DE69620814T2

DE69620814T2 - Monoklonäler Antikörper gegen die R2-Untereinheit von Ribonukleotid-Reduktase

Info

Publication number: DE69620814T2
Application number: DE69620814T
Authority: DE
Inventors: Akiko Furuya; Nobuo Hanai; Toshiaki Kamei; Toshiaki Saeki; Takeshi Takahashi; Motoo Yamasaki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1995-02-07
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2016-02-08
Also published as: EP0726277B1; EP0726277A2; ES2173248T3; DE69620814D1; CA2169024A1; ATE216709T1; US5885830A; EP0726277A3

Description

Hinterrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit einer Ribonucleotid-Reduktase R2-Untereinheit reagiert und der die Ribonucleotid- Reduktase-Aktivität hemmt, sowie eine Hybridomzelllinie, die den monoclonalen Antikörper produziert. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum immunologischen Nachweis einer Ribonucleotid-Reduktase R2-Untereinheit unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers.
Eine Ribonucleotid-Reduktase (hier nachstehend als "RNR" bezeichnet) ist ein Enzym, das die Reduktion von Ribonucleosiddiphosphat in Desoxyribonucleosiddiphosphat katalysiert, das ein Teil in der DNA ist. Da die RNR-Aktivität stark mit einer Zellproliferationsrate korreliert und da Desoxyribonucleotid sich nicht in Zellen ansammelt, kontrolliert die RNR einen Geschwindigkeits bestimmenden Schritt der DNA-Synthese (Annu. Rev. Biochem., 48, 133-158, 1979) und kann als ein Zellzyklusmarker und ein Proliferationsmarker betrachtet werden. Tatsächlich ist bekannt, dass die RNR-Aktivität abhängig vom Zellzyklus ansteigt oder abfällt und dass die Menge an RNR-Aktivität in der G0/G1-Phase niedriger und am höchsten in der S-Phase ist. RNR besteht aus zwei Untereinheiten R1 und R2, von denen keine von beiden allein irgendeine Aktivität besitzt. Es ist berichtet worden, dass, da die R1-Untereinheit immer konstant und ausreichend exprimiert wird, die RNR-Aktivität durch die Menge der exprimierten R2-Untereinheit kontrolliert wird, deren Menge vom Zellzyklus abhängt (JBC, 256 (18), 9436-9440, 1981). Es ist weiter berichtet worden, dass die Menge an RNR-Aktivität in menschlichem Tumorgewebe höher ist als in menschlichem normalem Gewebe (Life Science, 28, 1007-1014, 1981) und dass die RNR als ein Tumormarker und ein Tumorproliferationsmarker verwendet werden kann.
Ein herkömmliches Verfahren zur Bestimmung der RNR-Aktivität (Analytical Biochemistry, 34, 123-130, 1970) ist aufgrund der Schwierigkeit der Bestimmung der in einem Gewebe verteilten Aktivität der RNR nicht zufriedenstellend. Ein einfaches und genaues Verfahren zum Nachweis der RNR war gefragt.
Ein monoclonaler Anti-RNR-Antikörper, der mit einer R1-Untereinheit reagiert und der die RNR-Aktivität hemmt, war bekannt (Acta Chem. Scand., B36 (5), 343, 1982). Ein monoclonaler Antikörper, der mit einer R2-Untereinheit reagiert, war bekannt (EMBO Journal, 7 (6), 1615, 1988). Aber der bekannte monoclonale Antikörper, der mit der R2- Untereinheit reagiert, hemmt die RNR-Aktivität nicht.
Die vorliegende Erfindung liefert einen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit einer R2-Untereinheit der menschlichen RNR reagiert und der die RNR-Aktivität hemmt.
Der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist ein neutralisierender Antikörper gegen RNR und hemmt folglich die RNR-Aktivität, abhängig von den Konzentrationen des monoclonalen Antikörpers.
Mittels Western-Blot und Immunpräzipitation unter Verwendung des vorliegenden monoclonalen Antikörpers wurde gefunden, dass der vorliegende monoclonale Antikörper mit einem Protein reagiert, das ein Molekulargewicht von 45 KDalton hat, was mit dem Molekulargewicht der R2-Untereinheit von RNR übereinstimmt. Weiter wurde durch immunologische Färbung von Kulturzellen und verschiedenen menschlichen Geweben mit dem vorliegenden monoclonalen Antikörper gefunden, dass der monoclonale Antikörper RNR spezifisch in den Zellen und menschlichen Geweben nachweisen kann.
Der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist nicht nur zum immunologischen Nachweis einer R2-Untereinheit der RNR in Geweben und Zellen brauchbar, sondern auch zur Untersuchung der biologischen Merkmale der RNR. Folglich wird erwartet, dass die grundlegende Untersuchung von Krebs durch die Analyse der RNR gefördert wird.
Gemäss einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher ein monoclonaler Antikörper bereitgestellt, der spezifisch mit einer R2-Untereinheit der menschlichen RNR reagiert (hier nachstehend als RNR·R2-Untereinheit bezeichnet) und der die RNR-Aktivität hemmt. Der monoclonale Antikörper kann von KM1054 (FERM BP-4875) stammen.
Gemäss einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Hybridomzelllinie bereitgestellt, die den monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung produziert. Die Hybridomzelllinie kann KM1054 (FERM BP-4875) sein.
Weiter wird gemäss weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum immunologischen Nachweis der RNR·R2-Untereinheit bereitgestellt, sowie ein Verfahren zum immunologischen Nachweis der Anwesenheit menschlicher Krebszellen unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung, wobei die Verfahren nicht in einem lebenden menschlichen oder tierischen Körper ausgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt nur mittels eines Beispiels beschrieben werden, in dem auf die folgenden Figuren verwiesen wird:
Fig. 1 ist ein Graph, der die Reaktivität zeigt, wenn die monoclonalen anti-RNR·R2- Untereinheit-Antikörper KM1054, KM1056 und KM1060 mit dem C-terminalen Peptid der R2-Untereinheit im Enzymimmuntest reagierten.
Fig. 2 zeigt die Reaktivität der monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper KM1054, KM1056 und KM1060 mit der von HelaS&sub3;-Zellen stammenden RNR-Rohfraktion im Western-Blot. In der Zeichnung bezeichnet + die Reaktivität, wenn der mit dem C- terminalen Peptid der RNR-R2-Untereinheit reagierte Antikörper zugegeben wurde, und - bezeichnet die Reaktivität, wenn der Antikörper als solcher zugegeben wurde.
Fig. 3 zeigt die Reaktivität der monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper KM1054, KM1056 und KM1060 mit den von HelaS&sub3;-Zellen stammenden RNR- Rohfraktionen in der Immunpräzipitation. In der Zeichnung bezeichnet + die Reaktivität, wenn der mit dem C-terminalen Peptid der RNR·R2-Untereinheit reagierte Antikörper zugegeben würde, und - bezeichnet die Reaktivität, wenn der Antikörper als solcher zugegeben wurde.
Fig. 4 ist ein Graph, der die RNR-hemmende Aktivität der monoclonalen anti- RNR·R2-Untereinheit-Antikörper KM1054 und KM1056 zeigt.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Reaktivitäten der monoclonalen anti- RNR·R2-Untereinheit-Antikörper KM1054 und KM1056 mit verschiedenen Krebszellen in der immuncytochemischen Färbung mittels eines Zellsortiergeräts.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die Beziehung der Reaktivität des monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörpers und des monoclonalen anti- Wortmannin-Antikörpers KM1024 zum Zellzyklus mittels eines Zellsortiergeräts unter Verwendung der menschlichen T-Zelllymphomzelllinie CCRF-CEM analysiert wird.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die Beziehung der Reaktivität des monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörpers KM1054 und des monoclonalen anti-Wortmannin-Antikörpers KM1024 zum Zellzyklus mittels eines Zellsortiergeräts unter Verwendung von menschlichen peripheren Blutlymphocyten und menschlichen peripheren Blutlymphoblasten analysiert wird.
Die vorliegende Erfindung liefert den monoclonalen Antikörper, erhalten durch Fusion von Milzzellen einer mit einem C-terminalen Peptid einer R2-Untereinheit einer menschlichen RNR-Präparation immunisierten Ratte und murinen Myelomzelllinien, um Hybridome zu erzeugen, wobei aus den erhaltenen Hybridomen ein Hybridomclon ausgewählt wird, der einen monoclonalen Antikörper mit der Spezifität gegen eine RNR·R2- Untereinheit produziert, und der ausgewählte Hybridomclon in einem Medium gezüchtet wird oder der Hybridomclon einer Maus verabreicht wird, um dadurch die Hybridomzellvermehrung in der Aszitesflüssigkeit in der Maus zu verursachen.
Genauer wird das Verfahren zur Herstellung des monoclonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung nachstehend beschrieben.

(1) Immunisierung von Tieren und Herstellung von Antikörper produzierenden Zellen

Als Antigen wird ein Peptid, das an ein Trägerprotein wie KLH ("Keyhole lympet hemocyanin", hier nachstehend als "KLH" bezeichnet) und Rinderserumalbumin (hier nachstehend als "BSA" bezeichnet) mit einem Kreuzvernetzungsagens wie Glutaraldehyd und N-(m-Maleimidbenzoyloxy)succinimid (hier nachstehend als "MBS" bezeichnet) gebunden ist, verwendet.
3 bis 20 Wochen alte Mäuse oder Ratten werden mit C-terminalem Peptid einer R2-Untereinheit von menschlicher RNR mit der in Sequenz Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz, gebunden an das vorstehend erwähnte Trägerprotein, immunisiert, und Antikörper-produzierende Zellen werden aus Milz, Lymphknoten oder peripherem Blut der Tiere gewonnen.
Die Immunisierung wird allgemein durch Verabreichung des Antigens zusammen mit einem geeigneten Adjuvans, zum Beispiel Komplettes Freundsches Adjuvans, und einem Aluminiumhydroxidgel plus Pertussisvakzin an die Tiere subkutan, intravenös oder intraperitoneal durchgeführt.
Das Antigen wird wiederholt 5 bis 10 mal in Intervallen von ein bis zwei Wochen nach der ersten Antigenverabreichung verabreicht. 3 bis 7 Tage nach jeder Verabreichung wird Blut aus dem venösen Plexus des Augenhintergrunds entnommen, und das Serum aus der Blutprobe wird darauf getestet, ob es mit dem Antigen im enzymverbundenen Immunadsorptionstest reagiert (ELISA: Bericht, veröffentlicht in Igaku Shoin, 1976).
Die Mäuse oder Ratten, deren Serum einen ausreichenden Antikörpertiter gegen das zur Immunisierung verwendete Peptid aufweist, dienen als eine Quelle von Antikörperproduzierenden Zellen.
In der Fusion der Antikörper produzierenden Zellen und der Myelomzellen werden Milzzellen als die Antikörper produzierenden Zellen verwendet. Die Milz der immunisierten Maus wird 3 bis 7 Tage nach der letzten Verabreichung des Antigens herausgenommen, und die Milzzellen werden daraus gewonnen. Die Milz wird in einem minimalen essentiellen Medium (MEM) (hergestellt von Nissui Pharmaceutical) in Stücke geschnitten und mittels einer Pinzette gelockert. Nach Zentrifugation bei 1.200 UpM für 5 Minuten wird der Überstand dann verworfen, und der Rückstand wird mit einem Trisammoniumchloridpuffer (pH 7.65) für 1 bis 2 Minuten behandelt, um die Erythrocyten zu entfernen. Die restlichen Zellen werden mit MEM dreimal gewaschen und als Splenocyten zur Zellfusion verwendet.

(2) Herstellung von Myelomzellen

Als Myelomzellen wird eine aus einer Maus erhaltene Zelllinie verwendet. Zum Beispiel können Myleomzelllinien aus der 8-Azaguanin-resistenten Maus (abgeleitet von BALB/c), P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1- 7 (1978), und European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], 5P2/0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276, 269-270 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) 1% Immunology, 123, 1548-1550 (1979)] und P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495-497 (1975)] verwendet werden. Diese Zeillinien sind in einem 8-Azaguanin-Medium RPMI-1640 cloniert [Medium mit Glutamin (1,5 mM), 2-Mercaptoethanol (5 · 10&supmin;&sup5; M), Gentamycin (10 ug/ml) und fötalem Kälberserum (FCS) (CSL; 10%) und weiterer Ergänzung des resultierenden normalen Mediums (hier nachstehend "das normale Medium") mit 8-Azaguanin (15 ug/ml)]. Diese Zelllinien werden in dem normalen Medium 3 bis 4 Tage vor der Zellfusion cloniert, und mindestens 2 · 10&sup7; Zellen werden am Tag der Fusion gesichert.

(3) Zellfusion

Die Antikörper-produzierenden Zellen, erhalten in (1), und die Myelomzellen, erhalten in (2), werden gut mit MEM oder PBS (enthaltend 1,83 g Natriumdihydrogenphosphat, 0,21 g Kaliummonohydrogenphosphat, 7,65 g Natriumchlorid und 1 Liter destilliertes Wasser, pH 7.2) gewaschen und gemischt, bis das Verhältnis der Antikörper produzierenden Zellen zu den Myelomzellen 5-10 : 1 beträgt. Das Zellgemisch wird der Zentrifugation bei 1.200 UpM für 5 Minuten unterzogen, und der Überstand wird dann verworfen. Das Pellet wird suspendiert, und 0,2 ml bis 1 ml einer gemischten Lösung, enthaltend 2 g Polyethylenglycol-1.000 (PEG-1.000), 2 ml MEM und 0,7 ml Dimethylsulfoxid, werden pro 108 der Antikörper produzierenden Zellen zu der Suspension bei 37ºC unter Rühren zugegeben. Dann werden 1 bis 2 ml MEM mehrmals alle 1 bis 2 Minuten zugegeben. Danach wird die Gesamtmenge des MEM auf 50 ml durch weitere Zugabe von MEM gebracht. Das Gemisch wird bei 900 UpM für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wird leicht gelockert und dann mittels einer Pipette in 100 ml HAT-Medium suspendiert [Medium, hergestellt durch Zugabe von 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 1,5 · 10&supmin;&sup5; M Thymidin und 4 · 10&supmin;&sup7; M Aminopterin zum normalen Medium], während die Zellen mit einer Messpipette auf- und abpipettiert werden. Die Suspension wird in Portionen von 100 ul/Vertiefung auf einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen verteilt, und die Inkubation wird in einem 5% CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC für 7 bis 14 Tage durchgeführt.
Nach der Inkubation wird ein Teil des Kulturüberstands in jeder Vertiefung entnommen, um die Vertiefung zu selektieren, in der die spezifische Reaktivität mit einem C- terminalen Peptid einer R2-Untereinheit menschlicher RNR höher ist. Dann wird die Clonierung zweimal durch begrenzende Verdünnung wiederholt, wobei ein HT-Medium, hergestellt durch Auslassung von Aminopterin von einem HAT-Medium, in der ersten Verdünnung verwendet wird und das normale Medium in der zweiten Verdünnung verwendet wird. Die Zelllinie, von der gefunden wird, dass sie einen stabilen hohen Antikörpertiter besitzt, wird als eine Hybridomzelllinie selektiert, die einen monoclonalen anti-RNR·R2- Untereinheit-Antikörper produziert. Spezifische Beispiele der kompetenten Hybridomzelllinie schließen die Hybridomzelllinien KM1054, KM1056 und KM1060 ein. Die Hybridomzelllinie KM1054 ist beim National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology als FERM BP-4875 am 8. November 1994 hinterlegt worden.

Enzymimmuntest

Als ein Antigen wird das C-terminale Peptid der R2-Untereinheit von RNR verwendet. Das Peptid wird an ein Protein, das sich von dem unterscheidet, das in der Immunisierung verwendet wird, als ein Trägerprotein und ein Kreuzvernetzungsagens wie Glutaraldehyd und MBS gebunden.
Das Konjugat (von 1 bis 50 ug/ml) des C-terminalen Peptids der R2-Untereinheit menschlicher RNR und des Trägerproteins wird in einer Menge von 10 bis 100 ul/Vertiefung verteilt, und die Platte wird bei 4ºC für 10 Stunden zur Beschichtung gehalten. Nach Blockierung mit einer BSA-Lösung wird der Hybridomkulturüberstand in einer Menge von 50 bis 100 ul/Vertiefung als ein erster Antikörper zugegeben, und die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder bei 4ºC für 10 Stunden durchgeführt. Die EIA-Platte wird gut mit PBS oder einer Lösung von PBS in 0,05% Tween-20 (hier nachstehend als "Tween-PBS" bezeichnet) gewaschen. Dann werden 1 bis 50 ug/ml eines anti-Maus- Immunglobulinantikörpers oder eines anti-Ratte-Immunglobulinantikörpers, der mit Biotin, einem Enzym, einer Chemilumineszenzsubstanz oder einer radioaktiven Verbindung markiert ist, in einer Menge von 50 bis 100 ul/Vertiefung als ein zweiter Antikörper zugegeben, und die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Nachdem die EIA- Platte gut gewaschen wurde, wird die Reaktion abhängig von der Markierungssubstanz für den zweiten Antikörper durchgeführt. Die Vertiefung, in der die spezifische Reaktivität mit dem C-Peptid der R2-Untereinheit menschlicher RNR höher ist, wird als ein Hybridom selektiert, das den monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper produziert.

(4) Herstellung eines monoclonalen Antikörpers

Die monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper produzierenden Hybridomzelllinien, erhalten in (3), werden intraperitoneal in 8 bis 10 Wochen alte Mäuse oder Nacktmäuse, behandelt mit Pristan [0,5 ml 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (Pristan) wurde intraperitoneal den Mäusen verabreicht, und die Mäuse wurden für zwei Wochen aufgezogen], in Mengen von 2 · 10&sup7; bis 5 · 10&sup6; Zellen/Maus verabreicht. In 10 bis 21 Tagen produzieren die Hybridomzellen Aszitescarcinom in der Maus. Die Aszitesflüssigkeit wird aus den Mäusen entnommen und bei 3,000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, um feste Bestandteile zu entfernen. Der Rückstand wird dann aus einer 40 bis 50% gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat ausgesalzt und einer Caprylsäure-Präzipitation unterzogen, um einen gereinigten monoclonalen Antikörper zu ergeben. Alternativ wird der Rückstand über eine DEAE-Sepharose-Säule, eine Protein A-Säule oder Cellulofine GSL 2000-Säule (hergestellt von Seikagaku Corp.) gegeben, und eine IgG- oder IgM-Fraktion wird gesammelt und als ein gereinigter monoclonaler Antikörper verwendet.
Die Subklasse des Antikörpers wird mit einem monoclonalen Maus- Antikörpertypisierungskit (Zymed Laboratories) oder einem monoclonalen Ratten- Antikörpertypisierungskit (Nordic Immunology) bestimmt. Die Menge des Proteins wird mit der Lowry-Methode oder durch die Absorption bei 280 nm bestimmt.

(5) Untersuchung der Spezifität des monoclonalen Antikörpers durch das Western- Blotverfahren

Die Reaktionsspezifität des monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörpers, erhalten in (4), wird mittels des folgenden Western-Blotverfahrens untersucht.
Zuerst wird eine RNR-Rohfraktion aus einer menschlichen Tumorzelllinie wie HelaS&sub3; wie folgt hergestellt.
Ein Homogenat wird aus menschlichen Tumorzellen hergestellt und zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Streptomycinsulfat wird zugegeben, bis die Endkonzentration 0,65% (Gew./Vol.) erreicht, und das Gemisch wird bei 4ºC für 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Dann wird Ammoniumsulfat zugegeben, bis die Endkonzentration 50% Sättigung erreicht. Das Gemisch wird bei 4ºC für 45 Minuten gerührt und dann zentrifugiert, um ein Präzipitat zu sammeln. Das Präzipitat wird in einem Trishydrochloridpuffer, umfassend 50 mM Trishydrochlorid (Tris-HCl) (pH 7.6), 0.1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und 2 mM Dithiothreit (DTT), gelöst, und die Lösung wird weiter gegen den Trishydrochloridpuffer für 10 Stunden dialysiert. Das resultierende Dialysat wird als eine RNR-Rohfraktion verwendet.
Die so erhaltene RNR-Rohfraktion wird mittels SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) fraktioniert und dann auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran geblottet. Die resultierende Fraktion wird mit PBS, enthaltend 1 % Rinderserumalbumin (BSA) (hier nachstehend als "BSA-Lösung" bezeichnet) blockiert und wird dann mit 1 bis 10 ug/ml des monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit- Antikörpers, erhalten in (4), bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder bei 4ºC für 10 Stunden umgesetzt. Die das Reaktionsgemisch enthaltende EIA-Platte wird gut mit PBS oder PBS- Tween gewaschen. Anschließend werden 1 bis 50 ug/ml eines anti-Maus-Immunglobulin- Antikörpers oder eines anti-Ratte-Immunglobulin-Antikörpers, markiert mit Biotin, einem Enzym, einer Chemilumineszenz-Substanz oder einer radioaktiven Verbindung, in einer Menge von 50 bis 100 ul/Vertiefung als ein zweiter Antikörper verteilt, und die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Das resultierende Gemisch wird gut gewaschen, und die Reaktion wird abhängig von der Markierungsverbindung für den zweiten Antikörper durchgeführt. Es wird bestätigt, dass der monoclonale anti-RNR·R2- Untereinheit-Antikörper mit einem Protein mit einem Molekulargewicht von 45 KDalton, das mit dem Molekulargewicht der RNR·R2-Untereinheit übereinstimmt, reagiert.

(6) Untersuchung der Spezifität des monoclonalen Antikörpers durch Immunpräzipitation

Die Reaktionsspezifität des monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörpers, erhalten in (4), wird mittels der folgenden Immunpräzipitation untersucht.
Der gereinigte monoclonale Antikörper, erhalten in (4), und ein Kontrollantikörper (jeweils 5 bis 50 ug/ml) werden zu einer EIA-Platte in einer Menge von 50 bis 200 ul/Vertiefung zugegeben, für 10 Stunden bei 4ºC stehengelassen und an die Platte adsorbiert. Die EIA-Platte wird dreimal mit PBS gewaschen, und eine BSA-Lösung wird in einer Menge von 300 ul/Vertiefung zur Blockierung dazugegeben. Das C-terminale Peptid (100 ug/ml) der R2-Untereinheit von RNR oder PBS wird in einer Menge von 50 ul/Vertiefung dazugegeben, und die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden durchgeführt. Anschließend wird eine Rohfraktion von RNR, hergestellt aus einer menschlichen Tumorzelllinie wie HelaS&sub3;, in einer Menge von 100 ul/Vertiefung zugegeben, und die Reaktion wird für 10 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Nachdem die das Reaktionsgemisch enthaltende EIA-Platte mit Tween-PBS gewaschen worden ist, wird ein Probenpuffer für die SDS-PAGE (Lösung mit einer 5fachen Konzentration) in einer Menge von 50 ul/Vertiefung dazugegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wird 5fach mit PBS verdünnt und dann mittels SDS- PAGE mit 20 ul/Spur fraktioniert. Die Fraktion wird dann auf eine PVDF-Membran auf herkömmliche -Art geblottet. Die geblottete Fraktion wird mit einer BSA-Lösung blockiert und dann mit 1 bis 10 ug/ml des gereinigten monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit- Antikörpers bei Raumtemperatur für 2 Stunden umgesetzt. Die das Reaktionsgemisch enthaltende EIA-Platte wird mit Tween-PBS gewaschen. Ein anti-Maus-Immunglobulin- Antikörper oder ein anti-Ratte-Immunglobulin-Antikörper (1 bis 50 ug/ml), markiert mit Biotin, einem Enyzm, einer Chemifluoreszenz-Substanz oder einer radioaktiven Verbindung, wird als ein zweiter Antikörper dazugegeben, und die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Die das Reaktionsgemisch enthaltende EIA-Platte wird gut mit PBS, enthaltend 0,02% Tween, gewaschen. Die dem markierten zweiten Antikörper entsprechende Reaktion wird dann durchgeführt, und es wird bestätigt, dass der monoclonale anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper ein Protein mit einem Molekulargewicht von 45 KDalton, das mit dem Molekulargewicht der R2-Untereinheit der RNR übereinstimmt, präzipitiert.

(7) Untersuchung der RNR-hemmenden Aktivität mit dem monoclonalen Antikörper

Ob der monoclonale anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper die RNR-Aktivität hemmen kann oder nicht, kann durch Bestimmung von Desoxycytidin-5'-diphosphat (dCDP), das aus CDP durch die RNR-Rohfraktion aus P388-Zellen umgewandelt wurde, beurteilt werden.
Der gereinigte monoclonale anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper, erhalten in (4), wird schrittweise verdünnt und in Vertiefungen verteilt. Eine RNR-Rohfraktion aus P388- Zellen, die auf die gleiche Weise wie in (5) hergestellt worden ist, wird dazugegeben, und das Gemisch wird bei 4ºC für 1 bis 2 Stunden umgesetzt. Eine Lösung, enthaltend CDP, markiert mit Tritium, wird dazugegeben, und die Reaktion wird bei 37ºC für 30 Minuten durchgeführt. Danach wird das Reaktionsgemisch bei 95ºC für 2 Minuten erhitzt, um die Reaktion zu beenden. Weiter wird ein Schlangengift von Crotalus adamanteus dazugegeben, und das Gemisch wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nachdem das Nucleotid zum Nucleosid umgewandelt ist, wird das Gemisch zentrifugiert, und der Überstand wird auf ein Polyethylenimin (PEI)-boratcelluloseblatt in Tupfen aufgetragen. Die Substanz wird mit einer Entwicklungslösung (Gemisch von 20 mM Ammoniumformiat und Ethanol in einem Verhältnis von 6 : 4) entwickelt und getrocknet. Dann werden die dem Nucleosid und dem Desoxynucleosid entsprechenden Teile ausgeschnitten, und die Radioaktivität wird mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen.

(8) Immuncytochemische Färbung mit dem monoclonalen Antikörper

Suspendierte Zellen werden als solche auf eine Platte gegeben. Anhaftende Zellen werden mit Trypsin-EDTA (PBS, enthaltend 0,1% Trypsin und 0,02% EDTA) abgelöst und dann auf die Platte gegeben. Zu dieser Zeit ist die Menge an Zellen 1 · 10&sup6; Zellen/Vertiefung. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, und 4% Paraformaldehyd, direkt vor der Verwendung hergestellt, wird in einer Menge von 100 bis 500 ul/Vertiefung dazugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehengelassen und fixiert. Nachdem das Gemisch mit PBS gewaschen ist, wird Methanol in einer Menge von 100 bis 500 ul/Vertiefung dazugegeben, um die Antikörperpermeabilität der Zellmembran zu erhöhen, und die Behandlung wird bei -20ºC für 2 Minuten durchgeführt. Nachdem die so behandelte Substanz mit PBS gewaschen worden ist, wird 10% normales menschliches Serum in einer Menge von 100 bis 500 ud/Vertiefung dazugegeben, und die Blockierung wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Anschließend werden 1 bis 10 ug/ml des gereinigten monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörpers, erhalten in (4), dazugegeben, und die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Nachdem die das Reaktionsgemisch enthaltende EIA-Platte mit PBS gewaschen worden ist, werden 1 bis 50 ug/ml eines anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpers oder eines anti-Ratte- Immunglobulin-Antikörpers, markiert mit einem Fluoreszenzpigment wie FITC in einer Menge von 100 bis 500 ul/Vertiefung zugegeben. Die Reaktion wird bei 4ºC für 30 Minuten unter Lichtabschirmung durchgeführt. Nach Vollendung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch gut mit PBS gewaschen und dann mittels eines Zellsortiergeräts analysiert.
Wenn die Doppelfärbung mit Antikörperfärbung und DNA-Färbung durchgeführt wird, wird die Antikörperfärbung, wie vorstehend erwähnt, durchgeführt, und PBS, enthaltend 0,25 mg/ml Ribonuclease (RNase, hergestellt von Sigma Co.) und 0,1% NP40, wird in einer Menge von 0,9 ml pro 1 · 10&sup6; Zellen zugegeben, und die Reaktion wird bei 37ºC für 30 Minuten durchgeführt. Weiter wird PBS, enthaltend 500 ug/ml PI (Propidiumiodid) und 1% NP40, in einer Menge von 0,1 ml pro 1 · 10&sup6; Zellen dazugegeben, und die Reaktion wird für 20 Minuten oder länger unter Kühlung des Gemisches mit Eis durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird mittels eines Zellsortiergeräts analysiert.

(9) Immunhistochemische Färbung mit dem monoclonalen Antikörper

Ein Formalin immobilisiertes, Paraffin eingebettetes menschliches Gewebe wird in einer Dicke von 1 bis 5 Microns geschnitten und auf einem Ei-Albumin beschichteten Glasobjektträger fixiert. Das Paraffin wird mit Xylol entfernt, und der Rückstand wird schrittweise mit einem Gemisch von Alkohol und Wasser hydrophil gemacht. Bei Verwendung eines gefrorenen Schnittes wird das Gewebe in kaltem Aceton für 20 Minuten fixiert. Anschließend wird der so behandelte Schnitt mit Methanol, enthaltend 0,3% Wasserstoffperoxid, für 30 Minuten behandelt, um die interne Peroxidase zu blockieren. Der Schnitt wird mit PBS gewaschen, dann in einem verdünnten normalen Pferdeserum für 20 Minuten blockiert und mit 1 bis 10 ug/ml des gereinigten monoclonalen anti-RNR·R2- Untereinheit-Antikörpers, erhalten in (4), bei 4ºC für 12 Stunden umgesetzt. Nachdem die das Reaktionsgemisch enthaltende EIA-Platte gut gewaschen worden ist, werden 1 bis 50 ug/ml eines anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpers oder eines anti-Ratte-Immunglobulin- Antikörpers, markiert mit Biotin, einem Enzym, einer Chemifluoreszenzsubstanz oder einer radioaktiven Verbindung, als der zweite Antikörper dazugegeben, und die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Nachdem die das Reaktionsgemisch enthaltende EIA-Platte gewaschen worden ist, wird die dem markierten zweiten Antikörper entsprechende Reaktion durchgeführt. Nachdem die Reaktion durch Kühlung des Reaktionsgemisches mit Eis beendet ist, wird das Formalin immobilisierte, Paraffin eingebettete Gewebe mit Hämatoxylin gefärbt, mit einem Gemisch aus Alkohol und Wasser und mit Xylol dehydriert, mit Canadabalsam fixiert und mikroskopisch betrachtet. Bei Verwendung des gefrorenen Schnitts wird der gefrorene Schnitt mit einem Gemisch aus Glycerin und PBS fixiert und mikroskopisch betrachtet.
Die vorliegende Erfindung wird weiter spezifisch durch Verweis auf die folgenden Beispiele ausgeführt.

Beispiel 1

(1) Herstellung eines Immunogens

Ein C-terminales Peptid einer R2-Untereinheit von menschlicher RNR mit einer in Sequenz Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz wurde synthetisiert. Ein Konjugat des Peptids mit KLH (hergestellt von Carbiochem) wurde hergestellt, um die Immunogenität zu erhöhen, und wurde als ein Immunogen verwendet.
KLH wurde in PBS in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst, und MBS (hergestellt von Nacalai Tesque Co.) wurde tropfenweise in einer Menge von 25 mg/ml zugegeben, was 1/10 der Menge der Lösung entspricht. Die Reaktion wurde für 30 Minuten durchgeführt. Freies MBS wurde mittels einer Sephadex G-25-Säule (hergestellt von Pharmacia Co.), die mit PBS äquilibriert wurde, entfernt, und 2,5 mg des resultierenden KLH- MBS wurde mit 1 mg des C-terminalen Peptids der R2-Untereinheit menschlicher RNR, gelöst in einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.0), gemischt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden unter Rühren stehengelassen. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch gegen PBS, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, dialysiert, und das resultierende Dialysat wurde als ein Immunogen verwendet.

(2) Immunisierung eines Tieres und Herstellung Antikörper produzierender Zellen

100 ug des Konjugats des C-terminalen Peptids der R2-Untereinheit menschlicher RNR und KLH, erhalten in (1), wurden jeder 5 Wochen alten, männlichen Ratte Stamm SD zusammen mit 2 mg Aluminiumgel und 1 · 10&sup9; Zellen des Pertussis-Vakzins (hergestellt von Serum Institute, Chiba Prefecture) verabreicht. Zwei Wochen später wurden 100 ug des vorstehend erwähnten Konjugats einmal in der Woche verabreicht, insgesamt 4mal. Das Blut wurde aus dem venösen Plexus des Augenhintergrunds entnommen, und der Antikörpertiter des Serums wurde mittels Enzymimmuntest bestimmt. Aus der Ratte, die einen ausreichenden Antikörpertiter aufwies, wurde die Milz drei Tage nach der letzten Immunisierung extrahiert.
Die Milz wurde in MEM (hergestellt von Nissui Pharmaceutical) in Stücke geschnitten, mit einer Pinzette gelockert und bei 1.200 UpM für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und der Rückstand wurde mit einem Trisammoniumphosphatpuffer (pH 7.65) für 1 bis 2 Minuten behandelt, um die roten Blutkörperchen zu entfernen. Der Rückstand wurde dreimal mit MEM gewaschen und für die Zellfusion verwendet.

Enzymimmuntest

Ein Thyroglobulin (THY)-Konjugat des C-terminalen Peptids der menschlichen RNR·R2-Untereinheit wurde als ein Antigen für den Enzymimmuntest mittels eines Glutaraldehydverfahrens wie folgt hergestellt.
1 mg des C-terminalen Peptids der menschlichen RNR·R2-Untereinheit wurden in einem 0,1 M Acetatpuffer gelöst, und 5 mg THY, gelöst in dem gleichen Puffer, wurden dazugegeben, bis die Gesamtmenge 1 ml betrug. Unter Rühren des Gemisches wurden 540 ul 0,02 M Glutaraldelhyd tropfenweise dazugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch gegen PBS für 10 Stunden dialysiert, und das resultierende Dialysat wurde als ein Antigen verwendet.
Auf einer EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (hergestellt von Gleiner) wurden 10 ug/ml des so erhaltenen C-terminalen Peptidkonjugats von THY-menschlicher RNR·R2- Untereinheit und THY-SOX47-3 (Konjugat von SOX47-3-Peptid und THY; eine Aminosäuresequenz von SOX47-3 wurde in Sequenz Nr. 2 gezeigt) als ein Kontrollantigen in 50 ul/Vertiefung verteilt, für 10 Stunden bei 4ºC stehengelassen und an die Platte adsorbiert. Nachdem die EIA-Platte mit PBS gewaschen worden war, wurde 1% BSA-PBS in 100 ul/Vertiefung dazugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde durchgeführt, um die zurückbleibende aktive Gruppe zu blockieren. 1% BSA-PBS wurde verworfen, und der Überstand der Hybridomkultur oder eines Antiserums einer immunisierten Ratte wurde in 50 ul/Vertiefung verteilt. Die Reaktion wurde für 2 Stunden durchgeführt. Nachdem das Reaktionsgemisch mit Tween-PBS gewaschen worden war, wurde ein Peroxidase markiertes Kaninchen-anti-Ratte-Immunglobulin (hergestellt von Dako) in 50 ul/Vertiefung dazugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde durchgeführt. Nachdem die EIA-Platte mit Tween-PBS gewaschen worden war, wurde eine ABTS-Substratlösung [Ammonium-2.2-azinobis(3-ethylbenzothiazol-6-sulfonat)] zugefügt, und die sich entwickelnde Farbe wurde mittels Absorption bei OD415nm (NJ2001, hergestellt von Nippon Intermed K. K.) bestimmt.

(3) Herstellung von Myelomzellen

Die 8-Azaguanin-resistente murine Myelomzelllinie P3-U1 wurde in normalem Medium kultiviert, um mindestens 2 · 10&sup7; Zellen zur Zeit der Zellfusion zu erhalten, und der Zellfusion als ein Elternstamm unterzogen.

(4) Hybridomherstellung

Die Mausmilzzellen und Myelomzellen, erhalten in (2) und (3), wurden in einem Verhältnis von 10 : 1 gemischt, und das Gemisch wurde bei 1.200 UpM für 5 Minuten zentrifugiert. Dann wurde der Überstand verworfen, und das Pellet wurde gut suspendiert. Anschließend wurde eine gemischte Lösung, enthaltend 2 g Polyethylenglycol-1.000 (PEG- 1.000), 2 ml MEM und 0,7 ml Dimethylsulfoxid, bei 37ºC in einer Menge von 0,2 ml bis 1 ml pro 1 · 10&sup8; Mausmilzzellen unter Rühren dazugegeben, und 1 bis 2 ml MEM wurden mehrmals alle 1 bis 2 Minuten dazugegeben. Weiter wurde MEM dazugegeben, bis die Gesamtmenge 50 ml betrug. Nachdem das Gemisch bei 900 UpM für 5 Minuten zentrifugiert worden war, wurde der Überstand verworfen, und die Zellen wurden sanft suspendiert. Dann wurden die Zellen langsam in 100 ml HAT-Medium suspendiert, während die Zellen mittels einer Meßpipette auf- und abpipettiert wurden.
Die Suspension wurde auf eine Platte mit 96 Vertiefungen zur Kultivierung in einer Menge von 100 ul/Vertiefung verteilt und in einem 5% CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC für 10 bis 14 Tage inkubiert. Der Titer des Kulturüberstands wurde mittels des vorstehend erwähnten Enzymimmuntests bestimmt, und die Vertiefung, in der die spezifische Reaktivität mit dem C-terminalen Peptid der R2-Untereinheit der RNR höher war, wurde selektiert. Das HAT-Medium wurde durch ein HT- und normales Medium ersetzt, und die Clonierung wurde zweimal wiederholt, um eine Hybridomzelllinie zu erhalten, die den monoclonalen anti- RNR·R2-Untereinheit-Antikörper produziert. Als ein Ergebnis wurden die Hybridome KM1054, KM1056 und KM1060, wie in Fig. 1 gezeigt, selektiert. Die Antikörperklassen der von den Hybridomen produzierten monoclonalen Antikörper wurden durch Enzymimmuntest unter Verwendung eines Subklassentypisierungskits bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

KM Nr. Antikörperklasse

1054 IgG2a
1056 IgG2a
1060 IgG2a

(5) Reinigung des monoclonalen Antikörpers

In einer Dosis von 5 bis 20 · 10&sup6; Zellen/Maus wurden die Hybridome, erhalten in (4), intraperitoneal in Pristan behandelte, 8 Wochen alte, weibliche Nacktmäuse (Balb/c) injiziert. In 10 bis 21 Tagen produzierten die Hybridome Aszitescarcinom. Die Aszitesflüssigkeit wurde aus Aszites-Flüssigkeit enthaltenden Mäusen (1-8 ml/Maus) gesammelt und bei 3,000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, um die festen Bestandteile zu entfernen. Der Rückstand wurde mit der Caprinsäurepräzipitationsmethode (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) gereinigt, um einen gereinigten monoclonalen Antikörper zu erhalten.

(6) Untersuchung der Spezifität des monoclonalen Antikörpers mittels Western- Blotverfahren

Eine RNR-Rohfraktion wurde aus HelaS&sub3;-Zellen wie folgt hergestellt.
HelaS&sub3;-Zellen (1 · 10&sup9;) wurden in 30 ml eines Puffer, der Zellen solubilisieren kann, umfassend 20 mM Hepes (pH 7.6), 10 mM MgCl&sub2;, 2 mM DTT und 1 mM PMSF, suspendiert, und die Suspension wurde für 30 Minuten auf Eis stehengelassen und wurde dann homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 35,000 · g für 30 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu sammeln. Streptomycinsulfat wurde dazugegeben, bis die Endkonzentration 0,65% (Gew./Vol.) erreichte. Das Gemisch wurde bei 4ºC für 30 Minuten gerührt, und das Reaktionsgemisch wurde bei 13,000 g für 20 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu sammeln. Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat zugegeben, bis die Endkonzentration 50% Sättigung erreichte. Das Gemisch wurde bei 4ºC für 45 Minuten gerührt und dann bei 13,000 · g für 20 Minuten zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten. Das Pellet wurde in 4 ml eines Trishydrochloridpuffers, umfassend 50 mM Trishydrochlorid (pH 7.6), 0,1 mM PMSF und 2 mM DTT, gelöst, und die Lösung wurde weiter für 10 Stunden gegen den vorstehend erwähnten Puffer dialysiert. Das resultierende Dialysat wurde als eine RNR-Rohfraktion verwendet.
Die RNR-Rohfraktion wurde mittels SDS-PAGE in einer Menge von 40 ug/Spur oder 8 ug/Spur fraktioniert und auf eine PVDF-Membran auf herkömmliche Weise geblottet. Die Fraktion wurde mit 1% BSA-PBS blockiert und dann mit 10 ug/ml von jedem der menschlichen monoclonalen RNR·R2-Untereinheit-Antikörper KM1054, KM1056 und KM1060, erhalten in (5), und normalem Rattenserum (500fach verdünnt mit 1% BSA- PBS) als ein Kontrollantikörper bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder für 10 Stunden bei 4ºC umgesetzt. Die Fraktion wurde auch mit jedem der Antikörper bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt, die mit dem C-terminalen Peptid von RNR umgesetzt worden waren (Endkonzentration 10 ug/ml). Die EIA-Platte wurde gut mit Tween-PBS gewaschen und dann mit einem Peroxidase-markierten anti-Ratte-Immunglobulin-Antikörper (Dako) bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Die EIA-Platte wurde gut mit Tween-PBS gewaschen, und die Lösung wurde dann abgesaugt. Ein ECL-Reagens (hergestellt von Amersham Co.) wurde dazugegeben, und das Gemisch wurde für 1 Minute stehengelassen. Nach Vollendung der Reaktion wurde das überschüssige Reagens entfernt, und der Film wurde für 10 Sekunden bis zu 2 Minuten zum Nachweis sensibilisiert. Folglich, wie in Fig. 2 gezeigt, reagierte jeder von KM1054, KM1056 und KM1060 mit einem Protein mit einem Molekulargewicht von 45 KDalton, das mit dem Molekulargewicht der RNR·R2-Untereinheit übereinstimmt, aber die Reaktivität verschwand, wenn die Antikörper mit dem C-terminalen RNR-Peptid inkubiert worden waren.

(7) Untersuchung der Spezifität des monoclonalen Antikörpers durch Immunpräzipitation

Die monoclonalen Anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper KM1054, KM1056 und KM1060 und der Ratte-IgG-Antikörper KM1024 (50 ug/ml) als eine Kontrolle wurden in 200 ul/Vertiefung verteilt und an die Platte für 10 Stunden bei 4ºC adsorbiert. (Der Ratte- IgG-Antikörper KM1024 ist nicht öffentlich erhältlich. Als Kontrolle kann KM987 anstelle von KM1024 verwendet werden, weil KM987 völlig identisch mit KM1024 ist. KM987 wird in Journal of Biological Chemistry, 268, 25846 (1993) beschrieben.) Nachdem die EIA-Platte dreimal mit PBS gewaschen worden war, wurde 1% BSA-PBS in 300 ul/Vertiefung zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde blockiert. 1% BSA- PBS wurde verworfen, das C-terminale RNR·R2-Untereinheit-Peptid (100 ug/ml) oder PBS wurde in 50 ul/Vertiefung zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden stehengelassen. Anschließend wurde die RNR-Rohfraktion (7,67 mg/ml) in 100 ul/Vertiefung zugegeben, und das Gemisch wurde für 10 Stunden bei 4ºC stehengelassen. Die EIA-Platte wurde mit Tween-PBS gewaschen, und ein Probenpuffer für SDS-PAGE (enthaltend 25% 2-Mercaptoethanol-Lösung und auf ein Fünftel konzentriert) wurde in 50 ul/Vertiefung dazugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden geschüttelt, und das Reaktionsgemisch wurde 5fach mit PBS verdünnt, dann fraktioniert durch SDS-PAGE in 20 ul/Spur und auf eine PVDF-Membran auf herkömmliche Weise geblottet. Die Fraktion wurde mit 1% BSA-PBS blockiert und dann mit einer Antikörper-gemischten Lösung (1 % BSA-PBS-Lösung, enthaltend jeden monoclonalen Antikörper KM1054, KM1056, KM1060 oder KM1024 in einer Menge von 10 ug/ml) bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Tween-PBS gewaschen, und ein Peroxidase markiertes Kaninchen-anti-Ratte-Immunglobulin (hergestellt von Dako) wurde dazugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde stehengelassen. Auf die gleiche Weise wie in (6) wurde die Reaktion mit dem ECL-Reagens (Amersham) zum Nachweis durchgeführt. Als ein Ergebnis präzipitierten die monoclonalen Antikörper KM1054 und KM1056 ein Protein mit einem Molekulargewicht von 45 KDalton, das mit dem Molekulargewicht der RNR·R2-Untereinheit übereinstimmt, und die Reaktivität verschwand, wenn die Antikörper mit dem C-terminalen R2-Untereinheit-Peptid inkubiert worden waren.

(8) RNR-hemmende Aktivität unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers

Ob der monoclonale Anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper die RNR-Aktivität hemmen kann oder nicht, wurde unter Verwendung der Menge von Desoxy-CDP, das durch eine RNR-Rohfraktion aus P388-Zellen aus CDP umgewandelt worden war, als Index untersucht.
Die gereinigten monoclonalen Anti-RNR·R2-Untereinheit-Antikörper KM1054 und KM1056, erhalten in (5), wurden schrittweise auf 0,1 bis 100 ug/ml verdünnt. Anschließend wurden 50 ul von jedem der so erhaltenen, verdünnten monoclonalen Antikörper mit 0,75 mg/50 ul einer RNR-Rohfraktion aus P388-Zellen gemischt. Das Gemisch wurde bei 4ºC für 1 bis 2 Stunden stehengelassen, und 25 ul einer Substratlösung, enthaltend Tritium-markiertes CDP [Lösung, umfassend 5 mM ATP, 5 mM MgCl&sub2;, 50 mM Hepes (pH 7.4), 5 mM DTT, 10 mM NaF, 0,5 mM CDP und 1,25-uCi ³H-CDP], wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 30 Minuten stehengelassen. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 95ºC für 2 Minuten erhitzt, um die Reaktion zu stoppen. Weiter wurden 20 mg/ml eines Schlangengifts aus Crotalus adamanteus in 25 ul/Vertiefung dazugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert, um ein Nucleotid zu einem Nucleosid umzuwandeln. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde bei 95ºC 2 Minuten erhitzt, um die Reaktion zu stoppen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 5.000 UpM für 2 Minuten zentrifugiert. 10 ul des so erhaltenen Überstands wurden in Tropfen auf ein Polyethylenimin (PEI)-boratcelluloseblatt aufgetupft und in einem Entwicklungspuffer (ein 6 : 4-Gemisch von 20 mM Ammoniumformiat und Ethanol) entwickelt und getrocknet. Anschließend wurden die Teile, die dem Nucleosid und dem Desoxynucleosid entsprachen, ausgeschnitten, und die Radioaktivität davon wurde in einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Folglich hemmten die monoclonalen Antikörper KM1054 und KM1056 abhängig von der Antikörperkonzentration, wie in Fig. 4 gezeigt, die RNR-Aktivität.

Beispiel 2

(1) Reaktivität des monoclonalen Antikörpers mit Krebszellen

Die Reaktivität der monoclonalen Antikörper KM1054 und KM1056, erhalten in Beispiel 1, mit verschiedenen Krebszellen wurde wie folgt untersucht.
Die menschliche Magenkrebszelllinie NUGC-4, die menschliche Schilddrüsen- Krebszelllinie TPC-1, der menschliche Lungenkrebs Calu-1 (ATCC HTB54) und die menschliche Leukämiezelllinie U937 (ATCC CRL1593) wurden als Krebszellen verwendet. Suspendierte Zellen wurden auf eine Platte als solche gegeben, und adhärente Zellen wurden mit Trypsin-EDTA davon abgelöst und auf die Platte gegeben. Zu dieser Zeit waren die Mengen dieser Zellen 1 · 10&sup6; Zellen/Vertiefung. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, und 4% Paraformaldehyd, hergestellt gerade vor der Verwendung, wurde in 500 ul/Vertiefung dazugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehengelassen und fixiert. Das Gemisch wurde mit PBS gewaschen, und Methanol wurde in 500 ul/Vertiefung dazugegeben, um die Antikörper-Permeabilität der Zellmembran zu erhöhen, und die Behandlung wurde bei -20ºC für 2 Minuten durchgeführt. Das so behandelte Material wurde mit PBS gewaschen, und 10% normales menschliches Serum wurde in 500 ul/Vertiefung dazugegeben, und die Blockierung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden je 10 ug/ml des monoclonalen Antikörpers KM1054, KM1056 oder KM1024 in 200 ul/Vertiefung dazugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Nachdem das Reaktionsgemisch mit PBS gewaschen worden war, wurde das PBS verworfen, und ein FITC-markierter anti-Ratte-Immunglobulin-Antikörper (hergestellt von Dako) wurde in 200 ul/Vertiefung zugegeben. Die Reaktion wurde bei 4ºC für 30 Minuten unter Lichtabschirmung durchgeführt. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch gut mit PBS gewaschen und dann mittels eines Zellsortiergeräts (Epics Elite, hergestellt von Coulter) analysiert. Als ein Ergebnis, wie in Fig. 5 gezeigt, reagierten die monoclonalen Antikörper KM1054 und KM1056 mit allen Krebszelllinien. Folglich wurde gezeigt, dass jeder Antikörper von KM1054 und KM1056 verwendet werden kann, um RNR nachzuweisen, die in den Krebszellen verteilt war.

(2) Reaktivität der monoclonalen Antikörper mit dem Zellzyklus

Die Doppelfärbung mit Antikörperfärbung und DNA-Färbung wurde wie folgt durchgeführt, um die Beziehung zwischen der Reaktivität der monoclonalen Antikörper KM1054 und KM1056 und dem Zellzyklus zu untersuchen.
Die Färbung wurde unter Verwendung der (A) menschlichen T-Lymphocyten- Zelllinie CCRF-CEM (ATCC CCL119) und (B) Lymphocyten, gewonnen aus menschlichem peripherem Blut durch Zentrifugation mit Polymorphprep (hergestellt von Daiichi Chemical Co.), und Lymphoblasten, erhalten durch Stimulation der vorstehend erwähnten Lymphocyten mit OKT-3, was ein Überstand ist, erhalten durch Kultivierung des Hybridoms OKT-3 (ATCC CRL8001) und Reinigung einer Kultur mit einer Protein A-Säule, und IL-2 (hergestellt von Shionogi & Co., Ltd.) durchgeführt.
Die Antikörperfärbung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in (1) mit den monoclonalen Antikörpern KM1054 und KM1024 als Kontrolle durchgeführt. PBS, enthaltend 0,25 mg/ml Ribonuclease (RNase, hergestellt von Sigma Co.) und 0,1% NP40, wurde dann in 0,9 ml pro 1 · 10&sup6; Zellen zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37ºC für 30 Minuten durchgeführt. Weiter wurde PBS, enthaltend 500 ug/ml PI (Propidiumiodid) und 1,0% NP40, in 0,1 ml pro 1 · 10&sup6; Zellen dazugegeben, und die Reaktion wurde für 20 Minuten oder länger auf Eis unter Rühren durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mittels eines Zellsortiergeräts (Epics Elite, hergestellt von Coulter) analysiert. Die Ergebnisse wurden in den Fig. 6 und 7 gezeigt. Im Fall der Verwendung der menschlichen T- Lymphocytenzelllinie CCRF-CEM, wie in Fig. 6 gezeigt, reagierte der monoclonale Antikörper KM1054 mit einem Teil der Zellen in der G1-Phase sowie mit Zellen in der S- Phase, G2-Phase und M-Phase. Im Fall der Verwendung von unstimulierten peripheren Blutlymphocyten, wie in Fig. 7 gezeigt, reagierten sowohl der monoclonale Antikörper KM1054 als auch der Kontrollantikörper KM1024 nicht mit den Zellen in der G0-Phase. In den Lymphoblasten, in denen die Lymphocyten synchron unter Verwendung von OKT-3 und IL-2 wuchsen, wurde nicht nur das Auftreten einer Population in der G0/G1-Phase, sondern auch von Populationen in der S-Phase, G2-Phase und M-Phase beobachtet. Der Kontrollantikörper KM1024 reagierte mit keiner dieser Populationen, und der monoclonale Antikörper KM1054 reagierte selektiv mit den Populationen in der S-Phase, G2-Phase und M-Phase, von denen jede einen hohen DNA-Gehalt besitzt.
Folglich stimmt die Reaktivität des monoclonalen Antikörpers KM1054 mit der Entwicklung der RNR·R2-Untereinheit abhängig vom Zellzyklus überein, in dem die Menge an RNR-Aktivität niedriger in der G0/G1-Phase und höher in der S-Phase, G2-Phase und M-Phase ist. Es wurde vorgeschlagen, dass der monoclonale Antikörper KM1054 verwendet werden kann, um RNR nachzuweisen, die als ein Zellzyklusmarker und ein Proliferationsmarker brauchbar ist.

(3) Immuncytochemische Färbung mit dem monoclonalen Antikörper

Um die Anwendung des monoclonalen anti-RNR·R2-Untereinheit- Antikörpers für die Cytodiagnose zu untersuchen, wurde der folgende Test durchgeführt: 5 ml Aszitesflüssigkeitszellen oder Pleuralflüssigkeitszellen wurden aus 3 Serositis-Proben bei Krebs gesammelt und unter Verwendung von 95% Ethanol immobilisiert. Nach Vollendung der Immobilisierung wurde die immuncytochemische Färbung mit dem monoclonalen Antikörper KM1054 auf die gleiche Art wie in (1) durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Ethanol anstelle von Paraformaldehyd verwendet wurde. Als ein Ergebnis waren alle Proben, wie in Tabelle 2 gezeigt, positiv.

Tabelle 2

Probe Reaktivität von KM1054

C93-3034-Eierstockkrebs +
C93-3325-Eierstockkrebs +
C93-2845-Brustkrebs +

(4) Immunhistochemische Färbung mit dem monoclonalen Antikörper

Formalin immobilisiertes, Paraffin eingebettetes menschliches Gewebe wurde in einer Dicke von 1 bis 5 Microns geschnitten und auf einem Ei-Albumin beschichteten Glasobjektträger fixiert. Das Paraffin wurde mit Xylol entfernt, und der Rückstand wurde schrittweise mit einer Mischung von Alkohol und Wasser hydrophil gemacht. Im Fall der Verwendung eines gefrorenen Schnittes wurde das Gewebe in kaltem Aceton für 20 Minuten fixiert. Anschließend wurde der so behandelte Schnitt mit Methanol, enthaltend 0,3% Wasserstoffperoxid, für 30 Minuten behandelt, um interne Peroxidase zu blockieren. Der Schnitt wurde mit PBS gewaschen, in verdünntem normalen Pferdeserum für 20 Minuten blockiert und mit 10 ug/ml des gereinigten monoclonalen Anti-RNR·R2-Untereinheit- Antikörpers bei 4ºC für 12 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gut mit PBS gewaschen, und 1 ug/ml eines Biotin markierten anti-Ratte-Immunglobulin-Antikörpers (hergestellt von Jackson Immunoresearch Lab.) wurde in 100 ul/Vertiefung zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Nachdem die EIA-Platte mit PBS gewaschen worden war, wurde eine Avidin markierte Peroxidase (hergestellt von Nichirei) dazugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgesetzt. Die EIA-Platte wurde in Wasser für 10 Minuten gewaschen und dann mit 0,05% Diaminobenzidin, enthaltend 0,01% Wasserstoffperoxid, für 1 Minute umgesetzt. Die Reaktion wurde in kaltem Wasser gestoppt, und das Reaktionsgemisch wurde mit Hämatoxylin gefärbt. Das Formalin immobilisierte, Paraffin eingebettete Gewebe wurde mit einer Mischung von Alkohol und Wasser und mit Xylol dehydriert, und der Rückstand wurde mit Canadabalsam fixiert und mikroskopisch betrachtet. Folglich, wie in Tabelle 3 gezeigt, reagierte der monoclonale Antikörper KM1054 mit den Krebszellen in allen acht Brustkrebsproben, aber nicht mit den umgebenden normalen Bereichen und gutartigen Tumoren (4 Proben). Tabelle 3
* F - gefrorener Schnitt P - Formalin immobilisierter, Paraffin eingebetteter Schnitt

SEQUENZPROTOKOLL

(1) GENERELLE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd.
(B) STRASSE: 1-6-1, Ohtemachi
(C) STADT: Chiyoda-ku, Tokyo 100
(D) LAND: Japan
(E) POSTLEITZAHL (ZIP): keine
(F) TELEFON: 03 3282-0036
(G) TELEFAX: 03 3282-1527
(H) TELEX: J24543HKKYOWA
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: MONOCLONALER ANTIKÖRPER GEGEN DIE R2-UNTEREINHEIT VON RIBONUCLEOTID-REDUKTASE
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release#1.0, Version#1.25
(v) GEGENWÄRTIGE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vi) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: JP 18879/95
(B) ANMELDEDATUM: 07-FEBRUAR-1995
(2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr. 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID Nr. 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:

Claims

1. Monoclonaler Antikörper, der spezifisch mit einer menschlichen Ribonucleotid-Reduktase R2-Untereinheit reagiert und der fähig ist zur Hemmung der Ribonucleotid-Reduktase-Aktivität.

2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, der zur IgG2a-Unterklasse gehört und ein monoclonaler Antikörper der Ratte ist.

3. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei der monoclonale Antikörper erhältlich ist von der Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4875 (KM 1054).

4. Hybridomzelllinie, die den monoclonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 produziert.

5. Hybridomzelllinie nach Anspruch 4 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4875 (KM 1054).

6. Verfahren zum immunologischen Nachweis einer R2-Untereinheit von menschlicher Ribonucleotid-Reduktase unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren nicht in einem lebenden menschlichen oder tierischen Körper ausgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Verfahren ein immunhistochemisches Färbeverfahren ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Verfahren ein immuncytochemisches Färbeverfahren ist.

9. Verfahren zum immunologischen Nachweis der Gegenwart von menschlichen Krebszellen unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren nicht in einem lebenden menschlichen oder tierischen Körper ausgeführt wird.

10. Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder produziert von einer Hybridomzelllinie nach einem der Ansprüche 4 oder 5, zur Hemmung von Ribonucleotid-Reduktase-Aktivität.