DE69635304T2 - Faenger fuer oxidantien - Google Patents

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J. Rodney FOLZ
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Duke University
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Modulierung physiologischer und pathologischer Prozesse, und insbesondere die Modulierung intra- und extrazellulärer Niveaus von Qxidantien, wie etwa von Superoxidradikalen und Wasserstoffperoxid, und damit Prozesse, an denen solche Radikale beteiligt sind. Die Erfindung betrifft auch Verbindungen und Zusammensetzungen, die für die Verwendung bei solchen Verfahren geeignet sind.
  • Hintergrund
  • Oxidantien werden als Teil des normalen Stoffwechsels aller Zellen produziert, sind jedoch auch ein wichtiger Bestandteil der Pathogenese bei vielen Krankheitsprozessen. Beispielsweise sind reaktive Sauerstoffspezies entscheidende Elemente bei der Pathogenese von Erkrankungen der Lunge, des zentralen Nervensystems und des Skelettmuskels. Freie Sauerstoffradikale spielen auch eine Rolle beim Modulieren der Wirkungen von Stickstoffmonoxid (NO·). In diesem Zusammenhang tragen sie bei zur Pathogenese von Gefäßerkrankungen, entzündlichen Erkrankungen und dem Alterungsprozess.
  • Ein kritisches Gleichgewicht von Abwehrenzymen gegen Oxidantien wird benötigt, um die normale Funktion von Zellen und Organen aufrecht zu erhalten. Superoxiddismutasen (SODs), eine Familie von Metalloenzymen, die die intra- und extrazelluläre Umwandlung von O2 – in H2O2 plus O2 katalysieren, bilden die erste Abwehrlinie gegen die schädigenden Wirkungen von Superoxidradikalen. Säuger produzieren drei verschiedene SODs. Eine davon ist ein dimeres, Kupfer und Zink enthaltendes Enzym (CuZn SOD), das im Zytosol aller Zellen zu finden ist. Eine zweite ist eine tetramere Mangan-enthaltende SOD (Mn SOD), die in Mitochondrien zu finden ist, und die dritte ist ein tetrameres, glykosyliertes, Kupfer und Zink enthaltendes Enzym (EC-SOD), das sich in den extrazellulären Flüssigkeiten sowie gebunden an die extrazelluläre Matrix findet. Bekannter Maßen gibt es in Zellen mehrere andere wichtige antioxidative Enzyme, einschließlich Katalase und Glutathionperoxidase. Während Extrazellulärflüssigkeiten und die extrazelluläre Matrix nur geringe Mengen dieser Enzyme enthalten, ist die Existenz weiterer, extrazellulärer Antioxidantien bekannt, einschließlich Radikalfängern und Inhibitoren der Lipidperoxidation, wie etwa Ascorbinsäure, Harnsäure und α-Tocopherol (Halliwell et al, Arch. Biochem. Biophys. 280:1 (1990)). Der relative Mangel an extrazellulären antioxidativen Enzymen könnte die mögliche Funktion extrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies als Bioeffektormoleküle widerspiegeln (Halliwell et al, Arch. Biochem. Biophys. 280:1 (1990)). Der relative Mangel an solchen Enzymen kann auch in einer größeren Empfindlichkeit auf extrazellulären oxidativen Stress resultieren.
  • Das Enzym EC-SOD kommt an vielen extrazellulären Orten nur in geringen Konzentrationen vor. Obwohl seine physiologische Funktion in vivo an vielen extrazellulären Orten noch definiert werden muss, nimmt man nicht an, dass EC-SOD als Massen-Fänger von O2 – fungiert. Wie oben angegeben, ist EC-SOD ein tetrameres, Cu/Zn-enthaltendes Glykoprotein mit einem Molekulargewicht der Untereinheiten von 30.000 (Marklund, Proc. Natl. Acad Sci. USA 79:7634 (1982); Tibell et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6634 (1987); siehe auch US-Patent 5,130,245 und WO 91/04315). Biochemische Daten deuten darauf hin, dass EC-SOD an Heparansulfat-Proteoglykane auf endothelialen Zellen bindet, wo es – wie vermutet wird – als „schützende Hülle" fungiert (Marklund, J. Clin. Invest. 74:1398 (1984); Karlsson et al, Biochem. J. 255:223 (1988)). Endotheliale Zellen sekretieren sowohl O2 – (Halliwell, Free Radical Res. Commun. 5:315 (1989)) als auch Endothel-abgeleiteten Relaxierenden Faktor, mutmaßlich identifiziert als Stickstoffmonoxid (NO·) (Noak und Murphy, in: Oxidative Stress Oxidants and Antioxidants, Herausgeber Sies, H. (Academic, San Diego) S. 445–489 (1991)). NO· fungiert als Vasoregulator und als Regulator der Neurotransmission (Schuman und Madison, Science 254:1503 (1991)). NO· kann jedoch in bestimmten Situationen toxisch gegenüber Neuronen sein (Dawson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6368 (1991)). Es ist bekannt, dass O2 – die von NO· induzierte Vasorelaxation inaktiviert (Gryglewski et al, Nature 320:454 (1986); Rubanyi und Vanhoutte, Am. J. Physiol. 250:H822 (1986); Rubanyi und Vanhoutte, Am. J. Physiol. 250:H815 (1986); Bult et al, Br. J. Pharmacol. 95:1308 (1988); Nucci et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:2334 (1988)).
  • Somit besteht eine mögliche Funktion von EC-SOD darin, das von Zellen freigesetzte NO· vor der O2 –-vermittelten Inaktivierung zu schützen.
  • Es ist außerdem bekannt, dass die Reaktion von O2 – mit NO· ein potentiell toxisches Zwischenprodukt in Form des Peroxynitritanions (ONOO–) erzeugt (Beckmann et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1620 (1990); Mulligan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6338 (1991); Hogg et al, Biochem. J. 281:419 (1992); Matheis et al, Am. J. Physiol. 262:H616 (1992)). Somit könnte EC-SOD auch die Funktion haben, die Bildung von ONOO– zu verhindern.
  • Überraschender Weise ist herausgefunden worden, dass EC-SOD die O2-Toxizität auf das zentrale Nervensystem eher erhöht als vermindert und dass dieser Effekt von EC-SOD über die Modulation von NO· erfolgt. Dieses Ergebnis impliziert, dass NO· ein wichtiger Mediator der O2-Toxizität ist. Die Erfindung betrifft somit Verfahren zur Manipulation der Stickstoffmonoxidfunktion, die die Verwendung extrazellulärer Antioxidantien einbeziehen.
  • Zusätzlich zu Superoxid-Radikalen, ist Wasserstoffperoxid eine Spezies von Oxidans, die bei einer großen Vielzahl von Bedingungen des oxidativen Stresses produziert wird. Die Erfindung ermöglicht somit auch die Manipulation der Wasserstoffperoxid-Spiegel.
  • Die Verfahren der Erfindung finden Anwendung bei verschiedenen Krankheits- und Nichtkrankheitszuständen, bei denen oxidativer Stress eine Rolle spielt, einschließlich Entzündung.
  • In einem weiteren Sinne betrifft die Erfindung allgemein Verfahren zur Modulierung intra- und extrazellulärer Prozesse, an denen ein Oxidans, wie etwa O2 – oder Wasserstoffperoxid teilnimmt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Modulation intra- oder extrazellulärer Spiegel von Oxidantien, wie etwa Superoxidradikalen, Wasserstoffperoxid und Peroxynitrit. Genauer ausgedrückt, betrifft die Erfindung die Modulation normaler oder pathologischer Prozesse mit Beteiligung von Superoxidradikalen, Wasserstoffperoxid, Stickstoffmonoxid oder Peroxynitrit unter Verwendung niedermolekularer Antioxidantien, z.B. Mimetika von SOD, Katalase oder Peroxidase.
  • In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Oxidantienfänger der Formel
    Figure 00040001
    oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Metallkomplex davon bereit, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen, worin
    jeder R1' unabhängig voneinander
    Figure 00040002
    Figure 00040003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist, und wobei
    Figure 00040004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00040005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt,
    jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n ist, wobei n 1–4 ist,
    jeder R3' unabhängig voneinander -Y'', -Y''', -H, -OH, -OY'', -NO2, -CN, -NH2, -COOH, -COY'', -COO– oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist,
    wobei R3' nicht COOH, COY'' oder COO– ist, wenn
    Figure 00040006
    wobei R3' nicht -NO2 ist, wenn
    Figure 00040007
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht
    Figure 00040008
  • Bevorzugt ist Y''' ein sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin und jede Wasserstoffaustauschgruppe an dem Aminstickstoff ist eine C1-C4-Alkylgruppe.
  • Der Fänger kann die folgende Struktur besitzen:
    Figure 00050001
  • Der Fänger kann die folgende Struktur besitzen:
    Figure 00050002
  • Der Fänger kann die folgende Struktur besitzen:
    Figure 00060001
  • Der Fänger kann die folgende Struktur besitzen:
    Figure 00060002
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Schützen von Pflanzenzellen vor durch Oxidantien induzierter Toxizität bereit, bei dem man die Zellen in Kontakt bringt mit einer nichttoxischen Menge eines Fängers der Formel
    Figure 00070001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon oder eines Metallkomplexes davon, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen,
    worin
    jeder R1' unabhängig voneinander eine Bindung,
    Figure 00070002
    Figure 00070003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00070004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00070005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt,
    jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist,
    jeder R3' unabhängig voneinander -Y'', -Y''', -H, -OH, -OY'', -NO2, -CH, -NH2, -COOH, -COY'', -COO– oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist,
    wobei R3' nicht COOH, COY'' oder COO– ist, wenn
    Figure 00070006
    wobei R3' nicht -NO2 ist, wenn
    Figure 00070007

    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht -H, sind,
    in ausreichender Weise, um den Schutz zu bewirken.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines solchen Fängers bei der Herstellung eines Medikaments für den Schutz von Säugerzellen vor durch Oxidantien induzierter Toxizität durch Inkontaktbringen der Zellen mit einer nichttoxischen Menge des Fängers, die ausreicht, den Schutz zu bewirken, bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Fängers der Formel
    Figure 00080001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon oder eines Metallkomplexes davon bereit, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen,
    worin
    jeder R1' unabhängig voneinander eine Bindung,
    Figure 00080002
    Figure 00080003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00080004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00080005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt,
    jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist,
    jeder R3' unabhängig voneinander -Y'', -Y''', -H, -OH, -OY'', -NO2, -CN, -NH2, -COOH, -COY'', -COO– oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist,
    wobei R3' nicht COOH, COY'' oder COO– ist, wenn
    Figure 00080006
    wobei R3' nicht -NO2 ist, wenn
    Figure 00080007
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht -H, sind,
    bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von Xanthinoxidase-Aktivität einer Zelle oder eines Gewebes durch Inkontaktbringen der Zelle oder des Gewebes mit einer Menge des Fängers, die ausreicht, die Hemmung zu bewirken.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Oxidantienfängers der folgenden Formel bereit
    Figure 00090001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon,
    wobei
    R1 eine Bindung,
    Figure 00090002
    Figure 00090003
    ist, wobei X ein Halogen und Y eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00090004
    eine Bindung an
    R2 an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00090005
    eine Bindung an R2 und den Substituenten an irgendeiner Position angibt, und
    R2 eine Bindung, -(CY'2)n –, -(CY'2-CY'=CY')n –, -(CY'2-CY'2-CH=CH)n–, -(CY'=CY')n – oder -(CY'2-CO)n – ist,
    wobei Y' Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist und wobei n 1 bis 8 ist und
    R3 -Y'', -OH, -NH2, -N+(Y'')3, -COOH, -COO–, -SO3H, -SO3 –, -CH2-PO3H2 oder -CH2-PO3H– ist,
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist,
    wahlweise komplexiert mit einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen,
    bei der Herstellung eines Medikaments zum Modulieren der Funktion von NO· als einem Neurotransmitter in einem Säuger durch Inkontaktbringen des Säugers mit einer Menge des Oxidantienfängers, die ausreichend ist, um die Modulierung zu bewirken.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines Oxidantienfängers der folgenden Formel bereit
    Figure 00100001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon oder eines Metallkomplexes davon, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen, worin
    jeder R1' unabhängig voneinander eine Bindung,
    Figure 00100002
    Figure 00100003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00100004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position
    angibt und
    Figure 00100005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt,
    jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist,
    jeder R3' unabhängig voneinander -Y'', -Y''', -H, -OH, -OY'', -NO2, -CN, -NH2, -COOH, -COY'', -COO– oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist,
    wobei R3' nicht COOH, COY'' oder COO– ist, wenn
    Figure 00100006
    wobei R3' nicht -NO2 ist, wenn
    Figure 00100007
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht -H, sind,
    bei der Herstellung eines Medikaments zum Modulieren der Funktion von NO· als einem Neurotransmitter in einem Säuger durch Inkontaktbringen des Säugers mit einer Menge des Oxidantienfängers, die ausreicht, um diese Modulation zu bewirken.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Kit bereit, dieses umfassend den Fänger der ersten Ausführungsform der Erfindung, der in einem Behälter untergebracht ist.
  • In einer zweiten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Oxidantienfänger der folgenden Formel bereit
    Figure 00110001
    oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder einen Metallkomplex davon, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen,
    worin
    jeder R1' unabhängig voneinander eine Bindung,
    Figure 00110002
    Figure 00110003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00110004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position
    angibt und
    Figure 00110005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt,
    jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist,
    jeder R3' unabhängig voneinander -Y''', -COY'' oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist,
    wobei R3' nicht COY'' ist, wenn
    Figure 00120001
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht
    Figure 00120002
  • Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung klar werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt den EC-SOD-Expressionsvektor, der verwendet wird, um transgene Mäuse herzustellen. Die transgenen Mäuse wurden erzeugt mit dem Eco-RI-XbaI-Fragment. IVS1: Zwischengeschaltete (intervenierende) Sequenz 1 aus dem humanen β-Actin-Promotor.
  • 2 zeigt die Northern-Analyse von Geweben der transgenen Mäuse. Zwanzig μg Gesamt-RNA aus den Geweben transgener Mäuse wurden mit Glyoxal denaturiert, einer Elektrophorese auf einem 1,2%igen Agarosegel unterzogen und auf Nitrozellulose geblottet. Die Sondenmarkierung des Filters erfolgte mit der cDNA von vollständiger humaner EC-SOD. Die 2,5 kb-Bande entspricht der mRNA des humanen EC-SOD-Transgens, das die 1 kb große zwischengeschaltete Sequenz enthält (siehe 1). Die 1,5 kb große Bande entspricht der vollständig prozessierten mRNA des humanen EC-SOD-Transgens.
  • 3 zeigt das prozentuale Überleben transgener und nicht-transgener Mäuse, die für 25 Minuten 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt wurden. Den Mäusen wurde 10 Minuten vor der Druckbehandlung i.p. Saline injiziert, oder sie erhielten i.p. 20 mg/kg an N-ϖ-Nitro-L-Arginin (LNNA). 400 mg/kg an Diethyldithiocarbamat (DDC) in Saline wurden 55 Minuten vor der Druckbehandlung i.p. injiziert. *p<0,017, getestet durch χ2 mit Bonferroni-Korrektur im Vergleich zu transgenen, mit Saline behandelten Mäusen.
  • 4 zeigt die Zeit bis zum Einsetzen des ersten Anfalls bei transgenen und nicht-transgenen Mäusen, die 6 ATA an Sauerstoff ausgesetzt wurden. Den Mäusen wurde 10 Minuten vor Beginn der Druckbehandlung i.p. Saline injiziert, oder sie erhielten i.p. 20 mg/kg an N-ϖ-Nitro-L-Arginin (LNNA). 400 mg/kg an Diethyldithiocarbamat (DDC) wurden 55 Minuten vor der Druckbehandlung i.p. injiziert. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung der Zeit bis zum ersten Anfall, wobei die Zeit Null angesetzt wurde, als die Kammer 6 ATA erreicht hatte. *p<0,05, getestet durch Analyse der Varianz mittels des Scheffe F-Tests im Vergleich zu nicht-transgenen, mit Saline behandelten Mäusen.
  • 5 zeigt die Wirkung von Diethyldithiocarbamat und β-Mercaptoethanol auf das Überleben in 6 ATA Sauerstoff für 30 Minuten. (C57BL/6 X C3H)F1-Mäuse erhielten 55 Minuten vor der Druckbehandlung durch i.p.-Injektion Saline, 180 mg/kg β-Mercaptoethanol (2-ME) oder 400 mg/kg an Diethyldithiocarbamat (DDC) in Saline. *p<0,025, getestet durch χ2 mit Bonferroni-Korrektur im Vergleich zu mit Saline behandelten Mäusen.
  • 6 zeigt die Anfalls-Latenzzeit bei wildtypischen Mäusen, die 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt wurden, nachdem sie mit Saline oder 20 mg/kg an N-ϖ-Nitro-L-Arginin (LNNA) oder 20 mg/kg an N-ϖ-Nitro-L-Arginin plus 50 mg/kg L-Arginin (LNNA + L-Arg) behandelt worden waren. *p<0,05, getestet durch Analyse der Varianz mittels eines gepaarten Student T-Tests im Vergleich zu mit Saline behandelten Mäusen.
  • 7 zeigt das prozentuale Überleben bei wildtypischen Mäusen, die 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt wurden. Die Mäuse erhielten 15 Minuten vor der Druckbehandlung eine i.p.-Injektion mit normaler Saline (0,008 cc/g) oder mit 20 mg/kg an N-ϖ-Nitro-L-Arginin (LNNA) (0,008 cc/g). Die Mäuse wurden 6 ATA an Sauerstoff ausgesetzt, und zwar für 20 Minuten (n = 10, nur Saline), 25 Minuten (n = 10, beide Gruppen), 30 Minuten (n = 10, nur Saline), 50 Minuten (n = 6, nur LNNA), 75 Minuten (n = 12, nur LNNA), 90 Minuten (n = 14, nur LNNA), 105 Minuten (n = 6, nur LNNA) und 120 Minuten (n = 6, nur LNNA). Dabei wurde das prozentuale Überleben für jede Gruppe gemessen.
  • 8 zeigt die Überlebens/Dosisantwort-Kurve für N-ϖ-Nitro-L-Arginin (LNNA). Wildtypische Mäuse erhielten eine i.p.-Injektion mit normaler Saline (0,008 cc/g) oder 0, 2, 10, 20 oder 30 mg/kg an LNNA (0,008 cc/g) 15 Minuten vor der Druckbehandlung und wurden dann 75 Minuten lang 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt. Das prozentuale Überleben wurde für jede Behandlungsgruppe berechnet.
  • 9 zeigt das prozentuale Überleben bei Wildtyp-Mäusen, die einer Vorbehandlung mit Saline, 20 mg/kg an N-ϖ-Nitro-L-Arginin (LNNA) oder 20 mg/kg an N-ϖ-Nitro-L-Arginin plus 50 mg/kg an L-Arginin (LNNA + L-Arg) unterzogen und dann für 75 Minuten 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt wurden. *p<0,05, getestet durch χ-Quadrat-Test mit Bonferroni-Korrektur.
  • 10 zeigt das prozentuale Überleben bei transgenen und nicht-transgenen Mäusen, die für 75 Minuten 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt wurden. Die Mäuse erhielten 10 Minuten vor der Druckbehandlung i.p.-Injektionen mit Saline oder 20 mg/kg N-ϖ-Nitro-L-Arginin (LNNA). *p<0,05, getestet durch χ2 im Vergleich zu nicht-transgenen, mit Saline behandelten Mäusen. + p<0,05, getestet durch χ2 im Vergleich zu transgenen, mit Saline behandelten Mäusen.
  • 11 zeigt den Vergleich der Ödem-Bildung bei transgenen EC-SOD-Mäusen mit der Ödembildung bei nicht-transgenen Geschwistertieren nach Kälte-induzierter Verletzung an der rechten Gehirnhemisphäre sowie bei nicht verletzten Mäusen. Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardfehler angegeben. *p<0,05 im Vergleich zum Ödem-Index der jeweiligen nicht-transgenen Kontrollen unter Verwendung eines gepaarten Student-T-Tests.
  • 12 zeigt die Wirkung erhöhter Niveaus an EC-SOD auf Veränderungen der Gefäßdurchlässigkeit nach Kälte-induzierter Gehirnverletzung. Die Gefäßdurchlässigkeit wird anhand des Austretens von Evan's Blau in der verletzten rechten Gehirnhemisphäre bei nicht-transgenen (Kontroll-)mäusen und transgenen EC-SOD-Mäusen gezeigt.
  • 13 zeigt eine Western Blot-Analyse von rh-EC-SOD und einem humanen Lungenhomogenisat zum Nachweis der Antikörper-Spezifität. Die Proteine wurden auf einem 10% 0,75 mm SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulose übertragen. Die Proteine wurden mit dem Antikörper gegen rekombinante humane EC-SOD (4,3 μg/ml) hybridisiert, und der Antikörper wurde durch Hybridisierung mit 125I-Protein-A, gefolgt von Autoradiographie, detektiert. Die EC-SOD-Spur enthielt 0,05 μg an reinem, rekombinantem humanem Typ C EC-SOD-Protein. Die Lungen-Spur enthielt 1,0 μg eines 20.000 × g-Überstandes eines humanen Lungenhomogenisats.
  • Die 14A–14C zeigen die lichtmikroskopische immunhistochemische Lokalisierung von EC-SOD in der menschlichen Lunge. Die Gewebe wurden unter Verwendung des Antikörpers gegen rekombinante humane EC-SOD (5,4 mg/ml; anti-EC-SOD) markiert, oder mittels des entsprechenden Antikörperansatzes, bei dem der anti-EC-SOD IgG unter Verwendung von gereinigter rekombinanter EC-SOD, angeheftet an CNBr-Sepharose (absorbierte EC-SOD), herausgezogen worden war. Die Detektion des Antikörpers erfolgte unter Verwendung einer Markierungstechnik mittels Biotin/Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase. A: große elastische Lungenarterie, markiert mit anti-EC-SOD. Zu beachten ist die Markierung um die glatten Muskelzellen unterhalb des Endothels und unterhalb der elastischen Schicht des Gefäßes (kurzer Pfeil), sowie das Fehlen einer Markierung für EC-SOD an der Oberfläche der Endothelzellen (offener Pfeil) und an Elastin (langer Pfeil). B: Muskuläre Lungenarterie, markiert mit anti-EC-SOD. Zu beachten ist ein hohes Maß an Markierung in der das Gefäß umgebenden Bindegewebsmatrix und im Lymphgewebe (langer Pfeil), in der die glatten Muskelzellen umgebenden Matrix (kurzer Pfeil), sowie das Fehlen von Markierung an der Oberfläche der endothelialen Zellen (offener Pfeil). C: Muskuläre Lungenarterie, markiert mit an EC-SOD absorbierten Antiseren. Die Absorption von anti-EC-SOD IgG hebt die gesamte Markierung in dem muskulären Gefäß auf (Balken = 50 μm).
  • Die 15A–15C zeigen die immunhistochemische Lokalisierung von EC-SOD in der menschlichen Lunge. Die Gewebe wurden unter Verwendung des Antikörpers gegen rekombinante humane EC-SOD (5,4 mg/ml; anti-EC-SOD) markiert. Die Detektion des Antikörpers erfolgte mittels einer Biotin/Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Markierungstechnik. A: Großer knorpeliger Luftweg, markiert mit anti-EC-SOD. Zu beachten ist die intensive Markierung für EC-SOD in der Matrix um die glatten Muskelzellen (kurzer Pfeil), zwischen den epithelialen Zellen (langer Pfeil) und das Fehlen von Markierung an der Oberfläche der epithelialen Zellen (offener Pfeil), sowie in der Knorpelmatrix (Sternchen). B: Nicht-knorpeliger Luftweg, markiert mit anti-EC-SOD. Zu beachten ist die intensive Markierung für EC-SOD über die gesamte Matrix unterhalb des Epithels (kurzer Pfeil) und das Fehlen von Markierung an der Oberfläche des Epithels (offener Pfeil). C: Lungenparenchym, markiert mit anti-EC-SOD. Die EC-SOD-Markierung findet sich hauptsächlich an den septalen alveolaren Spitzen (kurzer Pfeil) und in der die kleinen Gefäße umgebenden Matrix (langer Pfeil). Es wurde keine Markierung für EC-SOD an der Oberfläche der alveolaren Epithelzellen (offener Pfeil) beobachtet. (Balken = 50 μm).
  • Die 16A–16C zeigen die elektronenmikroskopische Immunlokalisierung von EC-SOD in vaskulärem Bindegewebe. Die Gewebe wurden unter Verwendung des Antikörpers gegen rekombinante humane EC-SOD (40 μg/ml; anti-EC-SOD) markiert oder mittels des entsprechenden Antikörperansatzes, nachdem der anti-EC-SOD IgG unter Verwendung von gereinigter rekombinanter EC-SOD, angeheftet an CNBr-Sepharose (absorbierte EC-SOD), herausgezogen worden war. Der Antikörper wurde unter Verwendung von 10 nm Protein-A-Gold detektiert. A: vaskuläres Collagen, markiert mit anti-EC-SOD. B: Vaskuläres Elastin, markiert mit anti-EC-SOD. C: Vaskuläres Collagen, markiert mit an EC-SOD absorbierten Antiseren. Zu beachten ist die intensive Markierung von EC-SOD in Verbindung mit Typ I-Collagen und das Fehlen von Markierung in Zusammenhang mit Elastin (E). Des weiteren hebt die Absorption des anti-EC-SOD-Antikörpers die gesamte Markierung für EC-SOD in Zusammenhang mit Typ I-Collagen auf. (Balken = 200 nm).
  • 17 zeigt die elektronenmikroskopische Immunlokalisierung von EC-SOD um den vaskulären glatten Muskel. Die Gewebe wurden unter Verwendung des Antikörpers gegen rekombinante humane EC-SOD (40 μg/ml) markiert. Der Antikörper wurde unter Verwendung von 10 nm Protein-A-Gold detektiert. Es zeigt sich ein hohes Maß an Markierung in der Bindegewebsmatrix um die vaskuläre glatte Muskelzelle (S) in Zusammenhang mit Typ I-Collagen (kurzer Pfeil), sowie bei anderen, nicht identifizierten Matrix-Elementen (langer Pfeil). (Balken = 200 nm).
  • Die 18A–18B zeigen die elektronenmikroskopische Immunlokalisation von EC-SOD an der Oberfläche von Lungenendothelzellen. Die Gewebe wurden unter Verwendung des Antikörpers gegen rekombinante humane EC-SOD (40 μg/ml) markiert. Der Antikörper wurde unter Verwendung von 10 nm Protein-A-Gold detektiert. A: Endotheliale Zelle aus einer kleinen muskulären Lungenarterie. B: Endotheliale Zelle aus einer Lungenkapillare. Es fand sich keine Markierung für EC-SOD an der Oberfläche der endothelialen Zellen (kurze Pfeile). EC-SOD ist im Plasma (P) zu beobachten und ist mit Proteinen der extrazellulären Matrix unterhalb des Endothels assoziiert (lange Pfeile). (Balken = 200 nm).
  • 19 zeigt die elektronenmikroskopische Immunlokalisierung von EC-SOD um bronchiale Epithelzellen. Die Gewebe wurden unter Verwendung des Antikörpers gegen rekombinante humane EC-SOD (40 μg/ml) markiert. Der Antikörper wurde unter Verwendung von 10 nm Protein-A-Gold detektiert. EC-SOD wurde im Verbindungsbereich zwischen den Epithelzellen gefunden (Pfeil), und es wurde auch in einem gewissen Maße im Inneren der Zellen beobachtet. (Balken = 200 nm).
  • Die 20A–20D (nur zur Bezugnahme) zeigen eine partielle Restriktionskarte, die Sequenzierstrategie, die genomische Struktur und die Proteinstruktur von humaner EC-SOD, Klon #7. 20A: partielle Restriktionskarte des humanen, genomischen EC-SOD-Klons #7, dargestellt in 5'→3'-Orientierung. Ein 1 kb-Größenmarker ist angezeigt. B: BamH I; H: Hind III; P: Pst I; S: Sal I; K: Kpn I; E: EcoR I. In 20B ist die Subklonierung und Sequenzierstrategie dargestellt. Überlappende Restriktionsfragmente verschiedener Größe wurden für die nachfolgende DNA-Sequenzanalyse in den Plasmidvektor pGEM3Zf(+) subkloniert. Die gesamte DNA wurde für beide Stränge unter Verwendung von Sequenase (USB) und einer doppelsträngigen DNA-Matrize sequenziert, außer ~2kb des 3'-7K36-Fragments, bei dem nur eine Orientierung sequenziert wurde. In 20C ist die Exon/Intron-Struktur des humanen EC-SOD-Gens dargestellt. Die Position der codierenden Region für präEC-SOD in Exon 3 ist durch die gestrichelten Linien dargestellt. In 20D sind die vier strukturellen Domänen von humanem EC-SOD-Protein schematisch dargestellt. Das Signalpeptid ist durch einen Pfeil angezeigt. Darauf folgt die reife, glykosylierte (CHO), aminoterminale Peptid-Domäne. Eine dritte Region besitzt eine sehr hohe Aminosäure-Sequenzhomologie zu humaner CuZn-SOD. Die carboxy-terminale Domäne weist zahlreiche geladene basische Reste (+) auf, die entscheidend wichtig für die Bindung von Heparin-Glycosaminoglycan sind.
  • Die 21A–21B (nur zur Bezugnahme) zeigen Northern-Blots der EC-SOD für mehrere humane Gewebe. 21A: zwei μg an Poly A(+)-mRNA aus acht verschiedenen humanen Geweben wurden einer Elektrophorese auf einem denaturierenden Agarosegel unterzogen, auf eine geladene Nylonmembran übertragen und mit [32P]-markierter antisensecRNA für humane EC-SOD sondenmarkiert. Molekulare RNA-Größenmarker (Kilobasen) sind zur Rechten dargestellt. Die quantitative Übertragung wurde mittels Ethidiumbromid-Färbung überwacht. Die Ergebnisse zeigen, dass in allen acht untersuchten Geweben eine singuläre 1,4 kb große mRNA vorhanden ist. Interessanter Weise zeigt der Skelettmuskel eine zweite, größere mRNA von ~ 4,2 kb, während das Gehirn eine schwache, etwa 2,2 kb große Bande zeigt. In 21B wurden Banden, die der EC-SOD-mRNA entsprachen, mittels Laser-Densitometrieanalyse quantifiziert, gegenüber der 1,4 kb-Bande des Gehirns normalisiert und in relativen Extinktionseinheiten ausgedrückt.
  • Die 22A–22B (nur zur Bezugnahme) zeigen die Analyse der Transkriptionsinitiationsstelle. Die Technik der schnellen 5'-Amplifikation der cDNA-Enden (5'-RACE) wurde verwendet, um die Stelle der Transkriptionsinitiation bei dem humanen EC-SOD-Gen zu identifizieren. In 22A zeigt ein schematisches Diagramm die Hybridisierungsstellen (annealing sites) für die verschiedenen Oligonukleotide. Die dunkle Linie stellt zum ersten Strang gehörende, revers transkribierte cDNA von humaner Herz-poly A(+)-mRNA dar, wobei die Primerreaktion mit EC7 (einem für das EC-SOD-Gen spezifischen Primer) erfolgte und unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) ein Poly-C-Schwanz angehängt wurde. HEC1, HEC2, EC4 und EC7 sind 5'-ständige, für das humane EC-SOD-Gen spezifische Primer. Der Anker-Primer wird in dem 5'-RACE-Kit (GIBCO BRL) zur Verfügung gestellt und hybridisiert an den Poly-C-Schwanz. In 22B wurde die PCR verwendet, um Segmente der DNA zu amplifizieren, wobei [Anker + EC4] oder [HEC1 + EC7] als Primer und entweder mit Poly-C-Schwanz versehene cDNA (+ TdT, Spuren 1 & 4) oder cDNA ohne Poly-C-Schwanz (-TdT, Spuren 2 & 5) als Matrize eingesetzt wurden. Spur 3 beinhaltet PCR-amplifizierte DNA bei Verwendung von [HEC1 + EC7] als Primer und einer humanen EC-SOD-cDNA voller Länge als Matrize. Die resultierenden amplifizierten DNAs wurden auf einem 2% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, auf geladene Nylonmembranen überführt und mit [32P]-markiertem HEC2, einem 5'-ständigen, genspezifischen „Nested" Primer für EC-SOD sondenmarkiert. DNA-Molekulargewichtsmarker liefen zwischen den Spuren 2 und 3. Die erwartete Größe der PCR-amplifizierten Region in den Spuren 3, 4 und 5 beträgt 217 bp. In Spur 1 ist nur eine einzige Bande zu erkennen, mit einer molekularen Größe von etwa 185 bis 200 bp.
  • 23 zeigt eine genomische Southern Blot-Analyse des humanen EC-SOD-Gens. Zehn Mikrogramm humaner genomischer DNA wurden vollständig mit allen jeweils angezeigten Restriktionsenzymen verdaut, auf einem 1 %-Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf geladene Nylonmembranen überführt. Die Blots wurden mit einer [32P]-markierten EC-SOD-cRNA partieller Länge sondenmarkiert, die den ersten etwa 1050 Nukleotiden entsprach, und dann autoradiographiert. Die spezifische Restriktionsendonuklease ist an der Oberseite der jeweiligen Spur angegeben. DNA-Molekulargewichtsmarker (in Kilobasen) sind auf der rechten Seite zu sehen.
  • 24 (nur zur Bezugnahme) zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des humanen EC-SOD-Gens. Die vollständige Nukleotidsequenz des humanen Gens ist angegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Signalpeptids und des reifen Proteins ist unter Verwendung des Einbuchstabencodes der Aminosäuren angegeben.
  • 25 zeigt eine Lineweaver-Burk-Auftragung, die die nicht-kompetitive Inhibition von Xanthinoxidase durch MnTBAP zeigt.
  • 26 zeigt den Schutz der Endothelzellen der Lungenarterie vor Xanthinoxidaseinduzierter Verletzung durch MnTBAP.
  • Figure 00180001
  • 27 zeigt den Schutz der Lungenepithelzellen vor durch Paraquat induzierter Verletzung durch SOD-Mimetika.
  • 28 zeigt den Schutz der Endothelzellen der Lungenarterie vor durch Paraquat induzierter Verletzung durch MnTBAP.
  • 29 zeigt den mangelnden Schutz der Endothelzellen der Lungenarterie vor durch Paraquat induzierter Verletzung durch ZnTBAP.
  • 30 zeigt die Schutzwirkung von MnTBAP gegenüber Paraquat-induzierter Verletzung der Lunge.
  • 31 zeigt eine Auftragung im Bezug auf die Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für Katalase-Mimetika.
  • 32 zeigt die Wirkung von MnTBAP auf die durch H2O2 induzierte endotheliale Verletzung.
  • Die 33A und 33B zeigen die durch MnTBAP und MnTmPyP bewirkte Verringerung endothelialer Zellverletzungen durch die Exposition gegenüber von Glukoseoxidase produziertem Wasserstoffperoxid. 33C zeigt, dass ZnTBAP eine durch Wasserstoffperoxid induzierte endotheliale Zellverletzung nicht verringert. 33D zeigt, dass endotheliale Zellen durch CuZn-SOD nicht vor der durch Wasserstoffperoxid induzierten Verletzung geschützt werden.
  • Die 34A und 34B zeigen den Zeitverlauf der NMDA- und der KA-induzierten Inaktivierung von Aconitase. 34A: Kortikale Zellen, die mit Träger oder 50 μM NMDA für 0, 5, 15, 30, 60 und 240 Minuten behandelt wurden, sowie Messung der Aconitaseaktivität in den Zelllysaten. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert ± mittlerem Standardfehler (n = 6 – 8). 34B: Kortikale Zellen, die mit Träger oder 300 μM Kainat für 0, 60, 240 und 360 min behandelt wurden und Messung der Aconitaseaktivität in den Zelllysaten. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert ± mittlerem Standardfehler (n = 4 – 8).
  • Die 35A–35C zeigen die Korrelation der Toxizität mit der Aconitaseinaktivierung. Es wurde die Konzentrationsabhängigkeit von KA (35A), PQ++ (35B) und NMDA (35C) bei der Induktion von Toxizität (linke Achse) und Aconitaseinaktivierung (rechte Achse) bestimmt. Es wurden die als prozentuale LDH-Freisetzung oder Aconitaseinhibition normalisierten Werte aufgetragen, um die Korrelation zwischen der LDH-Freisetzung und der Aconitaseinaktivierung zu bestimmen. Gefüllte Quadrate repräsentieren LDH und offene Quadrate repräsentieren Aconitase. Die Kurven wurden per Computer unter Verwendung nichtlinearer Regressionsanalyse erstellt, wobei die Gleichung Y = Bottom + (Top-Bottom)/1 + 10LogEC50-X (GraphPad Prism) verwendet wurde. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert (n = 4 – 6).
  • Die 36A und 36B zeigen die Blockade der Aconitaseinaktivierung und Neurotoxizität durch MnTBAP. 36A: Kortikale Zellen wurden einer Behandlung mit 150 μM PQ++ für 3 Stunden (ausgefüllte Balken), 50 μM NMDA für 1 Stunde (offene Balken) oder 300 μM KA für 6 Stunden (gestrichelte Balken) in Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 μM MnTBAP (vorliegend 15 min vor und während der Dauer der Behandlung) unterzogen, und die Aconitaseaktivität wurde in den Zelllysaten gemessen. Die Balken repräsentieren den Mittelwert ± mittlerem Standardfehler (n = 8 – 12). Das Sternchen zeigt einen Unterschied gegenüber allen anderen Behandlungen an (p<0,05, einseitiger ANOVA). 36B: Kortikale Zellen wurden einer Behandlung mit 150 μM PQ++ (ausgefüllte Balken), 50 μM NMDA (offene Balken) oder 300 μM KA (gestrichelte Balken) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an MnTBAP (vorliegend 15 min vor und während der Dauer der Behandlung) für 18 Stunden unterzogen, und die LDH-Freisetzung wurde im Medium gemessen. Das Sternchen zeigt einen Unterschied gegenüber den Kontrollen an (Agonist in Abwesenheit von MnTBAP; p<0,05 Dunnet's Test). Die Balken repräsentieren den Mittelwert ± mittlerem Standardfehler (n = 3 – 6).
  • 37 zeigt die Inhibition der NMDA-Toxizität durch MnTBAP. Kortikale Zellen wurden einer Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen an NMDA in Gegenwart und Abwesenheit von 200 μM MnTBAP für 18 Stunden unterzogen, und das LDH wurde im Medium gemessen. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert ± mittlerem Standardfehler (n = 3 – 4).
  • Die 38A bis 38C zeigen die unterschiedliche Wirkung von MnTBAP und ZnTBAP auf den Zelltod. Kortikale Zellen wurden einer Behandlung mit 150 μM PQ++ (38A), 50 μM NMDA (38B) oder 300 μM KA (38C) in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen an MnTBAP (offene Quadrate) oder ZnTBAP (gefüllte Quadrate) unterzogen, und die toten Zellen wurden mittels EthD-1 angefärbt. Die Bilder der für EthD-1 positiven Zellen wurden gespeichert und unter Verwendung eines digitalen Bildanalysators in zufällig gewählten Feldern ausgezählt Die Daten sind ausgedrückt als Anzahl der toten Zellen pro Feld. Jeder Punkt repräsentiert Messungen, die anhand von 1200–1500 Zellen durchgeführt wurden.
  • 39 zeigt die Wirkung, die die Entfernung des EC-SOD-Gens in einem Mausmodell auf das Lernen hat.
  • 40 zeigt die Wirkung von Mn(III)tetrakis(4-benzoesäure)porphyrin (MnTBAP) (3–100 μM) auf die Oxidation von Dihydrorhodamin 123 zu Rhodamin 123 in Reaktion auf Peroxynitrit (5 μM). Die Daten sind ausgedrückt als Mittelwerte ± mittlerem Standardfehler von Dreifachbestimmungen.
  • 41 zeigt die von Peroxynitrit (41A) und der NO-Donorverbindung S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamin (SNAP, 3 mM) (41B) und von Diethylamin:NO NONOat (DNO) (41C) vermittelte Suppression der mitochondrialen Atmung (ausgedrückt als Prozentanteil der Atmung bei unbehandelten Zellen) in J774-Makrophagen, sowie die schützende Wirkung von Mn(III)tetrakis(4-benzoesäure)porphyrin (MnTBAP) (10–300 μM) gegen diese Suppression. Die Daten sind ausgedrückt als Mittelwerte ± mittlerem Standardfehler bei n = 12 Wells. **p<0,01 repräsentiert signifikante Effekte von SNAP im Vergleich zu den Werten der Kontrolle (C); #;## repräsentieren signifikante Schutzwirkungen von MnTBAP (p<0,05 bzw. p<0,01).
  • Die 42A–D zeigen Schemata von Synthesereaktionen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Schutzes gegen die schädlichen Wirkungen von Oxidantien, insbesondere von Superoxid-Radikalen, Wasserstoffperoxid und Peroxynitrit, und die Verhinderung und Behandlung von Krankheitszuständen, die oxidativen Stress beinhalten oder aus diesem resultieren. Die Erfindung betrifft außerdem das Modulieren biologischer Prozesse, an denen Oxidantien, einschließlich Superoxid-Radikalen, Wasserstoffperoxid, Stickstoffmonoxid und Peroxynitrit, beteiligt sind. Die Erfindung betrifft weiterhin Verbindungen und Zusammensetzungen einschließlich niedermolekularer Antioxidantien (z.B. Mimetika von Fängern reaktiver Sauerstoffspezies, einschließlich Mimetika von SODs, Katalasen und Peroxidasen) und Formulierungen hiervon, die für die obigen Anwendungen geeignet sind.
  • Mimetika von Fängern reaktiver Sauerstoffspezies, die für die oben genannten Verwendungen geeignet sind, beinhalten Manganderivate von Methin-substituierten Porphinen oder pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon. Die Methinsubstituenten können so ausgewählt werden, dass sie den Elektronenaustausch zwischen dem mimetischen Metall (z.B. Mn) und dem Sauerstoffradikal erleichtern. Substituenten, die Elektronen aus dem Ring abziehen, unterstützen die Delokalisierung der Ladung des Metalls und steigern daher dessen katalytische Aktivität. Folglich können die Substituenten so ausgewählt werden, dass sie das Redoxpotential des Porphins modulieren. Die Substituenten können außerdem so ausgewählt werden, dass sie das Porphyrin resistent gegenüber dem Abbau durch Hämoxygenase machen. Hämoxygenase, ein Schlüsselenzym im normalen Porphyrinabbau, und ein Enzym, das eine Rolle bei der Regulierung von Entzündungen spielt, greift an den Methinbrücken-Kohlenstoffen an. Durch die Erstellung von Verbindungen, die gegenüber dem Angriff nicht empfindlich sind (z.B. durch die Einführung von Substituenten an den Methinbrücken-Kohlenstoffen) kann die Halbwertszeit des Porphyrins gesteigert werden. Solche Verbindungen haben den weiteren Vorteil, dass sie nicht in den normalen Porphyrinstoffwechsel eingreifen.
  • Die Auswahl der Substituenten kann außerdem auf Basis des Ergebnisses erfolgen, das man erreichen möchte. Wenn z.B. bei einem gegebenen Behandlungsschema der Durchtritt durch Zellmembranen vorteilhaft ist, so können unpolare Substituenten ausgewählt werden, um das Mimetikum lipidlöslich zu machen. Die Substituenten können außerdem dafür ausgewählt werden, um dem Mimetikum die Fähigkeit zu verleihen, an Elemente der Zelloberfläche oder der extrazellulären Matrix zu binden. Solche Substituenten können ausgewählt werden, um das Mimetikum auf Basis von Ladung, Form, Struktur, etc. an ein Ziel zu lenken. Die Zielsteuerungs-Substituenten können z.B. für bestimmte Zelloberflächenrezeptoren spezifisch sein, so z.B. für Mannose-Rezeptoren, die sich auf epithelialen Zellen befinden, oder für bestimmte Zucker oder Lektine, die sich auf der Zelloberfläche befinden.
  • Bei einer Ausführungsform besitzen die gemäß der Erfindung verwendeten Mimetika die folgende Formel:
    Figure 00220001
    wobei
    R1 eine Bindung,
    Figure 00220002
    Figure 00220003
    ist, wobei X ein Halogen und Y eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00220004
    eine Bindung an
    R2 an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00220005
    eine Bindung an R2 und den Substituenten an irgendeiner Position angibt, und
    R2 eine Bindung, -(CY'2)n –, -(CY'2-CY'=CY')n –, -(CY'2-CY'2-CH=CH)n –, -(CY'=CY')n – oder
    Figure 00220006
    wobei Y' Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist und wobei n 1 bis 8 ist und
    R3 -Y'', -OH, -NH-, -N+(Y'')3, -COOH, -COO–, -SO3H, -SO3 –, -CH2-PO3H2 oder -CH2-PO3H– ist,
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist.
  • Bei einer spezifischeren Ausführungsform ist
    R1 eine Bindung,
    Figure 00230001
    Figure 00230002
    wobei X Cl oder Br ist und Y eine C1-4-Alkylgruppe ist und R2 eine Bindung, -(CY'2)n –,
    -(CY'2-CY'=CY')n –, -(CY'2-CY'2-CH=CH)n –, -(CY'=CY')n – oder
    Figure 00230003
    wobei Y' Wasserstoff oder eine C1-4-Alkylgruppe ist und wobei n 1 bis 4 ist und
    R3 -Y'', -OH, -NH2, -N+(Y'')3, -COOH, -COO–, -SO3H, -SO3 –, -CH2-PO3H- oder -CH2-PO3H– ist, wobei Y'' eine C1-4-Alkylgruppe ist.
  • Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist
    R1 eine Bindung,
    Figure 00230004
    Figure 00230005
    wobei X Cl oder Br ist und Y Methyl oder Ethyl ist und R2 eine Bindung, -(CY'2)n –,
    -(CY'2-CY'=CY')n –, -(CY'2-CY'2-CH=CH)n –, -(CY'=CY')n – oder
    Figure 00230006
    wobei Y' Wasserstoff oder Methyl oder Ethyl ist und wobei n 1 oder 2 ist und
    R3 Methyl, Ethyl, -OH, -NH2, -N+(CH3)3, -N+(CH2CH3)3, -COOH, -COO–, -SO3H, -SO3 –, -CH2-PO3H- oder -CH2-PO3H– ist.
  • Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform ist
    R1 eine Bindung,
    Figure 00230007
    wobei Y Alkyl, bevorzugt C1-4-Alkyl, bevorzugter Methyl oder Ethyl ist,
    R2 eine Bindung, -(CY'2)n –, -(CY'=CY')n – oder
    Figure 00230008
    wobei Y' Wasserstoff oder Alkyl (bevorzugt C1-4-Alkyl, bevorzugter Methyl oder Ethyl) ist, und wobei n 1 bis 4 (bevorzugt 1 oder 2) ist, und
    R3 C1-4-Alkyl (bevorzugt Methyl oder Ethyl), -OH, -NH2, -N+(CH3)3, -N+(CH2CH3)3, -COOH, -COO–, -SO3H, -SO3 –, -CH2-PO3H- oder -CH2-PO3H– ist.
  • Bei wiederum einer anderen spezifischen Ausführungsform ist
    R1 eine Bindung,
    Figure 00240001
    und R2 ist eine Bindung, -(CY'2)n –, -(CY'=CY')n –,
    wobei Y' Wasserstoff oder Alkyl (bevorzugt C1-4-Alkyl, bevorzugter Methyl oder Ethyl) ist, und wobei n 1 bis 4 (bevorzugt 1 oder 2) ist, und
    R3 C1-4-Alkyl (bevorzugt Methyl oder Ethyl), -OH, -NH2, -N+(CH3)3, -N+(CH2CH3)3, -COOH, -COO–, -SO3H, -SO3 –, -CH2-PO3H- oder -CH2-PO3H– ist.
  • Jedes P ist Wasserstoff. Spezifische, für die Verwendung bei den vorliegenden Verfahren geeignete Mimetika beinhalten Mn(III)tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)porphyrin (MnTMPyP), Mn(III)tetrakis(4-trimethyl-aminophenyl)porphyrin (MnTMAP) und Mn(III)tetrakis-(4-benzoesäure)porphyrin (MnTBAP).
  • Obwohl die vorstehenden Mimetika als Mangan-Chelate beschrieben wurden, können andere Metalle als Mangan, so etwa Eisen (III) und Kupfer (II), ebenfalls verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch den metallfreien, stickstoffhaltigen makrocyclischen Liganden. Es wird ersichtlich sein, dass das ausgewählte Metall verschiedene Valenzzustände aufweisen kann, wobei z.B. Mangan II, III oder V verwendet werden können. Diese Ladungsänderung wird abhängig sein von der Annahme oder Freisetzung von Elektronen.
  • Zusätzlich zu den vorstehenden Mimetika beinhaltet die Erfindung auch die Verwendung von Verbindungen der Formel
    Figure 00250001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon oder eines Metallkomplexes davon, wobei das Metall z.B. Mangan, Kupfer oder Eisen sein kann,
    worin
    jeder R1' unabhängig voneinander eine Bindung,
    Figure 00250002
    Figure 00250003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe (z.B. C1-C4) ist und wobei
    Figure 00250004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00250005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt,
    jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist,
    jeder R3' unabhängig voneinander -Y'', -Y''', -H, -OH, -OY'', -NO2, -CN, -NH2, -COOH, -COY'', -COO– oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist (bevorzugt ein Alkylamin, bei dem die Alkylgruppen z.B. C1-C5-Alkyle sind),
    wobei R3' nicht COOH, COY'' oder COO– ist, wenn
    Figure 00250006
    wobei R3' nicht -NO2 ist, wenn
    Figure 00250007
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht -H sind.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung sind -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht
    Figure 00260001
    z.B., wenn Y'' ein Methyl ist.
  • Wie oben angegeben, kann R3' eine heterozyklische Gruppierung darstellen. Mögliche Heterozyklen beinhalten substituierte oder unsubstituierte Tetrazole, Furane, Thiophene, Indole, Imidazole, Pyridine, Oxadiazole und Chinoline. Mögliche Substituenten für solche Gruppierungen beinhalten Halogen (z.B. Br oder Cl), -NO2, C1-4-Alkyl und C1-4-Alkylalkohol-Gruppen.
    P ist Wasserstoff.
  • Dort, wo Rotationsisomere möglich sind, können alle derartigen Isomere der hier beschriebenen Mimetika (Oxidantienfänger) gemäß der Erfindung verwendet werden.
  • Spezifische Beispiele geeigneter Mimetika für die Verwendung bei der Erfindung sind unten dargestellt:
    Figure 00260002
    R' = NH2-ArgGluHisSerGluArgLysLysArgArgArgGluSerGluCysLysAlaAla-COOH
  • 5,10,15,20-Tetrakis[R-Gruppe]mangan(III)porphyrine:
    Figure 00270001
  • Mimetika, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können ausgewählt werden, indem man auf SOD-, Katalase- und/oder Peroxidase-Aktivität und Stabilität hin testet. Die selektive, reversible und SOD-empfindliche Inaktivierung von Aconitase durch bekannte O2 –-Generatoren kann als Marker der O2 –-Erzeugung verwendet werden. Somit können geeignete Mimetika ausgewählt werden, indem man auf die Befähigung hin testet, Aconitaseaktivität zu schützen.
  • Die SOD-Aktivität kann in Gegenwart und Abwesenheit von EDTA unter Verwendung des Verfahrens von McCord und Fridovich (J. Biol. Chem. 244:6049 (1969)) gemessen werden. Die Effektivität eines Mimetikums kann bestimmt werden, indem man die Auswirkung des Mimetikums auf das Wachstum eines SOD null-Stammes von E. coli gegenüber einem Wildtyp-Stamm misst. Konkret können wildtypisches E. coli (AB1157) und SOD null E. coli (JI132) in M9-Medium, enthaltend 0,2% Casaminosäuren und 0,2% Glukose, bei pH 7,0 und 37°C herangezogen werden; das Wachstum kann über die Trübung spektrophotometrisch bei 700 nm verfolgt werden. Aktive Mimetika können in Säugerzellkulturen auf ihre Toxizität hin getestet werden, indem man die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) misst. Konkret können Ratten L2-Zellen (eine Typ II-artige Lungenzelle; (Kaighn und Douglas, J. Cell Biol. 59:160a (1973)) in Ham's F-12-Medium, supplementiert mit 10% fetalem Kälberserum, bei pH 7,4 und 37°C herangezogen werden. Die Zellen können mit jeweils gleicher Dichte in 24 Well-Kulturschalen inokuliert und bis auf etwa 90% Konfluenz vermehrt werden; die SOD-Mimetika können in logarithmischen Dosen (z.B. mikromolare Dosen in minimal-essentiellem Medium (MEM)) zu den Zellen hinzu gegeben werden, gefolgt von 24 h Inkubation. Die Bestimmung der Toxizität kann über die Morphologie und durch Messen der Freisetzung des zytosolischen Verletzungsmarkers LDH (z.B. auf einem thermokinetischen Platten-Lesegerät) erfolgen, wie es von Vassault beschrieben worden ist (in: Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer (Herausgeber), S. 118–26 (1983); die Oxidation von NADH wird bei 340 nm gemessen). Die Wirksamkeit aktiver Mimetika kann ermittelt werden, indem man deren Befähigung bestimmt, Säugerzellen vor durch Methylviologen (Paraquat) induzierte Toxizität zu schützen. Konkret dargestellt, können Ratten L2-Zellen, die gemäß obiger Beschreibung herangezüchtet und in 24 Well-Schalen inokuliert wurden, mit verschiedenen Konzentrationen des SOD-Mimetikums präinkubiert werden, gefolgt von der Inkubation mit einer Konzentration an Methylviologen, für die zuvor gezeigt wurde, dass sie eine LC75 bei Kontroll-L2-Zellen verursacht. Die Wirksamkeit des Mimetikums kann mit einer Abnahme der durch Methylviologen induzierten LDH-Freisetzung korreliert werden (St. Clair et al., FEBS Lett. 293:199 (1991)). Die Wirksamkeit von SOD-Mimetika kann in vivo mit Maus- und/oder Ratten-Modellen getestet werden, wobei sowohl die Applikation als Aerosol als auch parenterale Injektion verwendet werden können. Beispielsweise können männliche Balb/c-Mäuse zufällig in 4 Gruppen mit jeweils 8 Mäusen eingeteilt werden, von denen jede ein statistisches 2X2-Standard-Zufallsmodell bildet. Den Tieren kann entweder Paraquat (40 mg/kg, i.p.) oder Saline verabreicht werden, wobei die Behandlung entweder mit einem SOD-Mimetikum oder mit einer Trägerkontrolle erfolgt. Die Lungenverletzung kann 48 Stunden nach der Paraquat-Behandlung bestimmt werden, indem die Schädigungsparameter (LDH, Protein und % PMN) in der bronchoalveolaren Spülflüssigkeit (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) analysiert werden (siehe vorherige Beschreibung von Hampson et al., Tox. Appl. Pharm. 98:206 (1989); Day et al., J. Pharm. Methods 24:1 (1990)). Die Lungen von zwei Mäusen jeder Gruppe können durch Einflößen von 4% Paraformaldehyd fixiert und für die Histopathologie auf lichtmikroskopischem Niveau weiterverarbeitet werden.
  • Die Überwachung der Katalaseaktivität kann durch Messung der Extinktion bei 240 nm in Gegenwart von Wasserstoffperoxid erfolgen (siehe Beers und Sizer, J. Biol. Chem. 195:133 (1952)) oder durch eine Messung der Sauerstoffentwicklung mittels einer Clark-Sauerstoffelektrode (Del Rio et al., Anal. Biochem. 80:409 (1977)). Die Peroxidase-Aktivität kann spektrophotometrisch gemessen werden, wie zuvor beschrieben von Putter und Becker: Peroxidases. In: Methods of Enzymatic Analysis, H.U. Bergmeyer (Herausgeber), Verlag Chemie, Weinheim, S. 286–292 (1983). Die Messung der Aconitaseaktivität kann erfolgen, wie in Beispiel XI unten beschrieben.
  • Die unten stehende Tabelle IX liefert eine Zusammenfassung der Aktivitäten verschiedener Oxidantienfänger der Erfindung. Die Fußnote zu dieser Tabelle gibt Details über die verwendeten Tests an.
  • Die Synthese von Mimetika, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, kann unter Verwendung von Protokollen aus dem Stand der Technik erfolgen. Beispiel XIV beinhaltet eine detaillierte Beschreibung der Synthese von vier spezifischen Mimetika. Im Falle der Mn(III)-Porphyrin-Mimetika können Porphyrinringe mit verschiedenen Seitengruppen an dem Methinbrücken-Kohlenstoff kommerziell erworben werden, und das Mn(III)-Metallion kann in den Porphyrinring eingesetzt werden, wozu Verfahren einschließlich der folgenden verwendet werden können: (1) Mischen von Mn(II)-Acetat mit Porphyrin in Gegenwart von Sauerstoff, wobei die selektive Stabilisierung von Mn(III) durch das Porphyrin unter diesen Bedingungen die Autooxidation von Mn(II) bewirkt; (2) Herstellen von Mn(III)(OH)3 durch eine Modifikation des Winkler-Verfahrens (Sastry et al., Anal. Chem. 41:857 (1969)), gefolgt von der Reaktion mit dem Porphyrin; (3) Rühren von MnO2 mit dem Porphyrin in Gegenwart von NH2OH, was dazu dient, Mn(IV) zu Mn(III) zu reduzieren, das dann von dem Porphyrin „eingefangen" wird; oder (4) ein modifiziertes Verfahren, nach Pasternack et al (Biochemistry 22:2406 (1983)), das eine Rückflussbehandlung von im Überschuss vorhandenen MnCl3 mit dem Porphyrin vorsieht. Die Mn(III)-Porphyrin-Komplexe können mit Natriumperchlorat aus der Lösung präzipitiert werden, wonach sie gewaschen und das verbliebene Perchlorat über ein starkes Anionenaustauscherharz entfernt wird. Die Bildung des Mn(III)-Porphyrins kann spektrophotometrisch verfolgt werden, indem man eine charakteristische Soret-Bande bei 468 nm beobachtet. Die Synthese von Verbindungen, die Elektronen-abziehende Gruppen an einem oder mehreren der Pyrrolkohlenstoffatome tragen, kann so durchgeführt werden, wie sie von Richards et al., Inorg. Chem. 35:1940 (1996) beschrieben wurde. Die Reinigung der Mimetika kann unter Verwendung in der Technik bekannter Techniken, wie etwa Umkristallisieren, Chromatographie, etc. erfolgen. Das Anfügen einer Bindungsdomäne an den „mimetischen Kern" kann gemäß obiger Beschreibung durchgeführt werden.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ergibt sich wenigstens teilweise aus der Beobachtung, dass EC-SOD die Funktion von NO· in spezifischer Weise reguliert. Zusätzlich basiert die Erfindung auf der Erkenntnis, dass EC-SOD durch epitheliale Zellen synthetisiert wird und sich primär im Interstitium, an Matrixelementen und Collagen und in der Umgebung glatter Muskelzellen (insbesondere der Luftwege und Gefäße der Lunge) befindet. NO· stellt ein interzelluläres Signal dar, sodass NO· als solches die extrazelluläre Matrix durchqueren muss, um seine Wirkungen auszuüben. NO· ist jedoch hochgradig empfindlich gegenüber der Inaktivierung, die durch das in extrazellulären Räumen befindliche O2 – vermittelt wird. EC-SOD ist somit ein Enzym, das ideal geeignet ist, um die Bioverfügbarkeit von NO· durch das Verhindern seiner Degradation durch O2 – zu steigern.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Regulation der extrazellulären Spiegel von NO· unter Verwendung von Polypeptiden mit EC-SOD-Aktivität. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Manipulation von NO· als dem einzigen Wirkungsmechanismus der Verbindungen, Mimetika etc. der Erfindung beschränkt. Vielmehr bezieht sich die Erfindung auf das Abfangen von Sauerstoffradikalen, Wasserstoffperoxid und Peroxynitrit im Allgemeinen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft in einer weiteren spezifischen Ausführungsform die Inhibition der Produktion von Superoxid-Radikalen. Bei dieser Ausführungsform werden die Mimetika der Erfindung dafür verwendet, Oxidasen, wie etwa Xanthinoxidase, zu inhibieren, die für die Produktion von Superoxidradikalen verantwortlich sind (siehe Beispiel VII). Die Befähigung eines Mimetikums, Säugerzellen vor durch Xanthin/Xanthinoxidase induzierter Verletzung zu schützen, kann z.B. dadurch getestet werden, dass man Ratten L2-Zellen in 24-Well-Schalen heranzieht. Die Zellen können mit verschiedenen Konzentrationen eines Mimetikums präinkubiert werden, wonach Xanthinoxidase (XO) zusammen mit Xanthin (X) den Kulturen zugegeben werden kann. Die geeignete Menge an XO/X, die bei der Studie verwendet wird, kann vorab für jede Zelllinie bestimmt werden, indem man eine Dosis-Antwortkurve der Verletzung erstellt. X/XO kann in einer Menge verwendet werden, die eine ungefähre LC75 in der Kultur hervorruft. Die Wirksamkeit des Mimetikums kann mit einer Abnahme der XO/X-induzierten LDH-Freisetzung korreliert werden. Die Befähigung der Mimetika, die Produktion solcher Radikale zu hemmen, ermöglicht die Verwendung der Mimetika als Therapeutika für die Behandlung von Gicht und Reperfusionsverletzungen.
  • Die Mimetika der Erfindung können als katalytische Fänger von reaktiven Sauerstoffspezies verwendet werden, um vor ischämischen Reperfusionsverletzungen zu schützen, die in Zusammenhang stehen mit Myocardinfarkt, Schlaganfall, akutem Kopftrauma, Organreperfusion nach Transplantation, Darmischämie, pulmonalem Infarkt, chirurgischem Abschluss des Blutflusses und Weichgewebeverletzung. Die Mimetika können ferner verwendet werden, um vor Skelettmuskel-Reperfusionsverletzungen zu schützen. Die Mimetika können außerdem dazu verwendet werden, um vor einer Schädigung des Auges (und der Haut) aufgrund von Sonnenlicht zu schützen, ebenso wie vor Glaukom und der Makuladegeneration des Auges. Knochenerkrankungen sind der Behandlung mit den Mimetika ebenfalls zugänglich. Weiterhin kann bei Bindegewebsstörungen, die mit Störungen der Collagensynthese oder des Collagenabbaus verbunden sind, erwartet werden, dass sie auf eine Behandlung mit den vorliegenden Mimetika ansprechen.
  • Zusätzlich zum Einfangen von Superoxid wird die Befähigung der Mimetika der Erfindung, Wasserstoffperoxid einzufangen, vor der möglichen Bildung des hochreaktiven Hydroxylradikals schützen, indem diese in die Fenton-Chemie (Aruoma und Halliwell, Biochem. J. 241:273 (1987); Mello Filho et al., Biochem. J. 218:273 (1984); Rush und Bielski, J. Phys. Chem. 89:5062 (1985)) eingreifen. Es ist für diese Metalloporphyrine gezeigt worden, dass sie Peroxynitrit einfangen, wie dies indirekt gezeigt wurde durch eine Inhibition der Oxidation von Dihydrorhodamin 123 zu Rhodamin 123 (siehe Beispiel XIII), sowie direkt durch die Beschleunigung des Peroxynitritabbaus durch Stop-Flow-Analyse.
  • Zusätzlich zu dem oben genannten, können die Mimetika als katalytische Fänger reaktiver Sauerstoffspezies verwendet werden, um die sehr begrenzte Lagerungslebensdauer zu transplantierender Herzen, Nieren, Haut und anderer Organe und Gewebe zu erhöhen. Die Mimetika können außerdem verwendet werden bei Verfahren der Inhibition von Schäden aufgrund einer Autoxidation von Substanzen, die in der Bildung von O2 – resultiert, wobei hier z.B. Lebensmittelprodukte, Pharmazeutika, gelagertes Blut, etc. einbezogen sind. Um dies zu bewirken, werden die Mimetika den Lebensmitteln, Pharmazeutika, dem gelagerten Blut, etc. in einer Menge zugegeben, die hinreichend ist, um die Oxidationsschäden zu hemmen oder zu verhindern, und somit, um einen Abbau zu hemmen oder zu verhindern, der mit den Autoxidationsreaktionen zusammenhängt. (Für weitere Verwendungen der Mimetika der Erfindung: siehe US-Patent 5,227,405). Die Menge des Mimetikums, die bei einer bestimmten Behandlung zu verwenden ist, oder die mit einer bestimmten Substanz zusammengebracht werden muss, kann vom Fachmann bestimmt werden.
  • Die Verfügbarkeit der Mimetika ermöglicht außerdem Studien an Prozessen, die durch O2 – Wasserstoffperoxid, Stickstoffmonoxid und Peroxynitrit vermittelt werden.
  • Um eine Modulation der Wirksamkeit von extrazellulärem NO·, z.B. im sich entspannenden glatten Muskel, zu erreichen, werden Moleküle (Mittel) mit EC-SOD-Aktivität unter Bedingungen verabreicht, die so sind, dass die Spiegel an extrazellulärem O2 – verändert werden.
  • Moleküle, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten Mimetika von EC-SOD gemäß obiger Beschreibung.
  • Die allgemeinen Anforderungen an solche Mimetika sind, dass sie (a) in Gegenwart der vielen Chelat-bildenden Mittel, die in lebenden Systemen vorliegen, stabil genug sind, um das komplexierte Metall (z.B. Cu oder Mn) zu halten, (b) aktiv genug sind, sodass angemessene Dosen dazu dienen können, die Gesamtaktivität von SOD in den extrazellulären Räumen signifikant zu steigern, (c) in der Lage sind, sich an die Oberflächen von Zellen oder Elementen der extrazellulären Matrix (z.B. Collagen) anzuheften, wenn ein Schutz gegen extrazelluläre Quellen von O2 – benötigt wird, und (d) von geringer Toxizität sind. Beispiele geeigneter Mimetika beinhalten Mn(III)-Komplexe von Porphyrinen mit räumlich ausladenden kationischen Substituenten an den Methinbrücken-Kohlenstoffen, wie etwa den oben beschriebenen (z.B. MnTMAP und MnTMPyP). Solche Komplexe sind sehr aktiv und stabil genug, um ihre vollständige Aktivität in Gegenwart von im Überschuss vorliegendem EDTA oder in Gegenwart von Gewebeextrakten aufrecht zu erhalten.
  • Die oben beschriebenen Mimetika können in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden, die für die Verwendung bei den vorliegenden Verfahren geeignet sind. Solche Zusammensetzungen beinhalten den (mimetischen) Wirkstoff zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel. Die Zusammensetzung kann in Formen von Dosierungseinheiten, wie z.B. Tabletten, Kapseln oder Zäpfchen, vorliegen. Die Zusammensetzung kann auch in Form einer sterilen Lösung vorliegen, die für die Injektion oder das Versprühen geeignet ist. Die Zusammensetzungen können auch in einer Form vorliegen, die für die Verwendung am Auge geeignet ist. Die Erfindung beinhaltet auch Zusammensetzungen, die für die topische Applikation formuliert sind, wie etwa Zusammensetzungen in Form z.B. einer Lotion, einer Creme, eines Gels oder einer Salbe. Die in die Zusammensetzung einzubeziehende Konzentration des Wirkstoffs kann auf Basis der Natur des Wirkstoffs, des Dosierungsschemas und des gewünschten Resultats ausgewählt werden.
  • Die Dosierung der zu verabreichenden Zusammensetzung der Erfindung kann ohne unangemessenen Versuchsaufwand ermittelt werden und wird von verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich der Natur des Wirkstoffs, der Verabreichungsroute, dem Patienten und dem Ergebnis, das erzielt werden soll.
  • Geeignete Dosen an Mimetika werden z.B. mit dem Mimetikum und mit dem gewünschten Resultat variieren. Die Ergebnisse von Faulkner et al (J. Biol. Chem. 269:23471 (1994)) zeigen an, dass die in vivo-Oxidoreduktaseaktivität der Mimetika so ist, dass eine pharmazeutisch wirksame Dosis niedrig genug sein wird, um Probleme der Toxizität zu vermeiden. Dosierungen, die verwendet werden können, beinhalten solche im Bereich von 1 bis 50 mg/kg.
  • Weitere Beispiele für Krankheiten oder Störungen, die für eine Behandlung unter Verwendung der Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten Erkrankungen des zentralen Nervensystems (einschließlich AIDS-Demenz, Schlaganfall, amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Parkinson-Krankheit und Huntington-Krankheit), sowie Erkrankungen der Muskulatur (einschließlich Zwerchfellerkrankungen (z.B. Atemermüdung bei Emphysem, Bronchitis und Cystische Fibrose), Herzermüdung bei kongestiver Herzinsuffizienz, mit Myopathien in Zusammenhang stehende Muskelschwächesyndrome, ALS und Multiple Sklerose). Viele neurologische Erkrankungen (einschließlich Schlaganfall, Huntington-Krankheit, Parkinson-Krankheit, ALS, Alzheimer-Demenz und AIDS-Demenz) stehen in Verbindung mit einer Überstimulierung des Hauptsubtyps des Glutamatrezeptors, des NMDA(oder N-Methyl-D-aspartat)-Subtyps. Bei Stimulierung des NMDA-Rezeptors tragen exzessive neuronale Calciumkonzentrationen zu einer Reihe von Membranereignissen und zytoplasmatischen Ereignissen bei, die zur Produktion von freien Sauerstoffradikalen und Stickstoffmonoxid (NO·) führen. Es ist gezeigt worden, dass die Wechselwirkungen zwischen freien Sauerstoffradikalen und NO· zu dem neuronalen Zelltod beitragen. Es sind gut etablierte neuronal-corticale Kulturmodelle der NMDA-Toxizität entwickelt und als Grundlage der Arzneimittelentwicklung verwendet worden. In eben diesen Systemen inhibieren die Mimetika der Erfindung die NMDA-induzierte Verletzung.
  • Die in Beispiel XI vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die Bildung von O2 –-Radikalen ein obligatorischer Schritt bei den intrazellulären Ereignissen ist, die im excitotoxischen Tod kortikaler Neuronen gipfeln, und sie zeigen weiterhin, dass die Mimetika der Erfindung verwendet werden können, um O2 –-Radikale einzufangen und dadurch als protektive Mittel gegen die excitotoxische Verletzung wirken. Die Verbindung 10303 (siehe Tabelle IX) verringert die durch NMDA und Kainat induzierte Excitotoxizität in kortikalen Zellen der Ratte in einer dosisabhängigen Weise mit einem 100% Schutz, und zwar bei 25 μM an Verbindung 10303 im Fall der durch NMDA (50 μM) induzierten Excitotoxizität, bzw. bei 100 μM an Verbindung 10303 im Fall der durch Kainat (300 μM) induzierten Excitotoxizität.
  • Außerdem hier beschrieben ist die Verwendung von Verbindungen für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Arthrttis, systemischem Bluthochdruck, Arteriosklerose, Ödem, septischem Schock, pulmonalem Hochdruck, einschließlich primärem pulmonalem Hochdruck, Impotenz, Infertilität, Endometriose, vorzeitiger Gebärmutterkontraktion, mikrobiellen Infektionen, Gicht und der Behandlung des Typ II von Diabetes mellitus. Die Fänger der Erfindung können verwendet werden, um die toxischen Effekte abzumildern, die mit Endotoxin verbunden sind, z.B. durch die Aufrechterhaltung des Gefäßtonus und das Verhindern eines Mehrorgan-Systemschadens.
  • Ebenfalls beschrieben ist die Verwendung der Verbindungen für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Gedächtnisstörungen. Ohne hier durch die Theorie gebunden werden zu wollen, wird angenommen, dass Stickstoffmonoxid ein Neurotransmitter ist, der an der Potenzierung des Langzeitgedächtnisses beteiligt ist. Unter Verwendung eines EC-SOD-Knock out-Mausmodells kann gezeigt werden, dass eine Beeinträchtigung des Lernens mit einem verringerten Abfangen von Superoxid in den extrazellulären Räumen des Gehirns korreliert (siehe Beispiel XII). Ein reduziertes Abfangen resultiert in erhöhten Spiegeln an extrazellulärem O2 –. Man nimmt an, dass das 02 mit dem Stickstoffmonoxid reagiert und dadurch eine von Stickstoffmonoxid vermittelte Neurotransmission und somit eine Potenzierung des Langzeitgedächtnisses hemmt oder verhindert. Die Mimetika der Erfindung können verwendet werden, um Demenzerkranklungen und Gedächtnis-/Lern-Störungen zu behandeln.
  • Die Therapieschemata, einschließlich der Art der Verabreichung, die für die Durchführung der Behandlung der oben beschriebenen Zustände geeignet ist, können von einem Fachmann problemlos bestimmt werden.
  • Entzündungen, insbesondere Entzündungen der Lunge, sind der Behandlung unter Einsatz von Medikamenten, die unter Verwendung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, zugänglich (zu beachten sind hier insbesondere die entzündlich begründeten Störungen bei Asthma, ARDS einschließender Sauerstofftoxizität, Lungenentzündung (insbesondere mit AIDS in Zusammenhang stehende Lungenentzündung), Cystischer Fibrose, chronischer Sinusitis und Autoimmunerkrankungen (wie etwa rheumatoide Arthritis)). EC-SOD befindet sich in den Interstitialräumen, die die glatten Muskelzellen der Luftwege und der Gefäße umgeben. EC-SOD und O2 – vermitteln das antientzündliche/proentzündliche Gleichgewicht im alveolaren Septum. Das von den Zellen des alveolaren Septums freigesetzte NO· wirkt unterdrückend auf Entzündungen, solange es nicht mit O2 – reagiert, um ONOO– zu bilden. Durch das Abfangen von O2 – verschiebt EC-SOD das Gleichgewicht im alveolaren Septum von der Entzündung weg. Signifikante Mengen an ONOO– werden sich nur bilden, wenn die EC-SOD defizient ist oder wenn es eine massiv erhöhte Freisetzung von O2 – gibt. EC-SOD-Mimetika, wie die hier beschriebenen, können verwendet werden, um vor der durch Hypoxie erzeugten Zerstörung zu schützen. Geeignete Therapieschemata können von einem entsprechenden Fachmann problemlos erstellt werden.
  • Bestimmte Einzelheiten der vorliegenden Erfindung werden in den nun folgenden, nicht einschränkenden Beispielen in größerem Detail beschrieben.
  • Beispiel I
  • Erzeugung und Charakterisierung transgener Mäuse
  • Protokolle:
  • i) Konstruktion von transgenen Mäusen
  • Konstruktion des humanen EC-SOD-Expressionsvektors:
  • Der EC-SOD-Expressionsvektor (1) wurde wie folgt konstruiert: Das vollständige humane EC-SOD cDNA-Fragment (Hjalmarrson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6340 (1987); Hendrickson et al., Genomics 8:736 (1990)) mit flankierenden EcoRI-Restriktionsstellen wurde mit Mungobohnen-Nuklease umgesetzt, um glatte Enden zu erzeugen, mit Sal I-Linkern ligiert, mit Sal I verdaut und dann in die Sal I-Stelle des humanen β-Aktin-Expressionsvektors pHβApr-1 inseriert. Das EcoRI-HindIII-Fragment des resultierenden Plasmids, enthaltend den humanen β-Actinpromotor (zur Verfügung gestellt von Dr. Larry Kedes, University of Southern California, Los Angeles, Kalifornien), Intron, sowie EC-SOD-cDNA, wurde isoliert. Zusätzlich wurde die HpaI-Stelle von SV40 an Position 2666 in dem Plasmid pMSG (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, New Jersey) durch Linker-Ligation in eine HindIII-Stelle umgewandelt, und das HindIII-PstI-Fragment, das die Polyadenylierungsstelle der frühen SV40-Region enthält, wurde isoliert. Diese zwei DNA-Fragmente wurden dann an einen mit EcoRI plus PstI verdauten pKS-Vektor (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) ligiert. Das EcoRI-XbaI-Fragment, das das gesamte Expressionskonstrukt frei von Plasmidsequenzen enthält, wurde isoliert und dazu verwendet, um transgene Mäuse zu etablieren. Alle der rekombinanten DNA-Prozeduren wurden gemäß etablierter Verfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3, Cold Spring Harbor; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) durchgeführt.
  • Entwicklung transgener Mäuse:
  • Gereinigte DNA mit 2,5 μg/ml in 5 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, wurde in die Vorkerne (Pronuklei) befruchteter Eier injiziert, die aus Mäusen des Typs (C57BL/6 × C3H)F1 × (C57BL/6 × C3H)F1 isoliert worden waren. ((C57BL/6 × C3H)F1-Mäuse wurden von Charles River bezogen). Mauseier, die die Mikroinjektion überlebten, wurden dann in die Eileiter pseudoschwangerer Ammenmütter (CD1) eingesetzt (CD1-Mäuse wurden von Charles River bezogen), wobei man sich an die Prozeduren hielt, die von Hogan et al. (Hogan et al, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor; Cold Spring Harbor Laboratory 1986, 32) beschrieben worden waren. Mäuse, die das Transgen trugen, wurden mittels Southern Blot-Analyse von Schwanz-DNA, markiert mit der vollständigen humanen EC-SOD-cDNA, identifiziert. Es wurden transgene Gründertiere bei Durchtesten des ersten Wurfes ermittelt. Diese Mäuse wurden mit (C57BL/6 × C3H)F1 gekreuzt, um Nachkommen für weitere Studien zu erzeugen. (In allen folgenden Experimenten mit den transgenen EC-SOD-Mäusen beziehen sich die nicht-transgenen Mäuse auf Geschwistertiere der transgenen Mäuse, die das Transgen für die humane EC-SOD nicht enthalten. Bei den Versuchen, bei denen keine für EC-SOD transgenen Mäuse verwendet wurden, wurden wildtypische (C57BL/6 × C3H)F1-Tiere eingesetzt (siehe Beschreibung der Prozedur in Sambrook et al.).
  • Herstellung homozygoter für EC-SOD transgener Mäuse:
  • Homozygote transgene Mäuse wurden durch eine F1-Kreuzung heterozygoter transgener Mäuse produziert. Schwanz-DNA von F2-Mäusen wurde isoliert und mit RNase behandelt. Es wurden 10 μg an DNA von jeder Maus mit PstI geschnitten und dann über ein 1,2% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Es wurde dann eine Southern Blot-Analyse der Schwanz-DNA unter Sondenmarkierung mit der vollständigen humanen EC-SOD-cDNA durchgeführt. Die humane EC-SOD-cDNA zeigte keine Kreuzreaktion mit dem Maus-EC-SOD-Gen. Die Bandenintensität wurde visuell verglichen, um zu bestimmen, welche Mäuse homozygot, heterozygot oder negativ für das humane EC-SOD-Transgen waren.
  • ii) Charakterisierung der transgenen Mäuse
  • Northern Analyse:
  • Die transgenen Mäuse und ihre nicht-transgenen Geschwistertiere wurden mit einer Überdosis an Pentobarbital getötet. Die Gewebe wurden schnell entnommen und bis zur weiteren Bearbeitung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Es wurde dann gemäß Beschreibung (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) Gesamt-RNA mittels des CsCl-Verfahrens isoliert. Zwanzig μg an Gesamt-RNA aus den Geweben der transgenen Mäuse und der nicht-transgenen Geschwistertiere und eine RNA-Leiter wurden dann mit Glyoxal denaturiert, elektrophoretisch auf einem 1,2% Agarosegel aufgetrennt und gemäß Beschreibung (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) auf Nitrozellulose geblottet. Die Blots wurden dann mit vollständiger humaner EC-SOD-cDNA sondenmarkiert.
  • Auftrennung von SOD-Isoenzymen mittels Concanavalin A-Sepharose-Chromatographie:
  • Gewebe, die aus 3 Mäusen entnommen worden waren, wurden gewogen, dann vereint und in 10 Volumina an eiskaltem 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,4 mit 0,3 M KBr, 3 mM Diethylentriaminpentaessigsäure und 0,5 mM Phenylmethylsulfonyl-Fluorid homogenisiert. Die Abtrennung der EC-SOD von der CuZn-SOD und der Mn-SOD wurde durchgeführt, indem man die Gewebehomogenate gemäß Beschreibung (Marklund et al., Clin. Chim. Acta 126:4 (1982)) über eine Concanavalin A-Sepharosesäule leitete.
  • SOD-Aktivität:
  • Die EC-SOD-Aktivität und die gesamte, nach der Extraktion von EC-SOD verbleibende SOD-Aktivität (CuZn-SOD und Mn-SOD) wurde anhand der Inhibition der Cytochrom C-Reduktion bei pH 10 gemessen, wobei gemäß vorheriger Beschreibung (Crapo et al., Methods Enzymol. 53:382 (1978)) vorgegangen wurde. Das Gesamtprotein wurde mittels des BCA-Proteintests (Pierce, Rockford, IL) bestimmt. Die SOD-Aktivitäten wurden dann als Units/mg Gesamtprotein ausgedrückt.
  • Ergebnisse:
  • i) Transgene EC-SOD-Mäuse
  • Charakterisierung transgener Mäuse:
  • Mäuse, die das humane EC-SOD-Transgen tragen, wurden mittels Southern Blot-Analyse detektiert. Die Northern-Analyse verschiedener Gewebe der F1 bei einer Maus, die als Trägerin des Transgens ermittelt wurde, ist in 2 dargestellt. Hohe Spiegel des Transkripts humaner EC-SOD wurden im Herzen, Skelettmuskel und Gehirn transgener Mäuse detektiert, wogegen wenig oder kein Transkript in der Lunge, Leber und Milz beobachtet wurde. Bei den nicht-transgenen Geschwistertieren war kein Transkript detektierbar.
  • Durch Kreuzung zweier heterozygoter F1-Mäuse wurden homozygote Mäuse erzeugt. Die Detektion der homozygoten Mäuse erfolgte über die aufgefundenen, abweichenden Bandenintensitäten bei Anwendung der Southern Blot-Analyse auf gleiche Mengen an PstI-verdauter DNA der Nachkommen. Es wurde herausgefunden, dass die EC-SOD-Aktivität bei den Mäusen in Reaktion auf die Gesamt-Kopien des EC-SOD-Transgens zunahm (Tabelle I).
  • Tabelle I
  • EC-SOD-Aktivität in Geweben nicht-transgener, heterozygot transgener und homozygot transgener Mäuse. Für jede Messung wurden die Gewebe von 3 Mäusen vereint. Die Aktivität ist in Units/g Feuchtgewicht an Gewebe angegeben.
  • Figure 00380001
  • Beispiel II
  • Sauerstofftoxizität auf das zentrale Nervensystem
  • Protokolle:
  • Sauerstoffexpositionen:
  • 7–8 Wochen alte Mäuse wurden mit fünf Tieren zur selben Zeit in einer kleinen Tierkammer (Bethlehem, Pennsylvania) Überdruck-Sauerstoff ausgesetzt. Nach dem Spülen der Kammer mit reinem Sauerstoff erfolgte innerhalb von 5 Minuten eine Kompression auf 50 Meter (6 ATA). Die Sauerstoffkonzentration in der Kammer wurde kontinuierlich mittels eines Servomex-Sauerstoff-Analysators (Modell 572, Sybron, Norwood, Massachusetts) überwacht und auf ≥99% gehalten. Die Kohlendioxidkonzentration wurde anhand periodischer Proben des Kammergases mittels eines IR-Detektors (IR Industries, Santa Barbara, Kalifornien) analysiert, wobei man diese Konzentration nicht über 0,1% steigen ließ. Die Kammertemperatur wurde auf 25–26°C gehalten, dabei erhöhte die Sauerstoff-Kompression in der Kammer die Temperatur zwar vorübergehend auf 30–32°C, was jedoch von einem äußeren Kontrollsystem innerhalb von 3 Minuten wieder auf die normale Kammertemperatur eingestellt wurde.
  • Die Expositionen dauerten 25 bis 75 Minuten, gefolgt von einem Druckabbau für 5 Minuten. Die Mäuse wurden, vom Beginn der Exposition an bis 4 Stunden nach der Entnahme aus der Kammer kontinuierlich auf Zeichen von Sauerstofftoxizität hin beobachtet. Die Zeitspanne bis zur ersten generalisierten Konvulsion (Anfalls-Latenz) und die Zeitspanne bis zum Tod wurden aufgezeichnet. Diese Expositionsbedingungen sind so gestaltet, dass sie Sauerstofftoxizität im ZNS ohne merkliche Anzeichen pulmonaler Sauerstofftoxizität verursachen.
  • Behandlung mit Diethyldithiocarbamat:
  • Eine Stunde vor der Exposition gegenüber 6 ATA Sauerstoff wurde den Mäusen über i.p.-Injektion entweder 0,008 cc/g Saline oder 400 mg/kg Diethyldithiocarbamat, gelöst in normaler Saline (0,008 cc/g), verabreicht. Die Mäuse wurden dann gemäß obiger Beschreibung für 25 Minuten 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt.
  • Um das Ausmaß der EC-SOD- und CuZn-SOD-Inhibition durch Diethyldithiocarbamat zu bestimmen, wurde den Mäusen Diethyldithiocarbamat verabreicht, wonach sie eine Stunde später getötet wurden. Die Gehirne wurden entnommen und gemäß obiger Beschreibung auf die Aktivität von EC-SOD und CuZn-SOD hin getestet.
  • Behandlung mit β-Mercaptoethanol:
  • Eine Stunde vor der Exposition gegenüber 6 ATA Sauerstoff erhielten Mäuse i.p.-Injektionen entweder mit 0,008 cc/g Saline oder 180 mg/kg β-Mercaptoethanol (0,008 cc/g). Diese Dosis an β-Mercaptoethanol wurde ausgewählt, da sie eine gleichwertige Anzahl reduzierender Thiole enthält wie die Dosis an Diethyldithiocarbamat. Die Mäuse wurden dann gemäß obiger Beschreibung für 30 Minuten 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt.
  • Behandlung mit N-ϖ-Nitro-L-Arginin, einem Inhibitor der Stickstoffmonoxidsynthase:
  • Zehn Minuten vor Beginn der Druckbehandlung wurde den transgenen und nicht-transgenen Mäusen 0,008 cc/g Saline oder 20 mg/kg (0,008 cc/g) N-ϖ-Nitro-L-Arginin, gelöst in sterilem Wasser, i.p. verabreicht. Die Mäuse wurden dann für 25 oder 75 Minuten gemäß obiger Beschreibung 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt.
  • Statistische Analyse:
  • Es wurde ein gepaarter Student-T-Test verwendet, um die Enzymaktivitäten in transgenen und nicht-transgenen Mäusen zu vergleichen. Ein χ2-Test mit Bonferroni-Korrektur wurde verwendet, um die Signifikanz bei den Unterschieden des Überlebens bei den Überdruck-Expositionen zu bestimmen. Die Analyse der Varianz mittels eines Scheffe F-Tests wurde verwendet, um die Unterschiede der Anfalls-Latenzzeit bei den verschiedenen Mäusegruppen zu vergleichen.
  • Ergebnisse:
  • Überdruck-Sauerstoffexpositionen:
  • Um die Auswirkungen gesteigerter EC-SOD-Spiegel im Gehirn auf die Sauerstofftoxizität im ZNS zu testen, wurden sowohl transgene als auch nicht-transgene Mäuse (siehe Beispiel I) für 25 Minuten 6 ATA Sauerstoff ausgesetzt. Die transgenen Mäuse waren gegenüber der ZNS-Sauerstofftoxizität empfindlicher (83% Mortalität) als die nicht-transgenen Mäuse (33% Mortalität) (3).
  • Transgene und nicht-transgene Mäuse wurden nachfolgend mit einem Inhibitor der CuZn-SOD, Diethyldithiocarbamat, behandelt, um zu bestätigen, dass die gesteigerte Empfindlichkeit der transgenen Mäuse gegenüber ZNS-Sauerstofftoxizität das Ergebnis der gesteigerten SOD-Aktivität war. Sowohl bei transgenen als auch bei nicht-transgenen Mäusen resultierte die Behandlung mit 400 mg/kg an Diethyldithiocarbamat in einer 80%igen Inhibition der EC-SOD und in einer 60%igen Inhibition der CuZn-SOD im Gehirn. Dies stimmt mit vorherigen Beobachtungen überein (Frank et al, Biochem. Pharmacol. 27:251 (1978); Heikkila et al, J. Biol. Chem. 251:2182 (1976)). Die Behandlung mit Diethyldithiocarbamat verlieh sowohl transgenen als auch nicht-transgenen Mäusen eine gesteigerte Resistenz gegenüber ZNS-Sauerstofftoxizität. Die Überlebensrate stieg auf 100% bei den transgenen Mäusen und auf 93% bei den nicht-transgenen Mäusen (3). Das Einsetzen der Anfälle verzögerte sich ebenfalls vierfach bei den mit Diethyldithiocarbamat behandelten Mäusen (4).
  • Um zu bewerten, ob Diethyldithiocarbamat nicht eher dadurch vor der ZNS-Sauerstofftoxizität schützt, indem es als ein Reduktionsmittel anstatt als Inhibitor der SOD-Aktivität fungiert, wurden die Mäuse mit einer äquimolaren Menge an reduzierenden Thiolen in Form von β-Mercaptoethanol behandelt und dann Überdruck-Sauerstoff ausgesetzt. 5 zeigt, dass β-Mercaptoethanol nicht vor der ZNS-Sauerstofftoxizität schützt.
  • Eine Möglichkeit, die erklären könnte, warum EC-SOD die ZNS-Sauerstofftoxizität verschlimmert, könnte darin liegen, dass Stickstoffmonoxid ein Mediator der ZNS-Sauerstofftoxizität ist und die EC-SOD Stickstoffmonoxid vor der Superoxid-vermittelten Inaktivierung schützt. Um die Hypothese zu testen, dass Stickstoffmonoxid zu der ZNS-Sauerstofftoxizität beiträgt, wurden wildtypische (C57BL/6 × C3H)F1-Mäuse mit einem Inhibitor der Stickstoffmonoxidsynthase, N-ϖ-Nitro-L-Arginin, behandelt. 6 zeigt die Wirkungen von N-ϖ-Nitro-L-Arginin auf die Anfalls-Latenz bei Mäusen. Die Vorbehandlung mit N-ϖ-Nitro-L-Arginin resultierte in einer signifikanten Zunahme der Anfalls-Latenzzeit (13,50 ± 5,6 min) im Vergleich zu den mit Saline behandelten Mäusen (2,75 ± 1 min). 7 zeigt, dass die Inhibition der Stickstoffmonoxidsynthase auch die Überlebensrate nach der Exposition gegenüber Überdruck-Sauerstoff signifikant erhöhte. Mäuse, denen der Inhibitor der Stickstoffmonoxidsynthase verabreicht worden war, zeigten 50% Mortalität nach 90 Minuten Exposition gegenüber 6 ATA Sauerstoff, und eine Mortalität von 100% wurde nicht unterhalb einer 2-stündigen derartigen Exposition erreicht. Mit Saline behandelte Mäuse dagegen zeigten bereits nach nur 25 Minuten der Exposition eine 50%ige Mortalität, wobei eine Mortalität von 100% bereits nach 30 Minuten bei 6 ATA Sauerstoff erreicht wurde. 8 zeigt, dass die prozentuale Überlebensrate unter Überdrucksauerstoff von der verabreichten Dosis des Inhibitors abhängig war. Der von diesem kompetitiven Inhibitor der Stickstoffmonoxidsynthase verliehene Schutz konnte aufgehoben werden, wenn ein Überschuss an L-Arginin verabreicht wurde (6 und 9).
  • Die Wirkungen des Stickstoffmonoxidsynthase-Inhibitors N-ϖ-Nitro-L-Arginin auf die ZNS-Sauerstofftoxizität wurden dann bei den transgenen Mäusen untersucht. Diese Behandlung verminderte die ZNS-Sauerstofftoxizität sowohl bei den transgenen als auch bei den nicht-transgenen Mäusen dramatisch. Das Überleben bei einer 25-minütigen Exposition gegenüber 6 ATA Sauerstoff stieg bei beiden Gruppen auf 100% (3). Die Anfalls-Latenz verzögerte sich ebenfalls signifikant (4). Die Expositionsdauer wurde dann auf 75 Minuten erhöht, um zu untersuchen, ob die transgenen Mäuse noch immer empfindlicher gegenüber Überdruck-Sauerstoff waren als die nicht-transgenen Mäuse. Die Ergebnisse in 10 zeigen, dass die Behandlung mit N-ϖ-Nitro-L-Arginin den Unterschied in der Empfindlichkeit beseitigte, der bei der 25-minütigen, in 3 dargestellten Exposition zwischen den unbehandelten transgenen und nicht-transgenen Mäusen beobachtet wurde.
  • Beispiel III
  • Kälte-induziertes Hirnödem
  • Protokolle:
  • Verletzungsmodell:
  • Junge (6–7 Wochen alte) Mäuse (siehe Beispiel I) wurden mit 60 mg/kg Pentobarbital (Nembutal, Abbott Laboratories, Chicago, Illinois) betäubt. Es wurde dann ein Einschnitt in die Kopfhaut vorgenommen und ein Stahlstab (20 cm Länge, 3 mm Durchmesser), der in flüssigem Stickstoff äquilibriert worden war, und zwar in einem 8 cm-Bad mit flüssigem Stickstoff 4 cm vom Stabende, wurde für 30 Sekunden auf den Schädel über der rechten Gehirnhemisphäre aufgebracht. Der Hauteinschnitt wurde dann genäht.
  • Zwei Stunden nach der Verletzung erhielten die Mäuse eine weitere Dosis an Pentobarbital. Der Brustraum wurde geöffnet, die Lungen entnommen, und die Mäuse wurden dann über den linken Ventrikel des Herzens mit 20 ml Saline perfundiert. Das Gehirn wurde dann entnommen und das Cerebellum ausgeschnitten. Die rechte (R) und linke (L) Gehirnhemisphäre wurden getrennt und unverzüglich gewogen (Feuchtgewicht, W). Jede Hälfte wurde dann bei 70°C für 2–3 Tage in einem Heißluftofen getrocknet, bis ein konstantes Gewicht erreicht wurde (Trockengewicht, D). Der Index des Ödems (I) wurde dann, wie in Gleichung 13 gezeigt, berechnet. I = (W/D R – W/D L)/(W/D L) × 100 [13]
  • Diese Berechnung ermöglichte es, die linke Gehirnhemisphäre als interne Kontrolle für die verletzte rechte Gehirnhemisphäre bei jeder Maus zu verwenden.
  • Chemische Behandlungen:
  • Es wurden sechs Gruppen von Experimenten durchgeführt, um die Bedeutung von extrazellulärem Superoxid, Eisen und Stickstoffmonoxid bei dem Kälteinduzierten Hirnödem zu untersuchen. Bei allen Gruppen wurden die Arzneistoffe in Saline gelöst und mit 0,008 cc/g 15 Minuten vor der Kälte-Verletzung injiziert. Bei Gruppe 1 wurde die Ödembildung bei den EC-SOD-transgenen Mäusen mit der Ödembildung bei den nicht-transgenen Geschwistertieren verglichen. Bei Gruppe 2 erfolgte der Vergleich der Ödembildung zwischen den wildtypischen (C57BL/6 × C3H)F1-Mäusen, die mit Saline behandelt worden waren, und den (C57BL/6 × C3H)F1-Mäusen, die mit 0,33 mg/g an Deferoxamin (0,51 μmol/g) behandelt worden waren. Gruppe 3 verglich (C57BL/6 × C3H)F1-Mäuse, die mit Saline behandelt worden waren, mit (C57BL/6 × C3H)F1-Mäusen, die mit 0,51 μmol/g an Fe3+-gesättigtem Deferoxamin behandelt worden waren. Gruppe 4 bestand aus (C57BL/6 × C3H)F1-Mäusen, die mit Saline behandelt worden waren, und (C57BL/6 × C3H)F1-Mäusen, die mit 0,02 mg/g an N-ϖ-Nitro-L-Arginin-Methylester behandelt worden waren. Gruppe 5 bestand aus (C57BL/6 × C3H)F1-Mäusen, die mit Saline behandelt worden waren, und (C57BL/6 × C3H)F1-Mäusen, die mit 0,02 mg/g an N-ϖ-Nitro-L-Arginin-Methylester plus 0,05 mg/g an L-Arginin behandelt worden waren. Gruppe 6 verglich die Ödembildung zwischen den nicht-transgenen Mäusen, EC-SOD-transgenen Mäusen, die mit Saline behandelt worden waren, und EC-SOD-transgenen Mäusen, die mit 0,02 mg/g an N-ϖ-Nitro-L-Arginin-Methylester behandelt worden waren.
  • Mit Eisen gesättigtes Deferoxamin wurde hergestellt, indem man äquimolare Mengen an Deferoxamin und dann Eisen(III)chlorid in Saline löste. Die Sättigung des Deferoxamins mit dem Eisen(III)-Ion wurde spektrophotometrisch durch Messen der Extinktion bei 425 nm (ε = 2500 M–1 cm–1 für Fe3+-Deferoxamin) (Monzyk und Crumbliss, J. Amer. Chem. Soc. 104:4921 (1982)) bestimmt.
  • Behandlung mit Evan's Blau:
  • Eine Stunde und 50 Minuten nach der Kälteverletzung wurden 5 ml/kg an 1 % Evan's Blau in Saline in die Femoralarterie der transgenen und nicht-transgenen Mäuse injiziert. Die Mäuse wurden 10 Minuten später getötet. Die Lungen wurden dann herausgeschnitten und die Mäuse über den linken Ventrikel mit normaler Saline perfundiert, bis keine blaue Farbe mehr in der ausfließenden Lösung war. Die Gehirne wurden dann entnommen und photographiert.
  • Statistische Analyse:
  • Es wurde ein gepaarter Student T-Test verwendet, um die Signifikanz der Ödementwicklung im Vergleich zu den nicht-transgenen Mäusen oder den mit Saline behandelten Mäusen für jede der getesteten Gruppen zu bestimmen. Es wurde eine Varianz-Analyse mittels eines Fisher PLSD-Tests verwendet, um die Signifikanz innerhalb Gruppe 6 zu vergleichen. P-Werte von unter 0,05 wurden als signifikant bewertet.
  • Tabelle III
  • Auswirkung der Inhibition der Stickstoffmonoxidsynthese auf die Ödembildung nach Kälteinduzierter Hirnverletzung. Wildtypische (C57BL/6 × C3H)F1-Mäuse wurden mit dem kompetitiven Inhibitor der Stickstoffmonoxidsynthase, N-ϖ-Nitro-L-Arginin-Methylester (LNAME), behandelt, um zu bestimmen, welche Auswirkung Stickstoffmonoxid auf gefäßbedingte Ödeme hat. Es wurde außerdem N-ϖ-Nitro-L-Arginin-Methylester plus einem Überschuss an L-Arginin (LNAME + L-Arg) an Mäuse verabreicht, um zu prüfen, ob die Wirkungen, die bei LNAME alleine zu sehen sind, aufgehoben werden können. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler angegeben.
    Figure 00430001
    • *p<0,05 beim Vergleich mit dem Odem-Index der entsprechenden, mit Saline behandelten Kontrollen unter Verwendung eines gepaarten Student-T-Tests.
  • Bei den letzten Versuchen wurden transgene EC-SOD-Mäuse entweder mit Saline oder mit N-ϖ-Nitro-L-Arginin-Methylester behandelt, um zu bestimmen, ob es einen additiven Effekt bei der Verhinderung der Ödembildung bei Mäusen gibt, die sowohl erhöhte Spiegel an EC-SOD aufweisen als auch den Inhibitor der Stickstoffmonoxidsynthase. Die Tabelle IV zeigt, dass bei Verabreichung des Inhibitors der Stickstoffmonoxidsynthase an transgene EC-SOD-Mäuse im Verhältnis zu den transgenen Mäusen, die nur durch erhöhte Spiegel an EC-SOD im Gehirn geschützt sind, kein additiver Schutz gegen die Ödembildung detektiert wird.
  • Tabelle IV
  • Evaluierung des Effekts der Inhibition der Stickstoffmonoxidsynthese auf die Ödembildung bei transgenen Mäusen. Vergleich der Ödembildung bei nicht-transgenen Mäusen mit der Ödembildung bei transgenen Mäusen mit erhöhten Spiegeln an Hirn-EC-SOD-Aktivität und mit der Ödembildung bei transgenen Mäusen, die 15 Minuten vor der Kälte-induzierten Verletzung mit einem Inhibitor der Stickstoffmonoxidsynthese behandelt wurden (20 mg/kg N-ϖ-Nitro-L-Arginin; Transgen + LNAME). Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardfehler angegeben und wurden unter Verwendung einer Varianzanalyse mittels eines Fisher PLSD-Tests verglichen. Es war kein signifikanter Unterschied zwischen den transgenen Mäusen und den transgenen + LNAME Mäusen zu erkennen.
    Figure 00440001
    • *p<0,05 im Vergleich zu dem Odem-Index bei nicht-transgenen Mäusen.
  • Beispiel IV
  • Immunlokalisierung von EC-SOD
  • Protokolle:
  • Humane Lunge:
  • Es wurden fünf humane Lungenproben erhalten, um die Verteilung von EC-SOD in humanem Lungengewebe zu bewerten. Eine Probe wurde von einem chirurgischen Pathologie-Präparat des rechten oberen Lappens erhalten, entnommen bei einer 43 Jahre alten, weißen Frau mit einer Rauchergeschichte von 50 Packungen im Jahresbezug (entsprechend einer Packung pro Tag für ein Jahr) und einem vereinzelt stehenden Knoten, der beim Röntgen des Brustkorbs gefunden wurde. Bei der Patientin wurde die Diagnose auf Schuppenzellkarzinom gestellt. Bei den hier dargestellten Studien wurde Gewebe aus einer Region, die nicht an dem Karzinom aus diesem Lappen beteiligt war, verwendet. Eine zweite Lunge wurde aus einer chirurgischen Pathologie-Probe des rechten oberen Lappens erhalten, entnommen bei einem 51 Jahre alten weißen Mann mit einer Rauchergeschichte von 60 Packungen im Jahresbezug, bei dem bei der Röntgenuntersuchung ein isolierter Knoten gefunden wurde. Der Patient hatte keine anderen Krankheiten; die Diagnose lautete auf Schuppenzellkarzinom. Lungengewebe, das nicht am Karzinom aus dieser Probe beteiligt war, wurde für die Lokalisation der EC-SOD verwendet. Eine dritte Lunge wurde aus einer Schnellautopsie (Gewebe 6 Stunden nach dem Tod entnommen) von einem 66 Jahre alten weißen Mann mit Demenz, jedoch ohne Rauchergeschichte oder Lungenkrankheit, erhalten. Die vierte untersuchte Lunge wurde aus überschüssigem Lungengewebe einer Lunge erhalten, die für den Empfänger einer Lungentransplantation zu groß war. Die Lunge stammte von einer 45 Jahre alten weißen Frau ohne Rauchergeschichte oder Lungenerkrankung. Die fünfte bei diesen Studien untersuchte Lunge stammte ebenfalls aus überschüssigem Lungengewebe, das für die Lungentransplantation vorgesehen war und aus einem 39 Jahre alten weißen Mann ohne Rauchergeschichte oder Lungenerkrankung stammte. Bemerkenswerter Weise wurden keine Unterschiede der Markierungsmuster zwischen den chirurgischen Pathologieproben bzw. den Autopsiegeweben von den Spendern für die Lungentransplantation beobachtet.
  • Die Gewebe wurden in 2% Paraformaldehyd/0,2% Glutaraldehyd in 0,01 M Phosphatgepufferter Saline (PBS; 1,2 g NaH2PO4, 8 g NaCl, 0,2 g KCl, pro 1 Liter, pH 7,3) für 1 Stunde fixiert, gefolgt von einer Übernacht-Fixierung in 4% Paraformaldehyd bei 4°C und dann in einer O.C.T.-Verbindung. Die Gewebe wurden in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Hexan eingefroren und bei –70°C gelagert, bis sie für lichtmikroskopische Studien zerlegt wurden.
  • Für elektronenmikroskopische Studien wurden die Lungengewebe bis zu der Äquilibrierung in Sucrose wie bei den lichtmikroskopischen Studien weiterverarbeitet. Nach der Äquilibrierung in Sucrose wurden die Lungengewebe für 10 Minuten bei 37°C mit 10% Gelatine infiltriert. Die Gewebescheiben in Gelatine wurden dann auf Eis verfestigt, in Würfel mit 2 mm/Seite geschnitten und dann über Nacht einem Gefrierschutz in 4% Polyvinylalkohol mit 2 M Sucrose unterzogen. Diese Proben wurden dann auf Kontrollstreifen aufgebracht, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und schließlich in flüssigem Stickstoff gelagert, bis sie für die elektronenmikroskopischen Studien zerlegt wurden.
  • Charakterisierung von Antikörper gegen humane rekombinante EC-SOD:
  • Humane rekombinante EC-SOD (zur Verfügung gestellt von S.L. Marklund, Umea, Schweden; Tibell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6634 (1987)) und der 20.000 × g-Überstand eines humanen Lungenhomogenisats wurden in Gegenwart von β-Mercaptoethanol und Natriumdodecylsulfat denaturiert, indem man sie für 5 Minuten kochte und dann eine Elektrophorese durch ein 12% Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat durchführte. Das Protein wurde dann elektrophoretisch auf Nitrozellulose übertragen. Der Blot wurde dann mit 4,3 μg/ml einer mittels Affinitätschromatographie an rh-EC-SOD gereinigten IgG-Fraktion aus Kaninchen-anti-rh-EC- SOD (zur Verfügung gestellt von S.M. Marklund, Umea University Hospital, Umea, Schweden) inkubiert, gefolgt von der Inkubation mit 125I-Protein A und Autoradiographie.
  • Absorption von anti-EC-SOD IgG:
  • Man ließ CNBr-aktivierte Sepharose in PBS quellen. Das gequollene Gel wurde so mit PBS gemischt, dass das abgesetzte Gel 50% des Volumens einnahm. Das Gel wurde suspendiert und 100 μl wurden mit 100 μg reiner rh-EC-SOD für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter sanfter Bewegung gemischt. Das Gel wurde dann 4-mal mit PBS + 1 % Rinderserum-Albumin (BSA) gewaschen und ergab mit PBS + 1 % BSA 100 μl. Es wurden dann 100 μl an Kaninchen-anti-rh-EC-SOD mit der zweifachen Konzentration, wie sie bei der Immunmarkierung verwendet wurde, hinzugegeben, gefolgt von 2-stündigem Mischen bei Raumtemperatur und unter sanfter Bewegung. Es wurde dann IgG aus nicht immunisierten Kaninchen in einer Konzentration zu dem Überstand hinzugegeben, die der vorhergesagten Konzentration des anti-rh-EC-SOD-IgG entsprach, die durch die Prozedur entfernt wurde. Dieser Überstand wurde dann für die nachfolgende Immunmarkierung verwendet.
  • Lichtmikroskopische Immunhistochemie:
  • 4 μm Serienschnitte von in O.C.T. eingebettetem Gewebe wurden auf einem Cryostat bei –20°C geschnitten und auf mit poly-L-Lysin beschichtete Objektträger (3 Schnitte pro Objektträger) gelegt. Die Schnitte wurden bei –70°C gelagert, bis die Markierung erfolgte. Die Schnitte wurden dann für EC-SOD markiert, wobei ein indirektes Immunoperoxidase-Verfahren (Milde et al., J. Histochem. Cytochem. 37:1609 (1989); Randell et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 4:544 (1991)) mit einem biotinylierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG und Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (Jackson, ImmunoResearch Laboratories (West Grove, Pennsylvania)) verwendet wurde (Tabelle V). Um die Hintergrund-Färbung zu vermindern, wurden die Schnitte in 1 % H2O2 in Methanol inkubiert, um endogene Peroxidasen zu inaktivieren und in 10 mM Borhydrid, um Aldehyde zu blocken. Unspezifische Bindungen wurden durch die Inkubation mit 5% Ziegennormalserum (NGS), 5% Milch und 1 % BSA in PBS blockiert. Die optimalen Verdünnungen des primären und sekundären Antikörpers wurden empirisch bestimmt und erfolgten in PBS mit 1 % Milch plus 1 % BSA (Milch war nicht in der Streptavidin-Lösung enthalten). Die Scheiben wurden unter Verwendung von Diaminobenzidin (10 mg Diaminobenzidin, 50 ml 0,05 M Tris·Cl, pH 7,6, 100 μl 3% H2O2) entwickelt und mit 1 % Methylgrün gegengefärbt. Als Kontrolle wurden Serienschnitte separat entweder mit Kaninchen-anti-rh-EC-SOD (EC-SOD), IgG aus nicht immunisierten Kaninchen oder Kaninchen-anti-rh-EC-SOD, aus dem das EC-SOD-bindende IgG herausgezogen worden war (EC-SOD absorbiert; siehe oben), markiert.
  • Tabelle V
  • Färbeprozeduren für die lichtmikroskopische Immunhistochemie. Alle Inkubationen erfolgten in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur.
  • Figure 00470001
  • Elektronenmikroskopische Immunzytochemie:
  • Ultradünne Gefrierschnitte (70 nm) von humanem Lungengewebe wurden mit Kaninchen-anti-rh-EC-SOD und 10-nm Protein A-Gold gemäß vorheriger Beschreibung (Crapo et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:10405 (1992)) immunmarkiert (Tabelle VI). Kurz dargestellt wurden die Schnitte zuerst 3-mal für 5 Minuten bei Raumtemperatur in 0,15% Glycin in PBS inkubiert, um die Aldehydgruppen zu blocken. Unspezifische Bindungen wurden weiterhin durch Inkubation in 1 % BSA in PBS für 10 Minuten geblockt. Die Verdünnungen des primären und sekundären Antikörpers wurden empirisch bestimmt und erfolgten in PBS mit 1% BSA. Die Schnitte wurden gemäß vorheriger Beschreibung (Crapo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10405 (1992)) mit Uranyloxalat und mit Uranylacetat in Methylcellulose gefärbt. Die Kontrollgruppen entsprachen denen, die oben für die Lichtmikroskopie beschrieben worden sind.
  • Tabelle VI
  • Färbeprozeduren für die elektronenmikroskopische Immunhistochemie. Alle Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur.
  • Figure 00480001
  • Ergebnisse:
  • Charakteristika des EC-SOD-Antikörpers:
  • Der Antikörper gegen rh-EC-SOD wurde mittels Western Blot-Analyse der rh-EC-SOD und eines humanen Lungenhomogenisats charakterisiert. 13 zeigt, dass der Antikörper sowohl mit der EC-SOD Typ C-Untereinheit (obere Bande) als auch mit der Typ A-Untereinheit (untere Bande) in einem humanen Lungenhomogenisat reagiert (siehe hierzu Sandström et al, Biochem. J. 267:18205 (1992)). Die Typ A-Untereinheit kommt in vivo nicht im Interstitium von Geweben vor (Sandström et al., Biochem. J. 290:623 (1993)). Der Antikörper reagierte mit drei Banden in der Spur, die gereinigte Typ C rh-EC-SOD enthält. Die zwei Spezies mit dem niedrigsten Molekulargewicht in 13 sind durch teilweise, unzureichende Glykosylierung der rh-EC-SOD in den stark überproduzierenden CHO-Zellen bedingt.
  • Lichtmikroskopische Immunhistochemie:
  • Unter Verwendung eines Antikörpers gegen die rh-EC-SOD wurde dieses Protein in der menschlichen Lunge immunlokalisiert. Die lichtmikroskopische Immunhistochemie zeigte, dass EC-SOD hauptsächlich mit der Bindegewebsmatrix um die Gefäße und Luftwege in der Lunge verbunden ist (14a und b, 15a, b und c). EC-SOD wurde in enger Nähe zu den zu Gefäßen und Luftwegen gehörenden glatten Muskeln gefunden (14a und b und 15a). EC-SOD wurde auch im Bindegewebe der alveolaren septalen Spitzen (15c) beobachtet, was eine Affinität von EC-SOD für die Bindegewebsmatrix nahelegt. Es wurde keine Färbung in Zusammenhang mit den vaskulären Endothelzellen bei den großen elastischen Arterien, den Gefäßen mittlerer Größe oder den Kapillaren beobachtet (14a und b). Bemerkenswerter Weise fehlte die EC-SOD an den Epithelzellobertlächen der Luftwege (15a und b); ebenso fehlte sie im Knorpel (15a).
  • Der Antikörper gegen EC-SOD war ein polyklonaler IgG-Kaninchen-Antikörper, der unter Verwendung von rh-EC-SOD affinitätsgereinigt worden war. Um die Spezifität der Markierung für EC-SOD zu testen, wurde das IgG, das für EC-SOD spezifisch war, unter Verwendung von reiner, an Cyanogen-Bromid-Sepharose gebundener rh-EC-SOD aus dem Antiserum herausgezogen. Es wurde dann IgG aus nicht immunisierten Kaninchen zu diesem absorbierten Antikörperansatz hinzugegeben, und zwar in einer Menge, die hinreichend war, das absorbierte IgG zu ersetzen. Die Markierung von Lungengeweben mit dieser prä-absorbierten Antikörperpräparation resultierte im Fehlen der Markierung in allen Gebieten der Lunge, einschließlich des pulmonalen Gefäßsystems (14c). Die Markierung des Lungengewebes mit Nicht-Immun-IgG alleine resultierte ebenfalls in einem Fehlen der Färbung in allen Bereichen der Lunge. Diese Kontrollen zeigen, dass die bei dem primären Antikörper beobachtete Färbung spezifisch für die EC-SOD in der Lunge ist.
  • Elektronenmikroskopische Immunzytochemie:
  • Eine Zusammenfassung der Markierung für die EC-SOD in der Lunge, die unter Verwendung der elektronenmikroskopischen Immunzytochemie aufgefunden wurde, ist in Tabelle VII dargestellt. EC-SOD war in allen Regionen der Lunge hauptsächlich mit Proteinen der extrazellulären Matrix assoziiert. Insbesondere wurde ein hohes Maß an Färbung in Gebieten gesehen, die reich an Typ I-Collagen waren (16), sowie im Zusammenhang mit anderen, nicht-identifizierten Proteoglykanen in der extrazellulären Matrix (17). Bemerkenswerter Weise wurde keine Markierung für EC-SOD in Elastin-reichen Gebieten beobachtet (16). Ein hohes Maß an Färbung wurde nahe der Oberfläche glatter Muskelzellen und in der Bindegewebsmatrix, die die glatten Muskelzellen an Gefäßen (17) und Luftwegen umgibt, gefunden. Bemerkenswerter Weise fehlte eine Färbung an der Oberfläche der Endothelzellen an kleinen, mittleren und großen Gefäßen (18a und b). Das Fehlen der Endothelzellfärbung, die bei der lichtmikroskopischen Immunhistochemie gefunden wurde, unterstützt die elektronenmikroskopischen Ergebnisse. Eine Markierung von EC-SOD wurde auch im Plasma im Lumen der Blutgefäße beobachtet (18a). Die Lokalisierung der EC-SOD im Plasma wurde erwartet, da dieses Protein zuerst im Plasma entdeckt wurde (Marklund, Acta Physiol. Scand., 5492:19 (1980)). Eine Markierung für EC-SOD wurde in den interzellulären Verbindungen zwischen den bronchialen Epithelzellen (19) beobachtet, fehlte jedoch an der apikalen Oberfläche dieser Zellen. Schließlich fehlte die EC-SOD-Markierung an der Oberfläche von Typ I und Typ II-Zellen. Eine moderate, jedoch konsistente Menge an intrazellulärer EC-SOD fand sich in Typ II-Epithelzellen und in bronchialen Epithelzellen (19).
  • Tabelle VII
  • Verteilung von EC-SOD in der menschlichen Lunge. (+) zeigt das Vorliegen von Markierung für EC-SOD, und (–) zeigt eine fehlende Markierung für EC-SOD. (±) zeigt Gebiete, in denen niedrige Mengen an Markierung für EC-SOD in nicht konsistenter Weise beobachtet wurden.
  • Figure 00500001
  • Kontrollen, die dadurch erfolgten, dass man den für EC-SOD spezifischen Antikörper aus dem primären Antikörperansatz herauszog und diesen absorbierten Antikörper durch IgG aus nicht immunisierten Kaninchen ersetzte, führten zum Fehlen von Markierung in allen Gebieten der Lunge einschließlich Regionen, die reich an Typ 1-Collagen waren, wie in 16c zu sehen ist. Zusätzlich führte die Verwendung von IgG aus nicht immunisierten Kaninchen anstelle des primären Antiserums ebenfalls zum Fehlen von Markierung in allen Gebieten der Lunge. Das Fehlen der Markierung bei diesen Kontrollen zeigt, dass die bei dem primären Antiserum beobachtete Markierung spezifisch für EC-SOD in der Lunge ist.
  • Die Lokalisierung von EC-SOD an der Oberfläche glatter Muskelzellen und in der extrazellulären Matrix um diese Zellen sowohl bei Blutgefäßen als auch bei Luftwegen zeigt, dass EC-SOD an diesen Positionen eine wichtige Funktion haben könnte. Es ist bekannt, dass Superoxid schnell mit Stickstoffmonoxid reagiert und dessen Eigenschaften als Relaxans glatter Muskeln inaktiviert. Daher sollte die Anwesenheit von EC-SOD entlang des Diffusionswegs von Stickstoffmonoxid zu glatten Muskelzellen die Halbwertszeit dieses kurzlebigen interzellulären Botenmoleküls in dieser speziellen Region erhöhen und somit dessen Wirksamkeit als gefäßennreiterndes Mittel steigern. Die starke Markierung für EC-SOD, die um die vaskulären und zu den Luftwegen gehörenden glatten Muskelzellen beobachtet wird, zeigt eine Funktion für EC-SOD als Mediator der Stickstoffmonoxidaktivität bei der Aufrechterhaltung niedriger pulmonaler Gefäßdrücke und eines niedrigen Luftwegswiderstandes.
  • Zusätzlich zu der Markierung von EC-SOD in Verbindung mit glatten Muskelzellen scheint EC-SOD außerdem eine starke Co-Lokalisierung mit Typ I-Collagen aufzuweisen. Es ist zuvor für Collagen gezeigt worden, dass dieses empfindlich ist gegenüber dem Angriff durch reaktive Sauerstoffspezies, wie etwa dem Superoxidanion. Zusätzlich könnte das Superoxidanion dazu in der Lage sein, latente Collagenasen aus polymorphkernigen Leukozyten (PMN) zu aktivieren, was zu einem weiteren Collagenabbau führen kann. Da für Collagenfragmente gezeigt wurde, dass diese chemoattraktiv und aktivierend auf PMNs wirken, könnte jede Steigerung der Produktion von Superoxid, die in Collagenabbau resultiert, entzündliche Reaktionen und Gewebezerstörung durch die Rekrutierung und Aktivierung von PMNs beschleunigen. Folglich könnte die Assoziation von EC-SOD mit Collagen wichtig dafür sein, einen Superoxidvermittelten Abbau von Collagen zu verhindern und daher ein Mittel darstellen, um Entzündungsantworten zu kontrollieren.
  • Beispiel V
  • (nur als Bezugnahme)
  • Humanes EC-SOD-Gen
  • Protokolle:
  • Materialien und Radiochemikalien:
  • [α-35S]dATP (~1400 Ci/mmol), [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol) und [α-35P]CTP (800 Ci/mmol) wurden bei New England Nuclear erworben. Humane genomische DNA, T7-, T3- und SPS-RNA-Polymerase, RNasin und das Plasmid pGEM3Zf(+) wurden von Promega Biotec erhalten. Das Sequenase Sequenzierkit (V 2.0) stammte von der United States Biochemicals Corporation. Humane poly(A+)-RNA wurde von Clontech erworben. SeaPlaque GTG-Agarose stammte von FMC BioProducts. Die Restriktionsenzyme stammten von New England Biolabs. Alle anderen verwendeten Reagenzien entsprachen molekularbiologischem Reinheitsgrad. Die Oligonukleotide wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems 380B oder 392 von der Duke University, Abteilung für Botanik, Einrichtung für DNA-Synthese, synthetisiert. Die geladenen Nylonmembranen (GeneScreen Plus) stammten von DuPont.
  • Humaner Northern Blot oder Analyse:
  • Zwei μg an poly(A+)-RNA wurden aus acht verschiedenen menschlichen Geweben gereinigt. Diese mRNAs wurden einer Elektrophorese auf einem denaturierenden, Formaldehyd enthaltenden 1,2% Agarosegel unterzogen und auf eine ladungsmodifizierte Nylonmembran übertragen, gefolgt von einer Fixierung mittels UV-Bestrahlung. Die Membran wurde in 50% Formamid, 0,25 M NaPO4 (pH 7,2), 0,25 M NaCl, 1 mM EDTA, 7% SDS und 5% Polyethylenglykol (Molekulargewicht 8000) prähybridisiert. Die Hybridisierung des Blots erfolgte im gleichen Puffer über Nacht bei 60°C mit 1 × 106 cpm/ml an [32P]-markierter humaner EC-SOD-RNA, erzeugt durch Transkription der cDNA voller Länge unter Verwendung von T3-RNA-Polymerase in Gegenwart von [α-32P]CTP. Der Blot wurde in 0,25 M NaPO4 (pH 7,2), 1 % SDS und 1 mM EDTA bei 75°C gewaschen, gefolgt von einem zweiten Waschen unter Verwendung von 0,04 M NaPO4 (pH 7,2), 1 % SDS und 1 mM EDTA bei 75°C für 30 Minuten. Hierauf folgte die Exposition gegenüber einem XAR-5-Film unter Verwendung eines Lightening Plus Verstärkerschirms bei –70°C. Das Autoradiogramm wurde unter Verwendung eines LKB Ultrascan XL-Laserdensitometers gescannt, und die Peaks wurden durch Integration unter Verwendung des internen digitalen Integrators des Densitometers oder durch Ausschneiden der Peaks aus einer Druckerspur und Wiegen quantifiziert.
  • Schnelle 5'-Amplifikation der cDNA-Enden:
  • 0,5 μg an poly(A+)-mRNA aus menschlichem Herzen wurden unter Verwendung von 2 pmol EC7, einem 5'-ständigen, für das EC-SOD-Gen spezifischen Antisense-Oligonukleotid (5'-ATGACCTCCTGCCAGATCTCC-3'), gemäß einem Protokoll von GIBCO BRL (5'-RACE System) revers transkribiert. Die RNA-Matrize wurde durch die Zugabe von RNase H für 10 Minuten bei 55°C abgebaut. Die resultierende cDNA wurde unter Verwendung einer GlassMAX (GIBCO BRL) DNA-Isolierungs-Zentrifugationskartusche isoliert. Die gereinigte cDNA wurde unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT, 0,5 Unit/μl) mit einem dC-Schwanz versehen. Die Reaktion erfolgte mit 200 μM dCTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 25 mM KCl, 1,25 mM MgCl2 und 50 μg/ml an Rinderserum-Albumin für 10 Minuten bei 37°C. Die TdT wurde dann für 10 Minuten bei 70°C hitzeinaktiviert.
  • Die Produkte dieser Reaktion wurden dann mittels PCR amplifiziert, wobei ein „Anker"-Primer (GIBCO BRL), der an den homopolymeren Schwanz hybridisiert, und EC4 (ein inneres, 5'-ständiges, für das EC-SOD-Gen spezifisches „nested" Antisense-Oligonukleotid, 5'-AGGCAGGAACACAGTAGC-3') verwendet wurden. Alternativ wurden die mit dC-Schwanz versehenen Produkte unter Verwendung von EC7 und HEC1 (einem für das EC-SOD-Gen spezifischen Primer des Sinnstrangs, 5'-TGGGTGCAGCTCTCTTTTCAGG-3') PCR-amplifiziert. Die endgültige Zusammensetzung dieser Reaktion beinhaltete 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 100 μg/ml Rinderserum-Albumin, 400 nM Anker-Primer, 200 nM Genspezifischen Primer, sowie jeweils 200 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Nach Inkubation der PCR-Reaktion für 5 Minuten bei 94°C wurde Amplitaq (Perkin Elmer Cetus) mit einer Endkonzentration von 0,04 Unit/μl zugegeben. Die PCR-Reaktion erfolgte auf einem Perkin Elmer 9600 für 35 Zyklen mit Schmelzen für 45 Sekunden bei 94°C, Anhybridisieren bei 53°C für 15 Sekunden und Verlängerung für 90 Sekunden bei 72°C. Die EC-SOD-cDNA voller Länge (6 ng) wurde als Positivkontrolle bei der PCR-Reaktion verwendet. Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch in einem 2% SeaPlaque GTG-Agarosegel aufgetrennt und mittels des Verfahrens nach Southern (Southern, J. Mol. Biol. 98:503 (1975)) unter Verwendung des alkalischen Transferprotokolls (Reed et al., Nuc. Acids Res. 13:7207 (1985)) auf geladene Nylon-Membranen übertragen. Die DNA wurde an der Membran fixiert, indem die Membran bei 80°C für 2 Stunden in einem Vakuumofen gebacken wurde. Der resultierende Blot wurde mit [32P]-endmarkiertem HEC2 (einem inneren, für EC-SOD spezifischen nested Primer, 5'-TCCAGCTCCTCCAAGAGAGC-3') über Nacht bei 37°C hybridisiert. Der Blot wurde bei steigender Stringenz gewaschen, bis die Hintergrundhybridisierung entfernt war. Hierauf folgte die Exposition gegenüber einem XAR-5-Film unter Verwendung eines Lightening Plus Verstärkerschirms bei –70°C.
  • Humane genomische Southern Blot-Analyse:
  • Zehn μg humane genomische DNA wurden bis zur Vollständigkeit mit den Restriktionsendonukleaseenzymen BamHI, EcoR I, Kpn I und Pst I verdaut. Die DNA wurde dann auf einem 1 % Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und nach alkalischer Denaturierung (Reed et al., Nuc. Acids Res. 13:7207 (1985)) mittels der Southern-Technik (Southern, J. Mol. Biol. 98:503 (1975)) auf eine geladene Nylon-Membran übertragen. Die DNA wurde durch 2-stündiges Erhitzen auf 80°C im Vakuumofen an der Membran fixiert. Es wurde [32P]CTP-markierte humane EC-SOD Antisense-Strang-cRNA unter Verwendung der EC-SOD-cDNA, die mit Stu I linearisiert worden war, synthetisiert. Die Hybridisierung des Blots (500 × 103 cpm/ml) erfolgte bei 50°C in 50% Formamid, 0,25 M NaPO4 (pH 7,2), 0,25 M NaCl, 1 mM EDTA, 7% SDS und 5% Polyethylenglykol (Molekulargewicht 8000). Nach der Übernacht-Hybridisierung wurde der Blot in 0,25 M NaPO4 (pH 7,2), 2% SDS und 1 mM EDTA und dann in 0,04 M NaPO4 (pH 7,2), 1 % SDS und 1 mM EDTA bei steigender Stringenz gewaschen, bis die Hintergrundhybridisierung minimiert war. Der Blot wurde bei –70°C und unter Verwendung eines Lightening Plus-Verstärkerschirms der Exposition gegenüber einem XAR-5-Film unterzogen.
  • Isolierung des humanen Gens für EC-SOD:
  • Eine humane, adult-weibliche genomische Leukozyten-Bibliothek, konstruiert in dem Vektor EMBL-3, wurde von Clontech bezogen. Es wurden ungefähr 1 × 106 pfu bei einer Dichte von 50.000 pfu/Platte unter Verwendung von [32P]CTP-markierter humaner EC-SOD-cRNA (1 × 106 dpm/ml) durchgetestet. Der erste bis dritte Screen identifizierte etwa 7 singuläre putativ positive Plaques. Die einzelnen Plaques wurden isoliert, und die Lamda-DNA wurde unter Verwendung des LamdaSorb-Phagen-Adsorbens (Promega Biotec) gereinigt. Die Größe der Insert-DNA aus jedem Klon wurde mittels Sal 1-Restriktionsendonuklease-Verdau, gefolgt von einer Elektrophorese in 0,7% Agarose, bestimmt. Ausgewählte Klone wurden einer ausführlichen Restriktionsendonuklease-Kartierung unterzogen. Basierend auf den Ergebnissen der Restriktionskartierung und der asymmetrischen Hybridisierung unter Verwendung 5'- und 3'-anhybridisierender EC-SOD-Oligonukleotide, wurde Klon #7 für die gesamte nachfolgende DNA-Sequenzanalyse ausgewählt. Klon #7 enthält ein etwa 18–20 kb großes Fragment.
  • DNA-Seguenzierung des humanen EC-SOD-Gens:
  • Die allgemeine Strategie, die für die Sequenzierung von Klon #7 verwendet wurde, ist in 20 dargestellt. Durch Restriktionsendonuklease erzeugte DNA-Fragmente verschiedener Größe aus Klon #7 wurden in die Vektor-DNA von pGEM3Zf(+) subkloniert. Es wurde das Didesoxysequenzier-Verfahren (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York (1992)) unter Verwendung doppelsträngiger DNA als Matrize sowie des Enzyms Sequenase (United States Biochemicals) eingesetzt (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)). Es wurden sowohl der universelle als auch der –40 M13 Sequenzierprimer verwendet, um die DNA-Sequenzierung bei jedem subklonierten Fragment zu starten. Es wurden von diesen anfänglichen Sequenzierdaten abgeleitete Oligonukleotide synthetisiert, und zwar etwa alle 250 Basenpaare, bis die vollständige Nukleotidsequenz erhalten war. Wie in 20B gezeigt, wurden die Sequenzierdaten von beiden Strängen erhalten, mit Ausnahme des 3'-Bereichs des Gens, wo die DNA-Sequenz nur an einem Strang erhalten wurde.
  • Computer-gestützte Seguenzanalyse und Suche in der transkriptionellen Datenbank:
  • Das Programm IntelliGenetics Geneworks (Version 2.2) wurde für das Organisieren der DNA-Sequenzdaten verwendet. Die Homologiesuche wurde über NCBI unter Verwendung von BLAST (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403 (1990)) Netzwerkservice und nicht-redundanter Nukleotidsequenzdatenbanken (GenBank (77.0) + EMBL (35.0) + EMBLUpdate + GBUpdate) durchgeführt. Die Transkriptionsfaktor-Datenbanksuche wurde durchgeführt unter Verwendung sowohl des SIGNAL SCAN 3.0 Algorithmus (Prestridge et al., CABIOS 9:113 (1993)) sowie des FINDPATTERNS-Programms des GCG-Packets (V 7.2), wobei Ausgabe 6.3 der Transkriptionsfaktordatenbank (Gosh, Nuc. Acids Res. 18:1749 (1990)) verwendet wurde. Für eine Vorhersage der Signalpeptidase-Spaltstelle wurden die Programme SIGSEQ1 (Folz et al., J. Biol. Chem. 261:14752 (1986)) und SIGSEQ2 (Folz et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:870 (1987)) verwendet.
  • Ergebnisse:
  • Gewebespezifische Expression von humaner EC-SOD:
  • Um die Expression von humaner EC-SOD zu untersuchen, wurde poly(A+)-mRNA aus acht verschiedenen menschlichen Geweben auf einem denaturierenden Agarosegel aufgetrennt und auf eine geladene Nylon-Membran übertragen. Da ein früheres Paper lange Expositionszeiten beschrieben hatte, um die für EC-SOD spezifischen Banden bei der genomischen Southern Analyse zu identifizieren (Hendrickson et al., Genomics 8:736 (1990)), wurde eine radioaktiv markierte Antisense-cRNA-Sonde, die von humaner EC-SOD-cDNA voller Länge abgeleitet war, verwendet (Oury et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:9715 (1992)). Eine diskrete Bande von etwa 1,4 kb kann bei allen acht analysierten menschlichen Geweben beobachtet werden (21A). Zusätzlich enthält der Skelettmuskel ein etwa 4,2 kb großes Transkript, das bei den anderen Geweben nicht detektiert wurde. Durch densitometrisches Scannen der 4,2 kb und 1,4 kb großen Banden kann berechnet werden, dass das größere Transkript etwa 32% der gesamten EC-SOD-Transkripte des Skelettmuskels ausmacht. Im Gehirn ist eine sehr schwache Bande von 2,2 kb zu erkennen. Diese Bande war zu schwach für eine Quantifizierung mittels Laserdensitometer. Die Quantifizierung der Banden erfolgte mittels Laserdensitometrie und Integration der Peaks bei Autoradiogrammen, die im linearen Expositionsbereich erhalten wurden (21B). Nach der Normalisierung im Bezug auf das Gehirn zeigte das Herz die meiste Expression mit dem 10,1-fachen des Gehirns. Darauf folgten Plazenta, Pankreas und Lunge, die 13,6, 10,2 bzw. 7,5 ergaben. Die Expression im Skelettmuskel betrug 4,7 für die 1,4 kb-Bande oder 6,9 für das 1,4 kb-Transkript plus dem 4,2 kb-Transkript, während Niere und Leber bezogen auf das Gehirn die 6,3-fache bzw. 4,1-fache Expression zeigten. Diese Expressionsmuster sind auf Basis der Sondenmarkierung eines weiteren, unabhängigen Northern Blots mit mehreren Geweben reproduziert worden. Die Banden basieren in besonderer Weise auf der relativ hohen Stringenz des Waschens sowie auf Daten, die eine Sinnstrang-EC-SOD-cRNA als Sonde verwenden, was unter den gegebenen Bedingungen keine Hybridisierung ergab.
  • Kartierung der Transkriptionsinitiationsstelle:
  • Zuerst wurde eine Kartierung der Transkriptionsinitiationsstelle unter Verwendung des Primer-Extensionsvertahrens versucht. Bei der Verwendung mehrerer verschiedener endmarkierter 5'-Oligonukleotide sowie der Verwendung von poly(A+)-mRNA aus humaner Lunge und humanem Herzen sowie von Gesamt-RNA, die aus humanen Vorhautfibroblasten isoliert worden war, wurde auch nach langen Expositionszeiten kein positives Signal erhalten. Dies schien nicht an der Technik zu liegen, da es möglich war, positive Signale zu erhalten, wenn RNA verwendet wurde, die durch eine in vitro-Transkription der EC-SOD-cDNA erzeugt worden war. Ob der ausbleibende Erfolg bei der Verwendung dieser Technik durch die sehr geringe Häufigkeit der für EC-SOD codierenden mRNA oder durch ein oder mehrere andere Probleme bedingt war, ist unklar. Unter der Annahme einer mRNA niedriger Häufigkeit arbeitend, versuchten wir die Technik der schnellen Amplifikation der cDNA-Enden, um dieses Signal durch PCR zu amplifizieren. Es wurde der für das EC-SOD-Gen spezifische Primer EC7 für die Hybridisierung an und die reverse Transkription von poly(A+)-mRNA aus menschlichem Herzen verwendet, wie in 22 dargestellt.
  • Die Hälfte dieses Reaktionsansatzes wurde unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase mit einem 3'-dC-Schwanz versehen, die verbleibende Hälfte blieb unverändert. Diese Matrizen wurden dann einer PCR-Amplifikation unterworfen, wobei die Gen-spezifischen Primer HEC1 + EC7 ebenso verwendet wurden wie der Anker-Primer + EC4. Die Produkte dieser Reaktionen wurden mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, auf Nylonmembranen überführt und mit dem inneren Gen-spezifischen nested Primer HEC2 sondenmarkiert. Ein Autoradiogramm dieses Versuchs ist in 22A dargestellt. Bei Verwendung von EC-SOD-cDNA als Kontrollmatrize und HEC1 + EC7 wird eine Bande von 217 bp erwartet (Spur 3 von 22A). Da zu erwarten ist, dass die Primer HEC1 und EC7 unabhängig von einem dC-Schwanz amplifizieren, sind Banden gleicher Intensität in den Spuren 4 und 5, die auch von gleicher Größe wie die EC-SOD-Kontrolle sind, zu sehen. Bei Verwendung des Anker-Primers (der an den dC-Schwanz hybridisiert) und EC4, ist nur eine Bande von ~ 190 bp zu sehen (Spur 1). Da die Matrize hier nicht mit poly-C-Schwanz versehen war, zeigte Spur 2 erwartungsgemäß kein Signal. Nach Abziehen von 48 bp (der Länge des Anker-Primers) würde die Größe der revers transkribierten DNA ~ 136 bp 5' von dem EC4-Primer entsprechen. Diese Analyse würde vorhersagen, dass es etwa 6 Basenpaare an zusätzlicher 5'-Sequenz an dem cDNA-Klon gibt, und dass die Transkriptionsinitiation etwa 6 by stromaufwärts von dem ersten Intron (angezeigt durch eine gestrichelte Box) beginnt. Obwohl die Initiation der eukaryotischen Transkription für gewöhnlich an einem Adenosinrest beginnt, wird angenommen, dass sie hier an einem G beginnt (Breathnach et al., Ann. Rev. Biochem. 50:349 (1981)).
  • Genomische Southern Blot-Analyse:
  • Um die Charakterisierung des humanen EC-SOD-Gens zu beginnen, wurden 10 μg an humaner genomischer Gesamt-DNA einem Restriktionsverdau unterzogen und die Reaktionsprodukte auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, gefolgt von der Übertragung auf eine Nylonmembran. Der Blot wurde mit einer [32P]-markierten partiellen EC-SOD-cRNA sondenmarkiert. Ein Autoradiogramm dieses Blots ist in 23 dargestellt. Wie für jede Spur zu sehen ist, gibt es singuläre Banden, die mit dem jeweiligen Restriktionsverdau assoziiert sind. Es waren keine Schattenbanden, die Pseudogene nahe legen könnten, zu erkennen. Wenn eine cRNA-Sonde voller Länge für die mit Kpn I verdaute DNA verwendet wurde, war eine zusätzliche Bande von ~ 4000 bp zu sehen, die dem 3'-Ende des Gens entspricht. Zusätzlich zeigt die Kpn I-Spur eine 0,5 kb-Bande, die auf anderen Blots besser zu sehen war. Dieses Bandenmuster war ähnlich einer Restriktionskarte des humanen EC-SOD-Klons #7 (siehe 20A).
  • Isolierung und Charakterisierung der humanen EC-SOD durch DNA-Seguenzierung:
  • Es wurden mehrere unabhängige positive Klone bei einer humanen, adulten, genomischen Leukozyten-Bibliothek, die in EMBL-3 konstruiert worden war, identifiziert. Diese Klone wurden einer ausgedehnten Restriktionsendonuklease-Kartierung unterzogen und wurden mit für EC-SOD spezifische 5'- und 3'-Oligonukleotide sondenmarkiert, um die relative Orientierung der Inserts zu bestimmen. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde Klon #7 für eine weitere Analyse herangezogen. Klon #7 ist etwa 18 bis 20 kb groß und enthält wenigstens 5000 bp an 5'-flankierender DNA und wenigstens 4000 bp an 3'-flankierender DNA. Die Restriktionskarte von Klon #7 ist in 20A dargestellt. Diese Karte ähnelt den Ergebnissen, die als Daten einer genomischen Southern Blot-Analyse erhalten wurden, was anzeigt, dass Klon #7 das EC-SOD-Gen enthält. Die Strategie zur Subklonierung und Sequenzierung von Klon #7 ist in 20B dargestellt. Es wurden zusammenhängende und überlappende Restriktionsfragmente verschiedener Größe in den Plasmidvektor pGEM32f(+) subkloniert (20B). Die DNA-Inserts wurden an beiden Strängen sequenziert, wobei eine Kombination aus „Primer Walking" und vektorspezifischen, universellen Sequenzier-Primern verwendet wurde. Die 3'-Hälfte des 7K36-Inserts wurde nur an einem Strang sequenziert. Veröffentlichte Sequenzdaten für die humane EC-SOD-cDNA (Hjalmarsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6340 (1987)) sowie DNA-Sequenzinformation, erhalten von einem unabhängigen cDNA-Klon, der zusätzliche untranslatierte 5'-Information enthielt (Hendrickson et al., Genomics 8:736 (1990)) wurden verwendet, um die genomische Intron/Exon-Struktur zu bestimmen. Auf Basis eines Vergleichs dieser Daten mit der genomischen Sequenzinformation wurde bestimmt, dass das humane EC-SOD-Gen drei Exons und zwei Introns enthält (20C). Exon 1 enthält wenigstens 5 Basenpaare, ist aber vermutlich länger (um etwa 6 Basenpaare), da der genaue Startpunkt für die Transkriptionsinitiation nicht ermittelt wurde (siehe unten). Exon 2 enthält 84 bp und ist von Exon 1 durch eine 572 bp große, als Intron 1 gekennzeichnete, zwischengeschaltete Sequenz getrennt. Exon 3 ist von Exon 2 durch Intron 2, ein 3849 bp-Segment, getrennt. Exon 3 beinhaltet eine Gesamtheit von 1336 bp, wobei bei 17 bp im Inneren dieses Exons der Start für den Beginn der vollständigen codierenden Sequenz von präEC-SOD liegt (20D). Diese beinhaltet ein 18 Aminosäuren langes Signalpeptid, das den 222 Aminosäuren der reifen Proteinsequenz vorangeht. Es gibt keine Introns, die die verschiedenen strukturellen Domänen von EC-SOD trennen. Diese Domänen sind schematisch in 20D dargestellt und beinhalten die Aminosäuren 1–95, die ein glykosyliertes Asn-89 enthalten und keine Sequenzhomologie zu anderen Proteinen aufweisen. Die Reste 96–193 zeigen eine starke Homologie zu CuZn-SOD-Proteinsequenzen mit einer Konservierung kritischer Aminosäuren, die für die Enzymkatalyse und Struktur wichtig sind. Die Aminosäuren 194–222 enthalten mehrfach geladene Reste, für die gezeigt wurde, dass sie für die Bindung an sulfatierte Proteoglykane wichtig sind. 558 bp der 5'-flankierenden Region, enthaltend putative regulatorische Elemente und 3675 bp der 3'-flankierenden Region wurden ebenfalls sequenziert. Die Daten der Exon-DNA-Sequenzen stehen in Übereinstimmung mit der veröffentlichten cDNA-Sequenz (Hjalmarsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6340 (1987)). Die Intron-Exon-Grenzen sind in Tabelle VIII dargestellt und sind mit der eukaryotischen Konsensus-Spleiß-Sequenz (Senapathy et al., Methods Enzymol. 183:252 (1990)) konform. Beide Introns spalten Sequenzen in der 5'-untranslatierten Region des EC-SOD-Gens.
  • Tabelle VIII
  • Sequenzen an den Intron/Exon-Spleißverbindungsstellen
  • Die Größe der Introns und Exons ist in Basenpaaren (bp) angegeben. Die großgeschriebenen Buchstaben zeigen Exonsequenzen, während die kleingeschriebenen Buchstaben Intronsequenzen zeigen. Die gezeigten Spleißverbindungsstellen sind konform mit den zuvor veröffentlichten Konsensus-Sequenzen für Spleiß-Verbindungsstellen (Senapathy et al., Methods Enzymol. 183:252 (1990)).
  • Figure 00590001
  • 24 zeigt die vollständige Sequenz für das humane EC-SOD-Gen. Exonsequenzen sind als in Boxen gepackte Großbuchstaben dargestellt, während intronische, bzw. 5'- und 3'-flankierende Sequenzen in Kleinschrift dargestellt sind. Exon 3 enthält die vollständige, nicht unterbrochene codierende Region für EC-SOD, und die Proteinsequenz ist unter Verwendung des Einbuchstaben-Aminosäurecodes angegeben. Das 18 Aminosäuren große Signalpeptid und die 222 Aminosäuren große reife Proteinsequenz sind hervorgehoben. Die Identifizierung der Signalpeptid-Spaltstelle stimmt mit dem Computer-Algorithmus überein, der die Stelle der eukaryotischen Signalpeptidspaltung (Folz et al., Biochem Biophys. Res. Comm. 146:870 (1987)); Von Heijne, Eur. J. Biochem. 133:17 (1983)) vorhersagt.
  • Es wurde eine Suche in der Transkriptionsfaktordatenbank verwendet, um putative transkriptionelle Regulatorelemente zu identifizieren. Obwohl nahezu alle eukaryotischen Promotoren ein TATA-Box-Element verwenden, um die Position der Transkriptionsinitiation festzulegen, kann keine offensichtliche TATA-Box für das EC-SOD-Gen ermittelt werden. Es wurden zwei CAAT-Box-Elemente identifiziert. Eines davon ist revers orientiert und befindet sich etwa 20 bp stromaufwärts von dem ersten Exon, während das zweite etwa 335 bp stromaufwärts zu finden ist. Das putative Signal für die Polyadenylierung ist angegeben, und die Stelle der Poly(A)-Adenylierung ist angezeigt. Die Suche in der Transkriptionsfaktordatenbank im Bezug auf die 5'-untranslatierte Region und das erste Intron identifizierte mehrere potentielle regulatorische Elemente. Ein cAMP-Response-Element (CREB) (TGACGT), das dem viralen Transkriptions-Element des Adenovirus (ATF) ähnlich ist, kann beginnend bei 121 bp gefunden werden (Fink et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6662 (1988); Sassone-Corsi, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:7192 (1988)). Eine Halbstelle für das Glucocorticoid-Response-Element (GRE) (TGTCCT) befindet sich bei 370 bp (Karin et al., Nature 308:513 (1984)). Ein Response-Element für Skelettmuskel-spezifischen transaktivierenden Faktor (M-CAT) (CATTCCT) findet sich in reverser Orientierung beginnend bei Position 238 (Mar et al., Mol. Cell. Biol. 10:4271 (1990)). Ein Xenobiotika-Response-Element (XRE) (CACGCW) findet sich innerhalb des ersten Introns an der Position 1085 bp (Rushmore et al., J. Biol. Chem. 265:14648 (1990)). Ein Metallregulatorisches Element (MRE) (TGCRCYC) findet sich an Position 89 (Culotta et al., Mol. Cell. Biol. 9:1376 (1989)). Zwei putative Antioxidans-Response-Elemente (ARE) (RGTGACNNNGC) finden sich an den Positionen 650 und 5022 (Rushmore et al., J. Biol. Chem. 266:11632 (1991)). Ein sis-Response-Element (SIF) (CCCGTC), das wichtig für die Induktion des Proto-Onkogens c-fos ist, findet sich in reverser Orientierung an Position 251 (Wagner et al., EMBO J. 9:4477 (1990)). Es gibt eine AP1-Bindungsstelle oder TPA-Response-Element (TRE) (TGACTCA), das sich an Position 162 befindet (Risse et al., EMBO J. 8:3825 (1989)). Die SV40-Enhancerregion AP4 (CAGCTGTGG) ist an Position 171 zu finden (Jones et al., Genes Dev. 2:267 (1988)).
  • Beispiel VI
  • (nur zur Bezugnahme)
  • Durchtesten von Patienten auf Gendefekte in der EC-SOD
  • Präparation von aus Leukozyten stammender genomischer DNA aus Patienten:
  • Es werden normale gesunde Kontrollpatienten und Patienten mit Asthma, primärem pulmonalem Hochdruck und sekundärem pulmonalem Hochdruck identifiziert werden.
  • Genomische DNA wird unter Verwendung eines QIAGEN Blut PCR-Kits gereinigt werden. Dabei wird von jedem Patienten oder einem Kontroll-Subjekt ein Milliliter Blut, enthaltend ~107 Leukozyten/ml in Natriumcitrat gesammelt werden. Das Blut wird in eine QIAGEN-Zentrifugationssäule eingebracht, und die Leukozyten werden durch kurze Zentrifugation in dem Harz eingeschlossen, während die Erythrozyten und das Hämoglobin ausgewaschen werden. Die Leukozyten werden durch Zugabe von 0,7 ml Lysepuffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten lysiert. Freigesetzte DNA bindet an das Harz in dem Röhrchen. Die verbleibenden Zelltrümmer werden durch mehrere Wasch/Zentrifugations-Zyklen weggespült. Die DNA wird durch Zugabe von 1,2 M KCl, 50 mM MOPS, 15% Ethanol, pH 8,3 eluiert. Dies ergibt typischerweise ~10 μg an genomischer DNA (Reihsaus et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:334 (1993)).
  • Primeraufbau und PCR-Amplifikation der exonischen Sequenzen von EC-SOD:
  • Es werden Sense- und Antisense-Oligonukleotidprimer (oder Verwendungsprimer, die bereits aus der Sequenzierung der genomischen DNA erhalten wurden), die eine 3'-GC-Klammer (Sheffeld et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:232 (1989)) enthalten, erstellt werden. Diese Primer werden für die Intron-freie codierende Region des EC-SOD-Gens codieren. Es ist eine 172 bp-Region in der 3'-untranslatierten Region unter Verwendung von DNA-Sequenzierprimern und humaner genomischer DNA amplifiziert worden. Die PCR-Bedingungen sind beschrieben (Reihause et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:334 (1993); Innis et al. (Herausgeber) Academic Press San Diego S. 1–12 (1990)), wobei Taq-Polymerase und die folgenden Temperaturzyklen verwendet werden: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 5 min, gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 94°C für 20 sec, Anhybridisieren bei 57°C für 15 sec, und Verlängerung bei 72°C für 45 sec. Aufgrund der GC-Zusammensetzung und der jeweiligen Primer-Sequenz wird es notwendig sein, die Bedingungen für die PCR-Amplifikation unter Verwendung jedes Primer-Sets experimentell zu optimieren. Es werden drei Sets von Primern verwendet werden, um die gesamte codierende Region abzudecken.
  • Identifizierung von Mutationen über die Analyse konformativer Einzelstrang-Polymorphismen (SSCP):
  • Die SSCP-Analyse ist verwendet worden, um Einzelbasen-Fehlpaarungen zu detektieren (Orita et al., Genomics 5:874 (1989)). Es wird Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE) verwendet werden, um Unterschiede der Mobilität (Wartell et al., Nuc. Acids Res. 18:2699 (1990)) zu detektieren. Die Herstellung der Proben für die TGGE wird erfolgen durch Hitzedenaturieren des PCR-Produkts bei 98°C für 5 min, gefolgt von Renaturierung bei 50°C für 15 min mit der korrespondierenden Wildtyp-DNA, stammend aus der PCR des klonierten Gens. Die Elektrophorese wird auf einem Gel mit 5% Acrylamid und 8 M Harnstoff über einen Temperaturgradienten erfolgen. Der Temperaturgradient wird für jedes der EC-SOD-DNA-Segmente optimiert werden. Typische Gradienten für die Detektion von Mutationen des β2-adrenergen Rezeptors bewegten sich zwischen 35°C und 60°C und erforderten 4 bis 6 Stunden Laufzeit (Rosen, Nature 262:59 (1993)).
  • Alle PCR-Proben, die durch TGGE als positiv für Mutationen ermittelt wurden, werden direkt unter Verwendung der Didesoxytechnik (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 74:5463 (1977)) sequenziert werden.
  • Beispiel VII
  • Inhibition von Xanthinoxidase
  • In einer ersten Studie erfolgten Tests in einer 1 ml-Quarzküvette mit 50 mM Carbonatpuffer, pH 10, 0,1 mM EDTA, 1 nM Xanthinoxidase (Boehringer Mannheim) bei 25°C. Die Aktivität von Xanthinoxidase wurde spektrophotometrisch durch Verfolgen der Abnahme an Xanthin über den Zeitverlauf bei 295 nm gemessen. Es wurden vier Konzentrationen an Xanthin (25, 50, 250, 500 μM) und 2 Konzentrationen an MnTBAP (5, 10 μM) verwendet. Es wurden dann zwei Inhibitionskonstanten aus den Achsenabschnitten (Kii = 5,5 μM) und Steigungen (Kis = 15 μM) abgeleitet. Die in 25 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass MnTBAP die Xanthinoxidase in einer nicht kompetitiven Weise hemmt.
  • Bei einer zweiten Studie wurden Endothelzellkulturen aus der Lungenarterie des Kalbs (CPA-47 (Tissue and Cell 10:535 (1978)) in Ham's F-12K-Medium mit 10% fetalem Rinderserum bei pH 7,4 und 37°C bis zur Konfluenz herangezogen. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und mit gleicher Dichte in 24 Well-Platten inokuliert und bis zu 90%iger Konfluenz herangezogen. Die Zellen wurden gewaschen und für 1 Stunde mit 50 μM MnTBAP in minimalessentiellem Medium (MEM) oder mit MEM alleine präinkubiert. Es wurden verschiedene Mengen an Xanthinoxidase (XO) plus 200 μM Xanthin (X) zugegeben und eine Inkubation für 24 Stunden ermöglicht. Die Zellverletzung wurde durch Messen der Freisetzung von zellulärer Laktatdehydrogenase (LDH) in das Medium quantifiziert. Die Wirksamkeit von MnTBAP ist in 26 durch die Verminderung der XO/X-induzierten Freisetzung von LDH dargestellt.
  • Beispiel VIII
  • SOD-Mimetika bieten zellulären Schutz vor durch Paraquat induzierter Verletzung
  • Rattenlungen-Epithelzellkulturen (L2 (Kaighn und Douglas, J. Cell Biol. 59:160a (1973)) wurden in Ham's F-12K-Medium mit 10% fetalem Rinderserum bei pH 7,4 und 37°C bis zur Konfluenz herangezogen. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und mit gleicher Dichte in 24 Well-Platten inokuliert und bis zu 90%iger Konfluenz herangezogen. Die Zellen wurden gewaschen und für 1 Stunde mit 100 μM MnTBAP oder MnTMPyP in MEM oder mit MEM alleine präinkubiert. Es wurde dann Paraquat (2,5 mM) hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 48 Stunden. Die Zellverletzung wurde durch Messen der Freisetzung von zellulärer Laktatdehydrogenase (LDH) in das Medium quantifiziert. 27 zeigt, dass MnTMPyP (schraffierte Balken) und MnTBAP (graue Balken) die durch Paraquat induzierte LDH-Freisetzung verringern.
  • Bei einer weiteren Studie wurden Endothelzellkulturen aus der Lungenarterie des Kalbs (CPA-47 (Tissue and Cell 10:535 (1987)) in Ham's F-12K-Medium mit 10% fetalem Rinderserum bei pH 7,4 und 37°C bis zur Konfluenz herangezogen. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und mit gleicher Dichte in 24 Well-Platten inokuliert und bis zu 90%iger Konfluenz herangezogen. Die Zellen wurden gewaschen und für 1 Stunde mit verschiedenen Konzentrationen an MnTBAP in MEM oder mit MEM alleine präinkubiert. Es wurde dann Paraquat (2 mM) hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 24 Stunden. Die Zellverletzung wurde durch Messen der Freisetzung von zellulärer Laktatdehydrogenase (LDH) in das Medium quantifiziert. MnTBAP verringerte die durch Paraquat induzierte LDH-Freisetzung in einer Dosis-abhängigen Weise (siehe 28).
  • Im Gegensatz zu MnTBAP schützt ZnTBAP nicht vor der durch Paraquat induzierten Verletzung. Endothelzellkulturen aus der Lungenarterie des Kalbs (CPA-47) wurden in Ham's F-12K-Medium mit 10% fetalem Rinderserum bei pH 7,4 und 37°C bis zur Konfluenz herangezogen. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und mit gleicher Dichte in 24 Well-Platten inokuliert und bis zu 90%iger Konfluenz herangezogen. Die Zellen wurden gewaschen und für 1 Stunde mit verschiedenen Konzentrationen an ZnTBAP in MEM oder mit MEM alleine präinkubiert. Es wurde dann Paraquat (2 mM) hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 24 Stunden. Die Zellverletzung wurde durch Messen der Freisetzung von zellulärer Laktatdehydrogenase (LDH) in das Medium quantifiziert. Die in 29 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass ZnTBAP keine SOD-artige Aktivität besitzt. ZnTBAP kann als Negativkontrolle verwendet werden, um zu zeigen, dass das Redoxmetall beim Schutz gegen die Paraquat-Toxizität wichtig ist.
  • Beispiel IX
  • Durch MnTBAP vermittelter Schutz vor Paraquat-induzierter Lungenverletzung
  • Mäuse wurden entweder mit Paraquat (PQ, 45 mg/kg, i.p.) oder mit Saline (10 ml/kg, i.p.) behandelt und MnTBAP (2,5 mg/ml, eingesprüht in eine 2 I-Kammer bei 2 I/min für 30 min, zweimal täglich für 2 Tage) oder Raumluft ausgesetzt. Die Mäuse wurden 48 Stunden nach dem Beginn der Behandlung getötet und die Lungenverletzung bestimmt, indem die bronchoalveolare Spülflüssigkeit (RALF) analysiert wurde. Die verwendeten BALF-Verletzungsmarker waren Laktatdehydrogenase (LDH, als Unit/I), die Proteinkonzentration (als mg/dl) und der Prozentsatz der polymorphkernigen Leukozyten (PMN). Die Behandlung mit MnTBAP verlieh einen teilweisen Schutz gegen Paraquat-induzierte Lungenverletzung (siehe 30).
  • Beispiel X
  • Die Messung der Katalaseaktivität erfolgte mittels einer Clark-Sauerstoffelektrode unter Verwendung eines modifizierten Assays, der zuvor von Del Rio et al., Anal. Biochem. 80:409 (1977) beschrieben worden war. Kurz dargestellt wurden die Reaktionen in einem Stickstoffentgasten Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,8) mit 0,1 mM EDTA bei 25°C durchgeführt. Es wurden drei Konzentrationen an Wasserstoffperoxid (1–4 mM) und vier Konzentrationen an Metalloporphyrin (0,5–50 μM) verwendet, um die Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung zu bestimmen. Die Geschwindigkeit der Sauerstoffentwicklung wurde für 2 Minuten verfolgt. Die Ergebnisse sind in 31 dargestellt.
  • Eine Lungenendothelzelllinie des Kalbs (CPA-47) wurde in 12-Well-Platten in F-12K-Medium mit 10% fetalem Kälberserum bis nahezu zur Konfluenz herangezogen. Die CPA-47-Zellen wurden, wie zuvor von Simon et al., J. Clin. Invest. 78:1375 (1986) beschrieben, in glukosereichem minimalessentiellem Medium (DMEM) mit Cr51 beladen. Die Zellen wurden für eine Stunde mit MnTBAP (100 μM) vorbehandelt und dann verschiedenen Konzentrationen eines Wasserstoffperoxid-Generators, Glukoseoxidase, für 4 Stunden ausgesetzt. Die Zellverletzung wurde dann als spezifische Cr51-Freisetzung aus CPA-47-Zellen, die auf eine spontane Cr51-Freisetzung eingestellt worden waren, quantifiziert. Die Ergebnisse sind in 32 dargestellt.
  • Eine Lungenendothelzelllinie des Kalbs (CPA-47) wurde in 12-Well-Platten in F-12K-Medium mit 10% fetalem Kälberserum bis nahezu zur Konfluenz herangezogen. Die CPA-47-Zellen wurden, wie zuvor von Simon et al., J. Clin. Invest. 78:1375 (1986) beschrieben, in glukosereichem minimalessentiellem Medium (DMEM) mit Cr51 beladen. Die Zellen wurden für eine Stunde mit verschiedenen Konzentrationen von entweder (A) MnTBAP, (B) MnTMPyP, (C) ZnTBAP oder (D) CuZnSOD vorbehandelt und dann dem Wasserstoffperoxid-Generator Glukoseoxidase (100 Mu/ml) für 4 Stunden ausgesetzt. Die Zellverletzung wurde dann als spezifische Cr51-Freisetzung aus CPA-47-Zellen, die auf eine spontane Cr51-Freisetzung eingestellt worden waren, quantifiziert. Die Ergebnisse sind in 33A–33D dargestellt.
  • Beispiel XI
  • Mimetika als Schutzmittel gegen excitotoxischen Zelltod
  • Versuchsprozeduren
  • Gewebekultur. Es wurden gemischte Kulturen von neuronalen Zellen und Gliazellen aus cerebralen Cortizes von 18 Tage alten Rattenembryonen (Sprague-Dawley, Zivic Miller) präpariert. Kurz dargestellt wurden die cerebralen Cortizes zerlegt und enzymatisch aufgespalten, indem man diese in Ca/Mg-freier Hank's Balanced Salzlösung (HBSS), supplementiert mit 10 mM HEPES und 0,25% Trypsin, für 20 min bei 37°C inkubierte. Das Gewebe wurde dann gespült und durch sanftes Durchleiten durch eine feuerpolierte Pasteurpipette zu einer Einzelzell-Suspension dispergiert. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert und in minimalessentiellem Medium (MEM) mit Earle's Salzen und supplementiert mit 3 g/l Glukose, 5% Pferdeserum und 5% fetalem Rinderserum (Wachstumsmedium), resuspendiert. Die Zellen wurden in mit Poly-D-Lysin beschichteten Multi-Well-Platten ausplattiert: 12-Well-Platten für die Messung der Aconitase und 24-Well-Platten für die Toxizitäts-Experimente. Die Zellen wurden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2/95% Luft in Wachstumsmedium gehalten. Das Medium wurde nicht ersetzt, um ein Überwuchern durch Gliazellen und den Verlust von Neuronen zu verringern. Es wurden für alle Versuche reife Zellen (14–17 Tage in vitro) verwendet.
  • Zellbehandlung: Das Wachstumsmedium wurde durch MEM ersetzt, das mit 25 mM Glucose supplementiert war (MEM-g). Sowohl für die Neurotoxizitätsstudien als auch für die Aconitasemessung wurden die Zellen mit der zugedachten Behandlung für die angegebene Länge der Zeit bei 37°C inkubiert. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Antagonisten oder SOD-Mimetika 15 min vor den Agonisten hinzugegeben. Für die Messung der Neurotoxizität wurden die Zellen mit den Behandlungen für 18 Stunden bei 37°C in MEM-g inkubiert. Um die Befähigung der Antagonisten zur Inhibierung der akuten NMDA-Toxizität oder zur Rettung der Zellen vor einer ablaufenden NMDA-Verletzung zu bestimmen, wurde ein alternatives Schema der NMDA-Behandlung zusätzlich zu dem oben beschriebenen verwendet. Bei diesem Schema wurde das Wachstumsmedium durch HBSS– (Ca/Mg-freie Hank's Balanced Salzlösung, supplementiert mit 2 mM CaCl2, 1mM NaNCO3, 10 mM HEPES und 5 μM Glycin) ersetzt, und die Zellen wurden mit dem Träger oder mit 100 μM NMDA für 15 min behandelt, wonach das HBSS– durch MEM-g ersetzt wurde und die Zellen für weitere 18 Stunden erneut in den Inkubator eingesetzt wurden. Die Zugabe der Antagonisten oder SOD-Mimetika zu den Zellen erfolgte 15 min vor der NMDA-Exposition oder 15, 30 oder 60 min nach dem letzten Austausch des Mediums. Zur Bestimmung der Ca2+-Abhängigkeit wurden die Zellen in HBSS– inkubiert, dem kein Ca2+ zugegeben worden war. Wenn Kainat (KA) als Agonist verwendet wurde, so wurden routinemäßig 100 μM D-APV einbezogen, um eine sekundäre NMDA-Rezeptoraktivierung zu blockieren. Katalase (100 U/ml) wurde stets einbezogen, wenn Xanthin plus Xanthinoxidase (X + XO) als Behandlung verwendet wurden, um die Beteiligung von Wasserstoffperoxid auszuschließen.
  • Neurotoxizitätsstudien: Die Bestimmung der Neurotoxizität erfolgte durch die Messung der in das überstehende Medium freigesetzten LDN gemäß vorheriger Beschreibung (Patel et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 115:124 (1991) und Neurotoxicology 14:35 (1992)). Die Messung von LDH erfolgte mittels des Verfahrens von Vassault „Lactate dehydrogenase". In: Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer HU (Herausgeber), Verlag Chemie, Weinheim, S. 118–126 (1983)). Zusätzlich wurde der Zelltod mit Ethidium 1-Homodimer (EthD-1) bestätigt. Kurz dargestellt, wurden die Zellen mit HBSS gewaschen, für 30 min mit 20 μM EthD-1 beladen, gespült und mittels Fluoreszenzoptik betrachtet. Die Anzahl der toten, mit EthD-1 markierten Zellen wurde in 4–6 zufällig ausgewählten Feldern ausgezählt, die Zahlen wurden gemittelt, um eine Abschätzung des Zelltods zu erhalten, und der Versuch wurde 3 mal wiederholt.
  • Aconitasemessung: Für die Messung der Aconitase nach der Behandlung mit den Mitteln wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden in eiskaltem 50 mM Tris/HCl, pH 7,4 mit 0,6 mM MnCl2, 1 mM L-Cystein, 1 mM Citrat und 0,5% Triton-X 100, lysiert. Die Messung der Aconitaseaktivität in den Zelllysaten erfolgte spektrophotometrisch durch Überwachen der Bildung von cis-Aconitat aus Isocitrat bei 240 nm in 50 mM Tris/HCl, pH 7,4 mit 0,6 mM MnCl2 und 20 mM Isocitrat bei 25°C (Kreb und Holzach, Biochem., J. 52:527 (1952); Gardner und Fridovich, J. Biol. Chem. 267:8757 (1992)). Inaktive Aconitase wurde durch eine 30-minütige Inkubation der kortikalen Zelllysate (90 μl) mit 0,5 M DTT (10 μl), 20 mM Na2S (1 μl) und 20 mM Eisen(II)-Ammoniumsulfat (1 μl) in 50 mM Tris/HCl, pH 8,0 bei 37°C reaktiviert. Die Aconitaseaktivität in den kortikalen Zelllysaten wurde durch 0,1 mM Kalium-Eisen(III)cyanid oder durch Kochen der Probe inhibiert.
  • Statistische Analysen: Es wurde eine in eine Richtung erfolgende Analyse der Varianz (ANOVA) verwendet, um drei oder mehr Behandlungen zu vergleichen; des weiteren wurde der Dunnet-Test verwendet, um mehrere Behandlungsgruppen mit einer Kontrollgruppe zu vergleichen. Der Tukey-Kramer-Mehrfachvergleichstest wurde verwendet, um Unterschiede zwischen den Behandlungen zu detektieren. Der Student t-Test wurde für den Vergleich von zwei Behandlungen verwendet.
  • Ergebnisse:
  • Validierung der Aconitaseaktivität als Marker der O2 –-Radikalbildung in der kortikalen Zellkultur. Mittels der Verwendung von Mitteln, die bekannter Maßen O2 – erzeugen, (X + XO und PQ–) wurde die Aconitaseaktivität als gültiger Marker von O2 – etabliert. Die O2 –-Generatoren inaktivierten Aconitase selektiv und reversibel, und zwar in einer Weise, die durch SOD verhinderbar war.
  • Die durch PQ–, NMDA und KA erzeugte Inaktivierung von Aconitase korreliert mit dem Zelltod: Kortikale Zellen wurden für 18 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen an KA, NMDA und PQ– behandelt, und die Medien wurden auf LDH-Aktivität hin analysiert. Schwesterkulturen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an KA, NMDA oder PQ– für 6, 1 bzw. 3 Stunden behandelt, und die Zelllysate wurden auf Aconitaseaktivität hin untersucht; dabei wurde für die Aconitaseaktivität eine kürzere Inkubationszeit gewählt, da der Tod von Neuronen zur irreversiblen Inaktivierung von Aconitaseaktivität führt, vermutlich aufgrund von Proteinabbau. Daher wurde ein früherer Zeitpunkt zur Messung der Aconitaseaktivität ausgewählt, basierend auf der Zeit einer Annäherung an einen verlässlichen Zustand reversibler Inaktivierung (34A und B für 50 μM NMDA bzw. 300 μM KA).
  • Die KA-Behandlung erzeugte eine proportionale Verringerung der Aconitaseaktivität sowie Zelltod, wie anhand der LDH-Freisetzung gemessen wurde (35A). Dem entsprechend erbrachte die Behandlung mit PQ– eine proportionale Verringerung der Aconitaseaktivität und eine Menge an LDH-Freisetzung (35B). Bei höheren Konzentrationen (30–1000 μM) erzeugte NMDA proportionale Verringerungen der Aconitaseaktivität und ebenfalls Zelltod. Dem gegenüber erzeugten niedrige Konzentrationen (3 und 10 μM) an NMDA Zelltod (LDH-Freisetzung), jedoch keine detektierbare Aconitaseinaktivierung (35C).
  • MnTBAP verhindert die Aconitaseinaktivierung und den Zelltod, die durch PQ, NMDA und KA hervorgerufen werden: Um zu bestimmen, ob MnTBAP die Aconitaseinaktivierung und den Zelltod, die von NMDA, PQ und KA hervorgerufen werden, verhindern kann, wurden kortikale Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von 200 μM MnTBAP mit PQ++, NMDA und KA inkubiert. PQ++, NMDA und KA bewirkten nach 3, 1, bzw. 6 Stunden eine Abnahme der Aconitaseaktivität von 70%, 40% bzw. 42%; 200 μM MnTBAP führten zu einer merklichen Inhibition der von PQ++, NMDA und KA vermittelten Verringerung der Aconitaseaktivität (36A). Parallele Effekte waren beim Zelltod, wie er durch die LDH-Freisetzung gemessen wurde, ersichtlich. MnTBAP (200 μM) bewirkte eine merkliche Inhibition des von PQ++, NMDA und KA vermittelten Zelltods (36B). Die Wirkungen von MnTBAP auf den Zelltod waren konzentrationsabhängig (36B). MnTBAP (200 μM) erzeugte eine nach rechts gehende und nach unten gerichtete Verschiebung in der Konzentrations-Antwortkurve für NMDA, wobei bei niedrigen Konzentrationen von NMDA ein vollständiger Schutz bereitgestellt wird (37).
  • Die Möglichkeit, dass MnTBAP einfach eine Aktivierung der NMDA- oder AMPA-Rezeptoren verhindert, wurde geprüft und ausgeschlossen.
  • Um die Möglichkeit zu untermauern, dass MnTBAP die Aconitaseinaktivierung verringert und den Zelltod durch seine SOD-mimetische Wirkung verhindert, wurden die Wirkungen des strukturell verwandten Analogons ZnTBAP mit verminderter (d.h. 10-fach kleinerer) SOD-Aktivität untersucht. In diesen Experimenten wurde EthD-1 dazu verwendet, um den Zelltod zu quantifizieren, da Vorläuferstudien gezeigt hatten, dass ZnTBAP einen Einfluss auf die LDH-Messung hat (für MnTBAP wurde keine Beeinflussung der LDH-Messung beobachtet). Konzentrations-Antwort-Kurven für NMDA und KA zeigten eine starke Korrelation zwischen dem Zelltod, der unter Verwendung der LDH-Freisetzung gemessen wurde, und den toten Zellen, die über EthD-1 quantifiziert wurden. Die Konzentrations-Antwortkurven offenbarten, dass MnTBAP im Vergleich zu ZnTBAP erheblich gesteigerte neuroprotektive Wirkungen gegenüber der Toxizität von PQ, NMDA und KA besaß (38).
  • Um zu bestimmen, ob die Zugabe von MnTBAP nach dem Start des excitotoxischen Angriffs neuroprotektive Wirkungen entfaltete, bezog man für 15 min 100 μM NMDA in HBSS– ein (in Ca/Mg-freiem HBSS mit 5,6 mM Glukose, supplementiert mit 2 mM CaCl2, 1 mM NaHCO3, 10 mM HEPES und 5 μM Glycin). Dieses akute Expositionsschema induzierte einen verspäteten neuronalen Tod (gemessen 18 Stunden später) und erlaubte die Bestimmung der zeitlichen Beziehung zwischen der MnTBAP-Exposition und der Neuroprotektion. Die neuroprotektiven Wirkungen von MnTBAP wurden unter den folgenden Bedingungen bestimmt: 1) bei Anwesenheit 15 min vor und während einer 15-minütigen NMDA-Verabreichung, jedoch nicht für die 18-stündige Zeitspanne nach dem Wechsel des Mediums (Bedingung „prä"); 2) bei Anwesenheit 15 min vor und während einer 15-minütigen NMDA-Verabreichung und für die folgenden 18 Stunden (Bedingung „prä + post"); 3) bei Zugabe 15, 30 oder 60 min nach einer 15-minütigen Inkubation mit 100 μM NMDA und Belassen im Medium für die folgenden 18 Stunden. Die Bedingung „prä" resultierte in einer 25%igen Verringerung der 18 Stunden später gemessenen LDH-Freisetzung; bei der Verwendung eines identischen Zeitplans für die Anwendung von 100 μM D-APV unter der Bedingung „prä" wurde eine vollständige Blockade der LDH-Freisetzung beobachtet. Demgegenüber resultierte die MnTBAP-Inkubation bei der Bedingung „prä + post" in einer 51 %igen Verringerung der LDH-Freisetzung. Die Zugabe von 200 μM MnTBAP 15, 30 oder 60 min nach einer 15-minütigen Exposition gegenüber 100 μM NMDA resultierte in einer 38%igen, 30%igen, bzw. 25%igen Verringerung der LDH-Freisetzung. Im Gegensatz dazu hatte die Zugabe von 10 μM MK801 15 min nach der NMDA-Behandlung nur einen mäßigen schützenden Effekt (17%), wenn die Verabreichung 15 min nach dem Angriff durch NMDA erfolgte. Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass die von NMDA induzierte Aconitaseinaktivierung aus einer Bildung von Peroxynitrit herrührte, wurden die Wirkungen von Inhibitoren der Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) bei NMDA-induzierter Aconitaseinaktivierung und Zelltod untersucht. Die NMDA-induzierte Aconitaseinaktivierung und LDH-Freisetzung waren in Gegenwart entweder von 1 mM NG-Nitro-L-Arginin-Methylester, NG-Nitro-L-Arginin oder NG-Monomethyl-L-Arginin unverändert. NOS wurde jedoch in der verwendeten kortikalen Neuronenpräparation exprimiert. Somit scheint Peroxynitrit keine ätiologische Rolle bei NMDA-induzierter Aconitaseinaktivierung oder Zelltod unter den verwendeten Bedingungen zu spielen.
  • Beispiel XII
  • Beeinträchtigung des Lernens bei EC-SOD-Knock out-Mäusen
  • EC-SOD-Knock out-Mäuse wurden erhalten von Dr. Lena Carlsson und Dr. Stephan Marklund, Umeä, Schweden. Die Untersuchung des Lernens erfolgte bei Knock out-Mäusen und Kontrollmäusen (die Kontrollen stammten von (+/+)-Geschwistertieren, die normale Niveaus von EC-SOD aufwiesen), wobei ein achtarmiges verzweigtes Labyrinth verwendet wurde, bei dem Futter in einer Schale am Ende jedes Armes platziert war. Den Mäusen wurde für eine Zeitspanne von acht Stunden das Futter vorenthalten, dann wurden sie in das Labyrinth eingesetzt. Es wurde die Anzahl der Arme gezählt, die die Mäuse herab liefen, um Futter zu erlangen, bevor sie den jeweiligen Arm ein zweites Mal herab liefen. Naive Tiere liefen zufällig zwischen vier und fünf verschiedene Arme des Labyrinths herab, bevor sie anfingen, den Weg zu wiederholen.
  • Die in 39 präsentierten Ergebnisse zeigen, dass, wenn das Experiment an 24 aufeinander folgenden Tagen wiederholt wird, die Kontrollmäuse das Muster erlernen und in der Lage sind, die Anzahl der Arme zu erhöhen, die sie herabsteigen, um ohne Fehler Futter zu finden. Die EC-SOD-Knock out-Tiere zeigten während der gesamten 24 Sitzungen kein signifikantes Lernen.
  • Beispiel XIII
  • Abfangen von Peroxynitrit durch Mimetika
  • Versuchsprotokolle
  • Zellkultur: J774-Makrophagen wurden in DMEM-Medium kultiviert, das mit L-Glutamin (3,5 mmol/I) und 10% fetalem Kälberserum supplementiert war. Die Zellen wurden in 95 Well-Platten (200 μl Medium/Well) bis zur Konfluenz kultiviert. Um die induzierbare Isoform von Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) zu induzieren, wurde frisches Kulturmedium mit E. coli LPS (011;B4; 10 μg/ml) alleine oder in Kombination mit murinem γ-Interferon (γ-IFN, 10 U/ml) in Gegenwart oder Abwesenheit des NOS-Inhibitors und dem SOD-Mimetikum als Kombination der zwei Verbindungen für 24 Stunden hinzugegeben. Darüber hinaus wurden Zellen den NO-Donorverbindungen S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamin (SNAP) (3 mM) und Diethylamin:NO NONOat (DNO) (3 mM) für 24 Stunden oder authentischem Peroxynitrit (1 mM) für 1 Stunde ausgesetzt. Die Konzentration von Nitrit/Nitrat im Medium und die mitochondriale Atmung wurden dann gemäß der unten stehenden Beschreibung gemessen.
  • Messung der Produktion von Nitrit/Nitrat: Die Produktion von Nitrit/Nitrat, ein Indikator der NO-Synthese, wurde im Überstand gemessen. Zuerst wurde das Nitrat im Kulturmedium durch Inkubation mit Nitratreduktase (670 mU/ml) und NADPH (160 μM) bei Raumtemperatur für 2 Stunden zu Nitrit reduziert. Nach 2 Stunden wurde die Nitritkonzentration in den Proben durch Griess-Reaktion gemessen, indem man 100 μl an Griess-Reagenz (1% Sulfanilamid und 0,1% Naphthylethylendiamid in 5% Phosphorsäure) zu 100 μl-Proben von konditioniertem Medium hinzugab. Die optische Dichte bei 550 nm (OD550) wurde unter Verwendung eines Spectramax 250 Mikroplatten-Lesegeräts (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen. Die Bestimmung der Nitratkonzentrationen erfolgte über den Vergleich mit der OD550 von Standardlösungen von Natriumnitrat, die in Kulturmedium hergestellt worden waren. Alle Messungen wurden im Hinblick auf die Interferenz von MnTBAP bei dieser Wellenlänge korrigiert. MnTBAP (bis zu 300 μM) fing Nitrit oder Nitrat nicht ab und zeigte kein Eingreifen in die Aktivität von Nitratreduktase.
  • Messung der mitochondrialen Atmung: Die Zellatmung wurde durch die von den Mitochondrien abhängige Reduktion von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu Formazan bestimmt. Die Zellen in den 96-Well-Platten wurden bei 37°C für eine Stunde mit MTT (0,2 mg/ml) inkubiert. Das Kulturmedium wurde durch Absaugen entfernt, und die Zellen wurden in DMSO (100 μl) solubilisiert. Das Ausmaß der Reduktion von MTT zu Formazan innerhalb der Zellen wurde durch die Messung der OD550 quantifiziert. Alle Messungen wurden im Hinblick auf die Interferenz von MnTBAP bei dieser Wellenlänge korrigiert.
  • Messung der von Peroxynitrit induzierten Oxidation von Dihydrorhodamin 123: Die Messung der von Peroxynitrit abhängigen Oxidation von Dihydrorhodamin 123 zu Rhodamin 123 erfolgte basierend auf den Prinzipien des Verfahrens, das von Kooy et al., Free Radical Biol. Med. 16:149 (1994) beschrieben worden ist. Kurz dargestellt, wurde Peroxynitrit mit 5 μM in Gegenwart oder Abwesenheit von MnTBAP (13–100 μM) zu Phosphat-gepufferter Saline gegeben, die 10 μM Dihydrorhodamin 123 enthielt. Nach 10 Minuten Inkubation bei 22°C wurde die Fluoreszenz von Rhodamin 123 unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Fluorimeters (Modell LS50B; Perkin-Elmer, Norwalk, CT) bei einer Anregungswellenlänge von 500 nm und einer Emissionswellenlänge von 536 nm (Spaltbreite 2,5 bzw. 3,0 nm) gemessen.
  • Messung der von NO induzierten vaskulären Relaxationen: Weiße Neuseelandkaninchen mit einem Gewicht von 3–4 kg wurden mit Pentobarbital (30 mg/kg) betäubt. Die absteigende Brustaorta wurde isoliert, entnommen, gereinigt und in Krebs-Puffer (pH 7,5) eingelegt. Die Gefäße wurden in 5 mm-Ringe geschnitten und an Bügel gehängt, die mit Kraft-Transduktoren verbunden waren. Die Ringe wurden in eingehüllten 20 ml-Bädern, die auf 37°C gehalten wurden, suspendiert und mit 95% O2 und 5% CO2 besprudelt. Die Ringe wurden bei einer Ruhespannung von 2g für eine Stunde vor der Verwendung äquilibriert und dann mit Phenylephrin in Kontakt gebracht. Eine gesättigte Lösung von NO wurde hergestellt, indem man komprimiertes NO-Gas durch eine NaOH-Falle und dann in anaerobes deionisiertes Wasser leitete. Aliquots der Stickstoffmonoxidlösung (Endkonzentration: 75–300 nM) wurden zu den Ringen hinzugegeben (in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 μM MnTBAP), und die Reaktionen auf das Relaxans wurden aufgezeichnet.
  • Datenanalyse: Alle Werte werden ausgedrückt als Mittelwert ± mittlerem Standardfehler bei n Beobachtungen, wobei n die Anzahl der untersuchten Wells darstellt (12 Wells aus 2–3 unabhängigen Versuchen). Die Datensätze wurden durch eine Analyse der Varianz untersucht, und einzelne Gruppenmittelwerte wurden dann mittels ungepaartem Student t-Test verglichen. Ein p-Wert unterhalb von 0,05 wurde als signifikant angesehen.
  • Ergebnisse:
  • MnTBAP ist kein Fänger für Stickstoffmonoxid: MnTBAP inhibierte nicht die Relaxationen der Gefäßringe in Reaktion auf authentisches NO. Darüber hinaus führte MnTBAP bei 300 μM nicht zu einer Inhibition der Nitrit-/Nitratakkumulation im Kulturmedium in Reaktion auf die NO-Donorverbindung SNAP und verursachte nur eine leichte Inhibition bei der Reaktion auf DNO. Diese Daten und die Beobachtung, dass NO die Spektralveränderungen der MnTBAP-Soret-Bande nicht beeinflusst, zeigen an, dass NO mit dem Mangan in MnTBAP nicht komplexiert.
  • MnTBAP inhibierf die durch Peroxynitrit vermittelte Oxidation: Peroxynitrit induzierte eine signifikante Oxidation von Dihydrorhodamin 123 zu Rhodamin 123, was dosisabhängig von MnTBAP inhibierf wurde, wobei bei 30 μM eine Inhibition von 50% gegeben war (40). Dies legt nahe, dass MnTBAP, wie Cystein, Urat, Ascorbat und alpha-Tocopherol, die durch Peroxynitrit verursachten Oxidationen inhibiert.
  • MnTBAP inhibiert die Suppression der mitochondrialen Atmung durch authentisches Peroxynitrit in J774-Zellen: Die mitochondriale Atmung wurde bei Exposition gegenüber 1mM Peroxynitrit für eine Stunde tiefgreifend inhibiert (41A). Dieser Effekt wurde teilweise und dosisabhängig durch MnTBAP verhindert.
  • MnTBAP inhibierf die Suppression der mitochondrialen Atmung durch NO-Donoren in J774-Zellen: Die mitochondriale Atmung wurde auch durch die Exposition gegenüber den NO-Donor-Verbindungen SNAP (41B) und DNO für 24 Stunden inhibiert (41C). Dieser Effekt wurde teilweise und dosisabhängig durch MnTBAP verhindert.
  • Wirkungen von MnTBAP auf die NO-Produktion und die Suppression der mitochondrialen Atmung in immunstimulierfen J774-Makrophagen: Die Immunstimulierung der Zellen durch Lipopolysaccharid (LPS; 10 μg/ml) alleine und, stärker betont, in Gegenwart von γ-Interferon (IFN; 10 U/ml) resultierte in Nitrit/Nitrat-Bildung und einer deutlichen Inhibition der mitochondrialen Atmung. Die Verabreichung von IFN alleine induzierte keine detektierbare Nitrit/Nitrat-Produktion und verursachte nur eine milde (<15%) Suppression der Atmung (n = 12).
  • MnTBAP bewirkte eine dosisabhängige Inhibition der Nitrit/Nitrat-Produktion in mit LPS stimulierten Zellen. Bei Zellen, die mit der Kombination von LPS und IFN immunstimuliert worden waren, verursachte MnTBAP jedoch eine weniger deutliche Inhibition der Nitrit/Nitrat-Akkumulation (300 μM). Bei 100 μM und 300 μM bewirkte MnTBAP beispielsweise eine signifikante Inhibition von 63% und 86% der durch LPS induzierten Nitrit/Nitrat-Akkumulation. Bei Verabreichung in der gemeinsamen Gegenwart von LPS und IFN verursachten 100 μM MnTBAP nur eine 25%ige Inhibition der Nitrit/Nitrat-Akkumulation, und eine deutliche Inhibition (61%) wurde nur für die höchste getestete Konzentration an MnTBAP (300 μM) beobachtet. L-NMA (NG-Methyl-L-Arginin) verursachte eine nahezu vollständige Inhibition der Produktion von NO in den Zellen, die mit LPS oder mit LPS und IFN stimuliert worden waren; dabei hatte MnTBAP keine zusätzliche Wirkung auf die Bildung von Nitrit/Nitrat in Gegenwart von L-NMA. Die Inhibition der Nitrit/Nitrat-Akkumulation durch MnTBAP in mit LPS stimulierten Makrophagen verringerte sich um mehr als 50%, wenn das Mittel 6 Stunden nach LPS verabreicht wurde, wogegen es im Fall der Inhibition durch L-NMA so war, dass das beobachtete Ausmaß der Inhibition ähnlich war, wenn die Verbindung zusammen mit LPS oder 6 Stunden nach diesem verabreicht wurde (n = 6).
  • MnTBAP verursachte eine dosisabhängige partielle Wiederherstellung der durch die Immunstimulation induzierten Suppression der mitochondrialen Atmung sowohl bei mit LPS behandelten als auch (weniger potent) bei mit LPS und IFN behandelten Zellen. Die Inhibition der NOS durch L-NMA verursachte eine Wiederherstellung der Atmung in einem Ausmaß, das mit dem von 300 μM MnTBAP vergleichbar war. Die kombinierte Verabreichung von 300 μM MnTBAP und 3 mM L-NMA verursachte eine zusätzliche Wiederherstellung der mitochondrialen Atmung. In Gegenwart von L-NMA und MnTBAP wurde die Atmung auf den Anfangsniveaus der mit LFS stimulierten Zellen wiederhergestellt, bliebt jedoch bei Zellen, die mit LPS und IFN stimuliert worden waren, unterhalb des Normalwerts.
  • Beispiel XIV
  • Schemata von Synthesereaktionen
  • Synthese von 10303 (42A)
  • 1. Methyl-2-methoxy-3-methyl-benzoat (1)
  • Zu einer magnetisch gerührten Lösung von 2-Hydroxy-3-methyl-benzoesäure (2,22 g, 14,6 mmol) fein gemahlenem wasserfreiem K2CO3 (8,06 g, 58,3 mmol) und Aceton (150 ml) wurde (CH3O)2SO2 (2,9 ml, 30,6 mmol) hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt und dann am Rückfluss erhitzt, bis die Analyse durch TLC anzeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war (1–2 Stunden). Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert, und der überschüssige K2CO3-Kuchen wurde gründlich mit Aceton gewaschen. Das Filtrat wurde eingedampft, und der Rückstand wurde erneut in EtOAc (100–125 ml) gelöst, und es wurde Triethylamin (ca. 5–9 ml) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 min gerührt, in einen Scheidetrichter überführt und nacheinander mit H2O (100 ml), 2N HCl (bis zum leicht sauren Zustand), H2O (100 ml) und Salzwasser (100 ml) gewaschen, dann getrocknet (mit Na2SO4), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Die Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel (Höhe des Kieselgels: 15 cm, Durchmesser: 3 cm, Elutionsmittel: 1:1 Hexane/Et2O) ergab 2,50 g (95%) an reinem (1).
  • 2. Methyl-2-methoxy-4-(α,α-dibrommethyl)benzoat (2)
  • Eine magnetisch gerührte Lösung von 1 (24,43 g, 135,6 mmol), NBS (54,41 g, 305, 7 mmol) und CCl4 (1 l) wurde für 6 Stunden einer 100 Watt-Lampe ausgesetzt. Die Analyse durch TLC zeigte, dass das Reaktionsgemisch aus den mono-, di- und tribromierten Benzoaten zusammengesetzt war, wobei das Dibromid das Hauptprodukt war. Das Reaktionsgemisch wurde mit H2O (200 ml) gequencht, dann wurde gesättigte Na2S2O3 (500 ml) hinzugegeben, um Br2 zu zerstören. Das Gemisch wurde in einen Scheidetrichter überführt, heftig geschüttelt und dann aufgetrennt. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na2SO4), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Das Rohspektrum der 1H-NMR zeigte, dass Methyl-2-methoxy-4-(α,α-dibrommethyl)benzoat das Hauptprodukt war, und dieses wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
  • 3. Methyl-4-formyl-2-methoxy-benzoat (3)
  • Das Rohprodukt 2 wurde in Aceton/H2O (200 ml, 83:17) gelöst, dann wurde AgNO3 (47,25 g, 278,2 mmol) hinzugegeben. Der Kolben wurde mit Folie bedeckt, um eine Zersetzung des AgNO3 durch Licht zu vermeiden. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2–3 Stunden gerührt, dann wurden die AgBr-Salze aus der Lösung herausfiltriert. Das Filtrat wurde mit EtOAc (400 ml) verdünnt, in einen Scheidetrichter überführt und dann mit gesättigter NaHCO3 (300 ml) gewaschen, um die Säure aus dem Aldehyd heraus zu extrahieren. Die organische Schicht wurde nacheinander mit H2O (300 ml) und Salzlösung (300 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Die Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel (Höhe des Kieselgels: 15 cm, Durchmesser: 5 cm, Elutionsmittel: 1:1 Hexane/Et2O) erbrachte 11,92 g (42%) an reinem Aldehyd (3).
  • 4. Methyl-4-formyl-2-hydroxy-benzoat (4)
  • Zu einer magnetisch gerührten Lösung von Methyl-4-formyl-2-methoxy-benzoat (3) (1,82 g, 9,37 mmol) in CH2Cl2 (35 ml) bei 0°C und unter N2 wurde tropfenweise 1 M BCl3 (18,7 ml, 16,7 mmol) hinzu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C für 10–30 min gerührt und dann mit H2O (50 ml) gequencht. Es wurde Ether (100 ml) zu dem Gemisch hinzugegeben, das dann in einen Scheidetrichter überführt und in Schichten aufgetrennt wurde. Die wässrige Schicht wurde mit Ether (35 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Die Chromatographie auf Kieselgel (Höhe des Kieselgels: 12,5 cm, Durchmesser: 5 cm, Elutionsmittel: 1:1 Hexane/Et2O) erbrachte 1,60 g (95%) des reinen Methyl-4-formyl-2-hydroxybezoats als Öl.
  • 5. Tetramethyl-2,2',2'',2'''-tetrahydroxy-4,4',4'',4'''-(21H,23H-porphin-5,10,15,20-tetrayl)tetrabenzoat (5)
  • In einen mit Folie bedeckten, 1 l fassenden 3-Halsrundbodenkolben, ausgestattet mit einem Rückflusskühler, Magnetrührer und einem N2-Einlass wurden Methyl-4-formyl-2-hydroxybenzoat (1,01 g, 5,6 mmol), Pyrrol (397 μl, 5,6 mmol) und trockenes CH2Cl2 (560 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 10–30 Minuten gerührt, dann wurde BF3-OEt2 (69 μl, 0,56 mmol) hinzugefügt. Das Ausmaß der Reaktion wurde durch UV-VIS-Spektrophotometrie verfolgt. Nach 1,5 Stunden bei Raumtemperatur wurde Tetrachlor-1,4-benzochinon (1,03 g, 4,2 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde am Rückfluss für 3,5 Stunden erhitzt. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen, dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft. Nach 2 chromatographischen Reinigungen auf Kieselgel wurden 0,38 g (30%) an (5) als violetter Feststoff erhalten.
  • Allgemeine Vorgehensweise bei der chromatographischen Reinigung von (5):
  • In einer Größenordnung des Aldehyds von 1 g wurde das Rohprodukt für gewöhnlich mit 2–3 g Kieselgel kombiniert, um ein Gemisch herzustellen, das dann für 2 getrennte chromatographische Reinigungen auf Kieselgel (Höhe des Kieselgels: 12–15 cm, Durchmesser: 5 cm) in 2 Chargen aufgeteilt wurde. Das erste verwendete Lösungsmittel war Ether 1:1 Hexane/Et2O oder 4:1 Hexane/EtOAc (in Abhängigkeit davon, wie sich das Porphyrin bei der TLC verhält), um Hydrochinon-Nebenprodukte und andere unpolare Verunreinigungen zu entfernen. Nachdem alle unpolaren Verunreinigungen entfernt worden waren, wurde das Elutionsmittel entweder durch CH2Cl2 oder durch CHCl3 ausgetauscht, um das Porphyrin zu eluieren.
  • 6. Trimethyl-2,2',2'',2'''-tetrahydroxy-4-benzoesäure-4',4'',4'''(porphin-5,10,15,20-tetrayl)tribenzoat-Mangan(III)chlorid (6)
  • Eine Lösung von 5 (0,38 g, 0,42 mmol) und MnCl2 (0,26 g, 2,1 mmol) in DMF (25 ml) wurde am Rückfluss für 1,5 Stunden erhitzt, dann wurde für 1,5 Stunden Luft eingesprudelt, während die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlte. Das DMF wurde unter reduziertem Druck verdampft, dann wurde der Rückstand mit Kieselgel (1 g) und CH2Cl2 (10 ml) gemischt, um eine Aufschlämmung herzustellen. Das CH2Cl2 wurde verdampft, wonach ein Feststoffgemisch zurückblieb, das im trockenen Zustand auf eine Säule geladen wurde, die mit Kieselgel gepackt war (Höhe der Säule: 12,5 cm, Durchmesser: 5 cm; Elutionsmittel: 3% McOH/CH2Cl2). Die voranschreitende Reinigung erbrachte 124 mg (32%) an reinem 6 als dunkelgrünen Feststoff. (SP: > 300°C; UV-VIS λmax 467 nm (131.000); die FAB-MS, berechnet für C52H34MnN4O12, war 949, gefunden wurde 949.)
  • Synthese von 10204 (42B)
  • 7. 4,4',4'',4'''-(21H,23H-porphin-5,10,15,20-tetrayl)-tetrakis(benzonitril) (7)
  • In einen mit Folie bedeckten, 2 l fassenden 3-Hals-Rundbodenkolben, ausgestattet mit einem Rückflusskühler, Magnetrührer und einem N2-Einlass wurden 4-Formyl-benzonitril (1,13 g, 8,6 mmol), Pyrrol (0,6 ml, 8,6 mmol) und CH2Cl2 (850 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten gerührt, dann wurde BF3-OEt2 (105 μl, 0,85 mmol) hinzugefügt. Das Ausmaß der Reaktion wurde durch UV-VIS-Spektrophotometrie verfolgt. Nach 2 Stunden wurde Tetrachlor-1,4-benzochinon (1,56 g, 6,34 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde am Rückfluss für 2 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf ein Volumen von 50–100 ml eingedampft und dann zu 2,8 g Kieselgel hinzugefügt. Es wurde dann der Rest des Lösungsmittels unter reduziertem Druck verdampft, um ein Feststoffgemisch für chromatographische Reinigungen zu erhalten. Nach 3 getrennten Reinigungen wurden 700 mg (46%) an reinem (7) als pulveriger violetter Feststoff erhalten.
  • 8. 1,1',1'',1'''-Tetra-(1H-tetrazol-5-yl)-4,4',4'',4'''-(21H,23H-porphin-5,10,15,20-tetrayl)tetrakisbenzol (8)
  • Eine Lösung von 7 (0,30 g, 0,42 mmol), NaN3 (0,24 g, 3,69 mmol), NH4Cl (0,18 g, 3,37 mmol) und DMF (25 ml) wurde für 3 Tage auf 120°C erhitzt. Es wurde zusätzliches NaN3 (0,17 g, 2,59 mmol) und NH4Cl (0,11 g, 2,05 mmol) portionsweise während Tag 2 hinzugefügt, um die Reaktion zur Vollständigkeit zu treiben. Das DMF wurde unter reduziertem Druck verdampft, dann wurde kaltes H2O (10 ml) hinzugegeben. Die resultierende Lösung wurde mit 6N HCl angesäuert, dann wurde CH2Cl2 (10 ml) hinzugegeben. Das resultierende Präzipitat wurde gesammelt und unter Vakuum getrocknet, um 0,37 g (99%) an 8 als grünlichen Feststoff bereitzustellen, der ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
  • 9. 1,1',1'',1'''-Tetra-(1H-tetrazol-5-yl)-4,4',4'',4'''-(porphin-5,10,15,20-tetrayl)tetrakisbenzol-Mangan(III)chlorid (9)
  • Eine Lösung von 8 (0,35 g, 0,4 mmol) und MnCl2 (0,25 g, 2 mmol) in DMF (20 ml) wurde am Rückfluss für 4–5 Stunden erhitzt. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen, dann wurde das DMF unter reduziertem Druck verdampft. Das Rohprodukt wurde auf 1,5 g Kieselgel mit 10–15 ml CH2Cl2 adsorbiert. Das CH2Cl2 wurde unter Zurückbleiben eines Feststoffs eingedampft, der im trockenen Zustand auf eine Säule geladen wurde, die mit einer Kieselgelaufschlämmung gepackt war (Höhe des Kieselgels: 12,5 cm, Durchmesser: 5 cm, Elutionsmittel: 6 CHCl2/3 MeOH/1 NH4OH). Die chromatographische Reinigung erbrachte 0,19 g (50%) an reinem 9 als dunkelgrünem Feststoff. (SP: >320°C; UV-VIS λmax 468 nm (42.000); FAB-MS berechnet für C48H28MnN20: 939; gefunden: 939).
  • Synthese von 10305 (42C)
  • 10. Methyl-3-methoxy-4-methyl-benzoat (10)
  • Zu einer magnetisch gerührten Lösung von 3-Hydroxy-4-methyl-benzoesäure (15,1 g; 99,2 mmol), fein gemahlenem wasserfreiem K2CO3 (43,7 g, 317 mmol) und Aceton (250 ml) wurde (MeO)2SO2 (21 ml, 222 mmol) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt und das überschüssige K2CO3 wurde abfiltriert. Das Aceton wurde durch Verdampfen entfernt und der Rückstand wurde erneut in EtOAc (250 ml) gelöst, und es wurde dann Et3N (15 ml) hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 30 min gerührt, in einen Scheidetrichter überführt und nacheinander mit H2O (100 ml), 1 N HCl (bis zum leicht sauren Zustand), NaHCO3 (100 ml), R2O (100 ml) und Salzwasser (100 ml) gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Die Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel (Höhe des Kieselgels: 25 cm, Durchmesser: 4 cm, Elutionsmittel: 1:1 CH2Cl2/Hexane) ergab 16,84 g (94%) an reinem 10.
  • 11. Methyl-4-formyl-3-methoxy-benzoat (11)
  • Zu einer magnetisch gerührten Lösung von 10 (5,87 g, 32,6 mmol) in 1:1 CH3CN/H2O (250 ml) wurden nacheinander CuSO4·5H2O (8,13 g, 32,6 mmol) und K2S2O8 (26,4 g, 97,7 mmol) hinzu gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde am Rückfluss für 50 min erhitzt, dann in einen Scheidetrichter überführt und mit EtOAc (2 × 100 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Na2SO4 getrocknet, gefiltert und eingedampft. Die Reinigung auf Kieselgel durch Schwerkraft-basierte Chromatographie (Höhe des Kieselgels: 33 cm, Durchmesser: 4 cm, Elutionsmittel 5:1 Hexane/EtOAc, dann 4:1 Hexane/EtOAc) erbrachte 1,47 g (23%) an reinem 11.
  • 12. Tetramethyl-3,3',3'',3'''-tetramethoxy-4,4',4'',4'''-(21H,23H-porphin-5,10,15,20-tetrayl)tetrabenzoat (12)
  • In einen mit Folie bedeckten, 2 1 fassenden 3-Halsrundbodenkolben, ausgestattet mit einem Rückflusskühler, Magnetrührer und einem N2-Einlass wurden Methyl-4-formyl-3-methoxybenzoat (11) (1,23 g, 6,3 mmol), Pyrrol (448 μl, 6,3 mmol) und trockenes CH2Cl2 (630 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 15 Minuten gerührt, dann wurde BF3-OEt (78 μl, 0,63 mmol) hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch UV-VIS-Spektrophotometrie verfolgt. Nach 3 Stunden wurde Tetrachlor-1,4-benzochinon (1,17 g, 4,7 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde am Rückfluss für 2,5 Stunden erhitzt. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen und verdampfte das Lösungsmittel dann im Vakuum. Das Rohprodukt wurde auf 2,6 g Kieselgel mit 10–15 ml CH2Cl2 gegeben. Das CH2Cl2 wurde verdampft, und das resultierende Gemisch wurde in 3 gleiche Portionen für drei getrennte chromatographische Reinigungen aufgeteilt. Jede Portion wurde separat im trockenen Zustand auf eine Säule geladen, die mit Kieselgel gepackt war (Höhe des Kieselgels: 15 cm, Durchmesser: 5 cm, Elutionsmittel: 1:1 Hexane/Et2O, dann CH2CH2). Das vereinte Produkt, 0,461 g (30%) an reinem 12 wurde als Gemisch der Rotationsisomere erhalten.
  • 13. Tetramethyl-3,3',3'',3'''-tetramethoxy-4,4',4'',4'''-(porphin-5,10,15,20-tetrayl)-tetrabenzoat-Mangan(III)chlorid (13)
  • Eine Lösung von 12 (0,32 g, 0,33 mmol) und MnCl2 (0,20 g, 1,56 mmol) in DMF (32 ml) wurde für 6,5 Stunden am Rückfluss erhitzt. Es wurde dann für 1,25 Stunden Luft in die Lösung eingesprudelt, während das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlte. Das DMF wurde durch Verdampfen entfernt und das Rohgemisch wurde auf 1,5 g Kieselgel mit 10–15 ml CH2Cl2 adsorbiert. Das CH2Cl2 wurde durch Verdampfen entfernt, und das resultierende Feststoffgemisch wurde im trockenen Zustand auf eine Säule geladen, die mit Kieselgel gepackt war (Höhe des Kieselgels: 12,5 cm, Durchmesser: 5 cm, Elutionsmittel: 5% MeOH in CH2Cl2). Die chromatographische Reinigung erbrachte 294 mg (84%) an reinem 13 als grünschwarzen Feststoff. (SP: >300°C; UV-VIS λmax 467 nm (145.000); FAB-MS berechnet für C56H44MnN4O12: 1019, gefunden: 1019.)
  • 14. 3,3',3'',3'''-Tetramethoxy-4,4',4'',4'''-(porphin-5,10,15,20-tetrayl)tetrakis(benzoesäure) (14)
  • Eine magnetisch gerührte Lösung von manganiertem Tetrabenzoat 13 in einem 10 ml Claisen-Behälter (mit KOH/MeOH/H2O) wurde am Rückfluss für 40–60 min erhitzt. Der Reaktionsansatz wurde auf Raumtemperatur, dann auf 0°C abgekühlt. Die kalte Lösung wurde dann mit 6N HCl angesäuert, wonach das MeOH unter reduziertem Druck verdampft wurde. Die Feststoffe wurden aus der sauren Lösung abfiltriert und gründlich mit kaltem Wasser gewaschen. Die Feststoffe wurden gesammelt und unter Vakuum bei 80°C über Nacht getrocknet, um 96 mg (87%) an reinem 14 als dunkelgrünen Feststoff zu erhalten (SP: >300°C; UV-VIS λmax 467 nm (150.000); FAB-MS, berechnet für C52H36MnN4O12: 963, gefunden: 963).
  • Synthese von 10109 (42D)
  • 15. 4,4',4'',4'''-(Porphin-5,10,15,20-tetrayl)-tetrakis(benzoylchlorid)-Mangan(III)chlorid (15)
  • MnTBAP (500 mg, 0,57 mmol) wurde in trockenem Benzol (125 ml) in einem 3-Halsrundbodenkolben, ausgestattet mit einem Rückflusskühler und einem N2-Einlass, suspendiert. Es wurde Thionylchlorid (45 ml; 617 mmol) zu dem Gemisch hinzugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde am Rückfluss für 22 Stunden erhitzt. Das Benzol und das nicht umgesetzte SOCl2 wurden durch Destillation entfernt. Der Rückstand wurde mit trockenem Benzol (50 ml) gewaschen und auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit eingedampft. Dieses Waschen und Eindampfen wurde zweimal wiederholt. Der dunkelgrüne Rückstand wurde unter Hochvakuum getrocknet, um 0,54 g (100%) Produkt zu erhalten.
  • 16. Tetra(N,N-dimethyl)-4,4',4'',4'''-(porphin-5,10,15,20-tetrayl)-tetrakis(benzamid)-Mangan(III)chlorid (16)
  • Zu Verbindung 15 (340 mg, 0,36 mmol) in THF (20 ml) wurde Dimethylamin in THF-Lösung (10 ml, 2 M Lösung) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 6 Stunden am Rückfluss erhitzt. Die TLC-Analyse (Elutionsmittel: 1 Methanol : 3 Chloroform) zeigte eine vollständige Umsetzung des Säurechlorids zum Produkt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde deionisiertes Wasser (100 ml) zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben, und der Feststoff wurde abfiltriert. Der Rohfeststoff wurde durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Methylenchlorid:Methanol = 4:1 als Elutionsmittel) gereinigt. Die kombinierten Fraktionen (Rf = 0,75 in CH2Cl2:MeOH = 4:1) wurden eingedampft und unter Hochvakuum getrocknet, um das Produkt als grünen Feststoff bereitzustellen: 0,11 g (31%). (UV-VIS λmax 467 nm (55, 100); FAB-MS berechnet für C56H45MnN8O4: 952, gefunden: 952.)
  • Synthese von 10402, 10602, 11001, 11002, 11003 und 11103
  • Was die Verbindungen 10402, 10602, 11001, 11002, 11003 und 11103 betrifft, so kann die Synthese im wesentlichen so durchgeführt werden, wie in Beispiel XIV, Abschnitte 5 und 6 beschrieben, wobei die folgenden Austausche bei den Ausgangsstoffen erforderlich sind: 4-Hydroxybenzaldehyd statt Methyl-4-formyl-2-hydroxybenzoat im Falle von 10402, 4-Hydroxy-3-nitrobenzaldehyd statt Methyl-4-formyl-2-hydroxybenzoat im Fall von 10602, Indol-3-carboxaldehyd statt Methyl-4-formyl-2-hydroxybenzoat im Fall von 11001, 4-Chinolincarboxaldehyd statt Methyl-4-formyl-2-hydroxybenzoat im Fall von 11002, 3-Chinolincarboxaldehyd statt Methyl-4-formyl-2-hydroxybenzoat im Fall von 11003 und 3-Fluor-4-methoxybenzaldehyd statt Methyl-4-formyl-2-hydroxybenzoat im Fall von 11103.
  • Synthese von 10207 und 10208
  • Acetonitril wird mit Hydroxylamin umgesetzt, um das Amidoxim herzustellen. Man lässt einen Überschuss des Amidoxims mit dem in Beispiel XIV, Abschnitt 15 beschriebenen Produkt reagieren, um ein Gemisch von 10207 und 10208 bereitzustellen. Die chromatographische Reinigung des Reaktionsgemischs liefert reines 10207 und 10208.
  • Synthese von 10209
  • Kommerziell erhältliche 4-Methylbenzoesäure wird durch Reaktion mit Oxalylchlorid oder Thionylchlorid in das Säurechlorid umgewandelt. Das resultierende Säurechlorid wird in Gegenwart von Kupfercyanid erhitzt, um das α-Ketonitril-Derivat bereitzustellen. Das α- Ketonitril wird hydrolysiert mit wasserfreiem Methanol, der mit wasserfreiem Chlorwasserstoffgas gesättigt ist, um das α-Ketonitrilesterderivat zu ergeben. Eine effiziente Oxidation der aromatischen Methylgruppe zum Oxidationszustand des Aldehyds erfolgt dadurch, dass zuerst eine Reaktion mit N-Bromsuccinimid durchgeführt wird, gefolgt von einer Hydrolyse mit Silbernitrat. Die Synthese von 10209 kann im wesentlichen gemäß der Beschreibung in Beispiel XIV, Abschnitte 5 und 6, erfolgen, wobei ein Austausch der Ausgangssubstanz Methyl-4-formyl-2-hydroxybenzoat mit dem hier eben beschriebenen Aldehyd erforderlich ist.
  • Ein Fachmann auf dem Gebiet wird beim Lesen dieser Offenbarung erkennen, dass zahlreiche Änderungen hinsichtlich Form und Detail vorgenommen werden können, ohne vom tatsächlichen Schutzbereich der Erfindung abzuweichen. Zusätzlich zu den hier offenbarten Verbindungen, können Verbindungen, die in den folgenden Literaturstellen offenbart sind, ebenfalls als Oxidantienfänger, die mit der vorliegenden Erfindung konsistent sind, verwendet werden: US-Patent 5,227,405; Nagele et al., Biochem. Pharmacol (UK) 47: 555–562 (1994); Baudry et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 192: 964–968 (1993); Duran et al. Cancer Lett. (IRE) 69 : 167–172 (1993); Itami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 197 : 536–541 (1993); Kitajima et al., Inorg. Chem. 32 : 1879–1880 (1993); Riley et al., Free Radical Biol. & Med. 15 514 (1993); Weiss et al., J. Biol. Chem. (US) 268: 23049–23054 (1993); Foye, Ann. Pharmacother. 26: 1144–1147 (1992); Haseloff et al., J. Biolmun. Chemilumin. (UK) 7: 171–175 (1992); Pelletier, J., Biochem. Pharmacol. 43: 1061–1066 (1992); Yaping et al., J. Free Radic. BioIMed 13 : 533–541 (1992); Schechinger et al., Biol. Met. 1:112 (1968); Linss et al., Inorg. Chim. Acta 125:117 (1986); und Weser et al., Adv. Exp. Med. Biol. 254:51 (1990).
  • Fußnote zu Tabelle IX:
    • 1 Die Porphinkohlenstoffzahlen beziehen sich auf die Methinbrückenkohlenstoffe (5, 10, 15, 20), an denen jede der R-Gruppen angeheftet ist, oder auf den Pyrrolkohlenstoff (2, 4, 7, 8, 12, 13, 17 oder 18), an dem P angeheftet ist. P ist Wasserstoff, sofern nicht anders definiert.
    • 2 SOD-Aktivität, bestimmt gemäß der Beschreibung von McCord und Fridovich, J. Biol. Chem. 244: 6049 (1969).
    • 3 Katalaseaktivität, bestimmt gemäß der Beschreibung von Del Rio et al., Anal. Biochem. 80: 409 (1977). Die Metalloporphyrine wurden bei verschiedenen Konzentrationen in Gegenwart von 1 mM Wasserstoffperoxid auf Katalase-artige Aktivität hin getestet. Es wurde eine Clark-Elektrode verwendet, um die Bildung von Sauerstoff aus dem Abbau von Wasserstoffperoxid über eine Zeitspanne von 2 Minuten zu messen.
    • 4 Die Wachstumsgeschwindigkeiten von Kulturen von SODnull-E.coli (Stamm J1132) wurden turbidimetrisch bei 700 nm verfolgt, um Interferenzen zu minimieren, die von einer Extinktion durch die Testverbindungen herrühren. Das Wachstumsmedium enthielt 0,2% Glucose, 0,2% Casaminosäuren, 30 mg/l Thiamin, 30 mg/l Pantothensäure und M9-Salze in Wasser, mit einem auf 7,0 eingestellten pH. Die Testverbindungen wurden vor der Zugabe zum Medium sterilfiltriert (Faulkner et al., J. Biol. Chem. 269:23471 (1994)). 5 Die Anzucht der humanen Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) (ATCC #CRL-1730) (Moldow et al., Methods in Enzymology 105: 378–385 (1984)) erfolgte in Ham's F-12 K-Medium, das mit 10% fetalem Rinderserum, 0,1 mg Heparin und 0,03 mg/ml an Endothelzellwachstumsfaktor supplementiert war, in T-75 Kulturkolben in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid und 95% Luft. Die Zellen wurden mit ~3,5 × 104 Zellen/Well in 24-Well-Platten ausplattiert. Die Versuche wurden 48 Stunden später durchgeführt. Zu Beginn jeder Studie wurde das Medium mit EMEM ohne Serum-Supplementierung, jedoch mit Heparin und Endothelzellwachstumsfaktor, ausgetauscht. Die Stammlösungen von D-Aminosäure-Oxidase und Metalloporphyrinen wurden vor der Verwendung in EMEM verdünnt und durch einen 0,2cc-Filter geleitet. Die HUVEC-Zellen wurden mit 52Cr markiert, indem man sie für vier Stunden in EMEM inkubierte, das radioaktiv markiertes Natriumchromat enthielt, und zwar mit einer Isotopenkonzentration von 20 μCi/106 Zellen. Nicht eingebautes 52Cr wurde durch wiederholtes Waschen in EMEM entfernt. Die Verletzung wurde initiiert durch eine Inkubation der Endothelzellen für 5 Stunden mit einem Wasserstoffperoxid-erzeugenden System, bestehend aus D-Alanin (1 mM) und 40 mU/ml an D-Aminosäure-Oxidase in EMEM. Die D-Aminosäure-Oxidase findet sich in PMNs (polymorphkernige Leukozyten), und man nimmt an, dass sie einen Teil des oxidativen „Feuerstoßes" ist, der einen Schlüsselbestandteil der durch PMN vermittelten Entzündungsantwort darstellt (Robinson et al., J. Cell Biology, 77:59 (1978); Cline et al., Microbiology 62:756 (1969); De Chatelet J. Reticul. Soc. 24:73 (1978)). Am Ende der Inkubationsperiode wurde der Überstand aus jedem Well gesammelt, die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann mit 0,4N Natriumhydroxid lysiert. Die Radioaktivität sowohl in den Überständen als auch in den Zelllysaten wurde jeweils separat in einem gamma-Zähler gemessen. Es wurde ein Set von Wells in jeder Platte verwendet, um die basale Freisetzung von 51Cr aus HUVEC, die alleine in EMEM inkubiert wurden, zu messen. Die Freisetzung von 51Cr wurde ausgedrückt als Prozentsatz der Radioaktivität im Überstand gegenüber der Gesamt-Radioaktivität [(51Cr im Überstand + 51Cr im Lysat) × 100].
  • Figure 00830001
  • Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001

Claims (13)

  1. Oxidantienfänger der Formel
    Figure 00880001
    oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Metallkomplex davon, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen, worin jeder R1' unabhängig voneinander
    Figure 00880002
    Figure 00880003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00880004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00880005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt, jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist, jeder R3' unabhängig voneinander -Y'', -Y''', -H, -OH, -OY'', -NO2, -CN, -NH2, -COOH, -COY'', -COO– oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist, wobei R3' nicht COOH, COY'' oder COO– ist, wenn
    Figure 00890001
    wobei R3' nicht -NO2 ist, wenn
    Figure 00890002
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht
    Figure 00890003
  2. Fänger nach Anspruch 1, wobei Y''' ein sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist und jede Wasserstoffaustauschgruppe an dem Aminstickstoff eine C1-C4-Alkylgruppe ist.
  3. Fänger nach Anspruch 1, wobei der Fänger die folgende Struktur hat
    Figure 00890004
  4. Fänger nach Anspruch 1, wobei der Fänger die folgende Struktur hat
    Figure 00900001
  5. Fänger nach Anspruch 1, wobei der Fänger die folgende Struktur hat
    Figure 00900002
  6. Verfahren zum Schützen von Pflanzenzellen vor durch Oxidantien induzierter Toxizität, bei dem man die Zellen mit einer nichttoxischen Menge eines Fängers der Formel
    Figure 00910001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon oder eines Metallkomplexes davon, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen, worin jeder R1' unabhängig voneinander eine Bindung,
    Figure 00910002
    Figure 00910003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00910004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00910005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt, jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist, jeder R3' unabhängig voneinander -Y'', -Y''', -H, -OH, -OY'', -NO2, -CN, -NH2, -COOH, -COY'', -COO– oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist, wobei R3' nicht COOH, COY'' oder COO– ist, wenn
    Figure 00910006
    wobei R3' nicht -NO2 ist, wenn
    Figure 00910007
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht -H, sind, in Kontakt bringt, die ausreicht, den Schutz zu bewirken.
  7. Verwendung eines Fängers nach Anspruch 6 bei der Herstellung eines Medikaments für den Schutz von Säugerzellen vor durch Oxidantien induzierter Toxizität durch Inkontaktbringen der Zellen mit einer nichttoxischen Menge des Fängers, die ausreicht, den Schutz zu bewirken.
  8. Verwendung eines Fängers der Formel
    Figure 00920001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon oder eines Metallkomplexes davon, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen, worin jeder R1' unabhängig voneinander eine Bindung,
    Figure 00920002
    Figure 00920003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00920004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00920005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt, jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist, jeder R3' unabhängig voneinander -Y'', -Y''', -H, -OH, -OY'', -NO2, -CN, -NH2, -COOH, -COY'', -COO– oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist, wobei R3' nicht COOH, COY'' oder COO– ist, wenn
    Figure 00920006
    wobei R3' nicht -NO2 ist, wenn
    Figure 00930001
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht -H, sind, bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von Xanthinoxidase-Aktivität einer Zelle oder eines Gewebes durch Inkontaktbringen der Zelle oder des Gewebes mit einer Menge des Fängers, die ausreicht, die Hemmung zu bewirken.
  9. Verwendung eines Oxidantienfängers der Formel
    Figure 00930002
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, wobei R1 eine Bindung,
    Figure 00930003
    Figure 00930004
    ist, wobei X ein Halogen und Y eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00930005
    eine Bindung an R2 an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00930006
    eine Bindung an R2 und den Substituenten an irgendeiner Position angibt, und R2 eine Bindung, -(CY'2)n –, -(CY'2-CY'=CY')n –, -(CY'2-CY'2-CH=CH)n –, -(CY'=CY')n oder -(CY'2-CO)n – ist, wobei Y' Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist und wobei n 1 bis 8 ist und R3 -Y'', -OH, -NH2, -N+(Y'')3, -COOH, -COO–, -SO3H, -SO3 –, -CH2-PO3H2 oder -CH2-PO3H– ist, wobei Y'' eine Alkylgruppe ist, wahlweise komplexiert mit einem Metall, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen, ausreichend, die Modulierung zu bewirken, bei der Herstellung eines Medikaments zum Modulieren der NO-Funktion als ein Neurotransmitter in einem Säuger durch Inkontaktbringen des Säugers mit einer Menge des Oxidantienfängers.
  10. Verwendung eines Oxidantienfängers der Formel
    Figure 00940001
    oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon oder eines Metallkomplexes davon, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen, worin jeder R1' unabhängig voneinander eine Bindung,
    Figure 00940002
    Figure 00940003
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00940004
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00940005
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt, jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist, jeder R3' unabhängig voneinander -Y'', -Y''', -H, -OH, -OY'', -NO2, -CN, -NH2, -COOH, -COY'', -COO– oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist, wobei R3' nicht COOH, COY'' oder COO– ist, wenn
    Figure 00950001
    wobei R3' nicht -NO2 ist, wenn
    Figure 00950002
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht -H, sind, bei der Herstellung eines Medikaments zum Modulieren der NO-Funktion als ein Neurotransmitter in einem Säuger durch Inkontaktbringen des Säugers mit einer Menge des Oxidatnienfängers, die ausreicht, um diese Modulation zu bewirken.
  11. Kit, welcher den Fänger nach Anspruch 1 in einem Behälter untergebracht enthält.
  12. Oxidantienfänger der Formel
    Figure 00950003
    oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Metallkomplex davon, wobei das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mangan, Kupfer und Eisen, worin jeder R1' unabhängig voneinander eine Bindung,
    Figure 00950004
    Figure 00950005
    wobei Y'' eine Alkylgruppe ist und wobei
    Figure 00960001
    eine Bindung an R2' an irgendeiner Position angibt und
    Figure 00960002
    eine Bindung an R2' und den R1'-Phenylsubstituenten an irgendeiner Position angibt, jeder R2' unabhängig voneinander eine Bindung oder -(CH2)n- ist, wobei n 1–4 ist, jeder R3' unabhängig voneinander -Y''', -COY'' oder eine heterozyklische Gruppe ist, wobei Y'' wie oben definiert ist und Y''' ein primäres, sekundäres, tertiäres oder quaternäres Amin ist, wobei R3' nicht COY'' ist, wenn
    Figure 00960003
    wobei -R1'-R2'-R3' gemeinsam nicht
    Figure 00960004
  13. Fänger nach Anspruch 12, wobei der Fänger die folgende Struktur hat
    Figure 00960005
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