GEBIET DER ERFINDUNG
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Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich allgemein auf Laborzellkultur und insbesondere auf ein
System, geeignet zum Züchten von Zellen oder Untersuchung von Gewebeentwicklung in vitro.
HINTERGRUND
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Kultivieren von Zellen verschiedener Typen ist in vielen Laboratorien ein Routineverfahren
geworden. Zellen werden unter Ernten von Verbindungen kultiviert, auf verschiedene Empfindlichkeiten
gegenüber potentiell toxischen Verbindungen zu testen und sogar Gewebe für Implantate zur Verfügung zu
stellen. Diese Arbeit ist allgemein eine Monokultur, d. h. Zellen von einem Typ werden in einem geeigneten
Medium gezüchtet.
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Kürzlich ist Interesse in der Cokultur von Zellen entwickelt worden. Cokultur von Zellen umfaßt
Züchten einer Population von Zellen in der Anwesenheit einer anderen Population von Zellen. Cokultur von
Zellen ist wichtig für Untersuchung von Entzündungsreaktionen, Zelldifferenzierungsverfahren und Blut-
Hirn Permeabilitätsuntersuchungen.
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Repräsentative Literaturberichte, bezogen auf Zellcokultur, schließen ein: Magnum et al., In Vitro
Cell Dev. Biol. 26 : 1135-1143 (Dez. 1990), "Co-Culture of Primary Pulmonary Cells to Model Alveolar
Injury and Translocation of Protein", Madara et al., J. Tissue Cult. Method, 14 : 209-216 (1992), "A Simple
Approach to Electrical Parameters of Cultured Epithelial Monolayers: Use in Assessing Neutrophil-
Epithelial Interactions", Miller et al., J. Tissue Cult. Meth., 14 : 217-224, "Application of Cultured
Endothelial Cells of the Brain Microvasculature in the Study of the Blood-Brain Barrier; and Science,
266 : 564-565 (1994), "Finding Clues About How Embryo Structures Form." Die Artikel, auf die zuvor
bezug genommen worden ist, werden zitiert unter zur Verfügung stellen von Hintergrund im Hinblick auf
die in vitro Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einem Zelltyp und einem anderen.
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Miller et al., zuvor zitiert, beschreibt Kultivieren von Zellen auf Feststoffkunststoffoberflächen und
Filtern oder Membraneinsätzen. Miller et al. berichtet, daß Rinder-Hirn Endothelialzellen (BBEC),
kultiviert auf Filtern oder Membraneinsätzen, einen Vorteil über BBEC, kultiviert auf
Feststoffkunststoffoberflächen liefern. Dieser Vorteil ist, daß Zellpolarität im Hinblick auf Metabolismus
oder Rezeptorverteilung untersucht werden kann. Miller et al. stellt ferner fest, daß BBEC Kultur auf Filtern
oder Membraneinsätzen verlangt wird zum Bestimmen des transzellulären Transports oder Permeabilität
einer Verbindung über die zelluläre Monoschicht.
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Der Science Artikel, auf den zuvor bezug genommen wurde, beschreibt Untersuchungen im
Hinblick auf Nierenstrukturentwicklung. Der Artikel berichtet über Mesenchymal Zellen, cokultiviert mit
Zellen, die Wnt-1-Proteindifferentiat in Nierenstrukturen, einschließlich Nephron röhrenförmiges und
glomuläres Gewebe, herstellen, und berichtet, daß diese Wirkung nicht mit Kontrollzellen gesehen wird.
Als Reaktion auf das Entwicklungsverlangen für Vorrichtungen und Ausrüstung für Cokultur
Zellen ist ein Cokultursystem in der gemeinsam übertragenen US-A-5409829 offenbart. Die Offenbarung
stellt ein vollständiges, selbst-enthaltendes System zum Herstellen von Cokulturen zur Verfügung.
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United States Patent Nr. 5026649 von Lyman et al. offenbart eine Einsatzvorrichtung, die zum
Kultivieren und Cokultivieren von Zellen verwendet werden kann.
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United States Patent Nr. 4871674 von Matsui et al. offenbart einen Einsatz zum Kultivieren von
Zellen mit einer porösen Membran, den Boden eines Zylinders bildend. Der Zylinder hat zusätzlich
Vorkehrungen, in einer Vertiefung suspendiert zu werden.
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Sowohl die Lyman et al. wie die Matsui et al Patente offenbaren Vorrichtungen, die verwendet
werden können, Zellen auf einer Membran zu kultivieren, aber keine ist gut geeignet zum Züchten einer
Population von Zellen auf einer Membran mit variierenden Abständen von einer anderen Zelipopulation.
Das in US 5409821 offenbarte Zellkultursystem ist gut geeignet zum Kultivieren von Zellen auf beiden
Seiten einer Membran, aber der Abstand ist fixiert, und das System benötigt eine Reihe von
Manipulationen, die zeitverbrauchend sein können zum Prüfen von Untersuchungen, wo Viel-Cokulturen
entwickelt werden.
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In jeder der Vorrichtungen und Techniken, beschrieben in den zitierten Entgegenhaltungen und
Patenten, ist, wenn ein Zellkultureinsatz mit einer porösen Membran in einem Kessel für eine Zellkultur
suspendiert wird, der Abstand zwischen der porösen Membran und dem Boden des Suspensionskessels
fixiert und konstant. In einigen Anwendungen in der Untersuchung und Entwicklung von Organzellen, wo
Strukturen sich entwickeln, beispielsweise Nierenkulturen mit Nephron röhrenförmigem und glomulärem
Gewebe, ist es oft erwünscht, strukturelle Differenzierung sich entwickeln zu sehen. Es besteht ein
Verlangen nach einer Vorrichtung, die dem Forscher die Möglichkeit erlaubt, den Abstand zwischen dem
Boden der Vertiefung des Kessels und dem Einsatz einzustellen. Ein weiterer Nutzen, einen justierbaren
Abstand zwischen dem Einsatz und dem Vertiefungsboden zu haben, ist, daß ein Forscher variierende
Mengen von Kulturmedien und Probenvolumen kompensieren kann.
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In US 4296205 ist eine Vorrichtung und Verfahren zum Kultivieren von Gewebe oder Zellen und
für die Herstellung von konditionierten Kulturmedien offenbart. Insbesondere wendet die Vorrichtung und
Verfahren kontinuierliche gleichzeitige Dialyse der Kulturmedien an. Die Vorrichtung und Verfahren sind
besonders anwendbar auf das Langzeitwachstum in vitro von Zellpopulationen und die Herstellung von
assoziierten konditionierten Kulturmedien.
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US 5366893 offenbart Vorrichtung zum Züchten von Zellen oder Gewebe in vitro und zum
Unterstützen, Anordnen und/oder Zentrieren von Zellkultureinsätzen, die in derartigen Verfahren verwendet
werden. Die Vorrichtung umfaßt ein Teil mit einer Vielheit von Vertiefungen, wobei ein Zellkultureinsatz
unterstützt und zentriert werden kann, ohne mit dem Züchten von Gewebekultur in vitro in Wechselwirkung
zu treten.
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EP-A-242326 bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Untersuchen der Diffusion einer Substanz,
die ein Donorabteil hat, das rotierbar ist um eine vertikale Achse und lösbar gesichert ist an das Halteteil
eines Rotors, und das an dem Boden durch das Diaphragma von einem Empfängerabteil getrennt ist. Das
Diaphragma hat eine flexible Base eines biokompatiblen, nicht lebenden transluzenten Materials, auf dem
beispielsweise Zellen, die einen Rasen von Zellen bilden, kultiviert worden sind. Der Diffusionskoeffizient
und/oder die Permeabilität des Diaphragmas wie auch die darauf befindliche Zellkultur können bestimmt
werden durch Bestimmen des Zeitfortschritts der Mengen einer durch das Diaphragma diffundierenden
Substanz. Durch eine geeignete Wahl von Zellen können Bedingungen erzeugt werden, die eng denjenigen
während der Resorption der entsprechenden Substanz durch die Biophase eines lebenden Organismus
ähneln.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der gegenwärtigen Erfindung wird ein System für in vitro Kultur von Zellen zur Verfügung
gestellt, umfassend:
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ein Kulturgefäß mit mindestens einer Vertiefung darin, wobei die Vertiefung ein offenes oberes
Ende, einen Boden und eine Wand mit einer Innenseitenoberfläche hat;
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mindestens einen Einsatz, auf Größe gebracht für Plazierung in der Vertiefung, wobei der Einsatz
eine Außenseitenoberfläche, ein offenes Ende, ein geschlossenes Ende, hat, wobei das geschlossene Ende
durch eine mikroporöse Membran geschlossen ist, die eine Aufnahme in dem Einsatz bildet,
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Anordnungsmittel zum regulierbaren Anordnen des Einsatzes in der Vertiefung, so daß ein
Abstand zwischen dem geschlossenen Ende des Einsatzes und dem Boden der Vertiefung selektiv variabel
ist, wobei das Anordnungsmittel mindestens einen außen befindlichen Vorsprung auf der
Außenseitenoberfläche des Einsatzes und eine Vielheit von Stufen umfaßt, die nach innen von der
Innenseitenoberflöche der Vertiefung mit zunehmenden Abständen von dem Boden der Vertiefung
hervorragen, wobei der Vorsprung und die Stufen in einer Nocken/Nockenstößelbeziehung für regulierbares
Anordnen des Einsatzes in der Vertiefung durch Plazieren des Vorsprungs auf den Stufen angeordnet sind.
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Somit schließt ein System für in vitro Kultur von Zellen ein Kulturgefäß mit mindestens einer
Vertiefung darin ein. Die Vertiefung hat ein offenes oberes Ende, einen Boden und eine Wand mit einer
Innenseitenoberfläche. Das System schließt auch mindestens einen Einsatz, auf Größe gebracht für
Plazierung in der Vertiefung. Der Einsatz hat eine Außenseitenoberfläche, ein offenes Ende und ein
geschlossenes Ende. Es gibt eine mikroporöse Membran an dem geschlossenen Ende des Einsatzes, die das
Ende schließt und somit eine Aufnahme in dem Einsatz bildet. Der Einsatz ist regulierbar positionierbar in
der Vertiefung unter Verwenden mindestens eines außen befindlichen Vorsprungs und der Vielheit von
Stufen zum Variieren des Abstandes zwischen dem geschlossenen Ende des Einsatzes und dem Boden der
Vertiefung.
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Das System der gegenwärtigen Erfindung ist besonders geeignet für Untersuchungen von
Strukturdifferenzierung in Embryozellen in Organzellen wie in der Kultur von Modellen für Tumore und
Gewebedurchdringung. Gegenwärtig verfügbare Kultursysteme mit einem Einsatz, suspendiert in einer
Vertiefung, haben einen fixierten Abstand zwischen der Membran auf dem geschlossenen Boden des
Einsatzes und dem Kesselboden. In vielen Fällen ist die verfügbare Menge von Kulturmedien und
Zellsuspension unzureichend, den gewünschten Kontakt zwischen dem Medium und der Einsatzmembran
ohne Verdünnung der Suspension zur Verfügung zu stellen. In anderen Fällen, wenn die Kultur sich
entwickelt, werden Wirkungen von Gewebedifferenzierung nicht gesehen, wenn der Abstand zwischen der
Membran und den wachsenden Zellen in dem Kessel zu klein für Strukturen wie Nephronröhren und
glomeruläres Gewebe wird, richtig zu differenzieren. Das System der gegenwärtigen Erfindung ermöglicht,
daß der Abstand zwischen dem Zelleinsatz und dem Kulturkessel variiert wird, es somit einem Forscher
ermöglichend, den Abstand zwischen dem Einsatz und dem Kesselboden für ein bestimmtes Experiment zu
optimieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 ist eine teilweise auseinandergezogene perspektivische Ansicht eines Zellkultursystems,
eingeschlossen zum Verstehen einer Ausführungsform der gegenwärtigen Erfindung,
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Fig. 2 ist eine Querschnittsansicht des Systems von Fig. 1, genommen entlang der Linie 2-2 und
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Fig. 3 ist eine auseinandergezogene perspektivische Sicht einer alternativen Version des
Zellkultursystems von Fig. 1, das eine Ausführungsform 1 der gegenwärtigen Erfindung ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Während dieser Erfindung durch Ausführungsformen in vielen verschiedenen Formen Genüge
getan wird, ist in Fig. 3 in den Zeichnungen und hier detailliert eine bevorzugte Ausführungsform der
Erfindung mit dem Verständnis beschrieben, daß die gegenwärtige Offenbarung beispielhaft für die
Prinzipien der Erfindung anzusehen ist und nicht die Erfindung gegenüber der veranschaulichten
Ausführungsform begrenzen soll.
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Wie in Fig. 1 und 2 gezeigt, schließt ein System 10, geeignet für in vitro Kultur von Zellen, ein
Kulturgefäß 12 mit mindestens einer Vertiefung 14 darin ein. Vertiefung 14 hat ein oberes Ende 16, einen
Boden 18 und eine Wand 20 mit einer Innenseitenoberfläche 22. System 10 schließt mindestens einen
Einsatz 24, vorzugsweise röhrenförmig an Form, ein, der auf Größe gebracht ist für Plazierung in
Vertiefung 14. Einsatz 24 hat eine Seitenwand 25 mit einer Außenseitenoberfläche 26, einem offenen Ende
28, einem geschlossenen Ende 30 und einem Hohlraum 32 vom offenen Ende 28 zu geschlossenem Ende
30. Geschlossenes Ende 30 ist durch mikroporöse Membran 34 geschlossen, eine Aufnahme 36 in dem
Einsatz bildend. Einsatz 24 ist justierbar in Vertiefung 14 angeordnet zwischen einer ersten Position, wo
geschlossenes Ende 30 mit einem ersten Abstand "a" vom Boden 18 der Vertiefung angeordnet ist, und
einer zweiten Position, wo geschlossenes Ende 30 mit einem zweiten Abstand "b" vom Boden 18 der
Vertiefung angeordnet ist. In dieser Beschreibung ist passenderweise System 10 gezeigt, nur eine
Vertiefung zu haben. Vielfach-Vertiefungssysteme mit ähnlichen Nummern von Einsätzen werden
angesehen, im Umfang der gegenwärtigen Erfindung zu liegen.
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Vorzugsweise ist Einsatz 24 justierbar in Vertiefung 14 durch Konjugatfäden 40 auf
Innenseitenoberfläche 22 der Vertiefung und auf Außenseitenoberfläche 26 des Einsatzes angeordnet.
Bevorzugte Fäden 40 erleichtern justierbares Positionieren von Einsatz 24 in Vertiefung 14 durch Rotation
des Einsatzes im Hinblick auf Kessel 12. In der bevorzugten Ausführungsform ist Einsatz 24 justierbar, so
daß geschlossenes Ende 30 zwischen etwa 0,5 mm bis etwa 1,5 cm vom Boden 18 der Vertiefung ist. Am
bevorzugtesten ist Einsatz 24 regulierbar, so daß Membran 24 zwischen etwa 5 mm bis etwa 50 mm vom
Boden 18 der Vertiefung angeordnet ist.
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Kulturgefäß 12 schließt vorzugsweise mindestens eine Öffnung zum zur Verfügung stellen von
Zugang zu Vertiefung 14 ein. Bevorzugter schließt Kessel 12 eine obere Öffnung 52 ein, die als ein
Lüftungsloch mit einem Filter 54 zu Vertiefung 14 dient, und eine untere Öffnung 56 mit einem
perforierbaren, vorzugsweise selbstabdichtenden Septum 58, angeordnet, Abziehen von im wesentlichen
alles einer Menge von Flüssigkeit aus Vertiefung 14 zu erlauben. Vorzugsweise ermöglicht Filter 54
atmosphärischen Austausch zwischen der Außenseitenumgebung und Vertiefung 14, während es im
wesentlichen Durchgang von Mikroorganismen in Vertiefung 14 verhindert. Untere Öffnung 56 ermöglicht
es einem Forscher, Flüssigkeitskulturmedium hinzuzufügen oder von Vertiefung 14 zu entfernen, ohne im
wesentlichen das Zellwachstum zu zerstören. Das Medium kann ersetzt oder geändert werden unter
Verwenden der unteren Öffnung. Das Vorhandensein von Öffnung 52 ermöglicht den Austausch von Gasen
zwischen Vertiefung 14 und der Kammer und kompensiert atmosphärisch Zugabe und Abziehen von
Fluidmedium durch untere Öffnung 56. Kulturgefäß 12 hat ein oberes Ende 59, das vorzugsweise eine nach
oben ragende Rippe 60 einschließt, unter zur Verfügung stellen einer Barriere, die im wesentlichen
verhindert, daß auf der Oberseitenoberfläche vergossene Flüssigkeit in Vertiefung 14 fließt. Das bevorzugte
System schließt ein einen Deckel 62, auf Größe gebracht, Vertiefung 14 abzudecken und Freigabe für
Einsatz 24 zur Verfügung zu stellen, wenn er in der Vertiefung positioniert wird. Wenn Deckel 62 auf
oberem Ende 59 positioniert ist, bedeckt er vorzugsweise Rippe 60, so daß irgendeine Kondensation, die
sich auf einer Innenseitenoberfläche 64 des Deckels bildet und herunter auf oberes Ende 59 läuft, im
wesentlichen von Vertiefung 14 weg kanalisiert wird. Vorzugsweise verhüten Deckel 62 und Rippe 60 im
wesentlichen, daß Mikroorganismen in Vertiefung 14 eindringen.
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Oberes Ende 59 schließt vorzugsweise eine Vielheit von Markierungen 65 ein, die, wenn mit einer
Markierung 66 auf Einsatz 24 ausgerichtet, ein Anzeichen des Abstandes von poröser Membran 34 von
Bodenwand 18 liefern. Vorzugsweise ist Markierung 66 mit einer von Markierungen 65 abgeglichen, wenn
Einsatz in der ersten Position ist, und einer zweiten von Markierungen 65, wenn der Einsatz in der zweiten
Position im Hinblick auf Bodenwand 18 ist, wodurch somit dem Forscher ein Anzeichen des Abstandes
zwischen Markierung 34 und Vertiefungsboden 18 geliefert wird.
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Kulturgefäß 12 ist vorzugsweise aus thermoplastischem Harz, im wesentlichen frei von
Materialien, die durch wäßrige Zellkulturmedien extrahierbar sind, gebildet. Geeignete Materialien zum
Bilden von Kulturkessel 12 schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt, Polystyrol,
Polyethylenterephthalat, Polyethylenterephthalatnitril und dergleichen.
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Während Einsatz 24 vorzugsweise als ein Kegelstumpf mit einem ersten Durchmesser "c" am
offenen Ende 28 und einem zweiten Durchmesser "d" am geschlossenen Ende 30 gebildet ist, werden
andere Formen in Betracht gezogen, im Umfang der Erfindung zu liegen. Durchmesser "c" ist vorzugsweise
größer als Durchmesser "d". Seitenwand 25 von Einsatz 24 ist vorzugsweise im wesentlichen starr und aus
thermoplastischem Harz gebildet. Geeignete thermoplastische Harze schließen ein, sind aber nicht darauf
beschränkt, Polyethylenterephthalat, Polyethylen, Polystyrol, Polycarbonat und dergleichen. Mikroporöse
Membran 34 wird vorzugsweise aus Materialien, wie Polyethylenterephthalat, Polycarbonat und
dergleichen, gebildet. Membran 34 hat eine Menge von offenen Poren dadurch, vorzugsweise auf Größe
gebracht zwischen etwa 0,2 bis etwa 40,0 Mikrometer mit einer Porendichte zwischen etwa 0,1 · 106 bis
etwa 10,0 · 10&sup8; Poren pro Quadratzentimeter.
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Der Zellkultursystem ermöglicht es einem Forscher, eine Zellpopulation oberhalb der Membran in
der Aufnahme zu kultivieren, die durch die poröse Membran in einer Umgebung von enger Nähe zu einer
anderen Zellpopulation auf dem Boden von Vertiefung 14 gebildet ist. Wenn sich die Kultur entwickelt,
erlaubt die variable Position des Einsatzes in der Vertiefung das erneute Anordnen des Einsatzes, wodurch
entweder die ursprüngliche Abstandbeziehung beibehalten wird, wenn die Zellzahlen zunehmen, oder
Abstand zwischen den ersten und zweiten Zellpopulationen erhöht wird, wodurch Strukturentwicklung in
dem System ermutigt wird. Kürzliche Artikel von R. Nowak und J. Travis in Science: 266, Seiten 567-568
und 568-570 (1994) beschreiben potentielle Funktionen von Zellkommunikation bei Organbildung in
Embryonen und bei Neuronentwicklung. Das System liefert einem Forscher dadurch, daß es einen variablen
Abstand zwischen der porösen Membran und dem Vertiefungsboden hat, die Möglichkeit,
Abstandswirkungen auf die zelluläre Entwicklung zu untersuchen. Bevorzugtes System 10 mit Öffnungen
52 und 56 erlaubt es auch dem Forscher, die Umgebung der Zellpopulationen zu kontrollieren durch
Wiederauffrischen oder Ändern des Kulturmediums in der Vertiefung ohne Zerstörung der Zellen, wie auch
Einstellen des Abstandes zwischen dem Einsatz und dem Kesselboden. Das Vorhandensein von unterer
Öffnung 56 erlaubt Abziehen von Proben des flüssigen Mediums aus der Vertiefung ohne Zerstörung der
wachsenden Zellen. In den meisten verfügbaren Zellkultursystemen, auf die zuvor bezug genommen wurde,
muß ein Forscher mit einer Pipette in die Vertiefung von dem offenen oberen Ende unter Abziehen einer
Probe eindringen oder das Kulturmedium ändern. Die Verwendung einer Pipette kann das Züchten von
Zellen zerstören.
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Zellkultur wird auch in Laborverfahren auf einer Probe, gezogen von einem Patienten oder einem
Labortier, verwendet. Diese in vitro Proben sind nicht notwendigerweise immer das korrekte Volumen für
fixierte Abstandszellkulturvorrichtung. Bevorzugte Vorrichtung 10 ermöglicht es dem Laborarbeiter, leicht
variierbare Probengröße zu kompensieren durch Einstellen des Abstandes zwischen poröser Membran 34
auf dem Einsatz und Boden 18 der Vertiefung. Vorzugsweise würde der Laborarbeiter es nötig haben, das
Volumen aufzufüllen durch Verdünnen der Suspension mit Medium, was die Ergebnisse des Verfahrens
zerstören kann.
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Unter Bezugnahme auf Fig. 3 ist eine Ausführungsform des Systems der gegenwärtigen Erfindung
veranschaulicht. In dieser Ausführungsform sind einige Elemente des Systems im wesentlichen ähnlich zu
denjenigen in Fig. 1 und 2 veranschaulicht. Demgemäß werden im wesentlichen ähnliche Komponenten,
die im wesentliche ähnliche Funktionen durchführen, in ähnlicher Weise zu denjenigen von Fig. 1 und 2
nummeriert, ausgenommen, daß eine Nachsilbe "a" verwendet wird, jene Komponenten in Fig. 3 zu
identifizieren.
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In dieser Ausführungsform hat Außenseitenoberfläche 26a von Einsatz 24a mindestens zwei außen
befindliche Vorsprünge 70, angeordnet, eine Vielheit von Stufen 74 in Innenseitenoberfläche 22a von
Vertiefung 14a in einer Nocken/Nockenstößelbeziehung zu koppeln. Stufen 74 sind in verschiedenen
Abständen von Vertiefungsboden 18a angeordnet, es somit Einsatz 24a erlaubend, variabel in Vertiefung
14a zwischen der ersten Position und der zweiten Position über Vertiefungsboden 18a angeordnet zu sein.
Einsatz 24a ist regulierbar angeordnet durch Rotieren von Einsatz 24a im Hinblick auf Kessel 12a unter
Plazieren von Vorsprüngen 70 auf Stufen 74 unter zur Verfügung stellen der gewünschten Trennung
zwischen poröser Membran 34a und Kesselboden 18a.
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Das System der gegenwärtigen Erfindung ist besonders für Untersuchungen von
Strukturdifferenzierung in Embryozellen in Organe und in Kultur von Modellen für Tumore und
Gewebedurchdringung geeignet. Das System der gegenwärtigen Erfindung ermöglicht, daß der Abstand
zwischen dem Zelleinsatz und dem Kulturkessel variiert wird, wodurch es somit einem Forscher ermöglicht
wird, leicht den Abstand für ein bestimmtes Experiment zu optimieren oder die Wirkungen von Abstand auf
die Zellkommunikation und Transport zu untersuchen.