DE69528295T2 - APPLICATION OF THE BIOFREQUENCY SPECTRUM IN EMBRYOTECHNOLOGY IN ANIMALS - Google Patents
APPLICATION OF THE BIOFREQUENCY SPECTRUM IN EMBRYOTECHNOLOGY IN ANIMALSInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Biotechnologie, insbesondere die Anwendung eines Bio-Spektrums in der Embryonen-Technologie nicht-menschlicher Embryonen.The present invention relates to biotechnology, in particular to the application of a bio-spectrum in embryo technology of non-human embryos.
Der Begriff "Embryonen-Technologie", wie er in der folgenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich nur auf nicht- menschliche, tierische Embryonen.The term "embryo technology" as used in the following description refers only to non-human animal embryos.
Die Grundlagenforschung und technische Entwicklung in der Embryonen-Technologie tierischer Embryonen haben in den letzten Jahren große Fortschritte gemacht. Forschungen in der Embryonen-Technologie kommen schnell vom Stadium der Laborversuche zur Anwendung und Kommerzialisierung. Die Embryonen-Technologie tierischer Embryonen umfasst hauptsächlich in-vitro-Erzeugung von Embryonen, Kryokonservierung von Embryonen und Mikromanipulation von Embryonen etc.Basic research and technical development in animal embryo technology have made great progress in recent years. Research in embryo technology is rapidly moving from the stage of laboratory experiments to application and commercialization. Animal embryo technology mainly includes in vitro creation of embryos, cryopreservation of embryos and micromanipulation of embryos, etc.
Die Entwicklung der Technik der in-vitro-Erzeugung von Embryonen kann vollen Gebrauch von tierischen Genressourcen ermöglichen und die Verbesserung tierischer Gene beschleunigen. Diese Technik kann Unfruchtbarkeit einiger seltener Tiere überwinden und Ressourcen seltener Tiere konservieren. Diese Technik kann auch Embryonen zur Herbeiführung eines Gen-Transfers in Tieren und Geschlechtsbestimmung von Embryonen liefern. Die Effektivität der Erzeugung und die Qualität der in vitro erzeugten Embryonen sind jedoch geringer. Auch die Trächtigkeitsrate ist bei Embryotransfer geringer.The development of in vitro embryo production technology can enable full use of animal genetic resources and accelerate the improvement of animal genes. This technology can overcome infertility of some rare animals and conserve resources of rare animals. This technology can also provide embryos for inducing gene transfer in animals and sex determination of embryos. However, the efficiency of production and the quality of in vitro produced embryos are lower. The pregnancy rate is also lower with embryo transfer.
Kryokonservierung tierischer Embryonen ist die Schlüsseltechnik, die entscheidet, ob die Technik des Embryotransfers zur praktischen Anwendung gelangen kann, oder nicht. Durch die Kryokonservierungsstechnik kann zur Erleichterung des internationalen Transportes und Austausches von Tierzuchtressourcen ein Reservoir tierischer Embryonen eingerichtet werden. Zur Zeit gibt es zwei international akzeptierte Verfahren zur Kryokonservierung von Embryonen. Das eine ist das Verfahren des langsamen Einfrierens, das andere die Kryokonservierung. Die Überlebensrate gefrorener/aufgetauter, in vitro erzeugter Embryonen liegt jedoch bei 65% und die Trächtigkeitsrate der gefrorenen/aufgetauten Embryonen ist um 20% geringer, als die frischer Embryonen. Mikromanipulation von Embryonen besteht in Geschlechtsbestimmung von Embryonen, Klonen von Embryonen einschließlich Embryonenzerlegung und Kerntransfer, und Gentransfer. Ziel der Geschlechtsbestimmung von Embryonen ist die Erzeugung von Nachkommen mit bestimmtem Geschlecht. Durch Klonen von Embryonen kann eine große Zahl identischer Nachkommen von einem bestimmten tierischen Embryo erzeugt werden, was die Reproduktionseffektivität erhöht und die Tierzucht beschleunigt. Tiere mit transformierten Genen können durch Mikroinjektion und durch Verfahren mit Spermavermittlung erzeugt werden. Ziel der Gentransfertechnik ist die Erhöhung der Wachstumsrate und der Widerstandsfähigkeit der Tiere gegen Krankheiten, Erhöhung der Qualität der Tiererzeugung und daher Schaffung vieler wertvoller Medikamente für Menschen. Die Effektivität der Mikromanipulation ist jedoch sehr gering, da die Embryonen definitiv verletzt werden.Cryopreservation of animal embryos is the key technique that determines whether the embryo transfer technique can be put into practical use or not. Cryopreservation technology can establish a reservoir of animal embryos to facilitate international transportation and exchange of animal breeding resources. At present, there are two internationally accepted methods for cryopreservation of embryos. One is the slow freezing method and the other is cryopreservation. However, the survival rate of frozen/thawed embryos produced in vitro is 65% and the pregnancy rate of frozen/thawed embryos is 20% lower than that of fresh embryos. Micromanipulation of embryos consists of sex determination of embryos, cloning of embryos including embryo dissection and nuclear transfer, and gene transfer. The goal of embryo sex determination is to produce offspring of a specific sex. By cloning embryos, a large number of identical offspring can be produced from a given animal embryo, which increases reproductive efficiency and speeds up animal breeding. Animals with transformed genes can be produced by microinjection and sperm transfer techniques. The goal of gene transfer technology is to increase the growth rate and resistance of animals to diseases, increase the quality of animal production and, therefore, create many valuable medicines for humans. However, the effectiveness of micromanipulation is very low, since the embryos are definitely injured.
Zur Lösung der obigen Probleme wurde versucht, Laser- oder magnetische Bestrahlung zu verwenden. Beispielsweise beschreibt SU-A-1 724 204 die Anwendung von Bestrahlung mit einem Infrarotlaser bestimmter Wellenlänge während der Bearbeitung tierischen Reproduktionsspermas; SU-A-731 976 beschreibt ein Verfahren zur Verbesserung der Fruchtbarkeit von Labornagetieren, in dem die Weibchen einer cm-Band- Strahlung ausgesetzt werden; SU-A-1 757 676 beschreibt ein Verfahren zur Bestrahlung von Hühnerembryonen mit einem He-Ne-Laser der besonderen Wellenlänge 632,8 nm; SU-A-1 152 583 beschreibt ein Behandlungsvefahren, das ein reines Magnetfeld anwendet; SU-A-1 402 343 beschreibt eine Behandlung tierischen Spermas, die ein reines Magnetfeld anwendet und US 493 0505 beschreibt ein Therapieverfahren, das einen Laser mit einer bestimmten Wellenlänge anwendet.To solve the above problems, attempts have been made to use laser or magnetic irradiation. For example, SU-A-1 724 204 describes the application of irradiation with an infrared laser of a specific wavelength during the processing of animal reproductive sperm; SU-A-731 976 describes a method for improving the fertility of laboratory rodents in which the females are exposed to cm-band radiation; SU-A-1 757 676 describes a method for irradiating chicken embryos with a He-Ne laser of the specific wavelength 632.8 nm; SU-A-1 152 583 describes a treatment method using a pure magnetic field; SU-A-1 402 343 describes a treatment of animal sperm using a pure magnetic field and US 493 0505 describes a therapy method using a laser with a specific wavelength.
Die Erfindung beruht auf den folgenden Erkenntnissen. Sehr wenige Leute haben Forschungen über die Regulierung von Reproduktions- und Wachstumsvermögen von Tieren mit physikalischen Methoden unternommen, insbesondere über die Anwendung physikalischer Verfahren auf die Embryonentechnologie zur Lösung technischer Probleme. Der Erfinder erkannte, dass alle lebende Materie gleichzeitig chemische und physikalische Eigenschaften hat. Die lebende Materie hat besondere physikalische Eigenschaften, wie etwa elektrische Ladung in Zellen etc. Wechselwirkungen zwischen den Substanzen in lebender Materie, die über elektrische Ladungen verfügen und dem elektromagnetischen Feld in der Umgebung können bewirkt werden, wenn das elektromagnetische Feld in der Umgebung und einige wichtige physikalische Eigenschaften lebender Materie dieselben Eigenschaften haben. Die Wechselwirkungen können gleichzeitig die Moleküle, Atome und Elektronen beeinflussen, um deutliche biologische Wirkungen hervorzurufen. Beispielsweise können Gewebe und Zellen in der chemischen und physikalischen Umgebung eines lebenden Körpers normal wachsen und sich entwickeln.The invention is based on the following findings. Very few people have conducted research on regulating the reproductive and growth abilities of animals using physical methods, especially on applying physical methods to embryo technology to solve technical problems. The inventor realized that all living matter has chemical and physical properties simultaneously. Living matter has special physical properties such as electric charge in cells, etc. Interactions between the substances in living matter that have electric charges and the electromagnetic field in the environment can be achieved when the electromagnetic field in the environment and some important physical properties of living matter have the same properties. The interactions can simultaneously affect the molecules, atoms and electrons to produce significant biological effects. For example, tissues and cells can grow and develop normally in the chemical and physical environment of a living body.
Wachstum und Entwicklung von Geweben und Zellen werden deutlich verringert, wenn sie vom lebenden Körper getrennt werden, obwohl viele Arten chemischer Schutzstoffe und Nährstoffe zur Verbesserung der Kulturbedingungen verwendet werden. Der Erfinder erkannte außerdem, dass das Wachstumsvermögen von Geweben und Zellen in Kulturbedingungen durch Anwendung eines simulierten Bio- Spektrums verbessert werden, bei dem es sich um ein schwaches elektromagnetisches Feld handelt. Es hat also eine erhebliche Bedeutung, das simulierte Bio-Spektrum in der Embryonen-Technologie anzuwenden. Das Bio-Spektrum hilft, das Reproduktionsvermögen, die Wachstumsgeschwindigkeit und die Widerstandsfähigkeit der Tiere gegen Krankheiten zu verbessern.Growth and development of tissues and cells are significantly reduced when they are separated from the living body, even though many kinds of chemical protective agents and nutrients are used to improve the culture conditions. The inventor also realized that the growth ability of tissues and cells in culture conditions can be improved by applying a simulated bio-spectrum, which is a weak electromagnetic field. So, it has considerable significance to apply the simulated bio-spectrum in embryo technology. The bio-spectrum helps to improve the reproductive ability, growth rate and resistance to diseases of the animals.
Die Erfindung beabsichtigt, biologische Wirkungen von Bestrahlung durch Anwendung des Bio-Spektrums in der Embryonen-Technologie tierischer Embryonen und auf Tiere herbeizuführen, umfassend:The invention intends to bring about biological effects of irradiation by application of the bio-spectrum in embryo technology of animal embryos and on animals, comprising:
Verbesserung der Reifungsrate von Oozyten, der Fruchtbarkeit in vitro und von Embryonen durch Bestrahlung mit Bio- Spektrum bei der in-vitro-Erzeugung von Embryonen.Improving the maturation rate of oocytes, in vitro fertility and embryos by irradiation with Bio-Spectrum during in vitro embryo creation.
Das oben erwähnte simulierte Bio-Spektrum wird in der chinesischen Patentanmeldung Nr. 91109014.2 beschrieben und ist ein synthetisches physikalisches Breitbandfeld. Seine Wellenlänge beträgt 0,2 um bis 10 cm. Das Bestrahlungssignal ist sehr schwach im Wellenlängenband von 30 um - 10 cm.The simulated bio-spectrum mentioned above is described in Chinese Patent Application No. 91109014.2 and is a synthetic broadband physical field. Its wavelength is 0.2 um to 10 cm. The irradiation signal is very weak in the wavelength band of 30 um - 10 cm.
Einige Teile des physikalischen Feldes können bestimmte Wirkungen hervorrufen.Some parts of the physical field can produce certain effects.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden technischen Lösungen erreicht.The object of the present invention is achieved by the following technical solutions.
Verfahren zur Anwendung von Bio-Spektrum auf die in-vitro- Erzeugung tierischer Embryonen.Method for applying bio-spectrum to the in vitro production of animal embryos.
1. In-vitro-Reifung gewonnener Oozyten: Oozyten, die in ein Standardmedium oder in definiertes Medium gebracht wurden, werden mit einem Bio-Spektrum-Generator 3 bis 20 Minuten lang bestrahlt. In dieser Zeit wird die Temperatur des Mediums auf nicht mehr als 40ºC gehalten.1. In vitro maturation of obtained oocytes: Oocytes placed in a standard medium or in a defined medium are irradiated with a bio-spectrum generator for 3 to 20 minutes. During this time, the temperature of the medium is maintained at no more than 40ºC.
2. Kapazitation von Spermatozoen: Mit einem Standardmedium oder definiertem Medium verdünntes Semen wird mit dem Bio- Spektrum-Generator 3 bis 20 Minuten lang bestrahlt. In dieser Zeit wird die Temperatur des Mediums auf nicht mehr als 40ºC gehalten.2. Capacitation of spermatozoa: Semen diluted with a standard medium or defined medium is irradiated with the Bio-Spectrum Generator for 3 to 20 minutes. During this time, the temperature of the medium is maintained at no more than 40ºC.
3. In-vitro-Fertilisation von Oozyten: Sowohl gereifte Oozyten, als auch kapazitierte Spermatozoen werden zusammen in einem Standardmedium oder definiertes Medium enthaltenden Reagenzglas kultiviert und mit dem Bio-Spektrum-Generator ein- bis dreimal jeweils 3 bis 25 Minuten lang bestrahlt. Während der Bestrahlung beträgt die Temperatur des Mediums nicht mehr als 40ºC.3. In vitro fertilization of oocytes: Both mature oocytes and capacitated spermatozoa are cultured together in a test tube containing standard medium or defined medium and irradiated with the Bio-Spectrum Generator one to three times for 3 to 25 minutes each. During irradiation, the temperature of the medium is not more than 40ºC.
4. In-vitro-Kultur von Embryonen: In ein Standardmedium oder in definiertes Medium übertragene Zygoten werden mit dem Bio-Spektrum-Generator 3 bis 30 Minuten lang bestrahlt. Während der Bestrahlung beträgt die Temperatur des Mediums nicht mehr als 40ºC.4. In vitro culture of embryos: Zygotes transferred into a standard medium or into a defined medium are irradiated with the Bio-Spectrum generator for 3 to 30 minutes. During irradiation, the temperature of the medium does not exceed 40ºC.
Durch Anwendung von Bestrahlung mit Bio-Spektrum bei der Mikromanipulation von Embryonen in vitro konnte die Entwicklungsrate von Hemimorulae und Hemiblastozysten und die Erfolgsrate der Embryoerhaltung erheblich verbessert werden. Durch Anwendung von Bestrahlung mit Bio-Spektrum in der Tierkrankheitskontrolle konnten die Krankheiten gelindert und geheilt werden.By applying bio-spectrum irradiation to the micromanipulation of embryos in vitro, the development rate of hemimorulae and hemiblastocysts and the success rate of embryo preservation could be significantly improved. By applying bio-spectrum irradiation in animal disease control, the diseases could be alleviated and cured.
Die Oozyten werden nach üblichen Verfahren aus Spenderkühen gewonnen und dann zur Reifung in gewöhnliches Medium oder Spezialmedium gegeben. Während der Reifung werden die Oozyten mit der Bio-Spektrum-Vorrichtung (Modell WS-101 D) während 15 Minuten (bei geringer Stärke) bestrahlt. Die Temperatur sollte durch Einstellung des Abstandes zwischen Embryonen-Behälter und Bestrahlungsvorrichtung auf 38-40ºC gehalten werden. Das Spezialmedium wird nach dem Verfahren von Brackett et al. bereitet. Das Rezept des Spezialmediums lautet:The oocytes are collected from donor cows using standard procedures and then placed in ordinary medium or special medium for maturation. During maturation, the oocytes are irradiated with the Bio-Spectrum device (model WS-101 D) for 15 minutes (at low intensity). The temperature should be maintained at 38-40ºC by adjusting the distance between the embryo container and the irradiation device. The special medium is prepared using the method of Brackett et al. The recipe of the special medium is:
Bestandteile g/lComponents g/l
NaCl 6,55NaCl6.55
KCl 0,30KCl 0.30
CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,33CaCl2·2H2O 0.33
NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O 0,11NaH2 PO4 ·H2 O 0.11
MgCl&sub2;·6H&sub2;O 0,11MgCl2·6H2O 0.11
NaHCO&sub3; 3,10NaHCO3 3.10
Glukose 2,25Glucose 2.25
Albumin aus Rinderserum 3,00Albumin from bovine serum 3.00
Natriumpyruvat (oder Pyruvat) 0,14 (oder 0,11) Na-Penicillin 0,031 (50 IE/ml)Sodium pyruvate (or pyruvate) 0.14 (or 0.11) Na-penicillin 0.031 (50 IU/ml)
Das Medium muss durch Filtration sterilisiert werden, nachdem sich die Bestandteile vollständig in 1000 ml Wasser gelöst haben. Dieses Medium muss im Inkubator bei 38ºC und einem CO&sub2;-Gehalt der Luft von 59% äquilibriert werden. Die Osmolalität dieses Mediums beträgt ungefähr 300 mOsm/kg H&sub2;O. Das Spezialmedium wird durch Zusatz von 84 mg NaHCO&sub3; zu 100 ml der so bereiteten Lösung hergestellt. Das m-HIS wird durch Zusatz von 34 mg NaCl zu 10 ml Medium bereitet.The medium must be sterilized by filtration after the components have completely dissolved in 1000 ml of water. This medium must be equilibrated in an incubator at 38ºC and an air CO2 content of 59%. The osmolality of this medium is approximately 300 mOsm/kg H2O. The special medium is prepared by adding 84 mg of NaHCO3 to 100 ml of the solution thus prepared. The m-HIS is prepared by adding 34 mg of NaCl to 10 ml of medium.
Frisches Semen wird zunächst nach dem Verfahren von Brackett et al. behandelt. Semen wird in Spezialmedium vorverdünnt (350 g). Nach Zentrifugieren wird das Sperma- Pellet in m-HIS-Medium resuspendiert und für 15 Minuten in ein Wasserbad von 38ºC gestellt. Nach einer weiteren Zentrifugierung wird das Spermapellet in einem Glas in Spezialmedium resuspendiert, um mit der Bio-Spektrum-Vorrichtung bei geringer Stärke 10 Minuten lang bestrahlt zu werden. Während der Bestrahlung sollte die Temperatur des Mediums durch Einstellung des Abstandes zwischen dem Glas und der Bestrahlungsvorrichtung auf 38-40ºC gehalten werden.Fresh semen is first treated according to the method of Brackett et al. Semen is pre-diluted in special medium (350 g). After centrifugation, the sperm pellet is resuspended in m-HIS medium and placed in a 38ºC water bath for 15 minutes. After another centrifugation, the sperm pellet is resuspended in special medium in a jar to be irradiated with the Bio-Spectrum device at low intensity for 10 minutes. During irradiation, the temperature of the medium should be maintained at 38-40ºC by adjusting the distance between the jar and the irradiator.
Die in vitro gereiften Oozyten und in vitro kapazitiertes Sperma werden zur Bestrahlung während 20 Minuten mit der Bio- Spektrum-Vorrichtung in ein Glas mit Spezialmedium gebracht. Das Glas wird zur Kultivierung während einer Stunde bei 38ºC in den CO&sub2;-Inkubator gesetzt. Danach wird das Glas erneut für 18 Minuten mit Bio-Spektrum bestrahlt und erneut für eine fünfstündige Kultur in den Inkubator gesetzt. Bei der Bestrahlung wird geringe Stärke angewendet und die Temperatur des Mediums durch Einstellung des Abstandes zwischen dem Glas und der Bestrahlungsvorrichtung auf 38-40ºC gehalten.The in vitro matured oocytes and in vitro capacitated sperm are placed in a jar with special medium for irradiation with the Bio-Spectrum device for 20 minutes. The jar is placed in the CO₂ incubator for one hour at 38ºC for cultivation. The jar is then irradiated again with Bio-Spectrum for 18 minutes and placed in the incubator for five hours of culture. The irradiation is low and the temperature of the Medium is maintained at 38-40ºC by adjusting the distance between the glass and the irradiation device.
Vor Kultur im Inkubator werden die in vitro fertilisierten Eier zur Bestrahlung während 25 Minuten mit Bio-Spektrum in Spezialmedium gebracht. Geringe Stärke wird angewandt. Während der Bestrahlung wird die Temperatur des Mediums durch Einstellung des Abstandes zwischen dem Medium-Behälter und der Bestrahlungsvorrichtung auf 38-40ºC gehalten.Before culture in the incubator, the in vitro fertilized eggs are placed in a special medium for irradiation with Bio-Spectrum for 25 minutes. Low strength is used. During irradiation, the temperature of the medium is maintained at 38-40ºC by adjusting the distance between the medium container and the irradiation device.
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