JP3260634B2 - 生体外細胞培養アセンブリ - Google Patents

生体外細胞培養アセンブリ

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、概して研究室にお
ける細胞培養に関し、更に特定すると、生体外での細胞
の成長又は組織成長に有用なアセンブリに関する。
【０００２】
【従来の技術】種々のタイプの細胞の培養が多くの研究
室での定期的なプロセスとなっている。化合物を得るた
め、潜在的に有害な化合物に対する種々の感応性を試験
するため、及び移植組織を提供するために、細胞が培養
される。この作業は、単独培養（ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒ
ｅ）すなわち１つのタイプの細胞が適当な培養基内で成
長せしめられる方法が一般的である。
【０００３】最近においては、細胞の共培養（ｃｏ−ｃ
ｕｌｔｕｒｅ）が注目されてきた。細胞の共培養は、１
つの母集団の細胞を別の母集団の細胞の存在下で成長さ
せることを含む。細胞の共培養は、炎症反応の研究、細
胞分化プロセス、及び血液脳浸透性の研究にとって重要
である。
【０００４】細胞共培養に関する代表的な文献として
は、マグナム（Ｍａｇｎｕｍ）らによるＩｎ Ｖｉｔｒ
ｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ ２６：１１３５−
１１４３（１９９０年１２月）“初期肺細胞の標準的な
肺胞の傷に対する共培養及びタンパク質の移行（Ｃｏ−
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｐｕｌｍｏｎ
ａｒｙ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｍｏｄｅｌ Ａｌｖｅｏｌ
ａｒ Ｉｎｄｕｒｙ ａｎｄ Ｔｒａｎｌｏｃａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ）”、マダラ（Ｍａｄａｒ
ａ）らによるＪ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔ． Ｎｅｔｈ
ｏｄ，１４：２０９−２１６，（１９９２），“培養さ
れた上皮単層の電気的パラメータへの簡単なアプローチ
（Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｅｌｅ
ｃｔｒｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｏｆ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ
ｓ）：好中球−上皮間の相互作用の評価における使用
（Ｕｓｅｉｎ Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｎｅｕｔｒｏｐｈ
ｉｌ−ＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
ｓ）”、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らによるＪ．Ｔｉｓｓ
ｕｅ Ｃｕｌｔ． Ｍｅｔｈｏｄ，１４：２１７−２２
４“血液脳関門の研究における脳微小血管の培養された
上皮細胞の適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆＣｕｌ
ｔｕｒｅｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔ
ｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ
ｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ）”及びサイエ
ンス（Ｓｉｅｎｃｅ）、２６６：５６４−５６５（１９
９４）、“胎芽構造がいかに形成されるかについての手
掛かりの発見（Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｃｌｕｅｓ Ａｂｏｕ
ｔＨｏｗ Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｆｏ
ｒｍ）”がある。上記の文献は、１つのタイプの細胞と
別のタイプの細胞との間の相互作用の生体外での研究に
関する技術の背景を提供している。
【０００５】上記のミラーらは、剛性のプラスチック表
面及びフィルタ又は膜挿入部材上での細胞の培養につい
て説明している。ミラーらは、フィルタ又は膜挿入部材
上で培養されたウシの脳の内皮細胞（ｂｏｖｉｎｅ ｂ
ｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）（Ｂ
ＢＥＣ）は、剛性のプラスチック表面上で培養されたＢ
ＢＥＣより優れた利点を提供すると報告している。この
利点は、代謝又は受容体の配分に関する細胞の極性を検
査することができる点である。ミラーらは、更に、フィ
ルタ又は膜の挿入部材上でのＢＢＥＣの培養は、細胞の
単層を横切る細胞透過移送又は浸透性を測定するのに必
要とされることを述べている。
【０００６】上記した“サイエンス”という文献は、腎
臓組織の成長に関する研究について述べている。この文
献は、間葉細胞は、Ｗｎｔ−１プロテインを製造する細
胞と共培養して、腎臓の管状及び糸球体組織を含む腎臓
構造内へ分化すること及びこの効果は対照細胞内では見
られないことを報告している。
【０００７】細胞を共培養するための器具及び装置の必
要性の増大に応答して、本願出願人に譲渡されたマッシ
ー（Ｍｕｓｓｉ）らによる米国特許出願第０８／１２
４，４１５号に共培養装置が開示されている。この開示
は、細胞の共培養を準備するための完全な自己収容型の
装置を提供している。
【０００８】ライマン（Ｌｙｍａｎ）らに付与された米
国特許第５，０２６，６４９号は、細胞を培養及び共培
養するために利用することができる挿入器具を開示して
いる。
【０００９】マツイ（Ｍａｔｓｕｉ）らに付与された米
国特許第４，８７１，６７４号は、円筒状部材の底部を
形成している多孔質の膜を有する細胞を培養するための
挿入部材を開示している。この円筒形部材は更に、ウエ
ル内に懸架される構造を有している。
【００１０】ライマンらの特許及びマツイらの特許は、
両方とも、膜上で細胞を培養するために使用することが
できる装置を開示しているが、これらはいずれも、１つ
の母集団の細胞を、別の母集団の細胞から種々の距離に
おいて成長させるのに適していない。米国特許出願第０
８／１２４，４１５号に開示された細胞培養装置は、膜
の両側において細胞を培養するのに極めて適している
が、距離が固定されており、この固定距離は、多数の共
培養がなされるスクリーニングの研究のためには時間が
かかるかもしれない一連の操作を必要とする。
【００１１】本明細書において引用された引例及び特許
に記載された装置及び技術の全てにおいて、多孔質の膜
を備えた細胞培養挿入部材が細胞培養容器内に懸架され
ると、多孔質の膜と懸架している容器の底部との間の距
離は固定されており且つ一定である。構造が、例えば腎
臓の管状及び糸球体組織を含む腎臓培養を成長させる器
官細胞の研究及び成長における幾つか用途においては、
構造的な分化成長を観察することが望ましいことが多
い。研究者が、容器の壁の底部と挿入部材との間の距離
を調整することができる装置が必要とされている。挿入
部材と底部との間に調整可能な距離を有することの別の
利点は、研究者が培養基と試料の量の変化を補償できる
ことである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な装置すなわち、挿入部材と底部との距離を調整可能な
培養アセンブリを提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明による、細胞を生
体外で培養するためのアセンブリは、少なくとも１つの
ウエルを備えた培養容器を含んでいる。このウエルは、
開口頂部、底部及び内側面を有する壁を有している。こ
のアセンブリはまた、ウエル内に配置できる大きさの少
なくとも１つの挿入部材をも含んでいる。この挿入部材
は、外側面と、開口端部と、閉塞端部とを有している。
この挿入部材の閉塞端部には、端部を閉塞して挿入部材
内に収容容器を形成する微孔質の膜が設けられている。
この挿入部材は、挿入部材の閉塞端部とウエルの底部と
の間の距離を変更するためにウエル内で調整可能に配置
できる。
【００１４】本発明のアセンブリは、特に、器官細胞内
への胎芽細胞内の構造の分化の研究のみならず腫よう及
び組織浸透のための標準の培養における研究に対して有
用である。現状において入手可能な、ウエル内に懸架さ
れる挿入部材を備えた培養アセンブリは、挿入部材の閉
塞された底部に設けられた膜と容器の底部との間の距離
が固定されている。多くの場合には、入手可能な培養基
と細胞懸濁液との量は、懸濁液の希釈なしに培養基と挿
入部材の膜との間に所望の接触を提供するのには不十分
である。その他の場合には、培養が成長する際に、腎臓
の管状及び糸球体組織のような構造が適正に分化するた
めに膜と容器内で成長しつつある細胞との間の距離が小
さくなり過ぎるので、組織の分化の効果が観察できな
い。本発明のアセンブリは、細胞挿入部材と培養容器と
の間の距離を変えることができ、研究者が特定の実験の
ために挿入部材と容器の底部との間の距離を理想化する
ことができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明は、多くの異なる形の実施
形態によって実現できるけれども、本発明の原理の単な
る例示であり本発明は図示された実施形態に限定される
ものではないという理解の下に、本発明の好ましい実施
形態を図示し且つ以下に詳細に説明する。本発明の範囲
は、特許請求の範囲及びその等価物によって判断される
べきである。
【００１６】図１及び２を参照すると、生体外での細胞
の培養に有用な本発明のアセンブリ１０が示されてお
り、アセンブリ１０は、少なくとも１つのウエル１４を
備えた培養容器１２を含んでいる。ウエル１４は、開口
した頂部１６と、底部１８と、内側面２２を備えた壁２
０とを有している。アセンブリ１０は、ウエル１４内に
配置できる大きさになされた少なくとも１つの挿入部材
２４を含んでおり、この挿入部材は、管形状であるのが
好ましい。挿入部材２４は、外側面２６を有する側壁２
５と、開口端部２８と、閉塞端部３０と、開口端部２８
と閉塞端部３０との間のキャビティ３２とを有してい
る。閉塞端部３０は、微孔質の膜３４によって閉塞され
て挿入部材内に収容部３６を形成している。挿入部材２
４は、ウエル１４内で、閉塞端部３０がウエルの底部１
８から第１の距離“ａ”の位置に位置決めされる第１の
位置と、閉塞端部３０がウエルの底部１８から第２の距
離“ｂ”の位置に位置決めされる第２の位置との間に調
整自在に位置決めされる。本明細書においては、便宜の
ために、アセンブリ１０は１つのウエルのみを有するも
のとして示されている。複数の挿入部材を備えた複数ウ
エルのアセンブリも本発明の範囲内であると考えられ
る。
【００１７】好ましくは、挿入部材２４は、ウエルの内
側面２２と挿入部材の外側面２６とに設けられた結合ね
じ４０によってウエル１４内に調整自在に位置決めされ
る。好ましいねじ４０は、挿入部材を容器１２に対して
回転させることによってウエル１４内に挿入部材２４を
調整自在に位置決めするのを容易にする。この実施形態
においては、挿入部材２４は、閉塞端部３０がウエルの
底部１８から約０．５ｍｍないし約１．５ｃｍの間とな
るように調整可能である。最も好ましい挿入部材２４
は、膜３４がウエルの底部１８から約５ｍｍないし約５
０ｍｍの範囲に位置決めされるように調整することがで
きる。
【００１８】培養容器１２は、ウエル１４へのアクセス
を提供するための少なくとも１つの孔を含んでいるのが
好ましい。最も好ましくは、容器１２は、ウエル１４に
対するフィルタ５４を有する通気口として機能する上方
孔５２と、ウエル１４からほぼ全ての流体を抜き取るこ
とができるように位置決めされた穿刺可能で好ましくは
自己密封型の隔膜５８を備えた下方孔５６とを含む。フ
ィルタ５４は、ウエル１４内への微生物の侵入を実質的
に防止しつつ外界とウエル１４との間の大気の交換を可
能にするのが好ましい。下方孔５６は、研究者が、細胞
の成長を実質的に妨害することなくウエル１４から液体
培養基を追加するか又は取り出すことを可能にする。培
養基は、下方孔を使用して交換又は変えてもよい。孔５
２の存在によって、ウエル１４とチャンバとの間の気体
の交換が可能になり且つ下方孔５６を介する液体培地の
追加及び取り出しに対する大気の補償がなされる。培養
容器１２は頂部５９を有し、この頂部は、同頂部上にこ
ぼれた流体がウエル１４内へ流れ込むのを実質的に防止
するバリアを提供するために上方に延びたリブ６０を含
むのが好ましい。好ましいアセンブリは、ウエル１４を
覆う大きさになされた蓋６２を含み且つウエル内に位置
決めされたときに挿入部材２４のためのクリアランスを
提供する。蓋６２が頂部５９に位置決めされたとき、同
蓋は、蓋の内面６４上のいかなる凝縮及び頂部５９上へ
の流下が実質的にウエル１４から外へ流されるようにリ
ブ６０を覆うのが好ましい。蓋６２とリブ６０とは、微
生物がウエル１４内へ入るのを実質的に防止する。
【００１９】頂部５９は、挿入部材２４に設けられたマ
ーク６６と整合せしめられたときに多孔質の膜３４のウ
エル底部１８からの距離の指示を提供する複数のマーキ
ング６５を含むのが好ましい。好ましくは、マーク６６
は、挿入部材が第１の位置にあるときにマーキング６５
のうちの一つと整合し、挿入部材が底部１８に対して第
２の位置にあるときにマーキング６５のうちの第２のも
のと整合して、膜３４とウエル底部１８との間の距離の
指示を研究者に提供する。
【００２０】培養容器１２は、水性細胞培養基によって
抽出可能な材料に実質的に影響されない熱可塑性樹脂に
よって作られるのが好ましい。培養容器１２を形成する
ための適当な材料としては、限定的ではないが、ポリス
チレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテ
レフタレートニトリル等がある。
【００２１】挿入部材２４は、開口端２８が第１の直径
“ｃ”で閉塞端３０が第２の直径“ｄ”の円錐形の円錐
台として形成されるのが好ましいけれども、他の形状も
本発明の範囲内であると考えられる。直径“ｃ”は直径
“ｄ”よりも大きいのが好ましい。挿入部材２４の側壁
２５は、実質的には剛性で且つ熱可塑性樹脂によって作
られるのが好ましい。適当な熱可塑性樹脂としては、限
定的ではないが、ポリエチレンテレフタレート、ポリエ
チレン、ポリスチレン、ポリカーボネート等がある。微
孔質の膜３４は、ポリエチレンテレフタレート、ポリカ
ーボネート等のような材料によって作られるのが好まし
い。膜３４は、１平方センチメートル当たり約０．１×
１０6〜約１０×１０8個の孔を含む孔密度の好ましくは
約０．２〜４０．０ミクロンの大きさの多数の開口した
孔を有する。
【００２２】本発明の細胞培養アセンブリは、研究者
が、一つの集団の細胞を、ウエル１４の底部上の別の集
団の細胞に近接した環境内で多孔質の膜によって形成さ
れた収容部内において膜の上方で細胞を培養することを
可能にする。培養が成長するとき、ウエル内における挿
入部材の種々の位置によって、細胞の数が増加する際に
元々の間隔を維持するために、又は装置内での構造の成
長を促進するために第１の集団の細胞と第２の集団の細
胞との間の距離を増すために、挿入部材の再位置決めが
可能になる。サイエンス：２６６、ｐｐ５６７−５６８
及び５６８−５７０（１９９４年）におけるアール・ノ
ーワック（Ｒ．Ｎｏｗａｋ）及びジェイ・トラビス
（Ｊ．Ｔｒａｖｉｓ）による最近の文献は、各々、胎芽
内の器官の形成及び神経の成長における細胞の伝達の潜
在的な機能について述べている。本発明のアセンブリ
は、多孔質の膜とウエル底部との間の距離が変更可能で
あることにより、細胞成長に対する距離の効果を研究す
る機能を研究者に提供する。孔５２及び５６を備えた好
ましいアセンブリ１０はまた、細胞を妨害することなく
ウエル内の培養基を新しくするか又は交換することによ
るばかりでなく、研究者が挿入部材と容器底部との間の
間隔を調整することによって細胞群の環境を制御するこ
とを可能にする。下方孔５６の存在によって、細胞の成
長を妨害することなくウエルから液体培養基の試料を取
り出すことができる。上記において参考とした市販され
ている細胞培養アセンブリのほとんどにおいては、研究
者は、試料を抜き取るか又は培養基を変えるために開口
頂部からピペットによってウエル内に侵入しなければな
らない。ピペットの使用は、成長している細胞を妨害す
るかもしれない。
【００２３】細胞培養はまた、患者又は研究室の動物か
ら抜き取られた試料に対する研究室での過程においても
使用される。これらの生体内試料は、必ずしも常に固定
距離の細胞培養装置に対して正しい容積ではない。好ま
しい装置１０は、研究室の作業者が、挿入部材上の多孔
質の膜３４とウエルの底部１８との間の距離を調整する
ことによって、可変の試料の大きさに対する補償を容易
に行うことができる。以前には、研究室の作業者は、過
程の結果を破壊するかもしれない培養基によって懸濁液
を希釈することによって容積を作り上げる必要があっ
た。
【００２４】図３を参照すると、本発明のアセンブリの
別の実施形態が示されている。この実施形態において
は、アセンブリのいくつかの部品が図１及び２に示した
ものとほぼ類似している。従って、ほぼ同様の機能を果
たすほぼ類似の構成部品は、図３においてはこれらの構
成部品を特定するために添字“ａ”が付されている以外
は図１および２に示されたものと類似の番号が付されて
いる。
【００２５】この実施形態においては、挿入部材２４ａ
の外側面２６ａは、カム対カムフォロアーの関係でウエ
ル１４ａの内側面２２ａ内の複数の段部７４と係合する
ように位置決めされた少なくとも２つの外側突出部７０
を有する。段部７４は、ウエル底部１８ａからいくつか
の距離のところに設けられていて、挿入部材２４ａを、
ウエル底部１８の上方の第１の位置と第２の位置との間
で変更自在にウエル１４内に位置決めすることができ
る。挿入部材２４ａは、挿入部材２４ａを容器１２ａに
関して回転させて段部７４上に突出部７０を配置するこ
とによって調整自在に位置決めされて、多孔質の膜３４
ａと容器底部１８ａとの間の所望の間隔を提供する。
【００２６】
【発明の効果】本発明のアセンブリは、胎芽細胞内の構
造の器官への分化並びに腫よう及び組織の浸透のための
モデルの培養の研究のために特に有用である。本発明の
アセンブリは、細胞の挿入部材と培養容器との間の距離
が変更可能であり、研究者が、容易に特定の実験のため
の距離を理想化するか又は細胞の伝達及び移行に対する
距離の効果を研究することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞培養アセンブリの部分分解斜視図
である。
【図２】図１のアセンブリの線２−２に沿った断面図で
ある。
【図３】図１の細胞培養アセンブリの別の実施形態の分
解斜視図である。
【符号の説明】
１０ 細胞培養アセンブリ、 １２ 培養容器、
１４ ウエル、１６ 開口頂部、 １８ 底部、
２０ 壁、 ２２ 内側面、２４ 挿入部材、 ２
６ 外側面、 ２８ 開口端部、３０ 閉塞端部、
３２ キャビティ、 ３４ 多孔質の膜、３６ 収
容部、 ５２，５６ 孔、 ５４ フィルタ、５９
培養容器の頂部、 ６０ リブ、 ６２ 蓋、６
４ 蓋の内面、 ６５ マーキング、 ６６ マー
ク、７０ 突出部、 ７４ 段部
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲ ＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩ ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲ ＩＣＡ (72)発明者 ニコラス・ジー・エム・ペイ フランス共和国38720 サン−イレー ル・デュ・トゥヴェ，シュマン・デ・ヴ ィヤル（番地なし) (56)参考文献 米国特許4812407（ＵＳ，Ａ) 特許からみた機械要素便覧「軸・軸 受・ばね・緩衝」特許庁編，昭和57年２ 月１日発行，社団法人発明協会 ｐ46〜 49, (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 3/00 C12M 1/24

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞の生体外培養のためのアセンブリで
    あって、 該アセンブリは、開口端部、底部及び内側面を有する壁
    とを有する少なくとも１つのウエルを備えた培養容器
    と、前記ウエル内に配置するための大きさの少なくとも
    １つの挿入部材であって、外側面、開口端部及び閉塞端
    部を有し、前記閉塞端部が微孔質の膜によって閉塞され
    て同挿入部材に収容部を形成している挿入部材と、前記
    挿入部材の前記閉塞端部と前記ウエルの前記底部との間
    の距離が選択的に変更可能なように、前記挿入部材を前
    記ウエル内に調整自在に位置決めするための位置決め手
    段と、を含み、 前記位置決め手段が、前記挿入部材の前記外側面に設け
    られた少なくとも一つの外側突出部と、前記ウエルの前
    記底部から増加していく複数の距離の位置で前記ウエル
    の前記内側面から内方に突出している複数の段部とを含
    み、前記突出部と前記段部とは、同段部に前記突出部を
    配置することによって前記ウエル内に前記挿入部材を調
    整自在に位置決めするためのカム対カムフォロアーの関
    係で配設されている、前記アセンブリ。
  2. 【請求項２】 前記壁が、前記ウエルへのアクセスを提
    供するための少なくとも一つの孔を含む、請求項１に記
    載のアセンブリ。
  3. 【請求項３】 前記ウエルが、更に、前記ウエルへのア
    クセスを提供するための上方孔と下方孔とを含む、請求
    項２に記載のアセンブリ。
  4. 【請求項４】 前記下方孔が、前記ウエル内の流体の抜
    き取りを容易にするように位置決めされた穿刺可能な隔
    膜を含む、請求項３に記載のアセンブリ。
  5. 【請求項５】 前記上方孔が、前記ウエルと外側雰囲気
    との間の気体の交換を可能にするように位置決めされた
    通気口を含む、請求項３に記載のアセンブリ。
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