DE69421619T2

DE69421619T2 - Phosphattest

Info

Publication number: DE69421619T2
Application number: DE69421619T
Authority: DE
Inventors: Martin Brune; John Corrie; Martin Webb
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1993-07-16
Filing date: 1994-07-15
Publication date: 2000-03-09
Anticipated expiration: 2014-07-16
Also published as: ATE186600T1; US5898069A; WO1995002825A1; EP0715721B1; EP0715721A1; AU7190894A; DE69421619D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Detektion und Quantifizierung von anorganischem Phosphat, insbesondere in biologischen Lösungen. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein modifiziertes Phosphat-bindendes Protein und die Verwendung eines solchen Proteins in einem Phosphat-Test.
In biologischen Systemen sind Änderungen im Phosphorilierungsstatus und Schwankungen in der Konzentration von anorganischem Phosphat mit einer großen Anzahl wichtiger Ereignisse assoziiert. Beispielsweise zeigt eine Anzahl von Krankheiten und Zuständen erhöhte oder verringerte Pegel anorganischer Phosphat- Konzentration im Serum. Darüber hinaus wird der Hauptenergiebedarf des Körpers durch Energiegewinnung aus Veränderungen im Phosphorilierungsstatus von Nukleotiden gedeckt.
Weil anorganisches Phosphat (Pi) an einer großen Anzahl wichtiger biologischer Prozesse beteiligt ist, ist es wünschenswert, die Konzentration von Pi und die Veränderungen dieser Konzentration in biologischen Systemen messen zu können. Phosphat- Tests, die Pi-Konzentration messen, sind in einer Vielzahl diagnostischer Verfahren ebenso nützlich bei der Erforschung der Funktion biologischer Systeme.
Bis heute wurden zwei Klassen von Phosphat-Tests beschrieben. Dies sind enzymatische Tests für anorganisches Phosphat und chemische Tests für anorganisches Phosphat. Siehe beispielsweise Lindberg und Ernster, 1956 und Veldhoven und Mannaerts, 1987.
Enzymatische Phosphat-Tests, wie sie beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung 0 159 513 beschrieben sind, basieren auf einem Phosphat-benötigendem Enzym, häufig einer Phosphorylase. In dem in der EP 0 159 513 beschriebenen Verfahren wird eine Purinnukleosid-Phosphorylase verwendet, um ein Nukleosid (Inosin) in Ribose-1-Phosphat und eine Base, in diesem Fall Hypoxanthin, umzuwandeln. Hypoxanthin wird dann in ein farbiges Agens umgewandelt, aus dem das von der Pi-Konzentration abhängige Ausmaß der Inosin-Umwandlung bestimmt werden kann.
Ein weiterer, auf einer Purinnukleosid-Phosphorylase basierender Test ist in Webb, 1992a beschrieben.
Enzymatische Phosphat-Tests neigen dazu, relativ unempfindlich zu sein. Beispielsweise kann das von Webb beschriebene Verfahren nicht unter Konzentrationen von 2 mikromolar Pi verwendet werden. Darüber hinaus bleiben enzymatische Phosphat-Tests, obwohl sie schneller sind als chemische Phosphat-Tests, zu langsam, um die Untersuchung der Kinetiken vieler biologischer Systeme zu erlauben.
Chemische Phophat-Tests, wie sie beispielsweise von Veldhoven und Mannaerts (1987) beschrieben wurden, beruhen auf der chemischen Erzeugung von Farbe, nachdem sie Phosphat ausgesetzt wurden. Beispielsweise basieren viele chemische Verfahren auf der Komplex-Bildung von Phosphomolybdat bei niedrigem pH mit basischen Farbstoffen, was eine Verschiebung im Absorptionsmaximum dieser Farbstoffe bewirkt. Die Farbänderung wird durch Spektrophotometrie gemessen.
Chemische Verfahren haben den Nachteil, daß sie extrem langsam sind, obwohl große Empfindlichkeit erreicht werden kann. Beispielsweise beansprucht das Verfahren von Veldhoven und Mannaerts, daß es bis 1,5 mikromolar Pi sensitiv ist, um Pikomol- Mengen von Pi zu detektieren.
Die Universalität von Phosphat in biologischen Systemen und das extrem häufige Vorkommen von Phosphat-Kontamination in Labor- Lösungen machen die Entwicklung von Phosphat-Tests relativ unwichtig, die unterhalb des mikromolaren Konzentrationsbereichs sensitiv sind. Es bleibt jedoch wünschenswert, Phosphat-Tests herstellen zu können, die eine extrem schnelle Ansprechgeschwindigkeit aufweisen, um die Kinetiken biologischer und chemischer Prozesse zu überwachen, die die Erzeugung oder den Verbrauch von Pi umfassen.
Es sind eine Vielzahl von Proteinen bekannt, die spezifisch an Pi binden. Beispielsweise wird der Transport von Pi in Zellen und Organellen hinein und aus diesen heraus durch spezifische Transport-Proteine bewirkt. In Bakterienzellen wird dies durch ein hochaffines Transport-System erreicht, das von einem Phosphat-bindenden Protein abhängt. Solche Proteine sind in der Lage, spezifisch anorganisches Phosphat zu erkennen, an es zu binden und es durch Zellmembranen hindurch oder zwischen Zell- Kompartimenten zu transportieren.
Ein Beispiel für ein solches Protein ist das E.coli-Phosphatbindende Protein (PBP), das durch das phoS-Gen von E.coli kodiert wird. Dieses Protein ist im Periplasma von E.coli als Teil des Pi-einfangenden Systems des Bakteriums lokalisiert, das unter Bedingungen von Pi-Mangel arbeitet. Daher ist seine Bindungs-Affinität für Pi extrem hoch.
Das phoS-Gen wurde kloniert und sequenziert (Magota et al., 1984, Surin et al., 1984). Darüber hinaus wurde festgestellt, daß PBP Pi fest bindet (Medveczky und Rosenberg, 1970) und die Kristallstruktur der Pi-gebundenen Form wurde mit hoher Auflösung aufgeklärt (Luecke und Quiocho, 1990). Diese Untersuchungen haben gezeigt, daß PBP aus einem monomeren Protein von 35 kD besteht, das in zwei Domänen aufgeteilt ist, zwischen denen eine Pi-bindende Spalte liegt. Es wird postuliert, daß sich die Pi-bindende Spalte bei Pi-Bindung und -Freisetzung zwischen einer offenen und einer geschlossenen Stellung bewegt.
Obwohl dieses Protein extrem sensitiv gegenüber Pi ist, ist nicht bekannt, ob es nach Pi-Bindung irgendein schnell detektierbares Ereignis auslöst. Dementsprechend ist PBP nicht in Phosphatbindungstests genutzt worden.
Weitere Beispiele von Pi-Transport-Proteinen sind in einer Übersicht von Torriani (1990) dargestellt.
Eine zweite Klasse Pi-bindender Proteine umfaßt verschiedene Membran-Proteine, die ebenfalls am Pi-Transport beteiligt sind. Ein Beispiel für ein solches Protein ist das Bürstensaum- Membranprotein (Kessler et al., 1986).
Eine dritte Klasse Pi-bindender Proteine umfaßt Pi-bindende Enzyme. Obwohl viele Enzyme Pi schwach binden, ist von einigen bekannt, daß sie Pi stark binden. Obwohl Pi-bindende Enzyme - wie oben erwähnt - in Pi-Tests verwendet wurden, sind die verwendeten Verfahren durch ein zu langsames Ansprechen gekennzeichnet, um die Untersuchung der Kinetiken vieler biologischer Systeme zu ermöglichen.
In der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, daß eine Modifikation von Phophat-bindendem Protein, um daran eine lumineszierende Markierungssubstanz anzufügen, zu einem modifizierten Phosphat-bindenden Protein führt, das hochsensitiv gegenüber Pi ist und eine extrem schnelle Verschiebung von Lumineszenz- Charakteristiken erzeugt, wenn Pi gebunden wird. Das modifizierte Protein kann bei einem extrem schnellen Phosphat-Test verwendet werden, der die Kinetiken biologischer Reaktionen verfolgen kann, an denen Phosphat beteiligt ist, sowie bei herkömmlichen Pi-Tests, wie beispielsweise klinischen Tests, und beim Untersuchen von Umweltverschmutzung.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher ein modifiziertes Phosphat-bindendes Protein bereitgestellt, das zumindest eine detektierbare Markierungssubstanz aufweist.
Das Phosphat-bindende Protein ist modifiziert, so daß es eine detektierbare Markierungssubstanz umfaßt, deren detektierbare Charakteristiken sich bei einer Änderung in der Protein- Konformation ändern, die bei Pi-Bindung stattfindet. Die Änderung in den detektierbaren Charakteristiken ist durch eine Veränderung in der Umgebung der Markierungssubstanz bedingt, die an das Phosphat-bindende Protein gebunden ist.
Vorzugsweise ist die Markierungssubstanz daher an einen Bereich des Phosphat-bindenden Proteins gebunden, der eine Konformationsänderung durchläuft, wenn Pi bindet. Es versteht sich jedoch, daß eine Veränderung in der Umgebung der Markierungssubstanz, die aus einer Konformationsänderung in einem Bereich des Proteins herrühren kann, an den die Markierungssubstanz nicht direkt gebunden ist, für die Veränderung in den Lumineszenz-Charakteristiken der Markierungssubstanz verantwortlich ist.
Das erfindungsgemäß modifizierte Phosphat-bindende Protein kann jedes beliebige Phosphat-bindende Protein sein, insbesondere aber Phosphat-bindende Proteine, die an aktiven Transport- Systemen beteiligt sind, die Pi in Zellen und Zellkompartimente hinein und aus diesen heraus transferieren.
Besonders bevorzugt ist das E.coli phos-Phosphat-bindende Protein. Vorzugsweise ist die Markierungssubstanz in der Nachbarschaft der bindenden Spalte des E.coli PBP angefügt, die bei Pi-Bindung eine Konformationsänderung durchläuft.
Vorzugsweise ist die detektierbare Markierungssubstanz eine lumineszierende Markierungssubstanz. Die Verwendung anderer Markierungssubstanzen ist jedoch ins Auge gefaßt. Beispielsweise könnten elektrochemische Markierungssubstanzen verwendet werden, wobei eine Veränderung in der Umgebung der Markierungssubstanz eine Änderung in deren Redox-Zustand hervorruft. Eine solche Änderung kann unter Verwendung einer Elektrode detektiert werden.
Darüber hinaus ist ins Auge gefaßt, daß spektroskopisch detektierbare Markierungssubstanzen verwendet werden können, die beispielsweise durch EPR oder NMR detektierbar sind.
Die Markierungssubstanz kann an das Phosphat-bindende Protein durch jedes beliebige herkömmliche, im Fachgebiet bekannte Mittel angefügt werden. Beispielsweise kann die Markierungssubstanz über Amine und Carboxyl-Reste an dem Protein angefügt werden. Besonders bevorzugt ist jedoch die Verknüpfung über Thiolgruppen an Cystein-Resten.
Natürliche Cystein-Reste in der Sequenz des Phosphat-bindenden Proteins können für das Anfügen der Markierungssubstanz verwendet werden, wenn sie geeignet sind. Wo jedoch keine natürlichen Cystein-Reste zum Anfügen der Markierungssubstanz verfügbar sind, können Cystein-Reste in die Sequenz des Phosphat- bindenden Proteins, vorzugsweise durch stellenspezifische Mutagenese eingebaut werden.
Stellenspezifische (site directed) Mutagenese wird durch Verfahren durchgeführt, die im Fachgebiet zu diesem Zweck gut bekannt sind. Jedoch kurz dargestellt, isoliert und sequenziert man das Gen, das für das Phosphat-bindende Protein kodiert, und konstruiert Oligo-Nukleotid-Sonden, um durch Rekombination das Codon, das für die Aminosäure kodiert, die man ändern möchte, in ein für Cystein kodierendes Codon umzuändern. Das mutierte Gen wird anschließend typischerweise in einem Bakterienexpressionssystem exprimiert, um das mutierte Protein herzustellen.
Vorzugsweise ist die Markierungssubstanz an einen Cystein-Rest an dem Protein über eine Bindungsgruppe angefügt, die Thiolreaktiv ist.
Jede beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Thiolreaktive Bindungsgruppe kann verwendet werden. Beispielsweise kann ein Iodacetamid-Linker verwendet werden.
Vorzugsweise umfaßt die Bindungsgruppe einen Maleimid-Linker.
Die lumineszierende Markierungssubstanz kann eine fluoreszierende Markierungssubstanz oder eine phosphoreszierende Markierungssubstanz sein. Bevorzugt ist die Verwendung fluoreszierender Markierungssubstanzen, die zum Fluoreszieren angeregt werden können, indem sie bestimmten Wellenlängen des Lichts ausgesetzt werden.
Vorzugsweise ist die fluoreszierende Markierungssubstanz aus der Gruppe ausgewählt, die aus Acrylodan, Cumann, Dansylaziridin, Dimethylaminonaphthalinsulfonamid und Derivaten davon besteht.
Vorzugsweise basiert die Markierungssubstanz auf Cumann. Besonders bevorzugt sind 7-Diethylamino-3-[4'-(1- maleimidyl)phenyl]-4-methylcumarin (CPM) und N-[2-(1- Maleimidyl)ethyl]7-diethylaminocumarin-3-carboxamid (MDCC).
Verwendet man E.coli phoS PBP, ist die bevorzugte Anfügungsstelle für die Markierungssubstanz der Alanin-Rest an Position 197 in der Aminosäuresequenz von PBP (A197). Wie in Magota et al. (1984) gezeigt, ist A197 an Position 197, gezählt vom N- Terminus des reifen PBP, lokalisiert. Vorzugsweise ist daher A197 in Cystein umgeändert. Vorzugsweise ist CPM oder MDCC an den Cystein-Rest gebunden.
Die detektierbare Markierungssubstanz zeigt bei Pi-Bindung vorzugsweise eine Zunahme in ihren detektierbaren Charakteristiken. Vorteilhafterweise wird diese Zunahme in der Größenordnung von 50% oder darüber liegen.
Es wird ins Auge gefaßt, daß Veränderungen in den detektierbaren Charakteristiken von Markierungssubstanzen besser ausgenutzt werden können, wenn zwei Markierungssubstanzen verwendet werden, so daß eine Konformationsänderung des Phosphat- bindenden Proteins bewirkt, daß sich die Markierungssubstanzen im Verhältnis zueinander bewegen, wobei die Übertragung beispielsweise von Lumineszenzenergie verändert wird. Vorzugsweise weist das erfindungsgemäße modifizierte Phosphat-bindende Protein daher mehr als eine detektierbare Markierungssubstanz auf.
Gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Detektieren von anorganischem Phosphat in einer Probe bereitgestellt, mit den Schritten:
(A) Man läßt beliebiges Phosphat in der Probe an ein zumindest eine detektierbare Markierungssubstanz aufweisendes modifiziertes Phosphat-bindendes Protein binden, und
(B) detektiert eine Änderung in den detektierbaren Eigenschaften der Markierungssubstanz oder Markierungssubstanzen und setzt diese Änderung zu der vorhandenen Phosphat-Konzentration ins Verhältnis.
Vorzugsweise wird ein "Phosphat-Mop" verwendet, um die Hintergrund-Pegel von Pi zu reduzieren und Pi langsam von dem Phosphat-bindenden Protein zu entfernen, wobei die Bindungsstelle somit frei hinterlassen wird, um weiter Pi zu detektieren, das in das Test-System abgegeben werden kann. Dies stellt sicher, daß die Pi-Bindung durch das Phosphat-bindende Protein vorübergehend ist. Permanente Bindung würde die nutzbare Lebensdauer eines Test-Systems reduzieren, weil schließlich alle Bindungsstellen des Phosphat-bindenden Proteins besetzt werden würden.
Vorteilhafterweise ist der Phosphat-Mop ein enzymatisches System. Bevorzugt ist ein 7-Methylguanosin- und Purin-Nukleosid- Phosphorylase-System.
Es wurde beobachtet, daß es durch Anwendung dieses Verfahrens unter Verwendung eines erfindungsgemäß modifizierten Phosphat- bindenden Proteins bedingt durch die extrem schnelle Reaktionszeit des Verfahrens möglich ist, die Kinetiken biologischer Systeme zu verfolgen.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein erfindungsgemäßes modifiziertes Phosphat-bindendes Protein zur Verwendung in der Messung von anorganischem Phosphat bei der Diagnose einer Krankheit bereitgestellt.
Die Erfindung kann verwendet werden, um anorganisches Phosphat bei Diagnoseverfahren zu bestimmen, die in vitro oder in vivo im menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt werden.
Die Erfindung ist in den folgenden Beispielen nur zum Zweck der Illustration beschrieben.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt die Strukturen von CPM und MDCC;
Fig. 2 zeigt die Fluoreszenz-Emissionsspektren von MDCC-PBP in Gegenwart und Abwesenheit von Pi. Zu 3,2 uM MDCC-PBP in 10 mM PIPES, 1 mM MgCl&sub2; (pH 7,0) bei 22ºC wurde Pi zu 50 uM zugesetzt;
Fig. 3 zeigt die Korrelation zwischen der Fluoreszenz- Zunahme und der [Pi], die zu dem MDCC-PBP zugesetzt wurde.
Die Lösung enthielt bei 20ºC 5 um MDCC-PBP, 1 mM MgCl&sub2;, 10 mM PIPES pH 7.0. Aliquots von Pi wurden zugesetzt und die Fluoreszenzemission wurde bei 465 nm mit Anregung bei 425 nm gemessen. Die Daten wurden bezüglich des geringen Betrags der Verdünnung korrigiert;
Fig. 4 zeigt eine Titration von Pi zu MDCC-PBP, um die Dissoziationskonstante zu erhalten.
Die Lösung enthielt bei 25ºC 0,28 uM MDCC-PBP in 10 mM PIPES, pH 7.0, 1 mM MgCl&sub2;. Aliquots von Pi wurden zugesetzt und die Fluoreszenzemission wurde wie in Fig. 3 gemessen. Die Daten wurden an ein einfaches Bindungsmodell näherungsweise angepaßt und die Linie zeigt die beste Anpassung, Kd = 0,03 uM, obwohl alle Werte < 0,1 uM gut passen, und die maximale Fluoreszenz- Zunahme beträgt 415%;
Fig. 5 zeigt einen Zeitverlauf der Pi-induzierten Fluoreszenz-Änderung unter Verwendung des Pi-Mops zum Wiedergewinnen von ungebundenem MDCC-PBP.
Die Lösung enthielt 10 uM MDCC-PBP, 1 mM 7-Methylguanosin und 0,5 Einheiten ml&supmin;¹ Purinnukleosid-Phosphorylase in 10 mM PIPES pH 7,0, 1 mM MgCl&sub2; bei 25ºC. Aliquots von Pi (zu 5 uM) wurden wie durch die Pfeile angezeigt, in Zeitintervallen zugesetzt, die für den Pi-Mop ausreichend waren, um Pi aus dem MDCC-PBP zu entfernen und die Fluoreszenz-Emission wurde wie in Fig. 3 gemessen;
Fig. 6 zeigt die Kinetiken von Pi-Bindung an MDCC-PBP und von dessen Freisetzung.
A. 0,1 uM MDCC-PBP (Mischkammer-Konzentration) in 10 mM PIPES, pH 7,0 wurde bei 21ºC schnell mit unterschiedlichen Konzentrationen von Pi in diesem Puffer in einer "Stopped-Flow- Apparatur" gemischt, während die Fluoreszenz-Emission unter Verwendung eines 455 nm Kantenfilters mit Anregung bei 436 nm unter Verwendung einer Quecksilberlampe beobachtet wurde. Die Kurve zeigt einen Zeitverlauf mit 0,25 uM Pi. Das Signal hatte ein Zeitmittelwert bildendes Filter von < 0,1 · Halbwertszeit. Die anfängliche Verzögerung lag innerhalb der Totzeit der Apparatur. Die am besten passende einfache Exponentialgröße (65,3 s&supmin;¹) ist durch die gestrichelte Linie dargestellt, die nahezu vollständig durch die experimentelle Kurve verdeckt ist.
B. Die Freisetzungskinetiken wurden durch schnelles Mischen von 0,125 uM Pi, 0,25 uM MDCC-PBP mit 10 uM Wild-Typ-PBP (Mischkammer-Konzentrationen) bei 22ºC gemessen. Andere Bedin gungen waren wie oben. Die am besten passende einfache Exponentialgröße (21,4 s&supmin;¹) ist durch die gestrichelte Linie dargestellt, die nahezu vollständig durch die experimentelle Kurve verdeckt ist;
Fig. 7 zeigt die durch MDCC-PBP-Fluoreszenz beobachteten Kinetiken der Pi-Freisetzung von Actomyosin-Unterfragment 1 bei niedriger [ATP].
Alle Lösungen in 10 mM PIPES, 1 mM MgCl&sub2;, pH 7,0 wurden in einer "Stopped-Flow-Apparatur" gemischt und wie in Fig. 6 beobachtet. Die folgenden Konzentrationen sind diejenigen in den Spritzen: Die Mischkammer-Konzentrationen sind halb so groß wie die angegebenen. A. Beide Spritzen enthielten 100 uM 7-Methylguanosin, 0,02 Einheiten ml&supmin;¹ Phosphorylase. Lösung 1: 16 uM Myosin Unterfragment 1 und 18 uM MDCC-PBP. Lösung 2: 5 uM ATP. Die am besten passende Exponentialgröße ist ebenfalls gezeigt, k = 0,0875 s&supmin;¹ (nahezu vollständig durch die experimentelle Linie verdeckt). B. Lösung 1: 18 uM MDCC-PBP, 8 uM Unterfragment 1, 100 uM MEG, 0,02 Einheiten ml&supmin;¹ Phosphorylase. Lösung 2: 8 uM ATP, 116 uM Actin, 500 uM MEG, 3 Einheiten ml&supmin;¹ Phosphorylase. Die durch das im Text beschriebene Modell vorhergesagte Pi-Freisetzung ist durch die untere gestrichelte Linie (teilweise durch die experimentelle Linie verdeckt) dargestellt. Die obere gestrichelte Linie zeigt zum Vergleich das theoretische Gesamt-Pi (gebunden und freigesetzt);
Fig. 8 zeigt die Geschwindigkeit von Actomyosin- Unterfragment-1-ATPase als eine Funktion der Actin-Konzentration.
Die Geschwindigkeiten sind für die am besten für Kurven unter den Bedingungen in Fig. 7 passenden Exponentialgrößen: niedriges ATP:Unterfragment 1-Verhältnis. Die am besten passende Kurve ergibt eine Bindungskonstante von 26 uM und die maximale Exponential-Geschwindigkeit = 15,2 s&supmin;¹. Die Kreise und Quadrate repräsentieren unterschiedliche Meßreihen mit unterschiedlichen Proteinpräparationen;
Fig. 9 zeigt die durch MDCC-PBP-Fluoreszenz beobachteten Kinetiken der Pi-Freisetzung von Actomyosin-Unterfragment 1 bei hoher [ATP].
Die Reaktion wurde, wie auf den Kurven angegeben, bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Alle Lösungen in 10 mM PIPES, 1 mM MgCl&sub2;, pH 7.0 wurden in einer "Stopped-Flow-Apparatur" gemischt und wie in Fig. 6 beobachtet. Die folgenden Konzentrationen sind diejenigen in den Spritzen. Für Experimente bei 22, 15 und 10ºC: Lösung 1: 18 uM MDCC-PBP, 4 uM Unterfragment 1, 100 uM MEG, 0,02 Einheiten ml&supmin;¹ Phosphorylase. Lösung 2: 200 uM ATP, 90 uM Actin, 500 uM MEG, 0,1 Einheiten mit Phosphorylase. Für das Experiment bei 5ºC: Lösung 1 : 9 uM MDCC- PBP, 4 uM Unterfragment 1, 100 uM MEG, 0,02 Einheiten ml&supmin;¹ Phosphorylase. Lösung 2: 9 uM MDCC-PBP, 200 uM ATP, 90 uM Actin, 500 uM MEG, 3 Einheiten ml&supmin;¹ Phosphorylase. Die durch das im Text beschriebene Modell, aber unter der Annahme einer aktiven [Unterfragment 1] von 1,85 uM, vorhergesagte Pi- Freisetzung bei 22ºC ist durch die untere gestrichelte Linie (teilweise durch die experimentelle Linie verdeckt) dargestellt. Die obere gestrichelte Linie zeigt zum Vergleich das theoretische Gesamt-Pi;
Fig. 10 zeigt die Titration von Pi zu CPM-PBP;
Fig. 11 zeigt Acrylamid-Löschung von CPM-PBP-Fluoreszenz;
Fig. 12 zeigt Kinetiken von Pi-Bindung an CPM-PBP bei pH 7,0;
Fig. 13 ist ein Zeitverlauf, der Pi-induzierte Fluoreszenz- Änderung unter Verwendung des Pi-Mops zum Wiedergewinnen von ungebundenem CPM-PBP zeigt;
Fig. 14 zeigt die durch CPM-PBP-Fluoreszenz beobachteten Kinetiken der Pi-Freisetzung von Actomyosin-Unterfragment 1;
Fig. 15 zeigt die Geschwindigkeit der Actomyosin- Unterfragment 1-ATPase als Funktion der Actin-Konzentration; und
Fig. 16 zeigt eine Reaktionsfolge für die Synthese von MDCC.

EXPERIMENTELLE VERFAHREN

Bakterienstämme und Plasmide Escherichia coli-Stämme TG1 (supE hsdΔ5thiΔ(lac-proAB),F'[traD36proAB+lacq-lacZΔM15]) und JM109 (recA1 supE44 endA1 hsdR17 gvrA96 relA1 thiΔ(lac-proAB),F'[traD36 proAB + laclq- lacZΔM15]) (Gibson, 1984; Yanisch-Perron et al., 1985) wurden zur Einzelstrang-DNA-Herstellung aus Phagemid pEMBL9- Derivaten (Dente et al., 1983) und zum Suchen nach mutierten phoS- Genen verwendet. E.coli-Stamm ANCC75 (leu purE trp his argG rpsL pho564 metA oder met8 thi) und Plasmid pSN5182, das das phoS- Gen enthielt, wurden von Dr. A. Nakata (Osaka-Universität) zur Verfügung gestellt und zur Überproduktion von PBP verwendet (Morita et al., 1983).
Materialien LB-Medium wurde gemäß Sambrook et al. (1989) hergestellt. Zur Expression von phoS wurde ein Minimalmedium, TG-Plus, verwendet, das auf 120 mM Tris.HCl, pH 7,2 basiert, das 80 mM NaCl, 20 mM KCl, 20 mM NH&sub4;Cl, 3 mM Na&sub2;SO&sub4;, 100 mg.l&supmin;¹ L-Arginin.HCl, 50 mg.l&supmin;¹ L-Leucin, 40 mg.l&supmin;¹ L-Histidin.HCl, 20 mg.l&supmin;¹ L-Methionin, 10 mg.l&supmin;¹ L-Tryptophan und 20 mg.l&supmin;¹ Adenosin enthält.
Myosin-Unterfragment 1 wurde durch chymotryptischen Verdau von Kaninchen-Skelett-Myosin, wie von Weeds & Taylor (1975) beschrieben, hergestellt und in flüssigem Stickstoff bei ~ 1 mM gelagert. Konzentrationen wurden auf der Basis eines Molekulargewichts von 115.000 und E1% (280 nm) = 7,9 cm&supmin;¹ berechnet. Das Protein war, basierend auf der K&spplus;-ATPase-Aktivität zu ~ 50% aktiv. F-Actin aus Kaninchen-Skelettmuskel wurde im wesentlichen wie von Lehrer und Kerwar (1972) beschrieben hergestellt. Konzentrationen wurden aus den Absorptionsspektren unter der Annahme E1%(290 nm) - E1%(310 nm) = 6,2 cm&supmin;¹ gemessen. Purinnukleosid-Phosphorylase war das "bakterielle" Protein von Sigma, wobei angenommen wurde, daß es zu einem Drittel aktiv war (Webb, 1992a).
Andere Enzyme waren von Boehringer Mannheim, New England Biolabs und Amersham. Fluoreszierende Markierungsreagenzien wurden von Molecular Probes bezogen oder von Dr. J. Corrie (National Institute for Medical Research, London) zur Verfügung gestellt. Radiochemikalien waren von Amersham. Alle anderen Biochemikalien und Chemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit.
Klonierung und Mutagenese Zur stellenspezifischen Mutagenese wurde das das phoS-Gen enthaltende 1,4 kB EcoRI/PsI-Fragment von pSN5182 in die Multilinker-Stelle des Phagemid-Vektors pEMBL9 kloniert, wodurch pEPS9 (5,4 kB) geschaffen wurde. Von diesem Plasmid wurde gemäß Dente et al. (1983) ssDNA unter Verwendung von M13K07 als Helferphagem hergestellt. Oligonukleotid-geleitete stellenspezifische Mutagenese wurde gemäß dem Eckstein-Verfahren (Taylor et al., 1985; Nakamaye & Eckstein, 1986) durchgeführt. Wo es passend war, führte die Mutation zu einer neuen Restriktionsstelle, so daß Restriktionsverdau zur schnellen Identifizierung mutierter phoS-Gene verwendet wurde. Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Da die Expression von phoS-Genen von pEPS9-Derivaten gering war, wurde das Gen in pSN5182 transferiert. Die mutierten phoS- Gene wurden aus pEPS9 als 1,4 kB EcoRI/PstI-Fragmente ausgeschnitten und mit dem 3,6 kB EcoRI/PstI-Fragment von pSN5182 ligiert, wodurch pSN5182/N-Plasmide von 5,0 kB geschaffen wurden. pSN5182/N-Plasmide wurden in ANCC75-Zellen transformiert. Gängige Klonierungsverfahren wurden durchgeführt, wie es von Sambrook et al. (1989) beschrieben wurde.
Expression von phoS und Aufreinigung von PBP Eine 2 ml Übernacht-Kultur von entweder pSN5182 mit Wild-Typ oder pSN5182/N mit mutierten phoS-Genen enthaltenden ANCC75 wurde in 100 ml LB-Medium verdünnt, das 12,5 mg.l&supmin;¹ Tetracyclin enthielt. Nach 12 h bei 37ºC wurden 10 ml dieser Kultur in 500 ml TG-Plus- Medium verdünnt, das 0,64 mM KH&sub2;PO&sub4;, 2 g.l&supmin;¹ Glucose, 0,01 mM FeSO&sub4;, 0,2 mM MgSO&sub4;, 0,2 mM CaCl&sub2; und 12,5 mg.l&supmin;¹ Tetracyclin enthielt. Zellen wurden 16-20 h wachsen gelassen, durch Zentrifugation bei 3.000 rpm bei Raumtemperatur für 30 Minuten pelletiert und in 500 ml TG-Plus resuspendiert, das abgesehen davon, daß 0,064 mM KH&sub2;PO&sub4; verwendet wurde, diesselben Zusätze enthielt. Zellen wurden für weitere 12-16 h wachsen gelassen und dann geerntet.
PBP wurde aus dem Periplasma der Zellen durch osmotischen Schock freigesetzt (Willsky & Malamy, 1976). Der endgültige periplasmatische Extrakt wurde mit 10 mM Tris.HCl, pH 7,6 gepuffert und hatte typischerweise ein Volumen von 40 ml pro Liter Zellkultur. Der Extrakt wurde auf eine DEAE-Zellulose-Säule (2,6 · 28 cm) aufgetragen, die mit 10 mM Tris.HCl, pH 7,6, 1 mM MgCl&sub2; equilibriert war. Nach dem Beladen wurde die Säule mit einem Volumen Equilibrierungspuffer gewaschen und dann wurde ein kontinuierlicher 250 ml-Gradient von 0-100 mM NaCl in demselben Puffer verwendet. PBP war das hauptsächlich vorhandene Protein und wurde vereinigt und in einem Amicon-Druck- Konzentrator aufkonzentriert. Die finale Proteinlösung wurde in kleinen Aliquots bei -80ºC gelagert.
Markieren von A197C PBP mit 7-Diethylamino-3-[4'-(1- maleimidyl)phenyl]-4-methylcumarin (CPM) 100 uM A197C und 400 uM CPM wurden in 8 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,1 bei Raumtemperatur für 4 h auf einem "end-over-end"-Mischer inkubiert. Das Protein wurde auf einer Biogel-P4-Gelfiltrationssäule (1,5 · 70 cm) aufgereinigt, wobei mit 10 mM Tris.HCl, pH 8,0 eluiert wur de. Das Protein wurde durch ein Membranfilter mit 0,2 um Porengröße (Acrodisc 13, Gelman) filtriert und auf eine 10 ml Q-Sepharose-Säule geladen, die mit 10 mM Tris.HCl, pH 7,6, 1 mM MgCl&sub2; equilibriert war. Nach dem Waschen wurde das Protein mit einem 200 ml Gradienten von 0-50 mM NaCl in diesem Puffer eluiert. Die Reinheit des markierten Proteins wurde über seine Fluoreszenz-Änderung mit Pi, über sein Absorptionsspektrum und durch SDS-Gel-Elektrophorese sowohl mit Coomassie-Blau-Färbung als auch durch Sichtbarmachen von Fluoreszenz überprüft. Die Ausbeute betrug typischerweise etwa 50% des Ausgangsmateriales.

Synthese von MDCC

N-[2-(1-Maleimidyl)ethyl] 7-diethylaminocumarin-3-carboxamid (MDCC) hat die in Fig. 1 zum Vergleich mit CPM dargestellte Struktur. Die Synthese wurde wie folgt durchgeführt:
Allgemeine Details - Mikroanalysen wurden von MEDAC Ltd., Uxbridge, Middlesex durchgeführt. ¹H-NMR-Spektren wurden, wenn nicht anders angegeben, in CDCl&sub3;-Lösungen auf einem JEOL FX90Q- Spektrometer mit Tetramethylsilan als interne Referenz ermittelt. J-Werte sind in Hz angegeben. Merck 9385-Silicagel wurde zur "Flash Chromatography" verwendet. Leichtpetroleum war die bei 40-60ºC siedende Fraktion. Organische Extrakte wurden über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Cobaltnaphthenat war von Fluka, Gillingham, Dorset. Ein Reaktionsschema ist in Fig. 16 dargestellt.
Ethyl 7-diethylaminocumarin-3-carboxylat (1). - Eine Lösung von 4-Diethylamino-2-hydroxy-benzaldehyd (29,8 g, 154 mmol) und Diethylmalonat (23,8 ml, 157 mmol) in Ethanol (185 ml) wurde mit Piperidin (1,37 ml, 13,9 mmol) behandelt und unter Rückfluß für 4 h erhitzt. Man ließ die Lösung abkühlen, dann wurde sie unter reduziertem Druck auf ungefähr das halbe Volumen konzentriert, mit Äther verdünnt und Wasser, verdünnter wässriger NaOH und Wasser gewaschen, getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft. Zerreiben des Rückstandes mit EtOH (ungefähr 15 ml) ergab gelbe Kristalle, die aus EtOAc-Leichtpetroleum rekristallisiert wurden, so daß sich der Ester 1 als helle gelbe Prismen (18 g), Schmelzpunkt 76-77ºC, ergab. Eine ein zweites Mal rekristallisierte Probe hatte einen Schmelzpunkt von 77- 78ºC (gefunden: C, 66,4; H, 6,7: N, 4,8. C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub9;NO&sub4; erfordert C, 66,4; H, 6,6; N, 4,8%). Die Diskrepanz zu dem von Kendal et al. (GB 867 592) berichteten Schmelzpunkt (87ºC) legt es zusammen mit dem scharfen Schmelzpunkt und zufriedenstellenden analytischen Ergebnissen für die vorliegende Probe nahe, daß die Ziffern des berichteten Wertes versehentlich vertauscht worden sein könnten.
7-Diethylaminocumarin-3-carabonsäure (2). - Eine Lösung des. Esters 1 (11,6 g, 40 mmol) in MeOH (100 ml) wurde unter Rückfluß erhitzt und 0,5 M wässriges NaOH (100 ml) wurde schnell zugesetzt. Ein gelber Feststoff präzipitierte innerhalb von 5 Minuten und die Mischung wurde abgekühlt und mit 2 M wässriger HCl angesäuert, so daß sich ein orangefarbener Feststoff ergab, der filtriert und mit 2 M wässriger HCl, dann mit Wasser bis zur Neutralität und schließlich mit MeOH (50 ml) gewaschen und in vacuo getrocknet wurde, so daß sich die Säure 2 (9,4 g) ergab. Eine Probe rekristallisierte aus MeOH-Diisopropylether als orangefarbene Leisten, Schmelzpunkt 231-232ºC (Literaturschmelzpunkt 227-229ºC - siehe US 4 317 774).
t-Butyl N-(2-aminoethyl)carbamat (3). - Benzyl N-(2-aminoethyl)carbamat wurde nach dem Verfahren von Atwell und Denny (1984) hergestellt und in t-Butyl N-[2-benzyloxycarbonylamino)ethyl]carbamat, Schmelzpunkt 129-130ºC (Literaturschmelzpunkt 123-124ºC) wie beschrieben umgewandelt (siehe Barker et al., 1981). Die letzt genannte Verbindung (1,5 g, 5,1 mmol) wurde in EtOH (45 ml) gelöst, und 5% Pd-C (1,2 g) wurde zugesetzt. Die Mischung wurde unter Wasserstoff bei 5 atm und Raumtemp. für 18 h geschüttelt und der Katalysator wurde filtriert und mit Ethanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden unter vermindertem Druck eingedampft, so daß sie das Monoamin 3 (0,8 g, 5 mmol) als ein farbloses Öl lieferten, das ohne weitere Aufreinigung verwendet wurde.
N-[2-(t-Butoxycarbonylamino)ethyl] 7-diethylaminocumarin-3- carboxamid (4). - Eine Lösung von 7-Diethylaminocumarin-3- carbonsäure 2 (1,15 g, 5 mmol) und Tri-n-butylamin (1,38 g, 7,5 mmol) in trockenem DMF (50 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt und mit Isobutylchlorformiat (0,715 g, 5,2 mmol) behandelt. Die Lösung wurde 0,5 h in dem Eisbad gerührt, dann wurde eine Lösung des Amins 3 (0,8 g, 5 mmol) in trockenem DMF (5 ml) zugesetzt. Man ließ die Mischung auf Raumtemperatur erwärmen und hielt sie für 3 h dabei, dann wurde sie mit EtOAc verdünnt und gründlich mit Wasser, verdünnter wässriger HCl, wässriger NaHCO&sub3; und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand ergab nach Zerreiben mit ein wenig Ether einen gelben Feststoff. Ein Teil (400 mg) wurde durch "Flash Chromatography" gereinigt, so daß sich das Amid 4 nach Kristallisation aus EtOAc-Leichtpetroleum als gelbe Prismen (0,345 g), Schmelzpunkt 157-158ºC ergab. Das verbleibende Material kristallisierte ohne Chromatographie, so daß sich ein weiterer Teil des Produktes ergab (0,55 g, Gesamtausbeute 45%) (gefunden: C, 62,6; H, 7,3; N, 10,4. C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub9;N&sub3;O&sub5; erfordert C, 62,5; H, 7,2; N, 10,4%); δH 8,95 (1 H, t, J 5,5, NH), 8,68 (1 H, s, 4-H), 7,42 (1 H, d, Jortho 8,8, 5-H), 6,64 (1 H, dd, Jmeta 2,3, 6-H), 6,49 (1 H, d, 8- H), 5,08 (1 H, br s, NH), 3,23-3,64 (8 H, m, 4 · CH&sub2;), 1,44 (9 H, s, CMe&sub3;) und 1,24 (6 H, t, J7, 2 · Me).
N-[2-(1-Maleimidyl)ethyl] 7-diethylaminocumarin-3-carboxamid (5). - Das Amid 4 (0,88 g, 2,18 mmol) wurde in Trifluoressigsäure (10 ml) gelöst und für eine Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand wurde mit Chloroform und wässriger NaHCO&sub3; aufgeteilt. Die Chloroformschicht wurde getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft, so daß ein gelber Schaum (0,60 g) zurückblieb. Maleinsäureanhydrid (0.196 g, 2 mmol) wurde zugesetzt, gefolgt von trockenem N,N-Dimethylacetamid (2 ml) bei Raumtemp., woraufhin die Mischung über 20 Minuten auf 60ºC erwärmt wurde. Ein Aliquot (94 ul) einer Lösung von Cobaltnaphthenat (20 ul) in N,N-Dimethylacetamid (1 ml) wurde, gefolgt von Essigsäureanhydrid (0,38 ml), zugesetzt, und die Lösung wurde für zwei Stunden auf 70-80ºC erhitzt, dann gekühlt, mit Wasser verdünnt und mit EtOAc extrahiert (siehe GB 2 018 253). Der organische Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampf. Der Rückstand wurde durch "Flash Chromatography" aufgereinigt [EtOAc- Leichtpetroleum (7 : 3)], so daß sich das Maleimid 5 ergab, das aus EtOAc-Leichtpetroleum als feine gelbe Nadeln auskristallisierte (0,22 g, 26%), Schmelzpunkt 179-181ºC (gefunden: C, 62,5; H, 5,5: N, 10,8. C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub1;N&sub3;O&sub5; erfordert C, 62,65; H, 5,5; N, 11,0%); λmax (EtOH)/nm 258 und 418 ( /M&supmin;¹cm&supmin;¹ 13150 und 45000); λmax [EtOH-50 mM Na Phosphat, pH 7,0 (1 : 9)]/nm 264 und 430 ( /M&supmin; ¹cm&supmin;¹ 12800 und 46800); δ 8,88 (1 H, t, J 5,7, NH), 8,66 (1 H, s, 4-H); 7,41 (1 H, d, Jortho 8,8, 5-H), 6,69 (1 H, s, CH=CH), 6,63 (1 H, dd, Jmeta 2,7, 6-H), 6,47 (1 H, d, 8-H), 3,39-3,88 (8 H, m, 4 · CH&sub2;) und 1,24 (6 H, t, J7, 2 · Me).
Das Fluoreszenzspektrum wurde für eine Lösung von Maleimid 5 (1,3 uM) in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0 vor und nach Zugabe von 2 mM Dithiothreitol (DTT) gemessen. In beiden Fällen wurde die Anregungswellenlänge auf 430 nm eingestellt. In Abwesenheit von DTT lag das Emissionsmaximum bei 477 nm und verschob sich auf 480 nm nach Zusatz von DTT, begleitet von einer 4,25-fachen Intensitätszunahme.

Anmerkung betreffend die Maleimidsynthese

In dem Verfahren nach der GB 2 018 253 wird Cobaltnaphthenat verwendet, um die Ringbildung von N-Alkylmaleinsäure zu den entsprechenden Maleimiden zu fördern. Während die Bildung von N-Arylmaleimiden leicht durch Erhitzen von N-Arylmaleinsäure mit kondensiertem Natriumacetat und Essigsäureanhydrid erreicht wird, werden N-Alkylmaleimide weit weniger einfach hergestellt. Das Verfahren von Keller & Rudinger (1975) wurde, obwohl es für wasserlösliche Amine geeignet ist (siehe DE 39 19 915 für ein neueres Beispiel), nach unserer Kenntnis nicht für wasserunlösliche Amine angewandt. Während das Verfahren von Keifer und Haug (GB 2 018 253) wie beansprucht für N-Alkylmaleimide wirksam ist, war es für uns schwierig, farbige Verunreinigungen von dem Produkt zu entfernen. Indem zehnfach weniger Cobaltnaphthenat als angegeben verwendet wurde, wurde die Ausbeute von Maleimid nicht sehr verringert, aber die Aufreinigung des Produktes wurde sehr erleichtert.
Markierung von A197C PBP mit N-[2-(1-Maleimidyl)ethyl]-7- diethylaminocumarin-3-carboxamid (MDCC) 100 uM A197C und 500 uM MDCC (aus einer 25 mM Lösung in Dimethylformamid) wurden in 8 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,1 bei Raumtemperatur für 4 Stunden auf einem "end-over-end"-Mischer inkubiert. Das Protein wurde durch ein Membranfilter mit 0,2 um Porengröße (Acrodisc 13, Gelman) filtriert und auf einer Biogel P4-Gelfiltrationssäule (1,5 · 70 cm) aufgereinigt, wobei mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 eluiert wurde. Das Protein wurde auf eine 25 ml Q- Sepharosesäule geladen, die mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM MgCl&sub2; equilibriert war. Nach dem Waschen wurde das Protein mit einem 200 ml-Gradienten von 0-50 mM NaCl in diesem Puffer eluiert. Die Reinheit des markierten Proteins wurde über seine Fluoreszenz-Änderung mit Pi, über sein Absorptionsspektrum und durch SDS-Gel-Elektrophorese sowohl mit Coomassie-Blau-Färbung als auch durch Sichtbarmachen von Fluoreszenz überprüft. Die Ausbeute betrug typischerweise ~50% des Ausgangsmaterials. Die Konzentration des markierten Proteins wurde durch die Absorption bei 280 nm nach Korrektur um die Absorption bestimmt, die durch die Markierungssubstanz bedingt ist (0,164 von derjenigen bei 430 nm). Es wurde angenommen, daß das Spektrum der Markierungssubstanz dasselbe ist, wie dasjenige, das für das Addukt von MDCC mit Dithiothreitol bestimmt wurde.
Andere fluoreszierende Markierungssubstanzen wurden in einer ähnlichen Weise mit kleineren Modifikationen des Verfahrens, wie beispielsweise des Verhältnisses von Markierungssubstanz zu Protein, der Reaktionszeit und des pH, an PBP-Mutanten angefügt.
Messungen Absorptionsspektren wurden auf einem Beckman DU70- Spektrophotometer genommen. Fluoreszenzmessungen wurden auf einem Farrand Mkl- oder einem SLM 8000-Photonenzähl- Spektrofluorimeter genommen. "Stopped-Flow-Experimente" wurden in einer HiTech PQ/SF-53-Apparatur mit einer Quecksilberlampe und HiTech IS-2-Software durchgeführt.
Die K&spplus;-ATPase von Unterfragment 1 wurde unter Verwendung des spektrophotometrischen Verfahrens von Webb (1992a) gemessen. Die Lösung enthielt: 50 mM Tris.HCl pH 7,6, 0,6 M KCl, 5 mM EDTA, 5 mM ATP, 200 uM MESG (2-Amino-6-mercapto-7-methylpurin- Ribonukleosid) und 12,5 Einheiten.ml&supmin;¹ Purinnukleosid- Phosphorylase. Die Absorption wurde bei 360 nm verfolgt und die Reaktion wurde durch Zusatz von ~ 0,05 uM Unterfragment 1 gestartet. Zur Protonenfreisetzung enthielt die Lösung 0,6 M KCl, 5 nM ATP und 10 mM EDTA pH 8,0. 5 mM KOH wurde titriert, um diesen pH zu erhalten.
Die Dissoziationskonstante des PBP.Pi-Komplexes wurde unter Anwendung einer modifizierten Version eines von Pearlman et al. (1969) beschriebenen Tests bestimmt. Folgendes wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur in 0,5 ml 10 mM Tris.HCl, pH 8,0 unter "end-over-end"-Rühren inkubiert: 1 uM [³²P]Pi (durch ein 0,45 um Zelluloseacetat-Filter vorfiltriert, um jede teilchenförmige Radioaktivität zu entfernen), 0-30 uM PBP, 50 mg Sephadex G25 Superfine-Gel (Pharmacia), das in einem Teil der 0,5 ml Puffer vorgequollen wurde. Die Mixtur wurde zentrifugiert und die Radioaktivität im Überstand durch Szintillationszählung gemessen. Das Pi verteilt sich auf das Gel, die Lösung und dem PBP.Pi-Komplex. Das PBP bleibt vom Gel ausgeschlossen. Die Da ten wurden an die folgenden Gleichungen unter Anwendung von Grafit-Software (Leatherbarrow, 1992) angepaßt.
c.p.m. bei [PBP] = c.p.m.&sub0; Vt((P-Ep)/Vt + E/V&sub0;)/P,
wobei
Ep = (B - (B² - 4PE))/2
B = P + E + KVt
c.p.m.&sub0; = c.p.m. bei [PBP] = 0
P = nmol an Pi
E = nmol an PBP
Vt = Gesamtvolumen der Lösung
V&sub0; = Volumen der vom Gel eingeschlossenen Lösung (unbekannt)
K = Dissoziationskonstante (unbekannt)
Die Fluoreszenztitrationen von Pi mit CPM-PBP (und MDCC-PBP) wurden an die folgenden Gleichungen unter Anwendung von Enzfitter-Software angepaßt:
Verhältnis der Fluoreszenz bei einer gegebenen [P1] zu derjenigen bei null Pi = (Q[EP] + [E] - [Ep])/[E], wobei,
[EP] = ([P] + [E] + K - (([P] + [E] + K)² - 4 [P] [E]))/2
[P] = Konzentration von Pi
[E] = Konzentration von CPM-PBP
Q = Verhältnis der Fluoreszenz für CPM-PBP.Pi zu derjenigen für das ohne Ligand vorliegende CPM-PBP

BEISPIEL 1

SYNTHESE VON CPM-PBP UND MDCC-PBP

PBP wurde aus dem Periplasma von E.coli-Stamm ANCC75 aufgereinigt, der phoS in einem Multicopy-Plasmid überexprimiert (Morita et al., 1983). Eine 4-Liter Kultur ergab 400-600 mg an PBP mit einer Reinheit größer als 95% durch Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese. Das Wild-Typ-Protein enthält keine Cysteine und somit wurden fluoreszierende Gruppen anfänglich über Amine oder Carboxyle angefügt. Alle Versuche, das Wild-Typ-Protein mit einem Fluorophor zu markieren, ergaben bestenfalls eine 15%ige Fluoreszenz-Änderung bei Pi-Bindung, ungefähr diesselbe wie diejenige, die für die intrinsische Tryptophan-Fluoreszenz beobachtet wurde. Dies ist möglicherweise durch relativ unspezifisches und mehrfaches Markieren bedingt. Um sicherzustellen, daß eine einzelne Markierungssubstanz angefügt werden konnte, wurden mutierte PBP-Proteine durch Austausch einzelner Reste gegen Cystein unter Anwendung von Oligonukleotid-geleiteter Mutagenese gewonnen. Die Positionen wurden so ausgewählt, daß sich die Reste an der Kante der von Luecke & Quiocho (1990) beschriebenen Pi-Bindungsspalte befanden. Von diesen würde man erwarten, daß sie eine signifikante Änderung in der Umgebung bei Pi-Bindung erfahren, obwohl die Struktur nur für die Pigebundene Form von PBP bekannt ist. Darüber hinaus waren die mutierten Reste nicht direkt an der Pi-Bindung beteiligt, wie durch Luecke & Quiocho (1990) aufgeklärt wurde. Die Cystein- Mutanten wurden mit einer Vielzahl von Fluorophoren markiert und diese Daten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Eine Kombination von Mutante (A197C) und Fluorophor (MDCC; Fig. 1) ergab eine große Fluoreszenz-Änderung mit Pi, obwohl mehrere nah verwandte Fluorophore, einschließlich CPM und DACM, viel kleinere Änderungen ergaben. Die meisten anders markierten Mutanten wurden nicht daraufhin getestet, herauszufinden, ob der Mangel an Pi-Sensitivität darauf beruht, daß sie Pi nicht gebunden haben, oder darauf, daß das Fluorophor unsensitiv gegenüber der mutmaßlichen Konformationsänderung ist. Serin 139 ist an der Pi- Bindung beteiligt (Luecke & Quiocho, 1990), so daß von dem markierten S139C-Mutanten-PBP erwartet werden könnte, Pi unzureichend zu binden: Diese markierte Mutante wurde daher als eine Null-Kontrolle verwendet. Die A197C-Mutante wurde im selben Ausmaß überproduziert, wie das Wild-Typ-Protein, so daß große Mengen des markierten Proteins gewonnen werden konnten. Tabelle 1 Markierung von PBP-Mutanten mit fluoreszierenden Gruppen: Prozentuales Fluoreszenzzunahme beim Zufügen von Pi.
Die Bedingungen für die Messung von Fluoreszenz waren - 5 uM markiertes PBP in 10 mM Tris. HCl pH 8,0, zu dem 50 uM Pi zugesetzt wurde. Anregung und Emission fanden bei der Maximal- Wellenlänge statt. DEM ist N-2-[(1-Maleimidyl)ethyl]-5- dimethylaminonaphthalinsulfonamid, MIANS ist 2-[4'-(1- Maleimidyl)anilino]naphthalin-6-sulfonsäure und DACM ist 7- Dimethylamino-3-(1-maleimidyl)-4-methylcumarin. Aminosäuren sind vom N-Terminus des reifen Proteins her numeriert.
(a) Nicht bestimmt. (b) Vernachlässigbare Markierung. (c) Sehr schwache Markierung. (d) Markiertes Protein wurde auf Q- Sepharose-Harz aufgereinigt, wie es in den experimentellen Verfahren beschrieben wurde. (e) Unter Verwendung des Pi-Mops betrug die Fluoreszenz-Änderung 65%.

BEISPIEL 2

MDCC-PBP

Die Pi-sensitive markierte Mutante MDCC-PBP wurde weiter aufgereinigt und wie in den Experimentellen Verfahren beschrieben getestet, um zu zeigen, daß es ein einfach-markiertes Protein ohne unmarkiertes Protein oder ungebundenes Fluorophor war. Die weitere Aufreinigung ist wichtig, weil das unmarkierte Protein ebenfalls Pi bindet. Ungebundenes Fluorophor würde die prozentuale Fluoreszenz-Änderung durch Erhöhung des Hintergrunds reduzieren und es könnte ferner langsam mit anderen Verbindungen in dem experimentellen System reagieren oder daran binden. Die Ionenaustauschchromatographie trennte MDCC-PBP vollständig von unmarkiertem PBP und ungebundenem Fluorophor. Somit weist das finale markierte Protein ein Verhältnis der Absorptionsmaxima 280/430 nm von 1,8 auf. Das Fluoreszenz-Anregungsmaximum liegt bei 425 nm und das Emissionsmaximum liegt bei 474 nm, die Fluoreszenz-Änderung mit überschüssigem Pi bei pH 7,0 für die Bedingungen von Fig. 2 ist 5,3-fach mit einer Verschiebung der Maximal-Emission zu 464 nm. Das markierte Protein konnte bei - 80ºC gelagert werden und war auf Eis für mindestens 5 Tage stabil.
Das Produkt wurde auf verschiedene Arten charakterisiert. Zuerst war es wichtig zu zeigen, daß die Fluoreszenz linear auf Pi antwortete und dies ist in Fig. 3 gezeigt, was darauf hindeutet, daß das Protein zu 75-80% aktiv ist, obwohl, wie nachfolgend diskutiert, bedingt durch die niedrigen Konzentrationen von kontaminierendem Pi, etwas von dem inaktiven Protein Pi gebunden haben kann. Das inaktive Protein bindet zugesetztes 1% nicht stark. Die Dissoziationskonstante wurde durch Titrieren von Pi bei niedriger [MDCC-PBP] und Fluoreszenzmessung bestimmt (Fig. 4). Dies zeigt, daß die Bindung sehr fest ist, und die Kurve paßt zu einer Dissoziationskonstanten von 0,03 uM bei pH 7,0 und ein ähnlicher Wert wurde bei pH 8,0 erhalten (0,08 uM). Eine Kompetitionstitration von MDCC-PBP. Pi mit Wild-Typ-PBP, um die relativen Affinitäten für Pi zu zeigen, zeigte, daß das letztgenannte Pi zweifach stärker bindet als die markierte Mutante. Da die Pi-Bindung sehr stark ist, können diese Dissoziationskonstanten nur als Nährung angesehen werden: Die Fluoreszenz-Titration konnte nicht bei ausreichend niedrigen Konzentrationen durchgeführt werden, um genaue Kd-Werte zu erhalten.
Weil sehr niedrige Pegel von Pi-Kontaminationen die beobachtete Änderung bei Zusatz von Pi beeinflussen können und wegen der Variabilität in der Proteinaktivität, schwankt die maximale prozentuale Zunahme der Fluoreszenz von 400-500%. Obwohl PBP sehr spezifisch für Pi ist (Luecke & Quicho, 1990), sollte es als Sonde in Gegenwart anderer Phosphat-Arten, wie z. B. Ester oder Purinnukleotide, verwendet werden, so daß es wichtig zu wissen war, bei welchen Pegeln diese die Pi-Messungen stören könnten. Mehrere Pi-Analoga wurden ebenfalls getestet (Tabelle 2) und nur Arsenat und Vanadat erzeugten signifikante Erhöhun gen. Für eine Titration von Arsenat in eine Lösung von MDCC-PBP wurde die Fluoreszenz-Änderung verwendet, um eine Dissoziationskonstante von 3 uM zu erhalten. In allen Fällen, außer bei Arsenat, wurde die volle Fluoreszenz-Änderung beobachtet, wenn anschließend Pi zugesetzt wurde. Die Pi-abhängige Fluoreszenz- Änderung wurde für eine Vielzahl von Bedingungen bei einer einzigen Pi-Konzentration gemessen (Tabelle 2). Die Änderung wird nur geringfügig durch pH (7-8) oder Ionenstärke beeinflußt.

Tabelle 2

Fluoreszenz-Änderung von MDCC-PBP infolge verschiedener Zusätze und Lösungszusammensetzungen.

A. Zusätze % Fluoreszenz-Zunahme
Pi (50 uM) 430
Pyrophosphat (100 uM) [a] 6
ATP (100 uM) [a,b] 2
ATP (1 mM) [a,b] 11
GDP (100 uM) [a] 3
ADP (100 uM) [a] 3
"NPE-caged ATP" (5 mM) [a,b,d] 0
Glucose-6-Phosphat (100 uM) [a] 3
Natriumsulfat (1 mM) 3
BeCl&sub2; (100 uM/NaF (100 mM) 3
AlCl&sub3;(100 uM)/NaF (100 uM) 3
Natriumarsenat (100 uM) 313
Natriumvanadat (100 uM) 35
B. Lösungszusammensetzung
10 mM Tris-HCl (pH 8,0) 405
10 mM PIPES (pH 7,0) 430
10 mM PIPES (pH 7,0), 1M NaCl [c] 350
Außer dort, wo es angegeben ist, enthielten die Lösungen 2 uM MDCC-PBP (abgesehen von [b] 10 uM und [c] 3,2 uM) in 20 mM PIPES (pH 7,0). Den Lösungen in B war 100 uM Pi zugesetzt worden, um die angegebene Fluoreszenz-Änderung zu erzeugen. Die Fluoreszenz-Änderung wurde bei 465 nm mit Anregung bei 425 nm gemessen. Nach den Zusätzen in A bewirkte der Zusatz von überschüssigem Pi die volle Fluoreszenz-Zunahme.
[a] Die Lösung wurde mit dem Pi-Mop vorinkubiert. [d] "NPE- caged ATP" ist P³-1-(2-Nitrophenyl)ethyl-ATP.
Weil MDCC-PBP Pi stark bindet, war es wichtig, den Effekt von Pi-Kontaminationen zu beachten. Sogar in Abwesenheit von zugesetzten Phosphatverbindungen kann es schwierig sein, Pi- Kontaminationen unter 1 uM zu verringern, da Pi eine geradezu ubiquitäre Kontamination sowohl in Puffern als auch in biologischen Lösungen ist. Purinnukleotide weisen zwangsläufig niedrige Pi-Konzentrationen auf, die bedingt durch Hydrolyse vorhanden sind. Proteine können ebenfalls kontaminiert sein. Beispielsweise weist Actin gebundenes Nukleotid auf und Tests zeigten Pi-Pegel, die annähernd equimolar mit dem Protein waren. Pi ist außerdem eine Kontamination, die an Glasgeräte bindet und davon ausgewaschen wird. Obwohl einige Kontaminationen physikalisch, beispielsweise durch Chromatographie, entfernt werden können, ist es nicht möglich, dies vollständig oder ein fach durchzuführen. Da die Pi-Sonde nicht enzymatisch ist, ergibt zusätzliches Pi kein weiteres Signal, wenn einmal alle Stellen an dem MDCC-PBP durch Pi gebunden sind. Wir machten daher von einem "Phosphat-Mop" Gebrauch, einem enzymatischen Unterstützungssystem zum Entfernen von Pi, das aus 7-Methylguanosin (MEG) und Purinnukleosid-Phosphorylase bestand. Diese Reaktion war characterisiert, wie es für das Thioanaloge, MESG, beschrieben wurde (Webb, 1992a). Unter Verwendung der Absorptionsänderung bei 260 nm zur Beobachtung der Phosphorolyse-Geschwindigkeit beträgt der Km-Wert 59 uM für MEG, und 34 uM für Pi und kcat = 109 s&supmin;¹ (pH 8,0, 20 mM Tris.HCl, 1 mM MgCl&sub2;, 30ºC). Die Phosphorolyse ist im wesentlichen irreversibel und alles Pi reagiert chemisch, um Ribose 1-Phosphat zu bilden, so daß es nicht länger verfügbar ist, um an PBP zu binden: Tests zeigten, daß Pi auf unter ~ 0,1 uM reduziert werden konnte. Für Experimente mit dem PBP wurden die Bedingungen so gewählt, daß das Enzym in niedrigen Konzentrationen vorhanden war, die unzureichend waren, um mit dem MDCC-PBP um die anfängliche Bindung von Pi zu kompetitieren, das durch das Actomyosin oder andere Systeme freigesetzt wurde, die aber ausreichend waren, um 1% langsam zu entfernen. Dies ist in Fig. 5 dargestellt. Zusätze von Pi zeigen die schnelle Fluoreszenz- Zunahme bei Bindung an das MDCC-PBP. Das P1 wird durch den enzymatischen Pi-Mop langsam aus dem Protein entfernt und die Fluoreszenz kehrt zur Basislinie zurück: Dieser Prozess kann mehrmals wiederholt werden, obwohl es jedes Mal eine leichte Zunahme bei der Basislinie gibt. Dies kann ein geringes verbleibendes Pi oder den Effekt von Ribose 1-Phosphat-Bindung an MDCC-PBP repräsentieren.
Um die Sonde zum Messen von Pi-Freisetzung von ATPasen und GTPasen in Echtzeit zu verwenden, war es wichtig, die Kinetiken der Pi-Wechselwirkung mit dem markierten Protein zu kennen. Diese wurden in einer "Stopped-Flow-Apparatur" gemessen und die Daten für Pi-Bindung bei pH 7,0 sind in Fig. 6A dargestellt. Wegen der hohen Geschwindigkeiten wird nur ein Teil des Exponentials beobachtet: Ein signifikanter Anteil der Reaktion findet während der Totzeit des Instrumentes statt (d. h. der Zeit, die die Lösung zum Fließen zwischen dem Mischen und der Beobachtungskammer braucht). Die Geschwindigkeiten vergrößerten sich mit der [Pi] und es gibt eine Sättigung der Geschwindigkeiten bei hohem Pi, obwohl nicht klar ist, ob diese Sättigung durch die Beschränkungen des "Stopped-Flow-Instrumentes" bedingt ist oder ob es eine zweistufige Bindung von Pi gibt, diese Daten müssen daher mit Vorsicht behandelt werden. Die Geschwindigkeiten bei [Pi] < 5 uM nehmen ziemlich linear mit der [Pi] zu und lassen sich somit an ein einfaches einstufiges Bindungsmodell mit der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten = k&sbplus;[Pi]+K näherungsweise anpassen. Diese Anpassung ergibt k+ = 136 · 10&sup6;M&supmin;¹s&supmin;¹ und k&submin; = 43 s&supmin;¹, obwohl der letztgenannte Wert, beispielsweise bedingt durch Pi-Kontaminationen, teilweise fehleranfällig ist.
Die Dissoziationsgeschwindigkeit des MDCC-PBP.Pi-Komplexes wurde direkt in der "Stopped-Flow-Apparatur" durch schnelles Mischen dieses Komplexes mit überschüssigem Wild-Typ-PBP gemessen. Pi wird von dem fluoreszierenden Komplex freigesetzt und bindet an das Wild-Typ-Protein mit einer Geschwindigkeitskonstanten, die durch die Freisetzungsgeschwindigkeit limitiert ist (Fig. 6B). Die beobachtete Geschwindigkeit lag für Wild- Typ-Konzentrationen von 1,25 bis 10 uM mit 0,25 uM MDCC-PBP und 0,125 uM Pi bei 21,3±0,1 (Standardfehler des Mittelwertes) s&supmin;¹ (22ºC, 10 mM PIPES, pH 7,0). Da diese Geschwindigkeit über einen Bereich von Wild-Typ-Konzentrationen konstant ist und da die Geschwindigkeit viel niedriger ist als die für Pi-Bindung unter der Annahme, daß das Wild-Typ-PBP eine ähnliche Geschwindigkeitskonstante wie das MDCC-PBP hat, erwartete Geschwindigkeit, repräsentiert die beobachtete Geschwindigkeitskonstante wahrscheinlich Pi-Freisetzung. Unter Verwendung des oben erhaltenen Wertes für die Bindungsgeschwindigkeitskonstante ist Kd = k&submin;/k&sbplus; - 0,15 uM, was mit dem durch Titration erhaltenen Wert im Einklang steht, da die Fehler bei den Bindungskinetik-Messungen groß sind, wird weitere Arbeit notwendig sein, um den Mechanismus der Pi-Assoziation aufzuklären.
Nachdem einmal gezeigt wurde, daß Pi schnell an MDCC-PBP bindet, wurde dieses System dann verwendet, um die Geschwindigkeit der Pi-Freisetzung von Actomyosin-Unterfragment 1-ATPase zu messen. Pi-Mop, MEG und die Phosphorylase waren wie oben beschrieben vorhanden. Bei einem anfänglichen Experiment wurde diese Geschwindigkeit für Unterfragment 1 in Abwesenheit von Actin gemessen, und es ergab sich eine einfache exponentielle Zunahme in der Fluoreszenz mit einer Geschwindigkeitskonstanten von 0,09 s&supmin;¹ (pH 7,0, 22ºC) (Fig. 7A), was mit früheren Messungen im Einklang stand (Trentham et al., 1972; Webb, 1992b). Das Ende der Kurve bietet eine weitere Illustration des Effekts des Pi-Mops, der die Fluoreszenz langsam reduziert. Die Menge an zugesetztem Mop wurde so gewählt, daß sie die durch Myosin- katalysierte ATP-Hydrolyse bedingte, beobachtete Geschwindigkeit des Fluoreszenz-Anstieges nicht beeinflußte.
Zwei verschiedene Experimente wurden in Gegenwart von Actin durchgeführt. In dem ersten war die [ATP] ähnlich wie die [Unterfragment 1], in dem zweiten war die [ATP] hoch, so daß die Reaktion zweifellos mehrfach ablief. Das Ziel war es, zu sehen, ob es irgendeinen Ausbruch in der Pi-Freisetzung gab, der schneller war als die Fließgleichgewichtsgeschwindigkeit, oder ob die Pi-Freisetzung mit derselben Geschwindigkeit wie die Fließgleichgewichtsgeschwindigkeit stattfand. Ergebnisse der ersten Art von Experiment sind in Fig. 7B für eine Messung bei hoher [Actin] dargestellt. Die "Stopped-Flow-Kurven" zeigen mehrere Phasen. Anfänglich, wenn sich die Spritzen zu bewegen beginnen, wird die Lösung mit hoher Fluoreszenz in der Meßkammer durch frische, unreagierte Lösung ersetzt. Es gibt dann eine Zeitspanne, in der die unreagierte Lösung durch die Kammer fließt und zu einer Zeit, die im wesentlichen Null ist, stoppt der Fluß. Bei den meisten Kurven gab es einen anfänglichen kleinen schnellen Anstieg in der Fluoreszenz, der eine für die Bindung von freiem Pi an MDCC-PBP erwartete Geschwindigkeitskonstante hatte. Dieses repräsentierte gewöhnlich weniger als 0,3 uM Pi und ist wahrscheinlich eine geringe zurückgebliebene Pi-Kontamination, insbesondere von Actin, kann aber auch die Bindung von Ribose 1-Phosphat (das Produkt des Pi-Mops; siehe oben) repräsentieren. Die nächste Phase war eine Verzögerung, gefolgt von einem Anstieg in der Fluoreszenz mit einer Geschwindigkeit, die von der [Actin] abhing. Dieser letzte Anstieg war näherungsweise an eine einfache Exponentialgröße angepaßt, und Fig. 8 zeigt die Sättigung dieser angepaßten exponentiellen Geschwindigkeiten bei hoher [Actin]. Diese Daten passen zu einem zweistufigen Bindungsmodell mit einer Stufe 1, von der angenommen wird, daß sie viel schneller ist als Stufe 2. Dafür ist Kd = 26,0 uM und K&sbplus;&sub2; = 15,2 s&supmin;¹. ATPase-Messungen im Fließgleichgewicht ergaben KM, 25 uM, für ähnliche Lösungsbedingungen.
Um eine Geschwindigkeitskonstante für Fließgleichgewichtshydrolyse zu erhalten, ist eine Annahme über die aktive Myosin- Konzentration erforderlich. Um dieses Problem zu umgehen und um sicherzustellen, daß ATP-Bindung nicht zur Geschwindigkeitsbeschränkung beiträgt, wurden Experimente mit einem großen Überschuß an ATP durchgeführt, so daß jeder beliebige anfängliche Ausbruch von Pi-Freisetzung vor der Fließgleichgewichtshydrolyse beobachtet werden würde. Das Ergebnis eines solchen Experimentes ist in Fig. 9 dargestellt. Experimente wurden bei 50 oder 100 uM ATP, 40-45 uM Actin und 2 oder 4 uM Unterfragment 1 (Mischkammer-Konzentrationen) bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt: Der pH des PIPES-Puffers wurde bezüglich der Temperatur-Änderung nicht neu eingestellt.
In diesen Experimenten gab es auch einen kleinen, anfänglichen schnellen Ausbruch der Fluoreszenz-Zunahme, der viel geringer war als ein Umsatz des Unterfragmentes 1. Experimente, bei denen die Datensammlung schneller stattfand, zeigten an, daß die Geschwindigkeit diejenige war, die durch freie Pi-Bindung bedingt war. Anschließend gab es eine Verzögerung, dann einen linearen Anstieg in der Fluoreszenz. Der Fluoreszenz-Anstieg verlangsamt sich dann, was vermutlich das Einsetzen von MDCC-PBP- Sättigung repräsentiert. Der [Pi]-Maßstab an diesen Kurven basiert auf der Gesamt-[MDCC-PBP] und der bei längeren Zeiten beobachteten Gesamtfluoreszenz-Änderung, wenn das MDCC-PBP mit Pi gesättigt ist.

BEISPIEL 3

CPM-PBP

Alle zuvor beschriebenen Charakterisierungsverfahren wurden ebenfalls für CPM-PBP verwendet. Die Fluoreszenz-Antwort auf zugesetztes Pi war linear. Titrationen ergaben eine Dissoziationskonstante von 14 uM sowohl bei pH 7,0 als auch 8,0 mit einer Zunahme von 105% bei pH 8,0 (10 mM Tris HCl) und 63% bei pH 7,0 (10 mM PIPES). Die Fluoreszenz-Zunahme wurde durch Erhöhung der Ionenstärke reduziert. Pi-Bindung ist schnell, 36 · 10&sup6;M&supmin;¹s&supmin;¹ bei pH 7,0, 20ºC, niedrige Ionenstärke. Ergebnisse dieser Messungen sind in den Fig. 10 bis 13 dargestellt. Mit Actomyosin unter Verwendung des CPM-PBP durchgeführte Experimente ergaben ähnliche Ergebnisse, wie es in den Fig. 14 und 15 dargestellt ist.
Die Analyse der Effekte von Pi-Analoga und der Lösungszusammensetzung wurde wie für MDCC-PBP durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3

Fluoreszenz-Änderung von CPM-PBP infolge verschiedener Zusätze und Lösungszusammensetzungen.

A. Zusätze % Fluoreszenz-Zuwachs
Pi (50 uM) 65
Pyrophosphat (100 uM) [a] 5
ATP (100 uM) 5
ATP (1 mM) 13
GDP (100 uM) 5
ADP (100 uM) 4
Glucose-6-Phosphat (100 uM) 4
Natriumsulfat (1 mM) 0
BeCl&sub2; (50 uM/NaF (50 mM) -10
A12SO&sub4; (50 uM)/NaF (50 mM) -8
Natriumarsenat (100 uM) 25
Natriumvanadat (100 uM) -2
Natriumvanadat (1,1 mM) -11
B. Lösungszusammensetzung
10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl 63
10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl 45
10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl 32
20 mM Tris-HCl (pH 8,0) 69
20 mM Tris-HCl (pH 7,5) 60
20 mM Tris-HCl (pH 7,0) 44
20 mM PIPES (pH 7,0) 37
Außer dort, wo es angegeben ist, enthielten die Lösungen 6 uM (A), 7 uM (B) CPM-PBP in 10 mM Tris. HCl (pH 8,0). Den Lösungen in B war 100 uM Pi zugesetzt worden, um die angegebene Fluoreszenz-Änderung zu erzeugen. Die Fluoreszenz-Änderung wurde bei Maximal-Emission mit Anregung bei 397 nm gemessen. Nach den Zugaben in A bewirkte Pi-Zusatz den vollen Fluoreszenz-Anstieg. [a] 2 uM CPM-PBP.

LITERATURVERZEICHNIS

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Claims

1. Phosphat-bindendes Protein, das durch Anfügen von wenigstens einer detektierbaren Markierungssubstanz modifiziert ist, die sensitiv gegenüber dem Binden von anorganischem Phosphat ist.

2. Protein nach Anspruch 1, bei dem die detektierbare Markierungssubstanz an einen Bereich des Proteins angefügt ist, der bei Pi-Bindung eine Konformationsänderung durchläuft.

3. Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die detektierbare Markierungssubstanz über einen Cystein-Rest in dem Protein angefügt ist.

4. Protein nach Anspruch 3, bei dem der Cystein-Rest in die Sequenz des Proteines eingebaut wurde.

5. Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ein modifiziertes E.coli phoS PBP ist.

6. Protein nach Anspruch 4, das ein mutiertes E.coli phoS PBP ist, das die Mutation A197C aufweist.

7. Protein nach Anspruch 3, Anspruch 4 oder Anspruch 6, bei dem die detektierbare Markierungssubstanz über eine Thiolreaktive Bindungsgruppe angefügt ist.

8. Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die detektierbare Markierungssubstanz eine fluoreszierende Markierungssubstanz ist.

9. Protein nach Anspruch 8, bei dem die Markierungssubstanz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Acrylodan, Cumann, Dansylaziridin, Dimethylaminonaphthalinsulfonamid und Derivaten davon besteht.

10. Protein nach Anspruch 9, bei dem die Markierungssubstanz 7-Diethylamino-3-[4'-(1-maleimidyl)phenyl]-4-methylcumarin (CPM) ist.

11. Protein nach Anspruch 9, bei dem die Markierungssubstanz N-[2-(1-Maleimidyl)ethyl] 7-diethylaminocumarin-3- carboxamid (MDCC) ist.

12. Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das mehr als eine detektierbare Markierungssubstanz aufweist.

13. Verfahren zum Detektieren von anorganischem Phosphat in einer Probe, mit den Schritten:

(A) Man läßt beliebiges Phosphat in der Probe an ein zumindest eine detektierbare Markierungssubstanz aufweisendes modifiziertes Phosphat-bindendes Protein binden, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert ist, und.

(B) detektiert eine Änderung in den detektierbaren Eigenschaften der Markierungssubstanz oder Markierungssubstanzen und setzt diese Änderung zu der vorhandenen Phosphat-Konzentration ins Verhältnis.

14. Verfahren nach Anspruch 13, das weiter die Verwendung eines Phosphat-Mop-Systemes umfaßt.

15. Phosphat-bindendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Verwendung als diagnostisches Agens.

16. Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, das die Untersuchung von anorganischen Phosphat-Pegeln in vitro unter Verwendung eines Phosphat-bindenden Proteines nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfaßt.