DE69429673T2 - Ein aglukon isoflavon angereichertes pflanzenproteinkonzentrat und ein verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Ein aglukon isoflavon angereichertes pflanzenproteinkonzentrat und ein verfahren zu dessen herstellung

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines Aglucon Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinkonzentrats durch Waschen eines Pflanzenproteinmaterials unter Herstellen eines Pflanzenproteinkonzentrats und Behandeln mit einem oder mehreren beta-Glucosidaseenzymen unter derartigen Bedingungen, daß eine Mehrheit der Glucon Isoflavone zu Aglucon Isoflavonen umgewandelt werden, die in dem angereicherten Proteinkonzentrat zurückgehalten werden.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Isoflavone treten in einer Mannigfaltigkeit von Hülsenpflanzen, einschließlich Pflanzenproteinmaterialien, wie Sojabohnen, auf. Diese Verbindungen schließen ein Daidzin, 6"-OAc Daidzin, 6"-OMal Daidzin, Daidzein, Genistin, 6"-OAc Genistin, 6"-OMal Genistin, Genistein, Glycitin, 6"-OAc Glycitin, 6"-OMal Glycitin, Glycitein, Biochanin A, Formononetin und Coumestrol. Typischerweise sind diese Verbindungen mit dem inhärenten bitteren Aroma von Sojabohnen verbunden, und bei der Herstellung von kommerziellen Produkten, wie Isolaten und Konzentraten ist der Fokus gewesen, diese Materialien zu entfernen. Beispielsweise werden in einem herkömmlichen Verfahren für die Herstellung eines Sojaproteinisolats, in dem Sojaflocken mit einem wäßrigen alkalischen Medium extrahiert werden, viel der Proteine in dem Extrakt löslich gemacht und verbleiben in der Molke löslich gemacht, die üblicherweise im Anschluß an Säurefällung des Proteins unter Bilden eines Isolats verworfen wird. Restliche Isoflavone, zurückbelassen in dem Säure gefällten Proteinisolat, werden üblicherweise durch umfassendes Waschen des Isolats entfernt.
  • Es ist kürzlich erkannt worden, daß die Isoflavone, enthalten in Pflanzenproteinen, wie Sojabohnen, das Wachstum von Humankrebszellen, wie Brustkrebszellen und Prostatakrebszellen, wie in den folgenden Artikeln beschrieben, inhibieren können. "Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells, Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene" von Peterson und Barnes, Biochemical and Biophysical Research, Communications, Band 179, Nr. 1, Seite 661- 667, August 30, 1991; "Geniatein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostate Cancer cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Auto-phosphorylation" von Peterson und Barnes, The Prostate, Band 22, Seite 335-345 (1993), und "Soybeans Inhibit Mammary Tsimots in Models of Breast Cancer" von Bames et al. Mutaeens and Carcinogens in the Diet, Seiten 239-253 (1990).
  • Von den zuvor aufgeführten Isoflavonen existieren einige als Glucoside oder als Glucone, mit einem Glucosemolekül angefügt an der sieben Position, wie in der Formel im nachfolgenden veranschaulicht. Einige der Glucone, wie das 6"-OAc Genistin, enthalten eine Acetatgruppe, angefügt an die sechs Position des Glucosemoleküls selbst. Während alle der Isoflavone, einschließlich der Glucoside, von Interesse in medizinischer Bewertung sind, sind die spezifischen Isoflavone von höchstem Interesse die Aglucone, wo das Glucosemolekül nicht angefügt ist. Diese Isoflavone sind nicht so wasserlöslich wie die Glucone oder Glucoside. Spezifische Isoflavone in dieser Kategorie sind Daidzeln, Genistein und Glycitein. Diese Aglucone haben die folgende allgemeine Formel:
  • wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; ausgewählt werden können aus der Gruppe, bestehend aus H, OH und OCH&sub3;. Die gegenwärtige Erfindung ist deshalb auf die Aglucone und Anreicherung eines Pflanzenproteinkonzentrats mit diesen Materialien gerichtet.
  • Verfahren sind in der Technik zum Umwandeln von Gluconisoflavonen zu Agluconisoflavonen bekannt, wie in Japanischer Patentanmeldung 258 669 von Obata et al. beschrieben. Derartige Verfahren erzielen nur ein mäßiges Ausmaß an Umwandlung und sind somit nicht wünschenswert, insbesondere für kommerzielle Operationen in großem Maßstab. Zusätzlich lehren bekannte Verfahren, wie in der 669 Anmeldung beschrieben, Entfernen der Isoflavone aus dem Proteinmaterial und beschreiben nicht, wie ein Aglucon Isoflavon angereichertes Proteinkonzentrat herzustellen. Somit besteht ein Verlangen nach einem Verfahren zum Umwandeln einer Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen aller Glucon Isoflavone zu Aglucon Isoflavonen und zum Herstellen eines Aglucon Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinkonzentrats.
  • Matsuura et al.: "β Glucosidase from Soybeans Hydrolyse Daidzin and Genistin", Journal of Food Science, Band 58, Nr. 1, 1993, Seite 144-147 offenbart Verwenden von sterilisierter Sojamilch als ein Substrat zum Testen der Aktivität von β-Glucosidase Enzymen. Experimente in dieser Entgegenhaltung zeigen, daß die Isoflavonglucoside Daidzin und Genistin in Sojamilch durch β-Glucosidaseenzyme hydrolysiert werden. In einem Beispiel waren die Prozent Hydrolyse 28% für Daidzin und 29% für Genistin.
  • US-A-4064277 offenbart, daß restliches β-Glucosidaseenzym, enthalten in Vollsojabohnen, mit Glycosidsubstraten unter Bilden von beispielsweise Daidzein und Glycitein reagiert. Diese Entgegenhaltung lehrt, daß Verarbeiten von Sojabohnen, bevor die β-Glucosidase inaktiviert wird, in der Anwesenheit eines konkurrierenden Inhibitors für β-Glucosidase bewirkt werden sollte, um ein Sojabohnenprodukt zur Verfügung zu stellen, daß nicht eine Kehle-fangende Sensation erzeugt.
  • Coward et al.: "Genistein, Daidzein and their β-Glycoside Conjugates: Antitumor Isoflavones in Soybean Foods from American and Asian Diets", Journal of Agricultural Food Chemistry, Band 41, Nr. 1 l, 1993, Seite 1961-1967 offenbart, daß Sojaproteinisolat, hergestellt durch Löslichmachen von Proteinen und löslichen Kohlehydraten aus Sojamehl durch eine alkalische (pH 9,5) Extraktionsstufe und anschließende Säure (pH 4, 5) Fällung des extrahierten Proteins Isoflavon Konzentrationen enthält, die 4-6 fach niedriger als in Sojamehl oder Sojaproteinkonzentrat sind, wenn als Milligramm pro Gramm Protein ausgedrückt.
  • Es ist deshalb eine Aufgabe der gegenwärtigen Erfindung, ein Aglucon Isoflavon angereichertes Proteinkonzentrat und ein Verfahren zum Herstellen dieses zur Verfügung zu stellen. Diese und andere Aufgaben werden im einzelnen in der detaillierten Beschreibung der gegenwärtigen Erfindung, wie im nachfolgendne dargestellt, erzielt.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die gegenwärtige Erfindung liefert ein Aglucon Isoflavon angereichertes Pflanzenproteinkonzentrat und Verfahren zum Herstellen eines derartigen. Die Verfahren zum Herstellen eines derartigen umfassen Waschen eines Pflanzenproteinmaterials, umfassend Gluconisoflavone, mit einem wäßrigen Lösungsmittel mit einem pH bei etwa dem isolektrischen Punkt des Proteinmaterials unter Herstellen eines Pflanzenproteinkonzentrats, umfassend Gluconisoflavone. Die Gluconisoflavone werden dann mit einer ausreichenden Menge von Enzym umgesetzt, das mindestens eines einer beta-Glucosidase und einer Esterase ist, für eine Zeitdauer, Temperatur und pH, ausreichend, eine Mehrheit der Gluconisoflavone in dem Konzentrat zu Aglucon Isoflavonen umzuwandeln und dadurch ein Aglucon Isoflavon angereichertes Proteinkonzentrat herzustellen. Die gegenwärtige Erfindung liefert auch Verfahren zum Herstellen derartiger Konzentrate, wo ergänzende beta-Glucosidase und/oder Esterase zu der Waschung oder Konzentrat hinzugefügt werden. Das sich ergebende Aglucon angereicherte Konzentrat kann dann abgetrennt und entwässert werden. Zusätzlich liefert die gegenwärtige Erfindung Verfahren zum Gewinnen in relativ hohen Anteilen Isoflavone in Proteinkonzentraten aus Pflanzenproteinmaterialien.
    • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Obwohl die gegenwärtige Erfindung im Hinblick auf Sojabohenprodukte beschrieben wird, und obwohl das Verfahren besonders geeignet für die Herstellung von Aglucon Isoflavon angereicherten konzentrierten Sojabohnenmaterialien ist, ist das Verfahren nichtsdestoweniger allgemein anwendbar auf die Herstellung eines Aglucon Isoflavon angereicherten Konzentrats aus einer Mannigfaltigkeit von Pflanzenproteinquellen, die Isoflavone enthalten. Ein Beispiel eines geeigneten Pflanzenproteinmaterials ist ein Sojamaterial, ein Sojabohnenmaterial oder ein Pflanzenproteinmaterial, umfassend Sojabohnen. Der Ausdruck "Sojabohnenmaterial", wie hier verwendet, bezieht sich auf Sojabohnen oder irgendein Sojabohnenderivat.
  • Das Ausgangsmaterial in Übereinstimmung mit dem Konzentrat bevorzugter Ausführungsform ist Sojabohnenflocken, von denen das Öl durch Lösungsmittelextraktion entfernt worden ist. Typischerweise wird ein Sojaproteinkonzentrat hergestellt aus Sojabohnenflocken durch Waschen der Flocken mit einem wäßrigen Lösungsmittel mit einem pH bei etwa dem isoelektrischen Punkt des Proteins, der im Falle von Sojaprotein etwa 4, 4 bis 4,6 ist. Eine eßbare Säure wird typischerweise zu dem Wasser hinzugegeben unter zur Verfügung stellen einer isoelektrischen Waschung für das Sojaproteinmaterial. Die isoelektrische Waschung entfernt eine große Menge von wasserlöslichen Kohlehydraten und anderen Komponenten, aber entfernt wenig des Proteins, wodurch ein Proteinkonzentrat zur Verfügung gestellt wird, das typischerweise einen Proteingehalt auf einer Trockenbasis von etwa 60-75 Gew.-% hat. Die Glucon Isoflavone, enthalten in dem Pflanzenprotein oder Sojamaterial, werden durch isoelektrisches Waschen entfernt. Aber wegen des relativ geringen pH sind die entfernten Mengen geringer als in höheren pH Extraktionen. Deshalb ist es für die Zwecke der bevorzugten Ausführungsform bevorzugt und insofern als maximierende Gewinnung der Isoflavone, daß isoelektrisches Waschen auf eine einzelne Stufe beschränkt ist, oder höchstens eine zusätzliche Waschung durchgeführt wird, auch bei dem isoeleksrischen Punkt. Es ist auch bevorzugt, daß das Gewichtsverhältnis von wäßrigem Lösungsmittel, verwendet zum Waschen des Proteinmaterials, relativ zu der Menge von Proteinmaterial, etwa 5 : 1 bis etwa 10 : 1 beträgt.
  • Das sich ergebende Konzentrat wird in Wasser suspendiert bei einem Feststoffspiegel von etwa 10 bis etwa 15 Gew.-% und dann mit einer oder mehreren beta-Glucosidaseenzymen umgesetzt unter Umwandeln einer Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alles des Gluconisoflavonmaterials, enthalten in dem Konzentrat, zu Aglucon Isoflavonen. Der optimale pH Bereich für das beta- Glucosidaseenzym variiert in Abhängigkeit von dem spezifischen verwendeten beta-Glucosidaseenzym, aber variiert typischerweise zwischen etwa 4 und etwa 8. Der pH des Extrakts wird typischerweise auf etwa den pH Bereich eingestellt, bei dem das spezifische Enzym am aktivsten vor Reaktion mit dem Enzym ist. Der pH wird typischerweise durch die Zugabe einer eßbaren Säure, wie Essig-, Schwefel-, Phosphor-, Salzsäure oder irgendeines anderen geeigneten Reagenzes eingestellt.
  • Das beta-Glucosidaseenzyns kann natürlicherweise in dem Sojabohnenmaterial vorhanden sein oder von mikrobiologischem Wachstum vorhanden sein, hier als "ergänzendes" Enzym bezeichnet, oder kann zu dem Konzentrat hinzugegeben werden. Hinzugefügtes Enzym wird hier als "ergänzendes System" bezeichnet. Allgemein, wenn die Konzentration von restlichem Enzym in dem Konzentrat unzureichend ist, eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alles der Isoflavone in Gluconform zu Agluconform umzuwandeln, dann sollte ergänzendes Enzym hinzugefügt werden. Die Menge von Enzym, ausreichend, die Umwandlung von Isoflavonen durchzuführen, variiert bei einer Vielheit von Faktoren, einschließlich des Typs von vorhandenem Enzym, Verteilung von Enzymkonzentrationen, pH des Systems und Aktivitäten von vorhandenen Enzymen. Sowie einmal ausreichende Konzentrationen von Enzymen vorhanden sind, entweder über restliche Enzyme, ergänzende Enzyme oder beide, wird das Konzentrat mit den beta-Glucosidaseenzymen für eine Zeitdauer, Temperatur und pH umgesetzt, ausreichend, eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alles der Gluconisoflavone, enthalten in dem Konzentrat, zu der Agluconform umzuwandeln.
  • Bevorzugte ergänzende beta-Glucosidaseenzyme schließen Biopectinase 100L und 300L, Biopectinase OK 70L, Lactase F und Lactozyme ein. Lactase F ist erhältlich von Amano International Enzyme Co., Inc. P. O. Box 1000, Troy, VA 22974, welches einen optimalen pH Bereich von etwa 5-6 hat, und Lactozyme ist erhältlich von Novo Industries, Enzyme Divison, Novo Alle, DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark, welches einen optimalen pH Bereich von etwa 7 hat, Biopectinase 100L, Biopectinase 300L tmd Biopectinase OK 70L sind erhältlich von Quest International, Sarasota, Florida. Ergänzende Enzyme werden in Mengen hinzugefügt, ausreichend, eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alles der Glucon Isoflavone zu Agluconen umzuwandeln. In Fällen, wo es notwendig ist, ergänzende Enzyme hinzuzufügen, beträgt die Menge von hinzugefügtem Enzym etwa 0,5% Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% des Proteinkonzentrats auf einer Trockenbasis.
  • Eine andere Klasse von Enzymen, geeignet für Verabreichung als ergänzende Enzyme, sind Esteraseenzyme. Man nimmt von diesen Enzymen an, daß sie gut geeignet für die hier beschriebenen Verfahren der bevorzugten Ausführungsform sind, da sie die Acetat- und Malonatkonjugate zu Gluconisoflavonen umwandeln durch Entfernen der Acetat- und Malonatgruppen von den Isoflavonkonjugaten. In der bevorzugtesten Ausführungsform werden beide Formen von Enzymen, beta- Glucosidase und Esterase Enzyme, verwendet.
  • Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform sind vorzugsweise Einstufen-Verfahren und erzielen sehr hohe Umwandlungsgrade von Isoflavonen (von Gluconform zu Agluconform) in relativ kurzen Zeitdauern und mit relativer Leichtigkeit und Ökonomie. Der Ausdruck "Ein-Stufen" Reaktionsverfahren, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Reaktionsverfahren, bei dem bestimmte Verfahrensparameterwerte allgemein über den Verlauf des Reaktionsverfahrens erhalten bleiben. Diese Verfahrensparameter schließen pH und Temperatur ein.
  • Die sehr hohen Umwandlungsgrade sind derartig, daß eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alles der Isoflavone in Gluconform, vorhanden in dem Konzentrat, zu Agluconform umgewandelt werden. Der Ausdruck "eine Mehrheit" bezieht sich auf Umwandlungsausmaß von Gluconisoflavonen zu Agluconisoflavonen von mindestens 50%. Der Ausdruck "im wesentlichen alles" bezieht sich auf das Umwandlungsausmaß von Gluconisoflavonen zu Agluconisoflavonen von mindestens etwa 80% und am bevorzugtesten bei mindestens etwa 90%.
  • Obwohl es nicht gewünscht ist, durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die überraschenden und unerwartet hohen Umwandlungsgrade der hier beschriebenen Verfahren von einer Kombination von Verfahrensparametern, verwendet während des Ein-Stufen- Reaktionsverfahrens, herrühren. Es ist bevorzugt, daß pH des Reaktionssystems aufrechterhalten bleibt oder annähernd so, bei einem Wert von etwa 4 bis etwa 8, und am bevorzugtesten bei einem Wert, bei dem das (die) Enzyme äußerst aktiv vor Reaktion mit dem (den) Isoflavonkonjugat (en) während des Einstufenreaktiomverfahrens ist (sind). Es ist bevorzugt, daß die Temperatur des Reaktionssystems aufrechterhalten bleibt, oder annähernd so, bei einer Temperatur von etwa 40ºC bis etwa 60ºC, und am bevorzugtesten bei einer Temperatur von etwa 60ºC während des Einstufenreaktionsverfahrens. Im allgemeinen sind die Zeitdauern, notwendig zum Erzielen von Umwandlung von im wesentlichen allen Gluconisoflavonen zu Agluconen über die hier beschriebenen Einstufenverfahren, von etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden.
  • Ein alternatives Verfahren zum zur Verfügung stellen eines Aglucon angereicherten Konzentrats ist, isoelektrisches Waschen und Reaktion mit den beta-Glucosidaseenzymen in eine Einzelstufe zu kombinieren, wobei das Sojaausgangsmaterial in der isoelektrischen Waschung suspendiert wird, und ein oder mehrere beta-Glucosidaseenzyme mit einem optimalen pH bei etwa dem isoelekrischen Punkt, wie Lactase F, wie zuvor beschrieben, wird direkt zu der Aufschlämmung gegeben. Reaktion wird dann unter den zuvor beschriebenen allgemeinen Bedingungen durchgeführt, eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alles der Gluconisoflavone zu Agluconen umzuwandeln. Dieses stellt ein bevorzugtes und vereinfachtes Verfahren dar, ohne zuerst das Material an dem isoelektrischen Punkt zu waschen, unter Entfernen löslicher Kohlehydrate und dadurch Vermeiden von irgendwelchem möglichen Verlust der Isoflavone durch Waschen.
  • Das Proteinkonzentrat kann dann durch herkömmliche Verfahren, einschließlich Zentrifugations- und Trocknungstechniken, entwässert werden unter zur Verfügung stellen eines Konzentrats mit einem Genisteinspiegel auf einer Trockenbasis von etwa 1,0 bis etwa 2,0 mg/g und einem Daidzeinspiegel auf einer Trockenbasis von etwa 0,7 bis etwa 1,5 mg/g.
  • Die gegenwärtige Erfindung liefert auch Verfahren zum Gewinnen von Isoflavonen in einem Proteinkonzentrat in sehr hohen Anteilen aus einem Pflanzenproteinmaterial, wie einem Sojabohnenmaterial. Die Gewinnungsspiegel, erhältlich durch die hier beschriebenen Verfahren, sind typischerweise mindestens 50%, vorzugsweise 65% und am bevorzugtesten 80%, basierend auf dem gesamten aller Formen des bestimmten Isoflavons in dem Ausgangspflanzenproteinmaterial. Obwohl es nicht gewünscht ist, durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die hohen Gewinnungen aus den hier beschriebenen Umwandlungsreaktionen stammen, gekoppelt mit den verschiedenen auch beschriebenen Verarbeitungsvorgängen. Durch Umwandeln von Gluconisoflavonkonjugaten, die relativ löslich sind, zu weniger löslichen Agluconformen bei einer bestimmten Verarbeitungsstufe ist es möglich, in dem sich ergebenden Produkt einen hohen Prozentsatz der Isoflavone aus dem Beschickungsmaterial zu gewinnen.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben spezifische, aber nicht beschränkende Ausführungsformen der gegenwärtigen Erfindung.
    • EXPERIMENTELLES
  • Eine Mischung von 15 g Sojabohnenmehl und 150 g Wasser wurde auf einen pH von 7 eingestellt. 1,5 g Biopectinase 100L wurde zu der Mischung gegeben. Die Mischung wurde bei 60ºC zwei Stunden lang inkubiert, zu welcher Zeit der pH auf 4, 5 eingestellt wurde. Zusätzliche 1 g Biopectinase 100L wurden hinzugegeben, und die sich ergebende Mischung wurde zwei Stunden inkubiert. Nach Inkubation wurde das sich ergebende Aglucon Isoflavon angereicherte Protein/Faser Konzentrat gewonnen. Gewinnung von Isoflavonen in dem Protein/Faser Konzentrat ist in Tabelle 1, im nachfolgenden aufgeführt, berichtet. TABELLE 1
  • Diese Daten zeigen den Umwandlungsgrad an, erzielbar durch eine Kombination von restlichem(en) Enzym(n) und ergänzendem Enzym. Signifikante Umwandlung von Isoflavonkonjugaten zu Agluconen trat auf, insbesondere für Genistein und Daidzein. Die Konzentration jedes Typs von hier beschriebenem Isoflavon basiert auf dem Gesamten aller Formen jenes Isoflavontyps.
  • In einer weiteren Serie von Experimenten wurden die Prozent Gewinnung von Genistein und Daidzein in einem Proteinkonzentrat, abstammend von Sojabohnen, untersucht. Der Prozentsatz Gewinnung wurde festgestellt durch Bestimmen der Menge von Genistein (oder Daidzein) in dem Isolat und Ausdrücken jener Menge als einen Prozentsatz, basierend auf der Gesamtmenge aller Formen von Genistein (oder Daidzein) in dem Sojabohnenausgangsmaterial. 100 g entfettetes Sojamehl wurde zu 1600 g Wasser hinzugefügt, das auf einen pH von 4, 5 durch die Zugabe von Salzsäure eingestellt worden war. Die Aufschlämmung wurde auf 50ºC erhitzt, und 2%, bezogen auf Trockengewicht, des Quarks eines Enzyms mit bets-Glucosidase Aktivität, insbesondere Lactase F, wurden hinzugegeben. Man ließ die Aufschlämmung 16 Stunden bei 50ºC reagieren unter Gewährleisten vollständiger Umwandlung der Gluconisoflavone zu der Agluconform. Das Proteinkonzentrat wurde von dem wäßrigen Lösungsmittel durch Zentrifugation unter Bilden eines Aglucon angereicherten Konzentrats getrennt. Weiteres Waschen des Konzentrats wurde vermieden. Die Menge von Genistein, gewonnen in der Isolierung, betrug 82% des Gesamten aller Formen von Genistin und Genistein in dem Ausgangssojabohnenmaterial (entfettetes Sojamehl). In ähnlicher Weise war die Menge von Daidzein, gewonnen in dem Isolat, 64%.
  • Das folgende ist eine Beschreibung eines Verfahrens zum mengenmäßigen Bestimmen von Isoflavonen in Sojaprodukten. Die Isoflavone werden aus Sojaprodukten extrahiert durch Mischen von 0,75 g Probe (sprühgetrocknetes oder fein gemahlenes Pulver) mit 50 ml 80/20 Methanol/Wasser Lösungsmittel. Die Mischung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einem Orbitalschüttler geschüttelt. Nach 2 Stunden werden die verbleibenden ungelösten Materialien durch Filtration durch Whatman Nr. 42 Filterpapier entfernt. Fünf ml des Filtrats werden mit 4 ml Wasser und 1 ml Methanol verdünnt.
  • Die extrahiererten Isoflavone werden durch HPLC (Hochleismngsflüssigkeitschromatographie) unter Verwenden einer Beckman C18 Umkehrphasensäule getrennt. Die Isoflavone werden auf die Säule eingespritzt und mit einem Lösungsmittelgradienten, beginnend mit 88% Methanol, 18??% Wasser und 2% Eisessig und endend mit 98% Methanol und 2% Eisessig, getrennt. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml/Min werden alle die Isoflavone - Genistin, 6"-O-Acetylgenistin, 6"-O-Malonylgenistin, Genistein, Daidzin, 6"-O-Acetyldaidzin, 6"-O-Malonyldaidzin, Daidzin, Glycitin und dessen Derivate und Glycitein deutlich aufgelöst. Peaknachweis ist durch UV Absorption bei 262 nm. Identifizierung des Peaks war durch Massenspektrometer.
  • Mengenmäßige Bestimmung wird erzielt durch Verwenden reiner Standards (Genistin, Genistein, Daidzin und Daidzein), gekauft von Indofine Chemical Company, Sommerville, NJ. Reaktionsfaktoren (integrierter Bereich/Konzentration) werden für jede der zuvor angegebeben Verbindungen berechnet und werden verwendet, mengenmäßig unbekannte Proben zu bestimmen. Für die konjugierten Formen, für die keine reinen Standards verfügbar sind, werden Reaktionsfaktoren angenommen, dasjenige des Elternmoleküls zu sein, aber in bezug auf Molekulargewichtunterschied korrigiert. Der Reaktionsfaktur für Glycitin wird angenommen, derjenige dir Genistin, korrigiert in bezug auf Molekulargewichtunterschied, zu sein.
  • Dieses Verfahren liefert die Mengen jedes einzelnen Isoflavons. Aus Bequemlichkeit können Gesamtgenistein, Gesamtdaidzein und Gesamtglycitein aus den zuvor angegebenen Daten berechnet werden und stellen das Aggregatgewicht dieser Verbindungen dar, wenn alle die konjugierten Formen in ihre enstprechenden unkonjugierten Formen umgewandelt werden. Diese Gesamtmengen können auch direkt durch ein Verfahren unter Verwenden saurer Analyse unter Umwandeln der konjugierten Formen gemessen werden.

Claims (23)

1. Verfahren zum Herstellen eines Aglucon Isoflavon angereicherten Proteinkonzentrats aus einem Pflanzenproteinmaterial, umfassend
(a) Waschen von Pflanzenproteinmaterial, umfassend Glucon Isoflavone, mit einem wäßrigen Lösungsmittel mit einem pH bei etwa dem isoelektrischen Punkt des Pflanzenproteinmaterials unter Herstellen eines Pflanzenproteinkonzentrats, umfassend Glucon Isoflavone, und
(b) Umsetzen der Glucon Isoflavone mit einer ausreichenden Menge von Enzym, das mindestens eines einer beta-Glucosidase und einer Esterase ist, für eine Zeitdauer, Temperatur und pH, ausreichend, eine Mehrheit der Glucon Isoflavone in dem Konzentrat zu Aglucon Isoflavonen umzuwandeln, wodurch ein Aglucon Isoflavon angereichertes Proteinkonzentrat hergestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1; wobei die Zeitdauer 2 Stunden bis 24 Stunden beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zeitdauer 24 Stunden beträgt.
4. Verführen nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Temperatur 40ºC bis 60ºC beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Temperatur 60ºC beträgt.
6. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der pH in Stufe (b) 4 bis 8 beträgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der pH in Stufe (b) 4, 5 beträgt.
ä. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei Waschen des Pflanzenproteinmaterials und Umsetzen der Glucon Isoflavone mit beta-Glucosidase in einem Vorgang durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Aglucon Isoflavon angereicherte Proteinkonzentrat aus Sojabohnen hergestellt wird.
10. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Pflanzenproteinmaterial ein Sojabohnenmaterial umfaßt.
11. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei mindestens 80% der Glucon Isoflavone zu Aglucon Isoflavonen umgewandelt werden.
12. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Enzym restliches Enzym ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Enzym Ergänzungsenzym ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Enzym aus sowohl Ergänzungs- wie restlichem Enzym besteht.
15. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der pH in Stufe (b) bei einem Wert ist, bei dem das Enzym am aktivsten vor Reaktion mit den Isoflavonen ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der pH in Stufe (b) bei einem Wert ist, bei dem das restliche Enzym am aktivsten vor Reaktion mit den Isoflavonen ist.
17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der pH in Stufe (b) bei einem Wert ist, bei dem das Ergänzungsenzym am aktivsten vor Reaktion mit den Isoflavonen ist.
18. Verfahren zum Gewinnen in einem Proteinkonzentrat mindestens 50% eines Isoflavons in einem Pflanzenproteinmaterial, umfassend:
(a) Waschen eines Pflanzenproteinmaterials, umfassend Isoflavone, mit einem wäßrigen Lösungsmittel mit einem pH um etwa den isoelektrischen Punkt des Pflanzenproteinmaterials unter Herstellen eines Pflanzenproteinkonzentrats, umfassend die Isoflavone,
(b) Umsetzen der Isoflavone mit einer ausreichenden Menge von Enzym, das mindestens eines einer beta-Glucosidase und einer Esterase ist, für eine Zeitdauer, Temperatur und pH, ausreichend, eine Mehrheit der Isoflavone in dem Konzentrat zu weniger löslichen Isoflavonen umzuwandeln, und dadurch ein Isoflavon angereichertes Proteinkonzentrat herzustellen, das mindestens 50% der Isoflavone in dem Pflanzenproteinmaterial enthält.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Konzentrat mindestens 65% der Isoflavone in dem Pflanzenproteinmaterial enthält.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Konzentrat mindestens 80% der Isoflavone in dem Pflanzenproteinmaterial enthält.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20 in Übereinstimmung mit einem der vorhergehenden Ansprüche.
22. Isoflavon angereichertes Proteinkonzentrat, hergestellt durch ein Verfahren gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch.
23. Aglucon Isoflavon angereichertes Proteinkonzentrat, welches auf einer Trockenbasis einen Genisteingehalt von 1,0 bis 2,0 mg/Gramm und einen Daidzein Gehalt von 0,7 bis 1,5 mg/Gramm hat.
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