, enthaltend etwa 10¹¹ virale Partikel von Adenovirus) erfolgte durch Injizieren von 2,0 ml in sowohl die linke als auch die rechte Herzkranzarterie. Die Tiere wurden betäubt, und der arterielle Zugang wurde erlangt über die rechte Karotis durch einen Abwärtsschnitt; eine 5F-Cordis-Scheide wurde eingesetzt. Ein 5F-Mehrzweck(A2)-Koronarkatheter wurde verwendet, um an den Herzkranzarterien einzugreifen. Die Katheterspitze wurde dann 1 cm innerhalb des arteriellen Lumens platziert, sodass minimales Material bei der proximalen Aorta während der Injektion verloren gehen wird. Dieses Vorgehen wurde für jedes der Schweine durchgeführt.
Unter Anwendung dieser Techniken haben wir eine Genzuführung mit sehr hoher Effizienz an den Herzmuskel erhalten, wobei keine Transgen-Expression in Hepatocyten beobachtet wurde. Darüber hinaus konnte virale RNA nicht im Urin zu irgendeiner Zeit nach der intrakoronären Injektion nachgewiesen werden.
Wie beschrieben in Beispiel 13, wurde festgestellt, dass eine derartige in vivo-Genzuführung eines β-ASP-Transgens an den Herzmuskel die Herzfunktion in unserem Groß-Säugetiermodell wesentlich steigert.
Beispiel 12-2: In vivo-Gentransfer von anderen β-ASPs in den Herzmuskel
Vektoren, welche andere β-ASPs umfassen, wie Vektoren, codierend β-ARs oder GRK-Inhibitoren, wie beschrieben in den Beispielen 6 und 7, können verwendet werden, um andere bevorzugte β-ASP-Transgene unter Verwendung der Techniken, wie beschrieben in Beispiel 12-1, zuzuführen.
Wie nachfolgend beschrieben wird, hatte der in vivo-Gentransfer eines ersten exemplarischen β-ASP-Transgens (AC) einen wesentlichen und positiven Einfluss auf die Herzfunktion in unserem Großtiermodell.
Die Zuführung von anderen β-ASP-Transgenen kann anstatt dessen oder zusätzlich zur Zuführung eines AC-Transgens verwendet werden. Wo eine Kombination von β-ASP-Transgenen zugeführt wird, kann die Kombination in einem einzelnen Vektor (umfassend zwei oder mehr β-ASP-Transgene) oder in separaten Vektoren (jeweils umfassend ein β-ASP-Transgen) vorgesehen werden. Mit größenbeschränkten Vektoren, wie Adenovirus, kann ein zusätzliches β-ASP-Transgen (wie ein GRK-Inhibitor) in den Vektor aufgenommen werden durch Deletieren eines weiteren Replikationsgens, wie E4, wie oben beschrieben. Darüber hinaus stehen neuere Generationen derartiger viraler Vektoren in Verwendung, bei welchen Größenbeschränkungen auf mehreren Wegen abgemildert werden. Weiterhin zeigen eine Reihe von verfügbaren nicht-viralen Vektoren, wie lipid-basierenden Vektoren (einschließlich z. B. kationischen Liposomenkomplexen) keine derartig restriktiven Größenbeschränkungen, wie sie mit Virenpartikel-Vektoren beobachtet werden.
Derartige zusätzlichen β-ASPs können auch unter Verwendung von separaten Vektoren zugeführt werden. Falls separate Vektoren verwendet werden, können die Vektoren zusammen in einer Einzelinjektion (wie oben veranschaulicht) oder in separaten Injektionen eingebracht werden. Während derartige separate Vektoren, welche verschiedene Transgene bereitstellen, am zweckdienlichsten analoge Vektoren sind (in welchen ein β-ASP-Transgen effektiv durch ein anderes ersetzt wird) können verschiedene Promotoren ebenso verwendet werden, wie auch verschiedene Basisvektoren.
Das folgende Beispiel veranschaulicht den Effekt einer in vivo-β-ASP-Transgen-Zuführung auf die Herzfunktion in unserem Schweinemodell für Herzversagen.
BEISPIEL 13: Erhöhte Herzfunktion nach in vivo-Gentransfer in Großtiermodelle, welche für CHF bei Menschen als Vorhersage dienen
Schweine, welche ein exemplarisches β-adrenerges Signalleitungsprotein durch in vivo-Gentherapie erhalten hatten, wie beschrieben im obenstehenden Beispiel 12-1, wurden hinsichtlich Herzfunktion und anderer Kriterien sowohl vor als auch nach der Genzuführung untersucht.
Mismatch-Analysen bestätigten, dass das β-ASP-Transgen (murine AC_VI) im Herzmuskel von Tieren vorhanden war, welche den Gentransfer erhalten-hatten.
Eine Anzahl von Indikatoren der Herzfunktion wurden vor und nach dem Gentransfer gemessen. Kurz gesagt, wurden bewusste Tiere in einer Schlinge aufgehängt, und Drücke aus dem LV (n = 1), LA und der Aorta wurden überwacht und Elektrokardiogramme wurden in einem digitalen Format online aufgezeichnet (im Ruhezustand und während der atrialen Schrittmacherbehandlung bei 150 bpm bzw. Schlägen pro Minute). Zweidimensionale und M-Modus-Bilder wurden unter Anwendung eines Ultraschall-Bilderzeugungssystems von Hewlett Packard erhalten. Die Bilder wurden aus einer rechten parasternalen Annäherung auf dem Niveau des mittleren Papillarmuskels erhalten und auf VHS-Band aufgezeichnet. Die Bilder wurden aufgezeichnet mit Tieren in einem Grundzustand, und erneut während der rechtsatrialen Schrittmacherbehandlung (HR = 150 bpm). Diese Untersuchungen wurden einen Tag vor dem Gentransfer ausgeführt und wurden dann bei 7 ± 3 Tagen nach dem Transfer wiederholt. Geschwindigkeits-Druck-Produkte und linksatriale Drücke waren festgestelltermaßen ähnlich vor und nach dem Gentransfer, was ähnliche myokardiale Sauerstoffanforderungen und -beladungsbedingungen anzeigt. Echokardiographische Messungen wurden vorgenommen unter Anwendung von standardisierten Kriterien (Sahn et al., Circulation, 58: 1072, 1978). Der linksventrikuläre enddiastolische Durchmesser (EDD) und endsystolische Durchmesser (ESD) wurden von 5 kontinuierlichen Schlägen gemessen und gemittelt.
Die linksventrikuläre fraktionelle Verkürzung (% FS) wurde ebenfalls untersucht [(EDD-ESD)/EDD] × 100. Dieses Maß war durch Gentransfer unverändert, was die Abwesenheit von nachteiligen Auswirkungen des Eingriffs anzeigt und die Sicherheit der Vorgehensweise demonstriert. Um die Reproduzierbarkeit von echokardiographischen Messungen zu demonstrieren, wurden Tiere (n = 5) an zwei aufeinanderfolgenden Tagen abgebildet, wobei eine hohe Korrelation aufgezeigt wurde (r² = 0,90; p = 0,005).
Nachdem linksventrikuläre Abmessungen gemessen worden sind und Grundlinien-Hämodynamik aufgezeichnet wurde, wurde Glycopyrrolat (ein muskarinischer cholinerger Antagonist) verabreicht (bei 0,14 mg/kg, intravenös), um die Effekte des parasympathischen Nervensystems auf die Herzgeschwindigkeits-Antworten zu blockieren. Isoproterenol wurde dann in Bolus-Dosierungen in den Lungenarterien-Katheter zugeführt, als die Herzgeschwindigkeitsantworten aufgezeichnet wurden. Diese Untersuchungen wurden einen Tag vor dem Gentransfer und dann erneut 5-10 Tage nach dem Gentransfer in jedem Schwein durchgeführt. Die Daten wurden dann durch gepaarte Analysen untersucht, wobei jedes Tier vor und nach dem Gentransfer verglichen wurde.
Die Ergebnisse, wie gezeigt in den 10 und 11 demonstrierten, dass in vivo-Genzuführung von sogar einem einzelnen β-ASP-Transgen gemäß der vorliegenden Erfindung effektiv die β-adrenerge Antwortfähigkeit in einem Großtiermodell-Herz erhöhte, welches als Vorhersage für Menschen aussagekräftig ist.
Die 10 zeigt Daten, welche die Effekte von in vivo-Gentransfer von AC_VI auf die Herzgeschwindigkeit zusammenfassen. Tiere wurden untersucht vor und 5-10 Tage nach intrakoronärer Zuführung von 10¹¹ Virenpartikeln eines Adenovirus, welcher AC_VI exprimierte. Glycopyrrolat wurde verwendet, um parasympathische Einflüsse auf die Herzgeschwindigkeit zu entfernen, wodurch der myokardiale βAR-Weg optimal isoliert wurde. Die basale Herzgeschwindigkeit war unverändert, aber die maximale (Isoproterenol-stimulierte) Herzgeschwindigkeit war signifikant erhöht mittels in vivo-Zuführung eines β-ASP-Transgens (d. h. AC_VI) gemäß der vorliegenden Erfindung. Diese Daten demonstieren erstmalig, dass in vivo-Gentransfer eines β-ASP-Transgens effektiv die β-adrenerge Antwortfähigkeit in einem Großsäugetier-Herz erhöhen kann.
Die 11 zeigt Ergebnisse von in vivo-Gentransfer von AC_VI auf LV dP/dt in einem normalen Schwein. Das Tier wurde untersucht vor und 7 Tage nach der intrakoronären Zuführung von 10¹² Virenpartikeln eines Adenovirus, welches das β-ASP-Transgen AC_VI trug. Glycopyrrolat wurde verwendet, um parasympathische Einflüsse auf die kontraktile Funktion zu entfernen, wodurch der myokardiale βAR-Weg optimal isoliert wurde.
Wie gezeigt in der 11, war die basale LV dP/dt bei der gleichen basalen Herzgeschwindigkeit wesentlich erhöht. Die Antwort auf Isoproterenol war ebenfalls erhöht nach AC_VI-Gentransfer. Diese Daten demonstrieren, dass in vivo-Gentransfer eines veranschaulichenden β-ASP-Transgens effektiv die kontraktile Funktion des intakten Herzens in einem Großtiermodell erhöhen kann, von welchem erwartet wird, für die Herzfunktion in Menschen als Vorhersage zu dienen.
Zusammenfassend zeigten die vorangehenden Untersuchungen, dass die Anwendung von in vivo-Gentherapie zur Zuführung selbst eines einzelnen AC-Transgens gemäß der vorliegenden Erfindung effektiv die endogene β-adrenerge Antwortfähigkeit und Herzfunktion in einem Säugetierherz erhöhte, welches beobachtetermaßen die Herzfunktion und-dysfunktion in Menschen nachahmt.
Wie vorausgehend angemerkt, können AC-Genkonstrukte auch modifiziert werden, um die effektiven Spiegel der Expression des resultierenden Transgens zu verändern, welches im Kontext der vorliegenden Erfindung angewandt wird. Zum Beispiel, wie oben beschrieben, kann die Expression von AC-Transgenen verändert werden durch Platzieren des Transgens unter die Steuerung eines heterologen Promotors (einschließlich zum Beispiel verschiedener konstitutiver oder induzierbarer Promotoren sowie gewebespezifischer Promotoren, wie herzspezifischen Promotoren). Wie ebenfalls oben beschrieben wird, kann die Expression verändert werden durch Veränderung anderer Regionen der Gene, einschließlich zum Beispiel der untranslatierten Regionen derartiger Gene. Zur Veranschaulichung können AC_VI-Konstrukte, welche Deletionen in der 3'-untranslatierten Region aufweisen, erzeugt werden (wie beschrieben in Beispiel 5-3) und getestet werden hinsichtlich ihres relativen Vermögens, Expression und funktionelle Antwortfähigkeit in Herzzellen zu beeinflussen (wie veranschaulicht in Beispiel 8-2). Die Fähigkeit, Gene zu verwenden, welche unterschiedliche Expressionsspiegel aufzeigen, stellt ein zusätzliches Werkzeug bereit, welches eingesetzt werden kann, um die vorliegende Erfindung im Kontext variierender therapeutischer Anforderungen leicht maßzuschneidern und zu optimieren (z. B. abhängig vom gewünschten Expressionsspiegel in den Zellen und dem Gewebe, welche behandelt werden sollen), und kann ebenfalls verwendet werden, um die Menge an Vektor zur reduzieren, welche erforderlich ist, um einen gegebenen physiologischen Effekt hervorzurufen. Wie obenstehend weiter beschrieben wurde, ist es möglich, humane Isoformen von AC-Transgenen unter Anwendung von Techniken zu erhalten, wie denjenigen, welche im Beispiel 5-3 veranschaulicht sind. Die in den Beispielen 9-13 präsentierten Veranschaulichungen liefern eine zusätzliche Richtlinie hinsichtlich Mitteln zum Testen und Verwenden derartiger AC-Transgene im Kontext der vorliegenden Erfindung.
Darüber hinaus unter Betrachtung dieser aufgezeigten Effekte im Zusammenhang mit unseren Beobachtungen und Beobachtungen von anderer Seite in Hinsicht auf die effektive Kopplung verschiedener Komponenten im βAR-G₅-AC-Weg, wird erwartet, dass die Fähigkeit, β-ARs, GRK-Inhibitoren oder Kombinationen derartiger β-ASPs zuzuführen (wie oben beschrieben), eine noch größere Steigerung der endogenen β-adrenergen Antwortfähigkeit und Herzfunktion in derartigen disfunktionalen Säugetierherzen bereitstellt. Tatsächlich unterstützen unsere oben beschriebenen Daten die Vorstellung, dass Änderungen hinsichtlich β-ARs und Proteinen, welche β-ARs beeinflussen (wie GRK), einen bedeutenden frühen Beitrag zu Abnormalitäten der Antwortfähigkeit gegenüber endogenen β-adrenergen Agonisten leisten, welche in Assoziation mit CHF beobachtet werden.
Durch Bereitstellen von Mitteln zum effektiven Steigern der Antwortfähigkeit gegenüber endogenen β-adrenergen Agonisten, liefert die vorliegende Erfindung daher die dringend benötigten Alternativen zur Verwendung von exogenen pharmakologischen Agonisten und anderen Behandlungen für kongestives Herzversagen im Menschen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verwendung eines Vektors, der ein Gen umfasst, das für eine Adenylylcyclase (AC) codiert und das operativ mit einem Promotor verbunden ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Herzfunktion in einem Säugetier mit kongestiver Herzinsuffizienz durch Abgabe des Vektors an das Herz des Säugetiers.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor in ein Blutgefäß eingeführt wird, das Blut zum Herzmuskel leitet.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor an Herzmuskelzellen abgegeben wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Blutgefäß, das Blut zum Herzmuskel leitet, eine Herzkranzarterie, ein Vena-Saphena-Transplantat oder ein Transplantat der inneren Brustarterie ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei der Vektor sowohl in die linke als auch in die rechte Herzkranzarterie eingeführt wird.
Die Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Die Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Vektor außerdem ein Gen umfasst, das für ein β-adrenerges Signalprotein (β-ASP) codiert, das verschieden ist von der AC, und das operativ mit einem Promotor verbunden ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei ein zweiter Vektor, der ein Gen umfasst, das für ein β-ASP codiert und das operativ mit einem Pro motor verbunden ist, in das Säugetier eingeführt wird, wobei das β-ASP verschieden ist von der AC.
Die Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die AC eine AC der Isoform VI ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die AC menschliche AC der Isoform VI ist.
Die Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Gen, das für die AC codiert, operativ mit einem heterologen Promotor verbunden ist, der ausgewählt ist aus einem heterologen konstitutiven Promotor und einem heterologen induzierbaren Promotor.
Die Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der Promotor ausgewählt ist aus einem ventrikulären Myosin-leichte Kette 2-Promotor und einem ventrikulären Myosin-schwere Kette-Promotor.
Die Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Gen, das für die AC codiert, ein Wildtyp-AC-Gen ist, das eine Deletion in einem oder mehreren nicht-translatierten Bereichen des AC-Gens aufweist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die Deletion sich in dem 3'-nicht-translatierten Bereich befindet.
Die Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei die Deletion mindestens etwa 100 bp aus dem 3'-nicht-translatierten Bereich entfernt.
Die Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das Gen, das für die AC codiert, ein verkürztes AC_VI-Gen ist, das eine Deletion aufweist, die den 3'-nicht-translatierten Bereich entfernt.
Die Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei der oder jeder Vektor ausgewählt ist aus einem viralen Vektor und einem auf Lipid basierenden Vektor.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der oder jeder Vektor ein virales Partikel ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei das oder jedes virale Partikel ein Adenovirus (Ad) oder ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV) ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei das virale Partikel ein Adenovirus ist, das ein Polynucleotid umfasst, welches einen Promotor aufweist, der operativ mit einem Gen, das für eine AC codiert, verbunden ist, und dieser Adenovirus-Vektor in Menschen replikationsdefekt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 20, wobei die AC eine AC der Isoform VI ist.
Ein isoliertes Polynucleotid, umfassend eine Sequenz, die für ein humanes Adenylcyclase VI (AC_VI)-Polypeptid oder eine Variante dessen, die Adenylcylase-Aktivität aufweist, codiert, wobei das Polynucleotid umfasst: (i) eine Sequenz von mindestens 100 Nucleotiden, die mindestens 99 % Gesamtsequenzidentität mit einer Nucleotidsequenz vergleichbarer Länge innerhalb der Sequenz aufweist, die in 12A dargestellt ist; oder (ii) eine Sequenz von mindestens 1000 Nucleotiden, die mindestens 95 % Gesamtsequenzidentität mit einer Nucleotidsequenz verleichbarer Länge innerhalb der Sequenz aufweist, die in 12A dargestellt ist.
Ein isoliertes Polypeptid, das von dem Polynucleotid des Anspruchs 22 codiert ist.
Ein isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 23, wobei das Polypeptid eine Sequenz von mindestens 300 Aminosäureresten umfasst, die mindestens 95 % der Gesamtsequenzidentität der Aminosäuren mit einer Sequenz vergleichbarer Länge innerhalb der Sequenz aufweist, die in 12B dargestellt ist.
Ein isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 24, wobei die Gesamtsequenzidentität der Aminosäuren mindestens 99 % beträgt.
Ein Vektor, umfassend ein Polynucleotid gemäß Anspruch 22.
Ein Vektor gemäß Anspruch 26, der ein viraler Vektor oder ein auf Lipid basierender Vektor ist.
Ein Vektor gemäß Anspruch 26, der ein replikationsdefekter viraler Vektor ist, ausgewählt aus einem adenoviralen Vektor und einem adeno-assoziierten viralen Vektor.
Ein rekombinantes replikationsdefektes virales Partikel, umfassend ein Polynucleotid nach Anspruch 22, das operativ mit einem Promotor verbunden ist.
Das rekombinante replikationsdefekte virale Partikel nach Anspruch 29, wobei das virale Partikel ein Adenovirus-Partikel ist.