DE69534132T2

DE69534132T2 - Zellkulturflasche mit mehreren kammern

Info

Publication number: DE69534132T2
Application number: DE69534132T
Authority: DE
Inventors: John Wilson; Martin L. Wolf
Original assignee: WILSON WOLF CORP; WILSON WOLF CORP NEW BRIGHTON
Current assignee: Wheaton Industries Inc
Priority date: 1994-06-28
Filing date: 1995-06-27
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2015-06-28
Also published as: CA2193810C; ATE292673T1; DE69534132D1; WO1996000780A1; EP0769048A4; EP0769048A1; CA2193810A1; JPH10504710A; JP3608664B2; EP0769048B1

Description

HINTERGRUND – GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Züchten von Zellen oder Gewebe in vitro.
HINTERGRUND – BESCHREIBUNG VON STAND DER TECHNIK
Die Züchtung von Säugetierzellen in vitro erfolgt üblicherweise in ruhenden Kulturbehältern, beispielsweise Gewebekulturkolben (US-Patent 3,449,210, erteilt am 10. Juni 1966 und US-Patent 5,151,366, erteilt am 29. September 1992), Spinnerflaschen und Zellkulturplatten mit mehreren Aufnahmen (US-Patent 3,597,326, erteilt am 3. August 1971 und US-Patent 4,012,288, erteilt am 15. März 1977). Bei einer solchen Zellkultur wird periodisch ein Teil des Zellkulturmediums entfernt und ersetzt, da die Zellen Nährstoffe verbrauchen und Ausscheidungsprodukte erzeugen. Diese Vorgehensweise führt zu einer begrenzten Zelldichte, einer begrenzten Konzentration der von den Zellen abgeschiedenen Produkte und periodischen Änderungen in der Nährstoffkonzentration.
Marbrook verwendete eine Dialysemembran, um Zellen und von Zellen abgesonderte Produkte von dem Basalmedium zu trennen (Marbrook, J., "Primary Immune Response in Cultures of Spleen Cells", the Lancet, 2, 1279–1281 [1967]). Bei dieser Vorrichtung liegt eine innere konzentrische Kammer in einer äußeren konzentrischen Kammer. Der Boden der inneren Kammer wird von einer Dialysemembran gebildet, die in das Basalmedium eingetaucht ist, das in der äußeren Kammer enthalten ist. Zellen liegen auf der Membran, erhalten Nährstoffe und erzeugen Ausscheidungsprodukte. Eine ständige Dialyse wird dadurch begrenzt, daß die Membran durch die auf ihr lastende Zellmasse ihre Kapazität zum Substrattransport verliert. Dadurch wird die Fähigkeit zum Erhalten von Kulturen über längere Zeit beeinträchtigt.
Verma (US-Patent 4,296,205, erteilt am 20. Oktober 1981) lehrt die Verwendung eines Gewebekultureinsatzes, der in das Zellkulturabteil eingesetzt wird, um zu verhindern, daß Zellen direkt mit der Dialysemembran in Kontakt treten und diese verstopfen. Der Zellkultureinsatz ist perforiert, damit Nährstoffe zu den Zellen gelangen können. Beim Züchten von Zellen einer Suspension können sich Zellen und zellulärer Abfall durch die Perforation hindurch bewegen und auf der Dialysemembran ablagern. Dadurch wird eine fortdauernde Dialyse bei Züchtungen über längere Zeiträume verhindert. Ferner kann die räumliche Struktur des Einsatzes dazu führen, daß Mikroumgebungen entstehen, indem Konzentrationsgradienten ungleichmäßig über die Oberfläche der Platte verteilt sind.
Vogler (US-Patent 4,748,124, erteilt am 31. Mai 1988) beschreibt ein Zellkulturabteil, das von einem unteren, gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Blatt und einer oberen Dialysemembran begrenzt wird. Durch diesen Aufbau wird ein Verstopfen der Dialysemembran verhindert, da auf ihr keine Zellen liegen. Die Dialyse kann jedoch auf andere Weise behindert werden. Ferner ist die Möglichkeit zur Variation der Sauerstoffspannung im Vergleich zu Marbrook und Verma begrenzt. Zudem sind die chemischen Eigenschaften der Oberflächen von Materialien, die verwendet werden, um einen Gastransfer zu ermöglichen, beschränkt und können in manchen Fällen bei Kontakt mit Proteinen oder Zellen ungünstig sein. Schließlich führt die Lehre nicht zu einer höheren Zelldichte der Kultur als zu herkömmliche, statische Züchtungsverfahren.
Der Aufbau von Vogler kann dazu führen, daß die Dialyse des Zellabteils eingeschränkt wird. Ein großes Problem kann sich daraus ergeben, daß Flüssigkeit aus der Wachstumskammer verdunstet. Durch die gasdurchlässigen Oberflächen kann Dunst in erheblichem Umfang hindurchtreten. Dieser Flüssigkeitsverlust führt zu einem Abbruch der Dialyse, sobald die Dialysemembran nicht mehr mit Flüssigkeit in Kontakt steht. Ein Nachlassen der Dialyse tritt auch auf, wenn das Zellkulturmedium ausgast. Das Zellkulturmedium wird typischerweise bei 4°C gelagert. Wenn sich das Medium erwärmt, verringert sich dessen Kapazität, Gas zu speichern, und es entstehen Gasblasen, die mit der Dialysemembran in Kontakt kommen.
Durch das gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Blatt des Zellkulturabteils werden die zur Verfügung stehenden Möglichkeiten zur Kontrolle von perizellulärem pH und P_O2 beschränkt. In den vorbekannten Vorrichtungen von Marbrook und Verma konnte die Sauerstoffspannung durch Anpassen des Flüssigkeitsspiegels in dem Zellkulturabteil geändert werden. Bei dem Aufbau und der Methode, die von Vogler vorgeschlagen wurden, ist es erforderlich, die Sauerstoffspannung zu ändern, indem die Eigenschaften der die Vorrichtung umgebenden Raumluft geändert werden.
Die Sauerstoffspannung ist für die Lebensfähigkeit von Zellen und die Proteinabsonderung sehr bedeutsam (Reuveny et al., "Factors Affecting Cell Growth and Monoclonal Antibody Production in Stirred Reactors", Journal of Immunological Methods, 86, 53–59 [1986]). Die Gasdurchlässigkeit von handelsüblichen Blättern, die für Flüssig keit undurchlässig sind, und deren Einfluß auf perizelluläre pH und P_O2-Werte wird im Detail von Jenson et al. beschrieben (Jenson M. D., Wallach D. F. H. und Sherwood P., "Diffusion in Tissue Cultures on Gas-permeable and -impermeable Supports", J. Theor. Biol. (1976) 56, 443–458). Der Sauerstoffbedarf verschiedener Zellarten in Kombination mit der Gasdurchlässigkeit verschiedener gasdurchlässiger, flüssigkeitsundurchlässiger Blätter gibt für jede Kombination einen speziellen Gleichgewichtszustand perizellulärer pH und P_O2-Werte vor. Dies bedeutet, daß Zellinien sehr eingeschränkten perizellulären Bedingungen unterworfen sind. Eine Änderung der perizellulären Bedingungen wird erreicht, indem die Umgebungsbedingungen des Inkubators geändert werden, in dem sich die Vorrichtung befindet. Aus praktischen Gründen ist dies für Forscher schwierig, die Inkubatoren für eine große Vielfalt gleichzeitiger Anwendungen bei vorgegebenen Bedingungen betreiben.
Gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Blätter beschränken auch die oberflächenchemischen Eigenschaften, die zur Unterstützung der Zellen und Proteinstrukturen zur Verfügung stehen. Die Fortpflanzung und die Funktion von vielen Zellarten wird stark von der chemischen Natur der Oberfläche beeinflußt, auf denen sie liegen. Die oberflächenchemischen Eigenschaften von flüssigkeitsundurchlässigen Materialien sind mit vielen Zellarten und Proteinstrukturen unverträglich. Ferner kann hydrophobisches Material, das oft als Basis für gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Schichten dient, unspezifische Proteinbindungen bewirken. Dies wiederum kann zu einer Abreicherung von löslichen Wachstumsfaktoren führen. Auf diese Weise können zur Optimierung der Zellumgebung weitere Modifikationen der Materialien erforderlich werden.
Die Architektur von Vogler führt ferner zu einer begrenzten Zelldichte. Die Gestalt der Wachstumskammer wird durch das Gewicht der auf ihr lastenden Flüssigkeit deformiert. Druck einer größeren Flüssigkeitsmenge führt zu einem Absacken des gasdurchlässiges Blatts. Dadurch können sich Zellen der Suspension in einer Senke des Blatts absetzen. Hohe Zelldichten, die in der Senke des Blatts lokalisiert sind, führen zu einem zu hohen Widerstand für den Nährstofffluß und einer lokalen Reduktion der Lebensfähigkeit der Zellen. Ferner können sich die Zellen nicht in andere Gebiete des gasdurchlässigen Blatts ausdehnen.
Hubbard ( US 4,661,455 ) hat eine Zellkulturvorrichtung geschaffen, die eine erste Kammer für Sauerstoff, eine zweite Kammer für Zellen und eine dritte Kammer für Nährstoffe aufweist. Die Vorrichtung hat ein Gehäuse aus Plastik, in dem sich eine Doppelmembran befindet. Diese Veröffentlichung lehrt, daß zwei Öffnungen in dem Zellabteil (eine zum Einleiten von Flüssigkeit und eine zum Ablassen von Flüssigkeit) notwendig sind. Ein Pumpmechanismus wird verwendet, um den Fluß in die Basalmedium- und Zellabteile hinein und aus ihnen heraus mit einem Perfusionsverfahren zu steuern. Für Forschungsanwendungen und für Züchtungen in mittlerem Maßstab ist diese Vorrichtung nicht einfach genug.
Wrasidlo ( US 4,937,196 ) offenbart einen komplizierten Bioreaktor, in dem Zellen in einem von Blattmembranen gebildeten Abteil eingeschlossen sind. In dieser Vorrichtung sind Komponenten zum Züchten von Zellen und zum Extrahieren konzentrierter Zellabsonderungsprodukte vereint. Gasabteile ermöglichen den Fluß von ungebundenem Sauerstoff in die Zellabteile. Diese Veröffentlichung lehrt, daß zwei Öffnungen in dem Zellabteil (eine zum Einleiten und Flüssigkeit und eine zum Ablassen von Flüs sigkeit) notwendig sind. Der Fluß in die Basaldmedium- und Zellabteile hinein und aus ihnen heraus wird mit einem Pumpmechanismus gesteuert. Für Forschungsanwendungen und für Züchtungen in mittlerem Maßstab ist diese Vorrichtung nicht einfach genug.
Katinger ( EP 0155237 A2 ) befaßt sich mit einer Vorrichtung zum Züchten von Zellen, die getrennte Zellwachstums-, Medium- und Produktionskammern hat, die durch Membranen voneinander getrennt sind. Eine Nährstofflösung fließt durch die Mediumkammer, wohingegen der Inhalt der anderen Kammern in Ruhe ist. Diese Veröffentlichung lehrt, daß zwei Öffnungen des Zellabteils (eine zum Einleiten von Flüssigkeit und eine zum Ablassen von Flüssigkeit) notwendig sind. Die Umwälzung des Mediums erfolgt unter Einfluß von Perfusion. Gas wird zugeführt und abgeführt, indem die Gaskonzentration des Mediums, das sich in einem externen Behälter befindet, gesteuert wird. Für Forschungsanwendungen und für Züchtungen in mittlerem Maßstab ist diese Vorrichtung nicht einfach genug.
Cremonese ( EP 0307048 A2 ) diskutiert einen Zellkulturkolben mit einem hohlen Gehäuse und einer gasdurchlässigen Membran, die in dem Gehäuse angeordnet ist und das Gehäuse in zwei membrangeteilte Kammern unterteilt. Eine Gaseinlaßöffnung des Gehäuses steht mit der ersten Kammer in Verbindung. Eine Medieneinlaßöffnung des Gehäuses steht mit der zweiten Kammer in Verbindung. Diese Veröffentlichung lehrt die Notwendigkeit von zwei Öffnungen in dem Zellabteil, eine zur Zugabe von Flüssigkeit in und eine zum Ablassen von Flüssigkeit aus dem Zellabteil, in dem die Zellen ständig mit flüssigem Nährmedium versorgt werden. Gasfluß muß unter Druck durch einen Gaseinlaß und einen Gasauslaß erfolgen. Die Gefahr einer Kontamination ist groß.
Howell (WO 90/05179) offenbart eine Perfusions-Zellkulturvorrichtung, mit der biologische Zellen vermehrt und versorgt werden können. Diese Vorrichtung ist für die Züchtung von Zellen in großem Maßstab ausgelegt und nutzt zur Optimierung ein sehr komplexes Verfahren, das speziell angepaßte Zusatzausrüstung erforderlich macht. Die Vorrichtung ist zum Funktionieren völlig auf Perfusion (d. h. erzwungene mechanische Bewegung) angewiesen, was für viele Labors eine komplizierte und teuere Angelegenheit ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren und Vorrichtungen für die Langzeitzüchtung von Zellen, die auf Verankerung angewiesen sind, und Zellen einer Suspension mit hoher Dichte zur Verfügung zu stellen, wobei verschiedene Sauerstoffspannungen möglich sein sollen und eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf dem Boden des Kulturabteils, eine ununterbrochene Dialyse und eine große Vielfalt von chemischen Eigenschaften der Oberflächen möglich sein sollen. Weitere Ziele und Vorteile können der nachfolgenden Beschreibung und den Zeichnungen entnommen werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Viele Probleme im Stand der Technik lassen sich durch unterteilte Zellkulturvorrichtungen lösen, die gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert sind, um eine Züchtung von Zellen bei hoher Dichte über einen langen Zeitraum zu ermöglichen.
Insbesondere wird ein Zellkulturabteil geschaffen, das eine untere gasdurchlässige Schicht und vertikal darüber ein oberes Blatt, das selektiv für Verbindungen einer vorgegebenen Größe durchlässig ist, sowie Mittel umfaßt, die für einen Abstand zwischen der Schicht und dem Blatt sorgen, so daß ein Kulturmedium zwischen dem oberen Blatt und der unteren gasdurchlässigen Schicht aufgenommen werden kann. Ein Basalmediumabteil wird von geeigneten Mitteln gebildet, so daß ein Basalmedium auf dem oberen Blatt liegen kann. Zugangsöffnungen führen zu dem Zellkulturabteil und dem Basalmediumabteil. Ein gasdurchlässiger Schichtträger ist unterhalb der gasdurchlässigen Schicht angeordnet und steht mit dieser teilweise in Kontakt, wodurch der größte Teil der gasdurchlässigen Schicht in einer im wesentlichen horizontalen Lage gehalten wird, so daß sich Zellen entlang des horizontalen Abschnitts der gasdurchlässigen Schicht verteilen können und ein Gasaustausch mit dem Zellkulturabteil nicht wesentlich behindert wird. Die gasdurchlässige Schicht kann aus einem beliebigen biokompatiblen, flüssigkeitsdurchlässigen oder -undurchlässigen, hydrophoben oder hydrophilen, porigen oder nichtporigen Material bestehen, das in einer speziellen Zellkultur für eine geeignete perizelluläre Umgebung sorgt und passende oberflächenchemische Eigenschaften hat.
Das obere Basalmediumabteil und das untere Zellkulturabteil sind so ausgebildet, daß eine Pipette eingeführt werden kann und ein Temperaturanstieg keinen Überdruck verursacht. Das Zellkulturabteil ist dafür ausgelegt, ein Nachlassen der Dialyse wegen Verdunsten oder Ausgasen zu verhindern, einen Flüssigkeitsstrom aus dem Reservoir des Basalmediums zu kompensieren und die Pflege von Zellkulturen in hoher Dichte über einen langen Zeitraum zu ermöglichen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung kann ein Verlust von Zellkulturmedium durch Verdunsten unabhängig von Umgebungsbedingungen kontrolliert werden, indem für Gasaustausch zwischen dem Zellkulturabteil und feuchtem Gas des oberen Basalmediumabteils gesorgt wird.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung kann die Sauerstoffspannung in dem Zellkulturabteil unabhängig von Umgebungsbedingungen präzise kontrolliert werden, indem ein drittes Abteil hinzugefügt wird, mit dem zum Ändern der Sauerstoffspannung ein veränderlicher Flüssigkeitsspiegel genutzt wird.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung kann das Volumen des Zellkulturabteils im Betrieb geändert werden, ohne daß dadurch die Dialyse unterbrochen wird.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung kann bei routinemäßigen Arbeiten der Lufteintrag in das Zellkulturabteil minimiert werden, um pH-Fluktuationen zu minimieren.
Bei einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung sind mehrere Zellkulturabteile vorhanden, die jeweils eine untere gasdurchlässige Schicht und vertikal darüber ein oberes Blatt, das selektiv für Verbindungen einer vorgegebenen Größe durchlässig ist, sowie Mittel umfassen, die für einen Abstand zwischen der Schicht und dem Blatt sorgen, so daß sich ein Kulturmedium zwischen dem oberen Blatt und der unteren gasdurchlässigen Schicht befindet. Ein Basalmediumabteil wird von geeigneten Mitteln gebildet, so daß ein Basalmedium auf dem oberen Blatt liegen kann. Die Zellkulturabteile und das Basalmediumabteil haben jeweils Zugangsöffnungen. Unter jeder der gasdurchlässigen Schichten befindet sich ein gasdurchläs siger Schichtträger, der mit der jeweiligen Schicht teilweise in Kontakt steht und durch den der größte Teil der gasdurchlässigen Schicht in einer im wesentlichen horizontalen Lage gehalten wird, so daß sich Zellen einer Suspension entlang des horizontalen Abschnitts der gasdurchlässigen Schicht verteilen können und ein Gasaustausch mit dem Zellkulturabteil nicht wesentlich behindert wird.
Durch einen solchen Aufbau wird ein Verfahren zum Züchten von Zellen bei hoher Dichte ermöglicht. Ferner wird ein Verfahren zum Kontrollieren der Sauerstoffspannung in der Umgebung der Zellen ermöglicht, indem eine flüssige Barriere für den Sauerstofffluß verwendet wird.
Durch diese Erfindung werden viele der mit dem Stand der Technik verbundenen Probleme gelöst. Sowohl suspendierte als auch haftende Zellen können über lange Zeiträume in hoher Dichte in vitro gezüchtet werden, wobei zugleich für eine variable Sauerstoffspannung, eine kontrollierte Verdunstung, den Erhalt kleiner Flüssigkeitsvolumen in Zellkulturabteilen und eine ununterbrochene Dialyse gesorgt werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen unterteilten Gewebekulturkolben mit aufgeschnittenem Zentrum;
2 ist eine Querschnittsansicht eines unterteilten Gewebekulturkolbens und zeigt ein Ausführungsbeispiel mit einer gasdurchlässigen Membran, von der einige Abschnitte in das Zellkulturabteil hineinragen;
3 ist eine Querschnittsansicht eines unterteilten Gewebekulturkolbens und zeigt ein Ausführungsbeispiel, bei dem der hydrostatische Druck in zwei Abteilen ausgeglichen wird;
4 ist eine Querschnittsansicht eines unterteilten Gewebekulturkolbens und zeigt ein Ausführungsbeispiel, bei dem die Verdunstung kontrolliert wird;
5 ist eine teilweise geschnittene Ansicht eines unterteilten Kolbens, bei dem pH-Fluktuationen bei routinemäßigen Arbeiten minimiert werden;
6 ist eine Seitenansicht eines unterteilten Kolbens, der auf einem Ende steht;
7 ist eine Querschnittsansicht eines unterteilten Gewebekulturkolbens und zeigt ein Ausführungsbeispiel, bei dem die Sauerstoffspannung variiert werden kann;
8 ist eine Draufsicht einer unterteilten Gewebekulturplatte mit mehreren Aufnahmen gemäß der vorliegenden Erfindung;
9 ist eine teilweise geschnittene Ansicht entlang der Schnittlinie A-A der Gewebekulturplatte aus 8 mit mehreren Aufnahmen; und
10 ist eine Draufsicht einer unterteilten Gewebekulturplatte, bei der das Basalmedium in einem gemeinsamen Reservoir ruht.
Bezugszahlen in den Zeichnungen

10: unterteilter Gewebekulturkolben
15: unterteilte Gewebekulturplatte mit mehreren
: Aufnahmen
20: Membran
30: Basalmediumabteil
40: Zellkulturabteil
50: Kulturmedium
60: Basalmedium
70: Zugangsöffnung des Zellkulturabteils
80: Deckel der Zugangsöffnung des Zellkulturabteils
85: obere Abdeckung
90: Zugangsöffnung zu dem Basalmedium
100: Deckel der Zugangsöffnung zu dem Basalmedium
110: Membranträger
120: gasdurchlässige Schicht
130: gasdurchlässiger Schichtträger
140: Gasdurchtrittsöffnung
150: Füße
170: Totraum über dem Basalmedium
180: Totraum über dem Kulturmedium
190: Gasdurchtrittskanal
200: Abdeckung des Gasdurchtrittskanals
210: Auslaßanschluß
220: variables Sauerstoffkontrollabteil
230: untere gasdurchlässige Schicht
240: Boden des Sauerstoffkontrollbteils
250: Zugangsöffnung des Sauerstoffkontrollabteils
260: flüssiger Widerstand
270: oberer Membranhalter
280: Fußleiste
290: Schlitz
300: Schlitzabdeckung
310: Scharnier der Schlitzabdeckung

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Im folgenden werden die Figuren erläutert. 1 zeigt eine teilweise geschnittene Ansicht eines Ausführungsbeispiels eines unterteilten Gewebekulturkolbens 10 gemäß der Erfindung. Der unterteilte Gewebekulturkolben 10 wird von einer Membran 20 in ein Basalmediumabteil 30 und ein Zellkulturabteil 40 unterteilt. In dem Zellkulturabteil 40 befindet sich ein Kulturmedium 50, das Zellen oder Gewebe enthält. In dem Basalmediumabteil 30 befindet sich ein Basalmedium 60. Auf das Zellkulturabteil 40 kann durch eine Zellkultur-Zugangsöffnung 70 zugegriffen werden, die von einem Deckel 80 verschlossen ist. Auf das Basalmediumabteil 30 kann durch eine Basalmedium-Zugangsöffnung 90 zugegriffen werden, die von einem Deckel 100 verschlossen ist. Ein Membranträger 110 stabilisiert die Membran 20. Eine gasdurchlässige Schicht 120 ruht auf einem gasdurchlässigen Schichtträger 130, der so ausgebildet ist, daß Gas mit dem größten Teil der Oberfläche der gasdurchlässigen Schicht 120 durch eine Gaszugangsöffnung 140 in Kontakt treten kann. Der gasdurchlässige Schichtträger 130 ruht auf Füßen 150 über der Fläche, auf welcher der unterteilte Gewebekulturkolben 10 ruht.
Zu Beginn wird ein Kulturmedium 50 mit Zellen oder entsprechendem Gewebe in das Zellkulturabteil 40 durch die Zellkultur-Zugangsöffnung 70 eingebracht, bis es die Unterseite der Membran 20 vollständig berührt. Basalmedium 60 wird in das Basalmediumabteil 30 durch die Basalmedium-Zugangsöffnung 90 eingefüllt. Vorzugsweise bleibt zwischen dem Basalmedium 60 und der Oberseite des Basalmediumabteils 30 ein Basalmedium-Totraum 170 frei. Der Deckel 100 der Zugangsöffnung zu dem Basalmedium ist vorzugsweise etwas gelockert. Auf diese Weise kann umgeben des Gas den pH-Wert des Basalmediums 60 beeinflussen. In Fällen, in denen der Deckel zur Vermeidung einer Kontamination dicht sitzen sollte, können für die Zugangsöffnung zu dem Basalmedium Deckel von der Art verwendet werden, wie sie bei Falcon^® Gewebekulturkolben benutzt werden.
Der unterteilte Gewebekulturkolben 10 ist so konstruiert, daß sich kein Überdruck bildet, wenn die Temperatur von darin enthaltenem Gas oder Flüssigkeit bei Einbringen in einen Inkubator ansteigt. Der Deckel 80 der Zugangsöffnung des Zellkulturabteils und der Deckel 100 der Zugangsöffnung zu dem Basalmedium können gelockert werden, damit sich ausdehnendes Gas in die umgebende Atmosphäre austreten kann. Das Kulturmedium 50 kann sich in einen Kulturmedium-Totraum 180 hinein ausdehnen. Das Basalmedium 60 kann sich in einem Basialmedium-Totraum 170 hinein ausdehnen. Auf diese Weise wird weder die Ebenheit der gasdurchlässigen Schicht 120 noch ein Flüssigkeitsstrom durch die Membran 20 oder die gasdurchlässige Schicht 120 durch Druck beeinträchtigt.
Als Folge eines Temperaturanstiegs tritt neben einer Flüssigkeitsausdehnung ein weiteres Phänomen auf. Die Fähigkeit eines flüssigen Mediums, Gas zu binden, verringert sich. Von dem Kulturmedium 50 freigesetzte Gasblasen können in den Totraum 180 des Kulturmediums gebracht werden, indem der unterteilte Gewebekulturkolben 10 vorübergehend gekippt wird. Auf diese Weise wird verhindert, daß sich Gas an dem Boden der Membran 20 ansammelt und die Dialyse behindert.
Der Totraum 180 des Kulturmediums ist dafür ausgelegt, Flüssigkeitsbewegungen auszugleichen, die durch die Membran 50 hindurch als Folge von hydrostatischen Druckunterschieden erfolgen können, die sich aus unterschied lichen Flüssigkeitsspiegeln in dem Basalmedium 60 und dem Kulturmedium 50 bei Inbetriebnahme ergeben können. Wenn Flüssigkeit durch die Membran 20 in das Zellkulturabteil 40 eindringt, steigt der Flüssigkeitsspiegel des Kulturmediums in den Totraum 180 hinein an. Wenn der Deckel 80 der Zugangsöffnung zu dem Zellkulturabteil in der dichtenden Verschlußposition ist, steigt die Flüssigkeit in dem Totraum 180 des Kulturmediums so weit an, bis der hydrostatische Druck des Kulturmediums 50 mit dem Druck des verdrängten Gases im Gleichgewicht ist. Wenn der Deckel 80 der Zugangsöffnung des Zellkulturabteils in einer gelockerten Stellung ist, steigt Flüssigkeit in dem Totraum 180 des Kulturmediums so weit an, bis ein Pegel erreicht ist, bei dem der Flüssigkeitsdurchtritt durch die Membran 50 wegen des verminderten Druckunterschieds zum Erliegen kommt. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Volumen des Kulturmediums 50, nachdem der Flüssigkeitsstrom zum Erliegen gekommen ist, nicht mehr als zweimal so groß wie das Volumen des Kulturmediums 50 beim Einrichten der Kultur.
Die Membran 20 ist aus einem Material, das selektiv für eine Gruppe von Molekülen durchlässig ist. Verschiedene Arten von Materialien sind geeignet, einschließlich Zellulose, Polyacrylnitrile, Polysulfone, Polycarbonate und Polyacrylamide. Beispielsweise werden zum Züchten von murinen Hybridomazellen üblicherweise Dialysemembranen verwendet, die Moleküle und Verbindungen mit Molekulargewichten von mehr als 15.000 zurückhalten. Bei Verwendung einer Membran mit dieser Eigenschaft werden Zellen, Wachstumsfaktoren und abgeschiedene Antikörper in dem Zellkulturabteil 40 zurückgehalten. Bei anderen Anwendungen kann es vorteilhaft sein, einen Austausch größerer Moleküle und Verbindungen frei zwischen dem Basalmedium 60 und dem Kulturmedium 50 zuzulassen. Beispielsweise kann eine Kultur von Lymphozyten hoher Dichte die Anwesenheit einer großen Menge von wachstumsstimulierenden Faktoren erforderlich machen. Diese Faktoren, wie beispielsweise Interleukin 2, können zu dem Basalmedium 60 und dem Kulturmedium 50 hinzugefügt werden. Durch geeignete Wahl der Porengröße der Membran 20 kann den Lymphozyten ein größerer Vorrat dieser Faktoren zur Verfügung gestellt werden.
Bei den meisten Anwendungen wird von der Membran 20 eine Durchlässigkeitsgrenze für das Molekulargewicht von 150.000 Dalton nicht überschritten. Dennoch gibt es Anwendungen, bei denen sogar noch größere Porengrößen erwünscht sein können. Wenn es beispielsweise nur darum geht, eine große Zahl von Zellen zu kultivieren, kann eine beliebige Porengröße verwendet werden, mit der Zellen in dem Zellkulturabteil 40 zurückgehalten werden. In einem solchen Fall könnte eine 0,2 μM oder 0,45 μM mikroporige Polycarbonatmembran verwendet werden, wie sie beispielsweise von Poretics Corporation (Livermore, Kalifornien) erhältlich ist.
Die Membran 20 wird von dem Membranträger 110 stabilisiert. Wenn Basalmedium 60 in das Basalmediumabteil 30 eingefüllt wird, lastet das Gewicht auf der Membran 20. Der Memtranträger 110 verhindert, daß die Membran 20 durchsackt und Kulturmedium 50 in den Totraum 180 des Kulturmediums hineindrängt. Der Membranträger 110 hat mit der Membran 50 möglichst wenig Kontakt, so daß die Oberfläche für die Dialyse nicht wesentlich reduziert wird. Der Membranträger 110 ist so konstruiert, daß Gasblasen frei in den Totraum 180 des Kulturmediums hineinwandern können. Der Membranträger 110 kann aus beliebigen biokompatiblen Materialen bestehen. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel handelt es sich um durchsichtigen Kunst stoff, beispielsweise Polystyren oder Polycarbonat. Falls es sich bei der Membran 20 um ein Material handelt, das auf ein starres Trägergitter aufgebracht wurde, oder eine genaue Kontrolle des Volumens des Kulturmediums 50, das über der gasdurchlässigen Schicht 120 ruht, nicht erforderlich ist, kann auf den Membranträger 110 verzichtet werden.
Das in 2 gezeigte Ausführungsbeispiel hat einen Aufbau, bei dem Abschnitte der gasdurchlässigen Schicht 120 in das Zellkulturabteil 40 hineinragen, so daß die Membran 20 gestützt und der Membramträger 110 nicht benötigt wird. Als Material ist Silikon geeignet, da es leicht in eine geeignete Form gebracht werden kann. Die Wandstärke kann minimiert werden, so daß ein zusätzlicher Gaseintrag in das Zellkulturabteil 40 möglich ist. Falls Silikon verwendet wird, sollte die durchschnittliche Wandstärke weniger als 0,015 Zoll (0,038 cm), vorzugsweise 0,004 bis 0,012 Zoll (0,01 bis 0,03 cm), betragen.
Bei der in 3 gezeigten Ausführungsform wird ein Durchsacken der Membran 20 verhindert und gewährleistet, daß im Betrieb Flüssigkeit mit der Oberseite und der Unterseite der Membran 20 in Kontakt bleibt. Die Ausführungsform ist besonders geeignet für Anwendungen, bei denen eine hohe Zellkonzentration angestrebt wird. Ein Membranträger 120 ist nicht vorhanden. Auf diese Weise kann eine sehr kleine Menge Kulturmedium 50 verwendet werden. Ferner werden Hindernisse für die Entnahme von Zellen vermieden. Bei dieser Ausführungsform kann mit verschiedenen Volumen von Zellkulturmedium 50 gearbeitet werden, da Flüssigkeitskontakt mit der Membran 20 stets gewährleistet ist.
Im Betrieb wird die Membran 20 von dem Gewicht des Basalmediums 60 auf die Oberfläche der gasdurchlässigen Schicht 120 gedrückt. Die Membran kann in diese Lage auch dadurch gebracht werden, daß das Zellkulturabteil 40 Unterdruck ausgesetzt wird. Anschließend wird eine vorgegebene Menge Kulturmedium 50, in dem die gewünschte Kultur enthalten ist, durch die Zugangsöffnung 70 in das Zellkulturabteil 40 eingebracht. Wenn der Deckel 100 der Zugangsöffnung zu dem Basalmedium und der Deckel 80 der Zugangsöffnung des Zellkulturabteils in ihrer jeweiligen Entlüftungsposition sind, stellt sich ein Flüssigkeitspegel des Kulturmediums 50 in dem Totraum 180 ein, bei dem der hydrostatische Druck des Basalmediums 60 ausgeglichen ist.
Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Volumen des Kulturmediums 50, das sich in dem Totraum 180 befindet, ein kleiner Bruchteil des Volumens des Kulturmediums 50, das sich zwischen der Membran 20 und der gasdurchlässigen Schicht 120 befindet. Wenn sich über die Membran 20 hingweg starke osmotische Gradienten entwickeln, kann Wasser von dem Basalmedium 50 in das Zellkulturabteil 40 gelangen. Falls sich ein solcher Zustand einzustellen beginnt, sollte der Deckel 80 der Zugangsöffnung des Zellkulturabteils in die dichte Verschlußstellung gebracht werden. Auf diese Weise läßt sich ein Anstieg von Flüssigkeit in dem Totraum 180 des Kulturmediums verhindern.
Zum Einbringen von Kulturmedium 50 in das Zellkulturabteil 40 ist ein Druck erforderlich, der zum Überwinden des hydrostatischen Drucks des Basalmediums 60 ausreicht. Hierfür kann die Zugangsöffnung 70 zu dem Zellkulturabteil so gestaltet werden, daß eine Pipette, Spritze oder ein anderer Behälter für das Kulturmedium, beispielsweise eine Tüte oder Flasche, eingeführt werden kann. Kulturmedium 50 kann auf dieselbe Weise entfernt werden.
Bei allen hier beschriebenen Ausführungsformen kann diese Vorgehensweise angewendet werden, um das Kulturmedium 50 in das Zellkulturabteil 40 einzuführen und daraus zu entfernen. Bei den meisten Ausführungsformen mit einem Membranträger 110, wird es nötig sein, eine Lüftungsöffnung vorzusehen, damit Luft in dem Zellkulturabteil ein- und ausströmen kann. Die Lüftungsöffnung ist erforderlich, damit Gas verdrängt werden kann, wenn Kulturmedium 50 in das Kulturabteil 40 eingefüllt wird. Wenn das Kulturmedium aus dem Zellkulturabteil 40 entnommen wird, wird es durch die Lüftungsöffnung ermöglicht, daß Gas frei werdendes Volumen des Kulturmediums 50 einnimmt. Die Zugangsöffnung 70 des Zellkulturabteils ist so ausgebildet, daß Gas hindurchströmen kann, während Kulturmedium 50 eingefüllt oder entnommen wird. Auf diese Weise wird das Zellkulturabteil gut belüftet.
Bei dem in 3 gezeigten Ausführungsbeispiel wird keine Lüftungsöffnung benötigt. Wenn die Membran 20 gegen die gasdurchlässige Schicht 120 gedrückt wird, wird Luft aus dem Zellkulturabteil 40 vor dem Einfüllen von Kulturmedium 50 verdrängt. Wenn Kulturmedium 50 verdrängt wird, senkt sich einfach die Membran 20. Auf diese Weise besteht nie die Notwendigkeit, daß Gas und Flüssigkeit gleichzeitig in das Zellkulturabteil hinein- und aus ihm hinausströmen.
Wenn das in 3 gezeigte Ausführungsbeispiel für sehr dichte Kulturen verwendet wird, sollte der durchschnittliche Abstand zwischen der Membran 20 und der gasdurchlässigen Schicht 120 weniger als 5 mm, vorzugsweise etwa 1 mm bis 2 mm, betragen.
Bei dem Ausführungsbeispiel von 3 kann ferner ein Verdunsten von Kulturmedium 50, durch das die Membran 20 Kontakt mit dem Kulturmedium 50 verlieren könnte, verhindert werden. Die Membran 20 treibt im wesentlichen auf dem Kulturmedium 50. Wenn Kulturmedium 50 durch die gasdurchlässige Schicht 120 verdunstet, kommt die Membran 20 einfach näher an die gasdurchlässige Schicht 120 heran. Die Dialyse wird nicht behindert, da die Membran 20 ständig mit Kulturmedium 50 in Kontakt ist.
In Fällen, in denen die Membran 20 aus einem Material besteht, das im nassen Zustand anschwillt oder schlaff wird, wie beispielsweise Zellulose, kann es vorteilhaft sein, die Membran 20 mit einem oberen Membranhalter 270 zu fixieren. Der obere Membranhalter 270 verhindert eine Aufwärtsbewegung der Membran 20, wenn Kulturmedium 50 in das Zellkulturabteil 40 gelangt. Das Kulturmedium 50 preßt die Membran 20 gegen den oberen Membranhalter 270, wodurch Knitterfalten geglättet werden.
Knitterfalten in der Membran 20 führen zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Zellen bei der Inokulation. Wenn die Membran 20 stark verknittert wäre, würde Kulturmedium 50 in den Knitterfalten liegen. Dann hätten einige Gebiete über der gasdurchlässigen Schicht 120 mehr Kulturmedium 50 über sich als andere. In dem Inokulum sind Zellen gleichmäßig über das Kulturmedium 50 verteilt. Diese Zellen setzen sich schließlich auf der gasdurchlässigen Schicht 120 ab. Bereiche der gasdurchlässigen Schicht 120, über denen sich mehr Kulturmedium 50 befindet, erhalten mehr Zellen. Um dies zu verhindern, sollten Knitterfalten in der Membran 20 minimiert werden.
Die obere Membran 270 kann aus beliebigen biokompatiblen Materialien, beispielsweise hochpolymerem Polystyren oder Polypropylen, bestehen. Dabei sollte sorgfältig darauf geachtet werden, daß es die Dialyse nicht behindert. Bei der bevorzugten Ausführungsform sollte es etwa 70% bis 90% offen sein.
Bei der gasdurchlässigen Schicht 120 handelt es sich um ein biokompatibles Material, das einen Durchtritt von Gas in das Zellkulturabteil 40 hinein und aus ihm heraus ermöglicht. Die gasdurchlässige Schicht 120 kann flüssigkeitsdurchlässig oder -undurchlässig, hydrophob oder hydrophil, porös oder nichtporös sein. Die Dicke kann oberhalb oder unterhalb von 0,25 mm liegen. Die bestmögliche Wahl hängt von der gegebenen Anwendung ab. Als allgemeine Leitlinie sollte die Gasdurchlässigkeit einer gegebenen Membran zusätzlich zu der Wechselwirkung der Membran mit Zellen oder Proteinstrukturen berücksichtigt werden. Flüssigkeitsundurchlässige Schichten entsprechender Dicke führen an der Grenzfläche zwischen Zellen und Schicht zu unterschiedlichen Gleichgewichtszustände der Sauerstoffspannung. FEP Teflon, Silikone und Silikonpolycarbonat-Copolymere führen zu einer höheren Sauerstoffspannung als Polyethylene, Polycarbonate, Polypropylene, Polysulfone oder Polypropylene. Für Anwendungen, bei denen oberflächenchemische Eigenschaften zu Denaturierungserscheinungen von Proteinen, unspezifische Proteinbindungen, Zellmembranschäden oder Zellverankerungen führen, sind hydrophile Oberflächen besser geeignet. Für Anwendungen, bei denen es gewünscht ist, daß die gesamte Zellmembran mit Wasser in Kontakt bleibt, können Hydratgele am besten geeignet sein.
Durch den Einsatz von gewissen Materialien, die üblicherweise nicht mit Gasaustausch in Zusammenhang gebracht werden, können die zum Kontrollieren der Sauerstoffspannung an der Grenzfläche zwischen den Zellen und der Schicht zur Verfügung stehenden Möglichkeiten vergrößert werden. Beispielsweise hat nichtporöses Zelluloseazetat eine relativ geringe Durchlässigkeit für gasförmigen Sauerstoff in der Größenordnung von 7,3 × 10^–9 cm³·cm/(sec·cm²·atm). Wenn Zelluloseazetat porös hergestellt wird, erhöht sich die Durchlässigkeit für Sauerstoff bei Aufnahme von Kulturmedium 50 auf 1,4 × 10^–6 cm³·cm/(sec·cm²·atm). Auf diese Weise lassen sich verschiedene Sauerstoffspannungen erzielen, indem die Menge des sich in der gasdurchlässigen Schicht 120 befindenden Kulturmediums 50 vorgegeben wird. Änderungen der Sauerstoffspannung ergeben sich somit als Folge einer Änderung der Porengröße, der Porosität oder der Verflechtungen der gasdurchlässigen Schicht 120.
Der gasdurchlässige Schichtträger 130 hält die gasdurchlässige Schicht 120 in einer im wesentlichen horizontalen Lage und stabilisiert die gasdurchlässige Schicht 120, um ein Durchhängen zu verhindern. Es sollte sorgfältig darauf geachtet werden, daß die gasdurchlässige Schicht so flach ist, daß Zellen nicht in tieferliegende Punkte rollen oder sich dort auf andere Weise sammeln. Dies ist unerwünscht, da ein Aufschichten von Zellen die Diffusion zusätzlich beschränkt und zu Zelltod führt. Andererseits muß darauf geachtet werden, daß die Gasaustauschrate ausreichend bleibt. Folglich hängt die optimale Kontaktfläche des Gasfilmträgers 130 mit der gasdurchlässigen Schicht 120 von der Steifheit und der Gasdurchlässigkeit der gasdurchlässigen Schicht 120 ebenso wie von den Anforderungen einer gegebenen Zellkulturanwendung an den Gasaustausch und den Stoffwechsel ab. Es ist zu erwarten, daß die meisten Zellinien durch Diffusion auf etwa 10 bis 15 Zellagen beschränkt sind.
Der gasdurchlässige Schichtträger 130 dient auch dazu, die gasdurchlässige Schicht 120 vor Kontamination oder Einstichen zu schützen. Mit der gasdurchlässigen Schicht 120 besteht minimaler Kontakt, damit eine möglichst größe Fläche für den Gasaustausch zur Verfügung steht. Die Gasdurchlaßöffnung 140 ist an dem tiefsten Punkt des gasdurchlässigen Schichtträgers 130 angeordnet, damit Kondenswasser aus dem gasdurchlässigen Schichtträger 130 austreten kann. Sie ist so bemessen, daß bei minimaler Verdunstung ein ausreichender Gasaustausch mit dem Zellkulturabteil 40 möglich ist. Der gasdurchlässige Schichtträger 130 kann aus jedem beliebigen, mechanisch stabilen Material gefertigt sein. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel handelt es sich dabei um ein durchsichtiges Material, beispielsweise Polystyren oder Polycarbonat, um eine visuelle Überprüfung der Kultur in den Fällen zu ermöglichen, in denen die gasdurchlässige Schicht 120 durchsichtig ist. Der unterteilte Gewebekulturkolben 10 ruht erhöht auf Füßen 150, so daß der gasdurchlässige Schichtträger 130 nicht verkratzt oder sichtbar beschädigt wird.
Bei der Auswahl des Materials für die gasdurchlässige Schicht 120 ist auch die Rate zu berücksichtigen, mit der Feuchtigkeit als Dunst durchgelassen wird. Das Kulturmedium 50 verdunstet mit einer Rate, die von dem für die gasdurchlässige Schicht 120 gewählten Material abhängt. Indem man die Querschnittsfläche der Gasdurchlaßöffnung 140 beschränkt, kann die Verdunstungsrate reduziert werden, obwohl die Rate des Flüssigkeitsverlusts auch eine Funktion der umgebenden Luftfeuchtigkeit ist, die schwieriger zu kontrollieren ist. Bei dem in 4 gezeigten Aufbau wird dieses Problem berücksichtigt.
Das feuchte Gas in dem Totraum 170 des Basalmediums steht mit der Unterseite der gasdurchlässigen Schicht 120 über einen Gasdurchtrittskanal 190 in Verbindung. Durch eine Abdeckung 200 des Gasdurchtrittskanals wird Basalmedium davon abgehalten, in den Gasdurchtrittskanal 190 einzudringen und der Gasaustausch beschränkt. Bei der Abdeckung 200 des Gasdurchtrittskanals handelt es sich um eine gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Folie. Damit sich auf. der Abdeckung 200 des Gasdurchtrittskanals kein Kondenswasser ansammeln und den Gastransfer behindern kann, befindet sie sich nicht in einer horizontalen Lage. Auf diese Weise kann Kondenswasser durch Gravitationskraft in das Basalmedium 60 zurückfließen. Zudem ist der Gasdurchtrittskanal 190 so ausgebildet, daß sich Kondenswasser in einem Auslaßanschluß 210 ansammeln kann.
Es gibt viele andere Möglichkeiten, um den Totraum 170 des Basalmediums mit der gasdurchlässigen Schicht 120 in Verbindung zu bringen. Dabei sollte darauf geachtet werden, daß der Gasaustausch nicht durch Kondenswasser oder Basalmedium 60 behindert wird.
Mit dem in 4 gezeigten Aufbau kann auch eine Kontrolle des pH-Werts unterstützt werden, wenn die Vorrichtung für Routinearbeiten aus dem Inkubator entnommen wird. Üblicherweise ruht der unterteilte Gewebekulturkolben 10 in einem CO₂ Inkubator. Auf diese Weise kann der perizelluläre pH-Wert des Zellkulturabteils 40 auf einem geeigneten Wert gehalten werden. Wenn der unterteilte Gewebekulturkolben 10 aus einem Inkubator entnommen und für Arbeiten an den Zellen in einen Abzug mit laminarer Strömung plaziert wird, kann sich der pH-Wert in dem Zellkulturabteil 40 rasch ändern, da CO₂ aus dem Kulturmedium 50 entweicht. Bei dem in 4 gezeigten Aufbau kann CO₂ aus dem Basalmediumabteil 30 in das Kulturmedium 50 gelangen.
Ein anderer Aufbau, der sich mit diesem Problem befaßt, ist in 5 gezeigt. Eine Fußleiste 280 umgibt die Basis des unterteilten Gewebekulturkolbens 10. Durch die Fußleiste 280 wird die Luftzufuhr zu der Unterseite der gasdurchlässigen Schicht 120 wesentlich behindert, wenn sich die Vorrichtung in einem Abzug mit laminarer Strömung befindet. Auf diese Weise wird CO₂ in dem Kulturmedium 50 zurückgehalten, so daß der pH-Wert erhalten bleibt. Die Fächer der meisten CO₂-Inkubatoren haben Öffnungen, durch die Gas direkt zu der Unterseite der gasdurchlässigen Schichtträgers 130 gelangen kann. Deshalb wird der Gasaustausch durch die Fußleiste 280 nicht behindert, wenn sich die Vorrichtung in üblichen Inkubatoren befindet. Für den Fall, daß der Inkubator keine perforierten Regalböden hat, kann die Fußleiste 280 mit Schlitzen 290 versehen werden. Die Schlitzabdeckung 300 bedeckt jeden dieser Schlitze 290. Die Schlitzabdeckung 300 ist um ein Schlitzdeckelscharnier 310 schwenkbar. Wenn die Vorrichtung aus dem Inkubator entnommen wird, befindet sich die Schlitzabdeckung in der geschlossenen Stellung. Wenn sich die Vorrichtung in dem Inkubator befindet, ist sie in der offenen Stellung. 5 zeigt die Schlitzabdeckung in der offenen Stellung. Viele andere Mechanismen sind möglich, um die Fußleiste für Gasdurchtritt entweder offen oder geschlossen zu halten.
6 zeigt einen anderen Aufbau des unterteilten Gewebekulturkolbens 10, mit dem ein Gasaustausch ebenfalls begrenzt wird, wenn die Vorrichtung aus dem Inkubator entnommen wird. Bei dieser Ausführungsform steht die Vorrichtung auf einem Ende. Kulturmedium 50 sammelt sich in dem unteren Teil des Zellkulturabteils 40. Die Kontakt fläche zwischen dem Kulturmedium 50 und der gasdurchlässigen Schicht 120 ist deutlich reduziert. Auf diese Weise verringert sich der Gasaustausch direkt proportional zu der reduzierten Kontaktfläche. Dadurch wird ein Entweichen von CO₂ aus dem Kulturmedium 50 in die umgebende Raumluft verhindert und eine Änderung des pH-Werts verzögert.
Falls die für die gasdurchlässige Schicht 120 zur Verfügung stehenden Materialien nicht zu der gewünschten Sauerstoffspannung führen, kann der in 7 gezeigte Aufbau verwendet werden. Ein variables Sauerstoffkontrollabteil 220 wird von einer unteren gasdurchlässigen Schicht 230 gebildet, die von einem Boden 240 des Sauerstoffkontrollabteils in einer horizontalen Lage gestützt wird. Durch eine Zugangsöffnung 250 des Sauerstoffkontrollabteils kann eine Flüssigkeit als Widerstand 260 in das einstellbare Sauerstoffkontrollabteil 220 eingefüllt werden. Die Sauerstoffspannung an der Unterseite der gasdurchlässigen Schicht 120 kann sorgfältig gesteuert werden, indem die Höhe der auf der unteren gasdurchlässigen Schicht 230 ruhenden Flüssigkeit gemäß dem Fickschen Gesetz eingestellt wird. Als untere gasdurchlässige Schicht 230 können beliebige Folien oder Blätter verwendet werden, die sehr gasdurchlässig sind. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist sie flüssigkeitsundurchlässig und hat eine relativ niedrige Übertragungsrate für Feuchtigkeit in Form von Dunst. Über den Boden 240 des Sauerstoffkontrollabteils kann der größte Teil der unteren gasdurchlässigen Schicht 230 mit der umgebenden Raumluft in Verbindung stehen. Zwischen der unteren gasdurchlässigen Schicht 230 und dem Boden 240 des Sauerstoffkontrollabteils befindet sich eine hermetische Dichtung. Diese Dichtung kann durch Schweißen, Klebstoffe oder eine andere geeignete Methode erzeugt werden. Der Abstand zwi schen der Oberseite der unteren gasdurchlässigen Schicht 230 und der Unterseite der gasdurchlässigen Schicht 120 beträgt vorzugsweise etwa 5 mm bis 20 mm.
Um die Verdunstung von Flüssigkeit in dem einstellbaren Sauerstoffkontrollabteil 220 zu minimieren, kann die Unterseite der unteren gasdurchlässigen Schicht 230 mit dem Totraum 170 des Basalmediums wie im vorhergehenden beschrieben gasdurchlässig in Verbindung stehen.
Obwohl weder hinsichtlich der Form noch der Größe des Zellkulturabteils 40 Beschränkungen bestehen, beträgt der vorteilhafte Abstand zwischen der gasdurchlässigen Schicht 120 und der Membran 20 etwa 1 mm bis 5 mm, um eine hohe Konzentration von Zellen und von Zellen abgesonderten Produkten zu erhalten. Wenn die gasdurchlässige Schicht 120 im wesentlichen flach und horizontal ist, kann man erwarten, daß bis zu 30 × 10⁶ Zellen pro Quadratzentimeter Oberfläche lebensfähig sind. Diese Zellen können sich bis zu einer Höhe von etwa 300 μm aufschichten. Wenn die Membran 20 mindestens 1 mm von der gasdurchlässigen Schicht 120 beabstandet ist, besteht deshalb keine Gefahr, daß sie mit Zellen in Berührung kommt und verstopft.
Damit das Basalmedium 60 möglichst selten ausgetauscht werden muß, wird das Volumen des Basalmediums 30 in Relation zu der Oberfläche der gasdurchlässigen Schicht 120 bemessen. Bei einer Zelldichte von 1 Million Zellen pro Milliliter werden für Zellen einer Suspension in einer statischen Kultur etwa 5 ml bis 10 ml Basalmedium 60 pro Quadratzentimeter der gasdurchlässigen Schicht 120 benötigt. Beim Kultivieren von verankerungsbedürftigen Zellen, die in Monoschichten wachsen, ist es vorteilhaft, wenn das Volumen des Basalmediums 60 die Oberfläche der gasdurchlässigen Schicht 120 um einen Faktor von mindestens 2 übersteigt.
Das Gehäuse des unterteilten Gewebekulturkolbens 10 kann aus einem beliebigen biokompatiblen Material bestehen. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist das Gehäuse durchsichtig, so daß das Medium zum Bestimmen seines pH-Werts visuell überwacht oder eventuelle mikrobielle Verunreinigungen erkannt werden können. Polystyren ist eine bevorzugte Wahl. Der unterteilte Gewebekulturkolben 10 kann durch Ultraschallschweißen, mechanische Verbindungsmittel, Klebelack oder eine beliebige andere Methode, die für eine leckfreie Einheit sorgt, hergestellt werden. Die gasdurchlässige Schicht 120 und die Membran 20 können mittels O-Ringen, Profildichtungen, durch Schweißen, Verkleben oder eine beliebige andere Methode abgedichtet werden, die zu einer leckfreien Einheit führt. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel sollten alle in dem unterteilten Gewebekulturkolben 10 verwendeten Materialien für eine Sterilisation durch Gammastrahlen geeignet sein.
8 zeigt eine Draufsicht eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung in Form einer unterteilten Gewebekulturplatte 15 mit mehreren Aufnahmen. 9 zeigt den Querschnitt A-A von 8. Bei diesem Aufbau können mehrere verschiedene Kulturen in einer Vorrichtung gezüchtet werden. Die Zeichnung zeigt ein Ausführungsbeispiel, das sechs Kulturen ermöglicht. Falls gewünscht, kann die Vorrichtung so konstruiert werden, daß mehr oder weniger Kulturen möglich sind. Das Basalmedium 60 ruht in dem Basalmediumabteil 30. Eine obere Abdeckung 85 liegt über dem Basalmediumabteil 30 und schützt das Basalmedium 60 vor Verunreinigungen.
9 zeigt eine Draufsicht eines weiteren Ausführungsbeispiels einer unterteilten Gewebekulturplatte 15 mit mehreren Aufnahmen. Bei dieser Ausführungsform steht das Basalmediumabteil 30 mit mehr als einem Zellkulturabteil 40 in Verbindung.
Wie bereits anhand von 2 beschrieben wurde, ist ein Aufbau möglich, bei dem Abschnitte der gasdurchlässigen Schicht 120 in das Zellkulturabteil 40 hineinragen, um die Membran 20 zu stützen, ohne daß dafür ein Membranträger 110 benötigt wird.
Wie bereits anhand von 3 beschrieben wurde, ist ein Aufbau möglich, bei dem für Zellkulturen hoher Dichte vorteilhafte Merkmale und eine einstellbare Kontrolle des Volumens des Kulturmediums 50 verwirklicht sind.
Wie im vorhergehenden anhand von 4 beschrieben wurde, ist ein Aufbau möglich, bei dem Merkmale verwirklicht sind, die feuchtes Gas aus dem Basalmediumabteil 30 mit der Unterseite der gasdurchlässigen Schicht 120 in Kontakt bringen.
Wie im vorhergehenden anhand von 5 beschrieben wurde, kann eine unterteilte Gewebekulturplatte 15 mit mehreren Aufnahmen eine Fußleiste 280 aufweisen, um rasche Änderungen des pH-Werts zu verhindern, wenn die Vorrichtung für Routinearbeiten aus einem CO₂-Inkubator, wie im vorhergehenden beschrieben wurde, entnommen wird.
Wie im vorhergehenden anhand von 7 beschrieben wurde, ist eine Ausführungsform möglich, die so ausgebildet ist, daß bei ihr die Merkmale eines variablen Sauerstoffkontrollabteils 220 verwirklicht sind.

Claims

Zellkulturvorrichtung umfassend einen Behälter mit a) einem Zellkulturabteil (40), das von einer unteren gasdurchlässigen Schicht (120) und einem oberen Blatt (20), das selektiv für Verbindungen einer vorgegebenen Größe durchlässig und für Zellen undurchlässig ist, begrenzt wird und durch geeignete Maßnahmen dafür ausgelegt ist, ein Kulturmedium (50) zwischen dem oberen Blatt (20) und der unteren gasdurchlässigen Schicht (120) aufzunehmen; b) einem Basalmediumabteil (30), von dem sich mindestens ein Teil über dem oberen Blatt (20) befindet, und das so ausgebildet ist, daß ein Basalmedium (60) auf dem oberen Blatt (20) liegen kann; c) nur einer einzigen Zugangsöffnung (70) zu dem Zellkulturabteil (40); d) einer Zugangsöffnung (90) zu dem Basalmediumabteil (30); und e) einen gasdurchlässigen Schichtträger (130), der unterhalb der gasdurchlässigen Schicht (120) angeordnet ist und mit dieser teilweise in Kontakt steht, wodurch der größte Teil der gasdurchlässigen Schicht (120) in einer im wesentlichen horizontalen Lage gehalten wird, so daß sich Zellen einer Suspension entlang des horizontalen Abschnitts der gasdurchlässigen Schicht (120) verteilen können und ein Gasaustausch mit dem Zellkulturabteil (40) nicht wesentlich behindert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, die mehrere Zellkulturabteile (40) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 2, die mehrere Basalmediumabteile (30) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die untere gasdurchlässige Schicht (120) Abschnitte aufweist, die in das Zellkulturabteil (40) hineinragen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der ein oberer Membranhalter (270) über dem oberen Blatt (20) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, umfassend einen Behälter mit f) einem Gasaustauschfach, das durch geeignete Mittel dafür ausgelegt ist, eine gasdurchlässige Verbindung zwischen einem Gas in dem Basalmediumabteil (30) und der Unterseite der unteren gasdurchlässigen Schicht (120) zu schaffen.
Vorrichtung nach Anspruch 6, die mehrere Zellkulturabteile aufweist.
Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1, umfassend einen Behälter mit f) einem Sauerstoffkontrollabteil (220), das durch geeignete Mittel dafür ausgelegt ist, eine gasdurchlässige Verbindung zwischen der Unterseite der unteren gasdurchlässigen Schicht (120) und der umgebenden Umwelt zu schaffen.
Vorrichtung nach Anspruch 8, bei der die gasdurchlässige Schicht (120) Abschnitte aufweist, die in das Zellkulturabteil hineinragen.
Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 8, bei der mehrere Zellkulturabteile (40) vorhanden sind.
Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 8, bei der das Sauerstoffkontrollabteil von einer weiteren gasdurchlässigen Schicht (230), die in einer horizontalen Lage unter der unteren gasdurchlässigen Schicht (120) angeordnet ist, und einem Trennmittel gebildet wird, das zwischen der unteren gasdurchlässigen Schicht (120) und der weiteren gasdurchlässigen Schicht (230) zum Begrenzen des Sauerstoffkontrollabteils (220) angeordnet ist, wobei das Sauerstoffkontrollabteil (220) dafür ausgelegt ist, Flüssigkeit aufzunehmen, und eine Einlaßöffnung hat, durch die Flüssigkeit eingeleitet oder aus dem Sauerstoffkontrollabteil entfernt werden kann, um die Rate des Gastransports zu steuern.
Verfahren zum Züchten von Zellen umfassend die Schritte: a) Schaffen eines Zellkulturabteils (40), das von einer unteren gasdurchlässigen Schicht (120) und einem oberen Blatt (20), das selektiv für Verbindungen einer vorgegebenen Größe durchlässig und für Zellen undurchlässig ist, begrenzt wird und durch geeignete Maßnahmen dafür ausgelegt ist, ein Kulturmedium (50) zwischen dem oberen Blatt (20) und der unteren gasdurchlässigen Schicht (120) aufzunehmen; b) Schaffen eines Basalmediumabteils (30), von dem sich mindestens ein Teil über dem oberen Blatt (20) befindet und das so ausgebildet ist, daß ein Basalmedium (60) auf dem oberen Blatt (20) liegen kann; c) Schaffen von nur einer einzigen Zugangsöffnung (70) zu dem Zellkulturabteil (40); d) Schaffen einer Zugangsöffnung (90) zu dem Basalmediumabteil (30); e) Schaffen eines gasdurchlässigen Schichtträgers (130) unter der gasdurchlässigen Schicht (120), der diese teilweise berührt, wodurch der größte Teil der gasdurchlässigen Schicht (120) in, einer im wesentlichen horizontalen Lage gehalten wird, so daß sich Zellen einer Suspension entlang des horizontalen Abschnitts der gasdurchlässigen Schicht (120) verteilen können und ein Gasaustausch mit dem Zellkulturabteil (40) nicht wesentlich behindert wird; f) Einbringen eines Basalmediums (60) in das Basalmediumabteil (30); g) Einbringen von Zellen und einem Zellkulturmedium (50) in das Zellkulturabteil (40), wobei das Zellkulturmedium (50) mit der Unterseite des oberen Blatts (20) in Kontakt ist; und h) Pflegen der Zellen bei einer ausgewählten Temperatur.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die untere gasdurchlässige Schicht (120) Abschnitte aufweist, die in das Zellkulturabteil (40) hineinragen.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem mehrere Zellkulturabteile (40) gebildet werden.