DE69529845T2

DE69529845T2 - Wärmebehandlung von blutplasmaproteinen

Info

Publication number: DE69529845T2
Application number: DE69529845T
Authority: DE
Inventors: Charles Hardy; Vance Mcintosh
Original assignee: Common Services Agency
Current assignee: Common Services Agency
Priority date: 1994-12-08
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2015-12-09
Also published as: GB9424732D0; CA2206670C; US5831027A; ATE233576T1; WO1996017631A1; EP0804254A1; JP2008044963A; AU4183296A; CA2206670A1; JPH10510257A; DK0804254T3; AU692018B2; JP4181214B2; EP0804254B1; ES2193206T3; DE69529845D1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von kryopräzipitierbaren Blutplasmaproteinen, wie beispielsweise Fibrinogen, welche imstande sind, streng wärmebehandelt zu werden, um den Großteil der durch Blut übertragenen Viren, die vorhanden sein können, im wesentlichen zu inaktivieren; während gleichzeitig die wünschenswerten Eigenschaften des Plasmaproteins, wie beispielsweise Löslichkeit in wässeriger Lösung und funktionelle (z. B. Gerinnungs-) Aktivität, aufrechterhalten werden.

HINTERGRUND

Wie bekannt ist, enthält Blutplasma eine Reihe von Koagulationsfaktoren, welche zur Gerinnselbildung beitragen. Kürzlich ist eine Art von natürlichem Kleber, bezeichnet als Fibrinabdichtungsmittel, hergestellt worden, wobei bestimmte von diesen Blutkoagulationsfaktoren verwendet wurden. So erzeugt Fibrinogen, wenn es mit Thrombin vereinigt wird, Fibrin, ein unlösliches klebendes biologisches Polymer. Wenn auch Faktor XIIT vorhanden ist, erfolgt Vernetzen des Fibrins, was das Gerinnsel, welches gebildet wird, stabilisiert und festigt. Die Verwendung von Fibrinogen- und Thrombinkonzentraten in dieser Weise stellt einen bedeutenden technischen Fortschritt in der Chirurgie dar (Referenzen 1 bis 4). In der Tat sind einige Fibrinabdichtungsmittel-Produkte im Handel erhältlich und sind in einer Anzahl von europäischen Ländern ausgiebig verwendet worden. Um ein Beispiel zu geben, beschreiben die Patentbeschreibungen GB 2041942, GB 2042556 und WO 86/01814 verschiedenartige Wege zum Herstellen von Fibrinabdichtungsmittel-Zubereitungen. In der Praxis hat das Fibrinabdichtungsmittel eine Vielfalt von chirurgischen Anwendungen einschließlich der Wiederherstellung von Gefäßen und Anastomosen, der Wiederherstellung von Weichteilverletzungen, z. B. der Leber und der Milz, und der Wiederherstellung von Lungenlascerationen, gefunden.
Das Fibrinabdichtungsmittel wird im allgemeinen als zwei gesonderte Konzentrate von Fibrinogen bzw. Thrombin bereitgestellt, welche kurz vor der Verwendung gemischt werden. Gerinnung des Fibrinabdichtungsmittels kann relativ schnell stattfinden, und spezialisierte Applikatoren für die Aufbringung des Fibrinabdichtungsmittels auf eine Wunde sind in einer Anzahl von Patentbeschreibungen, wie beispielsweise EP 0037393, EP 0315222, EP 0156098 und US 4650678, offenbart.
Zusätzlich zu ihrer Verwendung als Komponente in Fibrinabdichtungsmittel können geeignete Zubereitungen von Fibrinogen auch infundiert werden, um Erkrankungen wie beispielsweise Hypo-, Dys- und Afibrinogenaemie zu behandeln.
Jedoch ist, trotz der ersichtlichen Wirksamkeit derartiger Produkte, ihre Verwendung im Vereinigten Königreich und in den USA bis heute begrenzt gewesen, teilweise wegen der Verfügbarkeit, aber auch wegen Befürchtungen der Übertragung von durch Blut übertragenen Viren durch auf Fibrinogen basierende Zubereitungen (Referenz 5). Typischerweise wird jede Gabe von humanem Plasma auf die folgenden Virusmarkierungszeichen; Hepatitis-B-Oberflächenantigen, Antikörper gegen das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) Typen 1 und 2 und das Hepatitis-C-Virus, unter Verwendung von validierten Testmethoden gescreent. Obwohl derartige Screening-Verfahren in großem Maße zu der Sicherheit von Blutprodukten beigetragen haben, gibt es ein Restrisiko von Viruskontamination. Daher ist eine Vielfalt von Methoden für Virusinaktivierung von Blutprodukten bekannt, einschließlich der Verwendung von Detergentien und der Wärmebehandlung. Jedoch sind diese von schwankender Zuverlässigkeit.
Wärmebehandlung von trockenem Blutplasmaprotein, um Viren zu inaktivieren, ist in den Patentbeschreibungen EP 0171506 und WO 88/08710 offenbart. Typische Temperatur-Zeitregimes in der ersteren sind 60ºC für 23 Stunden für Fibrinogen. Bei höheren Temperaturen wird der Verlust von Löslichkeit des Proteins erwähnt. Abschließende Wärmebehandlung von trockenem Produkt ist weithin als sichere und wirksame Methode der Virusinaktivierung vorgeschlagen worden und wird zum Beispiel in den Patentbeschreibungen EP 0944611, PCT/US90/01088, EP 0345246, EP 0159311 und EP 0183674 in Bezug genommen. Bei einer abschließenden Wärmebehandlung wird das Erwärmen als letzter Schritt in der Verarbeitung ausgeführt, wodurch die Chancen der Rekontamination beseitigt werden.
Jedoch hat die abschließende Wärmebehandlung eine Anzahl von potentiellen Nachteilen, welche die Verwendbarkeit des Verfahrens beeinträchtigen. So kann es, um ein hinreichend hohes Niveau der Virusinaktivierung bereitzustellen, wünschenswert sein, 50 bis 100 Stunden lang auf eine Temperatur von mindestens 70ºC zu erwärmen. Unter derartigen strengen Wärmebehandlungsbedingungen unterliegt das Plasmaprotein leicht nicht wünschenswerten Zersetzungen, welche zu verringerter biologischer Aktivität führen können. Weiterhin kann die Löslichkeit des Plasmaproteins bei der Rekonstitution vor der Verwendung signifikant verringert werden.
Ein Faktor-VIII-Konzentrat mit hoher Ausbeute, geeignet für strenge abschließende Wärmebehandlung, ist durch einen der Erfinder offenbart worden (Referenz 10), und dieses ist mit besonderen Formulierungs- und Lyophilisierungsschritten verbunden.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Herstellung eines kryopräzipitierbaren Plasmaproteins, insbesondere Fibrinogen, bereitzustellen, welche zu Virusinaktivierung über strenge (im allgemeinen abschließende) Wärmebehandlung imstande ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Allgemein gesprochen liegt die vorliegende Erfindung in der Verwendung einer Kombination von Behandlungsmaßnahmen, um ein lyophilisiertes Blutplasmaprotein, wie beispielsweise Fibrinogen, herzustellen, welches geeignete Löslichkeitseigenschaften und wirksame biologische Gerinnungsaktivität hat, jedoch gleichzeitig imstande ist, unter relativ strengen Wärmebehandlungsbedingungen wärmebehandelt worden zu sein, um im wesentlichen vollständige Virusinaktivierung sicherzustellen.
Wenn auch die vorliegende Erfindung in einer Kombination von Maßnahmen liegt, ist ein besonders wichtiges Merkmal die Verwendung einer wässerigen Lösung eines nichtpolaren polymeren Materials (wie beispielsweise Polyethylenglycol) oder eines anderen wie hier beschriebenen Materials in einer geeigneten Konzentration, um Protein zu waschen, welches kryopräzipitiert worden ist (oder alternativ, um das Protein in Anwesenheit des nichtpolaren polymeren Materials zu präzipitieren), wie beispielsweise, um vor der Lyophilisierung und viriziden Wärmebehandlung wärmeabbaubare Plasmaproteine daraus zu entfernen.
So stellt ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ein lyophilisiertes Fibrinogen bereit, welches wärmebehandelt worden ist (vorzugsweise abschließend wärmebehandelt), um im wesentlichen alle vorhandenen Viren zu inaktivieren und um so nichtinfektiös zu sein, und welches
(a) eine Löslichkeit in Wasser oder einer anderen pharmazeutisch verträglichen wässerigen Lösung bis 40 g/l Fibrinogen in weniger als 20 Minuten bei 20ºC; und
(b) eine Gerinnungszeit von weniger als 10 Sekunden, wenn mindestens 200 U/ml Thrombin ausgesetzt, hat; wobei das Fibrinogen aus einer wässerigen Lösung, enthaltend 10-15 g/l Fibrinogen, 5-80 mM/l Trinatriumcitrat und 0,5-5,0% Gewicht/Volumen Saccharose (wobei die Saccharose gegebenenfalls ganz oder teilweise durch L-Arginin ersetzt ist), lyophilisiert worden ist.
Die Thrombinaktivität ist anhand des Standards für humanes alpha-Thrombin 89/588 des UK National Institute of Biological Standards and Control definiert.
So hat das lyophilisierte Fibrinogen gute Löslichkeit in einem wässerigen Vehikel, um Rekonstitution vor der Verwendung zu ermöglichen, und auch gute verbleibende Gerinnungsaktivität, gemessen als die Gerinnungszeit, während es gleichzeitig wärmebehandelt worden ist, um im wesentlichen alle vorhandenen Viren mittels eines relativ strengen Wärmebehandlungsregimes zu inaktivieren, um so gute Sicherheit, was Virusübertragung betrifft, sicherzustellen.
Das Fibrinogen wird lyophilisiert (d. h. gefriergetrocknet), so daß das Material in einem festen trockenen Zustand aufbewahrt werden kann, um gute Langzeitaufbewahrungsstabilität sicherzustellen. Andererseits muß das Fibrinogen vor der Verwendung zu einer wässerigen Lösung aufgearbeitet werden. Es ist offensichtlich, daß das Fibrinogen, um praktisch verwendbar zu sein, zu Wiederauflösung in Wasser oder einem anderen pharmazeutisch verträglichen wässerigen Vehikel in einer ziemlich kurzen Zeit imstande sein muß. Jedoch ist Fibrinogen ein Material von relativ geringer inhärenter Löslichkeit und jede Verarbeitung davon neigt dazu, das Produkt noch weniger löslich zu machen. Es ist daher wichtig, daß in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignete charakteristische Löslichkeitseigenschaften aufrechterhalten werden, soweit es praktisch durchführbar ist. Die lyophilisierte Fibrinogenzubereitung der vorliegenden Erfindung hat eine Löslichkeit in Wasser bis zu einer gewünschten Konzentration von 40 g/l in weniger als 20 Minuten bei 20ºC. Im allgemeinen kann das Produkt der vorliegenden Erfindung unter diesen Bedingungen in weniger als 10 Minuten vollständig aufgelöst werden, und typischerweise liegt die Rekonstitutionszeit in dem Bereich von 5 bis 10 Minuten. Dies erfüllt eine vorgeschlagene Anforderung der European Pharmacopoeia Commission (PA/PH/Exp.6B/T (91)2) für eine Auflösungszeit innerhalb von 20 Minuten. Nach unserer Erfahrung ist es einzigartig, imstande zu sein, derartige charakteristische Löslichkeitseigenschaften nach einer wie hier beschriebenen strengen viriziden abschließenden Wärmebehandlung zu erreichen.
Wenn auch eine Konzentration von 40 g/l vorstehend in Verbindung mit einer Geschwindigkeit der Auflösung erwähnt worden ist, ist in der Tat die maximale erreichbare Konzentration höher als diese (z. B. 50 g/l), und Mengen bis zu 60 g/l können gelöst werden.
Es ist auch wichtig, daß das lyophilisierte Fibrinogen der vorliegenden Erfindung eine gute Gerinnungszeit haben sollte, welche definiert ist, weniger als 10 Sekunden zu betragen, um ein Gerinnsel zu bilden, wenn es mindestens 200 U/ml Thrombin ausgesetzt wird. Da die Geschwindigkeit der Gerinnung proportional der Menge des vorhandenen aktiven Fibrinogen ist, ist dieses Kriterium ein wirksames praktisches Maß der verbliebenen Gerinnungsaktivität.
Ein weiterer Faktor, der mit der Beurteilung der Gerinnungsfähigkeit verbunden ist, ist die Anwesenheit von Faktor XIII, welcher das durch Vernetzen der Fibrinfibrillen gebildete Gerinnsel festigt und vorzeitige Auflösung des Gerinnsels abschwächt. Es ist anerkannt, daß bestimmte Mengen von Faktor XII vorhanden sein müssen, um ein Gerinnsel mit Langzeitstabilität bereitzustellen. Wir haben gefunden, daß Anteile von Faktor XIII in dem Bereich von 0,14 bis 0,64 U pro mg des Fibrinogens Gerinnsel von guter Stabilität ergeben. Ein U ist definiert als die Menge von Faktor XIII, vorhanden in 1 ml von normalem humanen Plasma. Veränderungen der Faktor-XIII-Konzentration innerhalb dieses Bereiches führen zu keinem signifikanten Unterschied in der Festigkeit des Gerinnsels. In der Tat können Anteile von Faktor XIII von weniger als 0,14 U/mg Fibrinogen auch verwendbar sein, mit der Maßgabe, daß die Geschwindigkeit der Bildung eines stabilen Gerinnsels nicht ungebührlich langsam ist. Die Gerinnselstabilität, und indirekt die Faktor-XIII-Konzentration, kann, wie hier ausführlich dargelegt ist, mittels eines Harnstoff-Löslichkeittests beurteilt werden. Ein Gerinnsel mit geeigneter Stabilität wird erhalten, wenn das Gerinnsel in 6M Harnstoff im wesentlichen unlöslich bleibt, wenn es über Nacht aufbewahrt wird. Dieses wird hinsichtlich dessen beurteilt, daß weniger als 10% des gerinnbaren Proteins sich in 6M Harnstoff lösen, im allgemeinen sich weniger als 5% lösen und typischerweise sich 0,5 bis 2% des Gerinnsels lösen.
Während die Bildung eines stabilen Gerinnsels (und so die Anwesenheit von Faktor XIII) wichtig ist, wo das lyophilisierte Fibrinogen verwendet werden soll, um Fibrinabdichtungsmittel herzustellen, ist in anderen Verwendungen die Anwesenheit von Faktor XIII nicht wesentlich. So gibt es, wo das Fibrinogen verabreicht werden soll, um sich mit einem Fibrinogenmangel bei einem Patienten (z. B. Hypo-, Dys- oder Afibrinogenaemie) auseinanderzusetzen, gewöhnlich keine Anforderung für die Anwesenheit von Faktor XIII.
Um akzeptabel zu sein, muß das lyophilisierte Fibrinogen im wesentlichen zu einem akzeptablen Sicherheitsniveau viral inaktiviert worden sein. Es ist bekannt, daß unterschiedliche Viren in unterschiedlichen Ausmaßen wärmebeeinflußt werden können. Jedoch ist es wichtig, daß unter anderen Viren von Hepatitis A, B und C sowie HIV-Viren im wesentlichen inaktiviert werden, um Produktsicherheit bereitzustellen; und Bezugnahme hierin zu wesentlicher Inaktivierung aller vorhandenen Viren bezieht sich auf wesentliche Inaktivierung zumindest dieser Virustypen. In Laboratoriumstests unter Verwendung von Viren dieser Typen können Virustiterverringerungen von mindestens 1 · 102 erreicht werden. Das vorliegende lyophilisierte Fibrinogen ist zu strengerer Wärmebehandlung als früher verfügbare Zubereitungen imstande.
Die Strenge der Wärmebehandlung ist eine Funktion von sowohl Temperatur als auch Zeit, und die beiden stehen in umgekehrter Beziehung. Wir haben im Hinblick auf andere Plasmaproteine wie beispielsweise Faktor VIII gezeigt, daß eine abschließende Wärmebehandlung bei 80ºC für 72 Stunden ein Produkt mit einer bewährten Sicherheit ergibt. Wärmebehandelte Faktor-VIII-Zubereitungen, behandelt in dieser Weise, haben ein ausgezeichnetes Sicherheitsprotokoll. Das vorliegende lyophilisierte Fibrinogen ist auch imstande, unter derartigen standardisierten Wärmebehandlungsbedingungen behandelt zu werden. Jedoch ist es zu noch strengeren Wärmebehandlungsbedingungen imstande und kann zum Beispiel auf 90ºC bis zu 100ºC für 10 Stunden oder länger, abhängig von der Produktformulierung und dem Restwassergehalt, erwärmt werden. Der Zusammenhang zwischen Wirksamkeit der Wärmebehandlung und Restwassergehalt ist auf dem Fachgebiet bekannt. Im Gegensatz dazu sind andere auf dem Fachgebiet offenbarte Wärmebehandlungen, wie beispielsweise 60ºC für 10 Stunden, nach unserer Meinung wahrscheinlich nicht vollständig virizid und stellen so eine potentielle Sicherheitsgefahr dar. In der vorliegenden Erfindung ist Virusinaktivierung unter Anwendung des Semliki-Forest-Virus gemessen worden, welches in den charakteristischen Eigenschaften dem Hepatitis-C-Virus ähnlich ist. Es sind auch Tests gemacht worden, die die Verringerung im HIV-Titer zeigen. Virustiterverringerungen von mindestens 1 · 10² und bis zu 1 · 10&sup5; bis 1 · 10&sup6; oder mehr können erreicht werden.
Es ist auch gefunden worden, daß die strenge Wärmeinaktivierung an lyophilisierten Fibrinogenzubereitungen ausgeführt werden kann, Welche außerdem einem Lösungsmittel-Detergens- Virusinaktivierungsschritt unterzogen worden sind, wodurch erlaubt wird, daß eine noch wirksamere Gesamtinaktivierung erreicht wird.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines kryopräzipitierbaren Blutplasmaproteins, welches einer viriziden Wärmebehandlung unterzogen worden ist, welche umfaßt;
(i) Präzipitieren des kryopräzipitierbaren Proteins mit einer wässerigen Lösung, umfassend ein nichtpolares polymeres Material, oder Waschen des kryopräzipitierbaren Proteins mit einer wässerigen Lösung mit einem pH in dem Bereich von 6,8 bis 8, umfassend ein nichtpolares polymeres Material; wobei das nichtpolare polymere Material ein Polyethylenglycol mit dem Molekulargewicht 600 bis 6000 ist; wie beispielsweise, um wärmeabbaubare Plasmaproteine im wesentlichen daraus zu entfernen;
(ii) Lyophilisieren des kryopräzipitierbaren Proteins; wobei das kryopräzipitierbare Protein in einer Endpufferformulierung gelöst worden ist, enthaltend:
Tris 2-50 mM/l,
Trinatriumcitrat 5-80 mM/l und
Saccharose 0,5-5,0% Gew./Vol. (wobei die Saccharose gegebenenfalls ganz oder teilweise durch L-Arginin ersetzt ist) zu einem endgültigen pH von 6,8 bis 7,6; und
(iii) Vornehmen einer viriziden Wärmebehandlung des lyophilisierten kryopräzipitierbaren Proteins, um nichtinfektiös zu sein.
Der Begriff "kryopräzipitierbares Protein" ist auf dem Fachgebiet selbstverständlich und bezeichnet das Produkt einer bekannten Plasmaproteinabtrennungstechnik, wobei das Blutplasma gefroren wird, zum Beispiel auf -40ºC, und für eine Zeitspanne belassen wird. Die Temperatur wird ansteigen gelassen, zum Beispiel auf -1ºC bis +2ºC, was zu einigem teilweisen Auftauen des Plasmas führt, wobei ein festes Material hinterlassen wird, das als Kryopräzipitat bezeichnet wird. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt und das Kryopräzipitat weiter verarbeitet. Das Kryopräzipitat ist ein Gemisch von Materialien, aber schließt vorwiegend Fibrinogen, Fibronectin, Faktor VIII und Faktor XIII ein. Es ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß dieses Kryopräzipitat gewaschen wird, um Plasmaproteine, welche während der nachfolgenden viriziden Wärmebehandlung wärmeabgebaut werden könnten, im wesentlichen zu entfernen.
In einer alternativen Form der Zubereitung von Fibrinogen wird das Kryopräzipitat unter, etwas andersartigen Waschbedingungen hergestellt, und das Fibrinogen wird aus dem überstehenden Material durch Präzipitation mit einer geeigneten Konzentration des nichtpolaren polymeren Materials gewonnen.
Das nichtpolare polymere Material ist ein Polyethylenglycol mit dem Molekulargewicht 600 bis 6000. Zucker sollten in die Waschlösung nicht eingeschlossen werden, da sie dazu neigen, die Auflösung von Fibrinogen zu fördern. Die angewendete Menge von Polyethylenglycol hängt von der besonderen Qualität und dem Molekulargewicht, die angewendet werden, ab, aber es wird gefunden, daß eine Konzentration von 4 Gew.-% Polyethylenglycol 4000 in wässeriger Lösung Fibrinogen in der festen Phase hält, während die Entfernung von ungewünschten Plasmaproteinen erlaubt wird. Allgemein gesprochen liegt die Menge von Polyethylenglycol in dem Bereich von 3% bis 30% Gewicht/Volumen. So ist das nichtpolare polymere Material nichtionisch und von relativ hohem Molekulargewicht. Polyhydroxymaterialien sind imstande, Wasser in der Hydrathülle des Fibrinogens zu ersetzen und üben daher eine entwässernde Wirkung aus. Im Gegensatz dazu haben Vorschläge des Standes der Technik Waschen mit salzhaltigen Pufferlösungen einbezogen, aber diese üben nicht die gleiche entwässernde Wirkung aus, und sehr hohe molare Konzentrationen von Salz würden erforderlich sein, um eine entwässernde Wirkung der Art auszuüben, der mit dem in der vorliegenden Erfindung angewendeten Polyethylenglycol begegnet wird. Hohe Salzkonzentrationen sind darum nicht wünschenswert, weil sie Rückstände hinterlassen, welche vor der Formulierung des Produkts für nachfolgende Lyophilisierung entfernt werden müssen. So hat, wenn auch die Verwendung von Polyethylenglycol bei der Verarbeitung von Blutplasma nicht unbekannt ist, die vorliegende Erfindung das Waschen mit Polyethylenglycol als besonders nützlich in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erkannt.
Im allgemeinen wird das Waschen bei einer Temperatur in dem Bereich von 4ºC bis 10ºC (and möglicherweise bis zu Raumtemperatur, abhängig von der Menge von nichtpolarem polymeren Material in der Waschlösung) ausgeführt, und dieser Temperaturbereich ist nicht so kritisch wie bei im Stand der Technik beschriebenen Waschverfahren, wodurch zu der Kontrollierbarkeit des vorliegenden Verfahrens beigetragen wird.
Der pH der Waschlösung liegt im allgemeinen in dem Bereich von 6,8 bis 8. Im Gegensatz dazu haben die Vorschläge des Standes der Technik im allgemeinen Waschen bei stärker saurem pH erfordert, was für die endgültige Qualität des hergestellten Fibrinogens unvorteilhaft sein kann.
Weiterhin kann das Waschen gemäß der vorliegenden Erfindung bei niedrigen Ionenstärken ausgeführt werden. Dies vereinfacht wiederum die Reformulierung des Fibrinogens für nachfolgende Lyophilisierung. In Gegensatz dazu haben nach dem Stand der Technik gewaschene Lösungen im allgemeinen höhere Ionenstärken gehabt, um das Auflösen des Fibrinogens zu verhindern.
Das gewaschene Kryopräzipitat wird dann zu einer Endpufferformulierung formuliert, die für Lyophilisierung bereit ist. Die Formulierung schließt Saccharose, und gegebenenfalls Arginin, ein, um die Formulierung während des Gefrierens zu schützen und während der nachfolgenden Wärmebehandlung zu stabilisieren. Salz kann in die Formulierung eingeschlossen werden, um die Wiederauflösung des Fibrinogens zu unterstützen. Gefriertrocknen wird vorzugsweise unter Anwendung eines zweistufigen Gefrierverfahrens ausgeführt, wie es beispielsweise in unserer Arbeit in Thrombosis Haemostasis (1987)58 306 (Referenz 10) beschrieben ist. Das zweistufige Gefrierverfahren ist mit Unterkühlen verbunden, um einen gefrorenen Feststoff, umfassend eine große Anzahl von kleinen Kristallen, herzustellen. Die Temperatur wird schließlich auf -40 bis -50ºC verringert, um sicherzustellen, daß das Gefrieren vollständig ist, bevor primäres Gefriertrocknen unter verringertem Druck, typischerweise 0,01 mbar bis 1 mbar, erfolgt.
Diesem kann ein sekundäres Trocknen folgen, vorgesehen, um den Restwassergehalt des lyophilisierten Produkts zu verringern, um Langzeitstabilität bereitzustellen und um einen Restwassergehalt bereitzustellen, der für wirksame virizide Wärmebehandlung optimiert ist. Im allgemeinen wird ein Restwassergehalt in dem Bereich von 0,8 bis 2,5% Gew./Gew. bevorzugt. Eine sekundäre Trocknungstemperatur von 15ºC bis 40ºC kann für 10 bis 48 Stunden verwendet werden.
Das lyophilisierte Plasmaprotein kann dann einer viriziden Wärmebehandlung, wie sie vorstehend diskutiert wurde, unterworfen werden, und ein standardmäßiges Wärmebehandlungsregime sind 80ºC für 72 Stunden, obwohl höhere Temperaturen ebenfalls verwendet werden können. Produkte des Standes der Technik sind nicht imstande, nach derartigen strengen Wärmebehandlungsbedingungen wünschenswerte funktionelle und/oder Löslichkeitseigenschaften beizubehalten.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der Verwendung einer abschließenden Wärmebehandlung. So kann das lyophilisierte Protein in einem Fläschchen verschlossen und wärmebehandelt werden und ist dann für Aufbewahrung und Verwendung bereit. Das verschlossene Fläschchen wird wärmebehandelt und wird nicht wieder geöffnet, bis das Protein verwendet wird. Rekontamination des Proteins wird so vermieden.
Das hergestellte lyophilisierte Plasmaprotein hat gute Löslichkeit in Wasser (d. h. löst sich innerhalb von 20 Minuten) und behält mehr als 80%, gewöhnlich mehr als 90% und oftmals im wesentlichen 100% seiner ursprünglichen Gerinnungsaktivität bei. Weiterhin ist das Produkt sicher und zur Verwendung in Fibrinabdichtungsmittel-Formulierungen geeignet.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden jetzt beschrieben, lediglich um ein Beispiel zu geben.

BEISPIELE (HERSTELLUNGSMETHODEN)

Das Fibrinogenkonzentrat wird aus Kryopräzipitat hergestellt, welches durch Gefrieren und Auftauen von Plasma hergestellt wird. Kryopräzipitat kann auch verwendet werden, um ein anderes Produkt -Faktor VIII - herzustellen. Wenn das Plasma nicht für die Herstellung von FVIII geeignet ist, dann kann das Kryopräzipitat aus diesem Plasma direkt für die Fibrinogenherstellung verwendet werden. Wenn das Plasma für die FVIII-Herstellung gesammelt worden ist, wird das Kryopräzipitat zu FVIII verarbeitet. Jedoch kann Fibrinogen auch als Nebenprodukt der Verarbeitung von FVIII aus Kryopräzipitat hergestellt werden. Diese zwei allgemeinen Herangehensweisen der Herstellung sind in den Fig. 1 bzw. 2 dargestellt, welche auch auf die ausführlicheren Beispiele jeder der nachstehend angegebenen unterschiedlichen Methoden Bezug nehmen.
Zusätzlich zu dem nachstehenden Text sind außerdem Tabellen der Arbeitsgänge des Verfahrens für jedes der Beispiele der unterschiedlichen Herstellungsmethoden angefügt.

BEISPIEL 1 (direkt aus Kryopräzipitat)

1000 kg frisch gefrorenes oder ausgedientes Plasma, welches bei -40ºC gefroren gehalten worden ist, wird über Nacht auf -10ºC bis -20ºC gesetzt. Am folgenden Morgen wird das Plasma aus den Plasmapackungen entfernt und zerkleinert, wobei erlaubt wird, daß die Temperatur auf -1ºC bis +2ºC steigt. Das aufgetaute Plasma wird bei null bis +2ºC zentrifugiert, um das Kryopräzipitat zu sammeln.
Das Kryopräzipitat wird isoliert und durch Mischen bei 4ºC-10ºC mit 20-50 mM Tris pH 7,0 Puffer, enthaltend 3% bis 20% Gew./Vol. PEG 4000, mit einem Verhältnis von 1 Teil Kryopräzipitat zu 2 bis 10 Volumina Puffer, für zehn Minuten gewaschen. Das Gemisch wird bei 4 bis 10ºC zentrifugiert, um das gewaschene Kryopräzipitat zu gewinnen, welches den Großteil des Fibrinogens, Fibronectins und FXIII in dem Kryopräzipitat enthält, aber an den meisten anderen Plasmaproteinen, speziell Albumin, Plasminogen, FII und Immunoglobulin, in großem Maße verarmt ist. Ihre Entfernung durch diesen einfachen Schritt wird bevorzugt, um zufriedenstellende Wiederauflösungszeit und Produktfunktion nach der Wärmebehandlung sicherzustellen.
Das gewaschene Kryopräzipitat kann bei 20 bis 25ºC direkt in der Endpufferformulierung wiederaufgelöst werden. Dieser Puffer enthält Tris mit einer Konzentration von 2-50 mM/l (typischerweise 20 mM/l), Trinatriumcitrat (5-80 mM/l; typischerweise 40 mM/l) und Saccharose (0,5 bis 5,0% Gew./Vol., typischerweise 3% Gew./Vol.) mit einem endgültigen pH von 6,8. bis 7,6. Da wenig oder keine Feststoffe verbleiben, wird die Fibrinogenkonzentration auf 10 bis 15 g/l eingestellt und das Produkt aseptisch flitriert. Die Verteilung in endgültige Behälter (Fläschchen) kann variieren, so daß unterschiedlichen Dosisgrößen hergestellt werden können. Zum Beispiel können die Behälter 30-ml-Fläschchen mit 8 ml bis 20 ml Produkt pro Fläschchen, 50-ml-Fläschchen mit 10 ml bis 40 ml pro Fläschchen oder 250-ml-Fläschchen, enthaltend 40 ml bis 150 ml, sein. Gefrieren und Lyophilisierung sind jetzt notwendig.
Das Gefrieren des Produkts wird in einer derartigen Weise durchgeführt, um ein gleichmäßiges feines Kristallgitter herzustellen, welches zum Aufrechterhalten von Struktur und Funktion des Fibrinogens während nachfolgender Lyophilisierung und Wärmebehandlung bevorzugt wird.
Das Volumen des verteilten Produkts und das verwendete Fläschchen diktieren, welche Bedingungen des Gefrierens angewendet werden müssen. Die Temperatur des Gefriertrocknerregals kann beim Einfüllen -20ºC bis +20ºC betragen, und die Zeit bei dieser Lagertemperatur kann 20 Minuten bis 2 Stunden betragen. Die Lagertemperatur wird dann verringert, und wenn die Temperatur des Produkts -40ºC und vorzugsweise -50ºC erreicht, ist eine Verzögerung von 2 Stunden bis 24 Stunden erforderlich, um vollständiges Gefrieren des gesamten Produktgehalts sicherzustellen, bevor die primäre Trocknung beginnt.
Die Bedingungen der primären Trocknung werden ebenfalls durch das Volumen des in jedes Fläschchen verteilten Produkts und durch die Fläschchengröße diktiert. Während der primären Trocknung muß die Produkttemperatur vorzugsweise unter -30ºC betragen, so daß Eissublimation ohne lokalisiertes Schmelzen der gefrorenen Pfropfenstruktur erfolgt. Dieses Stadium kann, abhängig von der Größe des Fläschchens und dem Füllvolumen, 50 Stunden bis 150 Stunden zur Vollendung erfordern. Der Kammerdruck während der primären Trocknung kann 0,01 mbar bis l mbar betragen.
Die Bedingungen der sekundären Trocknung werden gestaltet, um den Restwassergehalt des lyophilisierten Produkts zu verringern, so daß die Langzeitstabilität des Produkts erhöht wird. Es ist erkannt worden, daß mehr als 0,8% Gew./Gew. Restwassergehalt für die Virusinaktivierung während der nachfolgenden Wärmebehandlung bevorzugt werden. Es ist weiter erkannt worden, daß mehr als 2,5% Gew./Gew. Wassergehalt zu Verlust von Produktfunktion (wie gemessen durch Löslichkeitszeit und Gerinnungsfähigkeit) während der Wärmebehandlung bei 80ºC für 72 Stunden führen. Die Bedingungen der sekundären Trocknung werden daher eingestellt, um sicherzustellen, daß der Restwassergehalt innerhalb des gewünschten Bereiches bleibt, der für die Bedingungen der Wärmebehandlung am. Ende erforderlich ist. Eine Produkttemperatur von 15ºC bis 40ºC kann für 10-48 Stunden, abhängig von Fläschchengröße, Produktvolumen und gewünschtem Restwassergehalt am Ende, verwendet werden.
Die lyophilisierte Fibrinogenzubereitung kann bei 70ºC bis 100ºC für bis zu 96 Stunden wärmebehandelt werden. Die Löslichkeitszeit in Wasser von so erwärmtem Material ist gut (10 bis 20 Minuten) und die Produktfunktion wird erhalten. Die Gerinnungszeit, wenn 200 U/ml Thrombin ausgesetzt, betrug weniger als 10 Sekunden, und das Gerinnsel war stabil, wobei typischerweise nur 0,5 bis 2,0% des gerinnbaren Proteins in 6M Harnstoff löslich sind.
Die wie vorstehend beschrieben hergestellte Fibrinogenzubereitung wurde vor dem Gefrieren, der Lyophilisierung und Wärmebehandlung bei 80ºC für 72 Stunden im Labor mit Viren kontaminiert. Wenn auf die Virusaktivität geprüft wurde, war es augenscheinlich, daß während der Wärmebehandlung beträchtliche Infektiosität verloren worden war. Das Semliki-Forest-Virus zeigte eine Verringerung von > 5,2 log (es verbleibt keine Aktivität) bei einem RWC von 1,14%. Das humane Immundefizienz-Virus Typ 1 zeigte eine Verringerung von > 4,8 log bei 0,76% Restwassergehalt.

BEISPIEL 2

Eine Zubereitung von humanem Fibrinogen kann wie in Beispiel 1 hergestellt werden. Um die Löslichkeitszeit zu vergrößern und die Filtration zu verbessern, wird eine differentielle Extraktion des gewaschenen Kryopräzipitats eingeschlossen. Dieser Schritt führt zu einer veränderlichen Menge der Feststoffe des gewaschenen Kryopräzipitats, die unlöslich bleiben, welche durch einen Zentrifugationsschritt verdichtet und entfernt werden können. Die Menge von unlöslichem Material kann sich zwischen den Ansätzen verändern und ist von Kryopräzipitatqualität und Ausgangsmaterial abhängig. Die Extraktion wird bei niedriger Ionenstärke und bei 18-30ºC durchgeführt. Der Zentrifugationsschritt wird bei einer niedrigeren Temperatur (4-18ºC) bevorzugt, um zu erlauben, daß ein kompakteres Präzipitat gebildet wird. Das Verhältnis von Puffer zu gewaschenem Kryopräzipitat liegt typischerweise zwischen 2 Volumina und 10 Volumina von 20 mM Tris pH 7,5 zu T Teil Feststoffe. Die überstehende Flüssigkeit kann wie in Beispiel 1 weiterverarbeitet werden. Gefriergetrocknetes wärmebehandeltes Fibrinogen, das in dieser Weise hergestellt wurde, löste sich in 5 bis 10 min wieder auf und zeigte die gleiche Gerinnungszeit und Gerinnselstabilität wie in Beispiel 1.

BEISPIEL 3

Die Zubereitung von humanem Fibrinogen kann wie in den Beispielen 1 und 2 hergestellt werden. Um die Geschwindigkeit der Wiederauflösung nach der Wärmebehandlung zu vergrößern und eine Zunahme in der Temperatur der Wärmebehandlung des Endprodukts zu erlauben, können die Saccharosestabilisatoren ganz oder teilweise durch die Aminosäure L-Arginin ersetzt werden. Geeignet ist eine Konzentration von 50 mM als gesamter Ersatz oder von 5-25 mM zusätzlich zu der Saccharose mit 1 bis 3% Gew./Vol. Gefriergetrocknetes wärmebehandeltes Fibrinogen, das in dieser Weise hergestellt wurde, wies die gleiche Löslichkeit, Gerinnungszeit und Gerinnselstabilität auf wie in Beispiel 2.

BEISPIEL 4 (Nebenprodukt der FVIII-Herstellung)

Kryopräzipitat aus frisch gefrorenem Plasma, welches für die Herstellung von FVIII-Konzentrat geeignet ist, wird in einem PEG enthaltenden (0,1 bis 4% PEG 4000) Puffer wie beispielsweise Tris (5-50 mM) bei einem geeigneten pH (6,5 bis 8,0) und bei einer niedrigen Temperatur (0 bis 15ºC) gewaschen. Der Waschpuffer kann zusätzlich Excipienten wie beispielsweise Heparin (0,1 bis 20 U/ml), Trinatriumcitrat (1,0 bis 100 mM) und Calciumchlorid (0,5 bis 10 mM) enthalten. Das Waschverhältnis kann von 1 : 1 bis 1 : 10 von Kryopräzipitat zu Waschpuffer reichen (vorzugsweise 3,5 bis 5,0 : 1), und die Temperatur kann von 0ºC bis 15ºC (vorzugsweise 4ºC) reichen.
Die überstehende Flüssigkeit dieses Waschverfahrens enthält eine nennenswerte Menge von Fibrinogen hoher Qualität. Dieses Fibrinogen wird eingebracht, indem die PEG Konzentration um bis zu 10% Gew./Vol., aber vorzugsweise auf 3,5 bis 4% Gew./Vol. bei 0-10ºC, vergrößert wird und das Präzipitat durch Zentrifugation gesammelt wird.
Das so gesammelte Fibrinogen-reiche Präzipitat kann sofort verarbeitet oder für spätere Verarbeitung gefroren (niedriger als -20ºC) aufbewahrt werden(bis zu 1 Jahr).
Das frisch hergestellte oder gefrorene Fibrinogenpräzipitat kann wie in den Beispielen I bis 3 zu einer lyophilisierten wärmebehandelten Fibrinogenzubereitung verarbeitet werden. Fibrinogen, hergestellt in dieser Weise, löste sich in 5 Minuten wieder auf und zeigte die gleiche Gerinnungszeit und Gerinnselstabilität wie in den Beispielen 1 bis 3.

BEISPIEL 5

Kryopräzipitat aus frisch gefrorenem Plasma, welches für die Herstellung von FVIII-Konzentrat geeignet ist, wird wie in Fig. 2 gewaschen, und die gelösten Feststoffe werden in einem geeigneten Puffer, z. B. Tris, bei einem geeigneten pH, z. B. 6,0 bis 8,0, extrahiert. Nach Solubilisieren oder Extrahieren des FVIII aus dem gewaschenen Kryopräzipitat ist es möglich, das FVIII zu reinigen und weniger lösliche Proteine, wie beispielsweise Fibrinogen und Fibronectin, durch Präzipitation unter Verwendung von zum Beispiel Metallionen wie beispielsweise Zink als Chlorid oder Sulfat (bis zu 50 mM) in Verbindung mit Heparin (bis zu 25 U/ml), wenn erforderlich, und einem Absorptionsmittel, z. B. Aluminiumhydroxid (bis zu 20% Gew./Vol.), zu entfernen.
Die Feststoffe aus diesem Präzipitationsschritt sind Fibrinogen-reich. Sie können durch Wiederauflösen in einem geeigneten Puffer (5 bis 50 mM Tris pH 7,5, 5 bis 100 mM Trinatriumcitrat) und Entfernen des unlöslichen Materials (hauptsächlich Aluminiumhydroxid) durch Zentrifugation extrahiert werden. Das Fibrinogen in der überstehenden Flüssigkeit kann durch PEG-Präzipitation (3 bis 10% Gew./Vol.) eingebracht werden und das entstehende Fibrinogenpräzipitat wie in den Fig. 1 bis 3 zu einer lyophilisierten und wärmebehandelten Fibrinogenzubereitung verarbeitet werden. Fibrinogen, das in dieser Weise hergestellt wurde, hatte die gleiche Löslichkeit, Gerinnungszeit und Gerinnselstabilität wie in Beispiel 4.

BEISPIEL 6

Die überstehende Flüssigkeit des Metallionenpräzipitationsschritts in Beispiel 5 ist nicht nur reich an FVIII, sondern auch an Fibrinogen. Das FVIII kann entweder vor oder nach Behandlung mit einem Lösungsmittel (z. B. TNBP mit 0,1 bis 2% Vol./Vol.) und einem Detergens (z. B. Tween 80 mit 0,2 bis 5% Vol./Vol.) an eine Affinitäts- oder Ionenaustauschmatrix gebunden werden und das Fibrinogen aus dem ungebundenen Material gewonnen werden.
Das Fibrinogen kann aus dieser ungebundenen Fraktion durch Präzipitation unter Verwendung von PEG 4000 (2 bis 10% Gew./Vol.) gewonnen werden. Wenn die Fraktion Lösungsmittel und Detergens enthält, können einige aufeinanderfolgende PEG-Präzipitationsschritte (drei oder mehr) erforderlich sein, um das Niveau der Kontamination durch diese Mittel auf ein annehmbares Niveau zu verringern. In jedem Stadium muß das präzipitierte Fibrinogen in einem geeigneten Puffer (z. B. 5 bis 50 mM Tris pH 7,5, 5 bis 100 mM Trinatriumcitrat, 0,1% bis 2,5% Gew./Vol. Natriumchlorid) solubilisiert werden. Das endgültige Präzipitat kann wie in den Beispielen 1 bis 3 zu einer lyophilisierten und wärmebehandelten Fibrinogenzubereitung mit der gleichen Löslichkeit, Gerinnungszeit und Gerinnselstabilität wie in Beispiel 4 verarbeitet werden.
Die Gerinnungsaktivität und Virusdesaktivierung der Produkte der Beispiele 2 bis 5 war der von Beispiel 1 ähnlich.
Dieses Beispiel demonstriert auch, daß diese Methoden zum Herstellen von abschließend wärmebehandeltem Fibrinogen mit Lösungsmittel-Detergens-Behandlung kombiniert werden können, um ein Produkt mit zwei sehr wirksamen und komplementären Virusinaktivierungschritten zu ergeben.

TEST 1

PRÜFUNG DER GERINNSELSTABILITÄT VON FIBRINOGEN

EINFÜHRUNG

Fibrinabdichtungsmittel ist ein Produkt, welches zur Verwendung in verschiedenartigen chirurgischen Verfahrensweisen entwickelt worden ist. Es besteht im Grunde aus einer Zubereitung von Fibrinogen und einer Zubereitung von Thrombin, welche, einmal in Lösung, zusammengebracht werden, um Fibrin zu erzeugen, welches an Wundstellen als Abdichtungsmittel wirkt, wobei Aussickern aus dem Wundgebiet minimiert wird, und welches normale Wundheilung erlaubt.
Um richtig zu funktionieren, muß das Fibringerinnsel einen minimalen Grad von Vernetzung haben und diese beschreibt eine Methode, wodurch Gerinnselstabilität, d. h. die Fähigkeit, Wiederauflösung durch Harnstoff zu widerstehen, geprüft wird. Dies stellt ein indirektes, aber funktionelles Maß des Grades der Vernetzung (durch FXIIIa-Aktivität) in dem Gerinnsel bereit.

REAGENZIEN

DIE FOLGENDEN REAGENZIEN SIND FÜR DIE PRÜFUNG ERFORDERLICH:

(a) Eine 0,9%ige (Gew./Vol.) wässerige Lösung von Natriumchlorid (9 g/l).
(b) Eine 6M wässerige Lösung von Harnstoff (360 g/l).
(c) Thrombin (erhältlich von Armour Pharmaceuticals), gelöst in 40 mM Calciumchlorid, um die erforderliche Konzentration von 200 U/ml zu ergeben.
(d) Eine 20 mM TRIS-Lösung pH 7,50.

VERFAHRENSWEISE

Man löse den Inhalt der Fläschchen mit lyophilisiertem Fibrinogen in 5 ml 20 mM TRIS pH 7,50 bei Raumtemperatur. Die Zubereitungen sollten innerhalb von 20 Minuten in Lösung sein. Wenn die Proben gelöst sind, stelle man eine Lösung von Thrombin in 40 mM Calciumchlorid zu einer Endkonzentration von 200 U/ml her.
Unter Verwendung einer geeigneten Apparatur stelle man 0,5-ml-Gerinnsel (Gesamtvolumen) wie folgt her:
Man verwende neue sterile 1-ml-Spritzen für jede Gruppe von Proben. Man ziehe für jedes.
Gerinnsel, welches erzeugt werden soll, 0,25 ml Thrombin-Lösung in eine Spritze und 0,25 ml Fibrinogen- Lösung in die andere. Gleichzeitig verteile und mische man unter Vermeidung von Blasenbildung gleiche Volumina von beiden Lösungen.
Man erlaube den Proben, 1 Stunde bei Raumtemperatur zu stehen, dann füge man einen ml 0,9%iges Natriumchlorid zu einer Gruppe von Doppelproben und einen ml 6M Harnstoff zu der anderen Gruppe hinzu. Man bedecke die Röhrchen und erlaube ihnen, über Nacht bei Raumtemperatur zu stehen.
Am nächsten Tag dekantiere man die überstehende Flüssigkeit aus den Röhrchen in frische saubere Röhrchen und untersuche die Gerinnsel auf Zeichen von Auflösung.
Um diesen Test zu durchlaufen, sollte die Proteinkonzentration der überstehenden Flüssigkeiten von Salzlösung und Harnstoff (gemessen unter Verwendung einer geeigneten Methode, z. B. wie in Referenz 6) weniger als 0,4 g/l betragen.
Man nehme in jedem Paar der überstehenden Flüssigkeiten von Salzlösung und Harnstoff entsprechend jeder Fibrinogenprobe den Mittelwert der Proteinkonzentration. Man subtrahiere den Mittelwert des Wertes der Salzlösung von dem Mittelwert des Harnstoffwertes = X mg. Man finde die Konzentration von Fibrinogen in jeder Probe mittels der Prüfung der gegenwärtigen QC- Fibrinogenkonzentration = Z mg/ml. Es gibt 0,25 ml von diesem in jedem Gerinnsel, was 0,25 ml · Z mg/ml = A mg entspricht.
Der Prozentsatz von durch Harnstoff solubilisiertem Fibrin in jeder Probe ist so:
Wenn der Prozentsatz größer als 10% ist, hat die Probe in dem Gerinnselstabilitätstest versagt.
TEST 2 (Prüfung der Gerinnselfestigkeit-Rattenhaut-Einschnittstest)
Die Verwendung der in Test 1 beschriebenen Prüfung wurde in Verbindung mit einem in-vivo- Modell validiert.
Kurz gesagt wurden standardmäßige dorsale Hauteinschnitte bei erwachsenen männlichen Wistar- Ratten mit Band allein oder mit Fibrinabdichtungsmittel und Band geschlossen. Unterschiedliche Formulierungen von Fibrinabdichtungsmittel, um verschiedenartige Konzentrationen von Fibrinogen, FXIII und Thrombin zu enthalten, wurden verwendet, um die Einschnitte zu schließen.
Nach einem geeigneten Zeitraum wurden die Tiere getötet und die Wunden exzidiert. Die exzidierten Wunden wurden dann mechanisch getestet und die Spannung, Verformung, Elastizität und geleistete Arbeit, um die Wunden zu zerreißen, wurden gemessen. In dieser Weise konnte demonstriert werden, daß es optimale Konzentrationen von Fibrinogen (ungefähr 39 g/l) und Thrombin (200-500 U/ml) gab, welche zu geheilten Wunden mit signifikant vergrößerten Werten von Spannung, Energieabsorption und Elastizität, verglichen mit denjenigen, behandelt mit niedrigeren, aber auch höheren Fibrinogenkonzentrationen, führten. Es konnte auch gezeigt werden, daß es unter diesen Bedingungen eine FXIII-Anforderung von > 0,14 U/mg Fibrinogen gab.
Es ist praktisch nicht durchführbar, vor der klinischen Verwendung an jedem Ansatz von Fibrinabdichtungsmittel in vivo funktionelle Tests durchzuführen. Daher war es notwendig, eine Laborprüfung der Gerinnselfestigkeit zu entwickeln und zu validieren, um einen adäquaten Grad von Vernetzung der Fibrinfibrillen in den Gerinnseln sicherzustellen. Dies wurde durch Ausführen der Prüfung der Gerinnsellöslichkeit an Fibrinabdichtungsmittel, hergestellt unter Verwendung verschiedenartiger Kombinationen von Fibrinogen, FXIII und Thrombin ähnlich den in dem. Rattenhaut-Einschnittstest verwendeten, gemacht. In dieser Weise konnte bestimmt werden, daß, damit weniger als 10% des gerinnbaren Proteins in 6M Harnstoff löslich waren, es erforderlich war, daß die Fibrinogenzubereitung einen FXIII-Gehalt von mehr als 0,25 U/mg Fibrinogen hatte, was signifikant höher ist als die 0,14 U/mg, die für Wundheilung in dem Rattenhaut-Einschnittstest erforderlich waren.

TEST 3

VIRUSINAKTIVIERUNG IN DER ZUBEREITUNG VON GEFRIERGETROCKNETEM HUMANEN FIBRINOGEN WÄHREND DER WÄRMEBEHANDLUNG BEI 80ºC FÜR 72 STUNDEN.

Das humane Fibrinogen, verwendet in den Untersuchungen der Virusinaktivierung, wurde aus Material hergestellt, das aus großtechnischen Produktionsansätzen, hergestellt in einer der früher beschriebenen ähnlichen Weise, als Probe genommen wurde.

VIREN UND ZELL-LINIEN

Das Semliki-Forest-Virus (SLFV) wurde ursprünglich von Prof. Bourke, Warwick-Universität, erhalten und wurde in Vero-Zellen gezüchtet und geprüft, wobei zum Bewerten von positiven Vertiefungen die cytopathische Wirkung verwendet wurde und die Titer durch die Methode von Reed und Muench (Referenz 7), ausgedrückt in infektiösen Dosen für die Gewebekultur (TC1D50) pro ml des Impfmittels, berechnet wurden.
Der HIV-1-Stamm RF wurde ursprünglich von den Chester Beatty Laboratories erhalten. Der HIV-1-Virus wurde in H9-NIH-Zellen gezüchtet und in der humanen lymphoblastoiden Zell-Linie C8166 unter Verwendung einer Kombination von synzytialer Erzeugung und einer p24-HIV-1-Antigen-Prüfung geprüft. Die HIV-1-Titer wurden als in-vitro-infektiöse Einheiten (IVIu) pro ml der Testprobe ausgedrückt.

PROBENAHME UND EXPERIMENTELLE GESTALTUNG

Alle Messungen der Virusinaktivierung wurden an bis zu vier Proben, jeweils doppelt, gesondert unerwärmte oder wärmebehandelte Fläschchen, ausgeführt.
In jedem Experiment wurden Proben vor dem Gefriertrocknen und vor der Wärmebehandlung ebenso wie an unterschiedlichen Zeitpunkten während des Wärmebehandlungsverfahrens genommen. In dieser Weise kann über einen Verlust von Virusaktivität beim Gefriertrocknen Rechenschaft abgelegt werden und die hier angeführten Zahlen gelten lediglich für die Virusinaktivierung während der Wärmebehandlung. Das Niveau der Inaktivierung wird als Reduktionsindex (RI) dargestellt und als log&sub1;&sub0; RI ausgedrückt, welches wie folgt abgeleitet wird:
Außerdem konnte durch Messen der Niveaus der Inaktivierung an Zeitpunkten während der Wärmebehandlung ebenso wie bei Abschluß des Erwärmungsszeitraums bestimmt werden, ob die Inaktivierungswerte intern übereinstimmend waren oder nicht, was weiteres Vertrauen in die Gesamtzahl ergibt. Die Experimente zur HIV-Inaktivierung schlossen auch parallele Proben, enthaltend eines der Modellviren (SLFV) als innere Kontrolle, ein.
Der Restwassergehalt der Zubereitungen von humanem Fibrinogen, verwendet in den Experimenten der Virusinaktivierung, wurde in parallelen nicht-beimpften Proben bestimmt.

WERTE DER INAKTIVIERUNG DES MODELLVIRUS

SLFV ist ein Togavirus, das zu der gleichen Familie wie Hepatitis C gehört, obwohl diese Familie jetzt in Togaviren und Flaviviren unterteilt worden ist. Es wird gewöhnlich als Modell für die Inaktivierung des Hepatitis-C-Virus verwendet. Eine Zusammenfassung der Werte der SLFV-Inaktivierung ist in Tabelle 1 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen eine totale Inaktivierung von > 5,2 log&sub1;&sub0; während des 72-Stunden- Erwärmungszeitraums mit über 4,8 log&sub1;&sub0;, inaktiviert in den ersten 24 Stunden.
Wir schlußfolgern, daß Wärmebehandlung der gefriergetrockneten Fibrinogenzubereitung bei 80ºC einen relevanten Modellvirus inaktiviert.

WERTE DER INAKTIVIERUNG VON HIV-1

Die Ergebnisse einer Untersuchung der 111 V- 1-Inaktivierung während der Wärmebehandlung der gefriergetrockneten humanen Fibrinogenkomponente des Kits sind in Tabelle 2 angegeben. Um die Empfindlichkeit der HIV-Prüfung zu vergrößern, wurde die Analyse auch mit dem Probenvolumen ausgeführt, das von den normalen 1,0 ml (2 · 0,5 ml) auf 40 ml (80 · 0,5 ml) vergrößert wurde. Wie Tabelle 2 zeigt, wurde während 72 Stunden bei 80ºC eine Gesamtzahl von > 4,8 log&sub1;&sub0; Verringerung im HIV-1-Titer unter Verwendung von 0,5-ml-Proben und eine Zahl von 6,1 log&sub1;&sub0; unter Verwendung des größeren 40-ml-Gesamtprüfvolumens erhalten.
Wir schlußfolgern, daß Wärmebehandlung der gefriergetrockneten Fibrinogenzubereitung bei 80ºC für 72 Stunden HIV-1 inaktiviert.

EIN VERGLEICH DER VIRUSINAKTIVIERUNG WAHREND DER WÄRMEBEHANDLUNG DER ZUBEREITUNG VON HUMANEM FIBRINOGEN UND DES SNBTS FVIII PRODUKTS 28.

Die Werte der Virusinaktivierung für die Wärmebehandlung der Zubereitung von gefriergetrocknetem humanen Fibrinogen lassen sich günstig mit früheren Werten, beobachtet während ähnlicher Wärmebehandlung des gefriergetrockneten FVIII-Produkts Z8 des Scottish National Blood Transfusion Service (SNBTS), vergleichen.
Das SNBTS-FVIII-Produkt 28 hat Niveaus der SLFV-Inaktivierung von 5,5 ± 0,9 log&sub1;&sub0; (n = 4) bei Wärmebehandlung mit 80ºC für 72 Stunden gezeigt, und die Zubereitung von humanem Fibrinogen in dieser Untersuchung hat eine Zahl von ≥5,2 log&sub1;&sub0; Verringerung während der gleichen Wärmebehandlung gezeigt.
Das gemessene Niveau der HIV-1-Inaktivierung während der Wärmebehandlung der Zubereitung von humanem Fibrinogen (6,1 log&sub1;&sub0;) mit 72 Stunden bei 80ºC liegt innerhalb des Bereiches von S. 2 bis 7,3 log&sub1;&sub0;, welchen wir bei 72 Stunden/80ºC Wärmebehandlung von SNBTS FVIII Z8 beobachtet haben.
In der Schlußfolgerung kann gesagt werden, daß die Niveaus der Virusinaktivierung, gesehen während der Wärmebehandlung bei 80ºC für 72 Stunden, der Zubereitung von humanem Fibrinogen für die Verwendung in dem Fibrinabdichtungsmittel-Kit ähnlich und mit den Niveaus der Virusinaktivierung, gesehen bei dem SNBTS-FVHI-Produkt Z8, welches ein hervorragendes klinisches Sicherheitsprotokoll hat (Referenz 8), vergleichbar sind, wie es andere abschließend streng wärmebehandelte Koagulationsfaktorprodukte sind (Referenz 9). TABELLE 1 TABELLE 2

REFERENZEN

1. Barst H. C., Haverich A., Walterbusch G. und Maatz W. Fibrin Adhesive: an important haemostatic adjunct in cardiovascular operations (Fibrinklebstoff ein wichtiger haemostatischer Zusatz bei kardiovaskulären Operationen). Journal of Thoracic und Cardiovascular surgery; 84, 548-553 (1982).
2. Scheele J., Gentsch H. H. und Matheson E. Splenic repair by fibrin tissue adhesive and collagen fleece (Milzwiederherstellung durch Fibringewebeklebstoff und Kollagenvlies). Surgery; 95, 6-13 (1984).
3. Brands W., Mennichen C. und Beck M. Preservation of the ruptured spleen by gluing with highly concentrated human fibrinogen: Experimental and clinical results (Erhaltung der gerissenen Milz durch Kleben mit hochkonzentriertem humanen Fibrinogen: Experimentelle und klinische Ergebnisse). World Journal of Surgery; 6, 366-368 (1982).
4. Mersner H., Struch E., Schmidt-Habelinan P. und Sebering F. Fibrin Seal application: Clinical experience (Anwendung der Fibrinabdichtung: Klinische Erfahrung). Thoracic und Cardiovascular surgery; 30, 232-233 (1982).
5. Revocation of Fibrinogen Licences (Entzug von Fibrinogenlizenzen): FDA Drug Bulletin; 8, 15 (1978).
6. Rizza C, et al. Confirmation of viral safety of dry heat treated FVIII concentrate prepared by BPL (Bestätigung der Virussicherheit von trockenem wärmebehandelten FVIII-Konzentrat, hergestellt durch BPL). Br. J. Haematol. 84, 269-272 (1993).
7. Reed L. J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent and points. (Eine einfache Methode zum Abschätzen von fünfzig Prozent und Punkten. AM. Hyg. 27, 493-497 (1938).
8. Bennet, et al. (1993). Study of viral safety of Scottish National Blood Transfusion Service Factor VIII and Factor IX Concentrate (Untersuchung der Virussicherheit des Konzentrats von Faktor VIII und Faktor IX des Scottish National Blood Transfusion Service). Transfusion Medicine 295-298.
9. Bradford M. B. A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding (Eine schnelle empfindliche Methode für die Quantifizierung von Mikrogramm-Mengen von Protein unter Verwendung des Prinzips der Protein-Farbstoff-Bindung). Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
10. McIntosh R. V. et al. A high yield Factor VIII concentrate suitable for advanced heat treatment (Ein Faktor-VIII-Konzentrat mit hoher Ausbeute, geeignet für moderne Wärmebehandlung). Thrombosis Haemostasis 58, 306 (1987).

Claims

1. Lyophilisiertes Fibrinogen, welches wärmebehandelt worden ist, um alle vorhandenen Viren zu inaktivieren und um nichtinfektiös zu sein, und welches

(a) eine Löslichkeit in Wasser oder einer anderen pharmazeutisch verträglichen wässerigen Lösung bis 40 g/l in weniger als 20 Minuten bei 20ºC; und

(b) eine Gerinnungszeit von weniger als 10 Sekunden, wenn mindestens 200 U/ml Thrombin ausgesetzt, hat und welches durch das Verfahren nach Anspruch 10 hergestellt worden ist.

2. Fibrinogen nach Anspruch 1, welches Faktor XIII in einem Anteil von mindestens 0,14 U pro mg umfaßt.

3. Fibrinogen nach Anspruch 2, wobei die Stabilität des Gerinnsels derart ist, daß weniger als 10% des geronnenen Proteins in einer 6M Harnstofflösung löslich sind, wenn es über Nacht bei Raumtemperatur belassen wird.

4. Fibrinogen nach Anspruch 3, wobei die Stabilität des Gerinnsels derart ist, daß weniger als 5% des geronnenen Proteins löslich sind.

5. Fibrinogen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches weiterhin Rückstand von Lösungsmittel-Detergens aus einem Virusinaktivierungsschritt mit Lösungsmittel-Detergens umfaßt.

6. Fibrinogen nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer Löslichkeit von 50 bis 60 g/l in Wasser oder einer anderen pharmazeutisch verträglichen wässerigen Lösung bei 20ºC.

7. Fibrinogen nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer Löslichkeit bis 40 g/l in 5 bis 10 Minuten bei 20ºC.

8. Fibrinogen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches mindestens mit einer Strenge von 80ºC für 72 Stunden wärmebehandelt worden ist.

9. Fibrinogen nach Anspruch 8, welches mindestens mit einer Strenge von 90ºC für 10 Stunden wärmebehandelt worden ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines kryopräzipitierbaren Blutplasmaproteins, das virizider Wärmebehandlung unterzogen worden ist, welches umfaßt;

(i) Präzipitieren des kryopräzipitierbaren Proteins mit einer wässerigen Lösung, umfassend ein nichtpolares polymeres Material, oder Waschen des kryopräzipitierbaren Proteins mit einer wässerigen Lösung mit einem pH in dem Bereich 6, 8 bis 8, umfassend ein nichtpolares polymeres Material; wobei das nichtpolare polymere Material ein Polyethylenglycol mit dem Molekulargewicht 600 bis 6000 ist; derart, um wärmeabbaubare Plasmaproteine im wesentlichen daraus zu entfernen;

(ii) Lyophilisieren des kryopräzipitierbaren Proteins; wobei das kryopräzipitierbare Protein in einer Endpufferformulierung gelöst worden ist, enthaltend:

Tris 2-50 mM/l,

Trinatriumcitrat 5-80 mM/l und

Saccharose 0,5-5,0% Gew./Vol. (wobei die Saccharose gegebenenfalls ganz oder teilweise durch L-Arginin ersetzt ist) zu einem endgültigen pH von 6,8 bis 7,6; und

(iii) Vornehmen einer viriziden Wärmebehandlung des lyophilisierten kryopräzipitierbaren Proteins, damit es nichtinfektiös ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das kryopräzipitierbare Protein Fibronectin, Faktor VIII oder Faktor XIII ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das kryopräzipitierbare Protein Fibrinogen ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Waschlösung 3 bis 30% Gew./Vol Polyethylenglycol umfaßt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die wässerige Waschlösung frei von Zuckern ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei das Waschen bei einer Temperatur in dem Bereich 4 bis 10ºC ausgeführt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei das kryopräzipitierbare Protein vor der Lyophilisierung formuliert wird, um ein Kohlenhydrat und/oder eine Aminosäure einzuschließen.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei das lyophilisierte Protein mindestens mit einer Strenge von 80ºC für 72 Stunden wärmebehandelt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das lyophilisierte Protein mindestens mit einer Strenge von 90ºC für 10 Stunden wärmebehandelt wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, wobei die Wärmebehandlung eine abschließende Wärmebehandlung ist, ausgeführt als letzter Schritt des Verfahrens.