DE69420308T2

DE69420308T2 - Indikatorreagenzien zum Nachweis oder zur Messung von Analyten, Testsatz, der diese enthält, und Verfahren zum Nachweis oder zur Messung

Info

Publication number: DE69420308T2
Application number: DE69420308T
Authority: DE
Inventors: Patrick Englebienne
Original assignee: DIAGAM GHISLENGHIEN
Current assignee: DIAGAM GHISLENGHIEN
Priority date: 1993-05-03
Filing date: 1994-04-25
Publication date: 2000-04-06
Anticipated expiration: 2014-04-26
Also published as: DE69420308D1; BE1006245A3; EP0623822A1; EP0623822B1; ATE184109T1

Description

Gegenstand der Erfindung sind Reagenzien, die in verschiedenen Tests zum Nachweis und zur Dosierung von Analyten, insbesondere in immunologischen Tests einsetzbar sind, bei denen leitfähige Polymere verwendet werden, ein Verfahren zum Nachweis oder zur Dosierung eines Analyten mittels dieser Reagenzien sowie sie enthaltende Kits.
Seit den 80er Jahren wurden auf dem Gebiet leitfähiger Polymere, bei denen es sich um organische Polymere handelt, die für ihre interessanten optischen und elektrischen Eigenschaften hinreichend bekannt sind, zahlreiche Untersuchungen durchgeführt.
Die wichtigsten der bekannten leitfähigen Polymere sind Polyanilin, Polypyrrol, Polythiophen, Polyacetylen, Polyphenylen, Polynaphthalin, Polycarbazol, Polypyren, Poly(pyrenylen vinylen), Polyazulen, Polyisothianaphthen, Poly(phenylen vinylen), Polythiophenol, usw.
Weitere, hier nicht angegebene Polymere fallen ebenfalls unter die Bezeichnung leitfähiger Polymere.
Allen leitfähigen Polymeren ist ein Kennzeichen gemeinsam: sie besitzen entlang ihrer Polymerkette zwischen Kohlenstoffatomen abwechselnd Einfach- und Doppelbindungen.
Diese Polymere werden in der Regel durch Dotierung mit einem externen Mittel leitfähig gemacht. Das dotierte Polymergerüst wird reduziert oder oxidiert, wodurch entlang der Polymerkette bewegliche Elektronenladungen entstehen, die für die Leitfähigkeit verantwortlich sind.
Auf natürliche Weise selbstdotierte leitfähige Polymere sind ebenfalls bekannt.
Das gleiche leitfähige Polymer kann je nach Oxidationsstufe verschiedene Farben aufweisen. Dies läßt sich auf bedeutende Änderungen in den elektronischen Absorptionsspektren zurückführen, die sich aufgrund der Änderungen in der elektrischen Ladung im Polymer ergeben.
Die Löslichkeit leitfähiger Polymere und ihrer Derivate in verschiedenen Medien war Gegenstand vieler Untersuchungen.
In dem Artikel von J. A. Frommer unter dem Titel "Conducting polymer solutions" (Leitfähige Polymerlösungen), Acc. Chem. Res. 1986, 19, 2-9, wurde beispielsweise die Löslichkeit eines leitfähigen Polymers in ungewöhnlichen Lösungsmitteln wie AsF&sub3;, SbCl&sub3; oder flüssigem Iod beschrieben.
In dem Artikel von Bryce M. R. et al. unter dem Titel "Soluble, conducting polymers from 3- substituted thiophenes and pyrroles" (Lösliche, leitfähige Polymere aus 3-substituierten Thiophenen und Pyrrolen), J. Chem. Soc.; Chem. Commun., 1987, 466-467, wurde darauf hingewiesen, daß Polymere, die durch Polymerisation von in 3-Stellung langkettig substituierten Monomeren hergestellt werden, in herkömmlichen organischen Lösungsmitteln löslich sind.
Vor kurzem erfolgte die Synthese wasserlöslicher leitfähiger Polymere.
In dem Artikel von Patil et al. unter dem Titel "Self-doped conducting polymers" (Selbstdotierte leitfähige Polymere), Synthetic Metals, 20 (1987) 151- 159, wird erwähnt, daß am Thiophenring durch eine relativ lange Kohlenwasserstoffkette substituierte Polythiopenderivate wasserlöslich gemacht werden konnten.
Die Patentanmeldungen WO 91/05979 und WO 91/06887 betreffen wasserlösliche Sulfonderivate des Polyanilins.
Leitfähige Polymere lassen sich außerdem unter bestimmten Synthesebedingungen in Wasser dispergieren und können kolloidale oder Latexlösungen bilden.
Bei jeder immunologischen Technik, die darauf abzielt, einen Analyten nachzuweisen oder zu dosieren, kommt es zur Bildung von Immunkomplexen. Die Bildung dieser Immunkomplexe erfolgt durch Bindung eines Antigens an einen Antikörper. Bei den ersten, auf diesem Prinzip beruhenden Dosierungen wurde die Bildung von Immunkomplexen durch die Trübung nachgewiesen, die sie im Reaktionsmedium hervorrufen. Dieser Nachweis wurde im Laufe der Zeit durch den Einbau von Tracern, insbesondere von radioaktiven, fluoreszierenden, enzymatischen und kolloidalen Tracern, in die verwendeten Reagenzien nach und nach verbessert.
Daß man daran interessiert ist, kolloidale Teilchen als Tracer zu verwenden, mit denen sich die Bildung von Immunkomplexen verfolgen läßt, liegt im wesentlichen an der durch die Anwesenheit dieser Tracer verursachten Vergrößerung dieser Komplexe. Die durch Bildung dieser von diesem Tracer "markierten" Komplexe verursachte Trübung ist daher stark erhöht.
Aus der Patentanmeldung EP-A-0360088 ist bekannt, daß sich leitfähige Polymere oder deren Derivate in Form eines Latex in Indikatorreagenzien, insbesondere für immunologische Tests, einsetzen lassen.
Der Einsatz von leitfähigen Polymeren in kolloidaler Form als Tracer bei immunologischen Tests rührt von dem weiter oben dargelegten Prinzip her. Außerdem bringt ihre Verwendung eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Kolloiden mit sich, insofern diese leitfähigen Polymere in der Regel stark gefärbt und somit mit dem Auge leichter nachweisbar sind. Trotzdem sehen sich die Anwender von kolloidalen Tracern trotz des Interesses, das diese Technik hervorgerufen hat, gegenwärtig Problemen gegenüber, die durch die Selbstgerinnung und/oder durch nichtspezifische Wechselwirkungen aufgrund des Vorliegens von Teilchen verursacht werden.
Ansonsten hat die Anwendung von wasserlöslichen Polymeren ganz allgemein als Tracer bei immunologischen Tests kein Interesse gefunden. Dieser Mangel an Interesse rührt von der gleichen Logik her. Da diese wasserlöslichen Polymere eine viel geringere Größe besitzen, neigen sie in der Tat nicht dazu, die Größe der Immunkomplexe so stark zu erhöhen, wie dies bei den kolloidalen Polymeren der Fall ist.
Somit schien es, daß ihre Verwendung als Tracer ausgeschlossen werden müßte.
Es hat sich jetzt gezeigt, daß ein erfindungsgemäßes Indikatorreagenz, das einen an einen spezifischen Bindungspartner gebundenen Tracer enthält, wobei dieser Tracer ein wasserlösliches leitfähiges Polymer ist, entgegen allen Erwartungen mit Erfolg zum Nachweis oder zur Dosierung eines Analyten in einer Probe einsetzbar ist. Die erfindungsgemäßen Indikatorreagenzien können nämlich bei Bindung ihres spezifischen Bindungspartners an einen Komplementärpartner ein Signal senden.
Zum besseren Verständnis der Beschreibung der Erfindung sind nachstehend einige Definitionen angegeben.
Im Rahmen der Erfindung wird unter einem Polymer ein organisches Molekül verstanden, das durch wiederholte Kondensation von als Monomeren bezeichneten kleineren Molekülen gebildet wurde. Erfolgt die Bildung eines Polymers aus untereinander identischen Monomeren, so spricht man von einem Homopolymer. Erfolgt die Bildung durch abwechselnde Kondensation verschiedener Monomere, so spricht man von einem Copolymer. Besitzt das Polymer schließlich ein niedriges Molekulargewicht, so spricht man von einem Oligomer.
Unter "leitfähiges Polymer" versteht man ein beliebiges organisches Polymer, das elektrische Leitfähigkeitseigenschaften besitzen kann.
Mit dem Begriff "Analyt" bezeichnet man einen in einer zu prüfenden Probe nachzuweisenden oder zu dosierenden Stoff.
Unter "spezifischer Bindungspartner" versteht man ein Molekül, das Bestandteil eines Paars verschiedener Moleküle ist, die auf chemischem oder physikalischem Weg spezifisch aneinander gebunden werden können. Zwei Partner des gleichen Paars werden als "komplementär" bezeichnet.
Ein hervorragendes Beispiel für solche spezifischen Paare ist das Paar Antigen-Antikörper. Als weitere spezifische Paare sind beispielsweise die komplementären Nukleotidsequenzen, die komplementären Peptidsequenzen, die Paare Hapten-Antikörper, die Paare Rezeptor-Ligand, die Paare Enzym-Substrat usw. zu nennen.
Die erfindungsgemäßen Indikatorreagenzien lassen sich in verschiedenen Arten von Immundosierungen einsetzen.
Unter anderem sind die immunologischen Tests, auf die die Erfindung anwendbar ist, sowohl heterogen als auch homogen.
Bei den homogenen Tests handelt es sich um solche, bei denen die Bestandteile der Reaktion bzw. Reagenzien in Lösung bleiben und vor Messung des durch das Indikatorreagenz hervorgerufenen Signals nicht getrennt werden.
Bei den heterogenen Tests handelt es sich um solche, bei denen vor Messung des Signals eine Trennung der freien und gebundenen Fraktionen der Reaktionsbestandteile bzw. Reagenzien erfolgt. Diese Trennung kann entweder dadurch erfolgen, daß man das Reagenz zuvor an einer Feststoffphase anbindet oder die im Verlauf der Reaktion auf physikalischem, chemischem oder biochemischem Weg (durch Zugabe eines oder mehrerer Nebenbindungspartner, die für einen oder mehrere spezifische Hauptbindungspartner spezifisch sind) gebildeten Immunkomplexe ausfällt und anschließend die Feststoffphase oder den Niederschlag durch Waschen, Zentrifugation oder Filtration aus dem Reaktionsmedium entfernt.
Die homogenen oder heterogenen Tests können ebenfalls auf der Basis eines Sandwich- oder Konkurrenzmodells konzipiert sein.
Sie können ebenfalls auf der Basis direkter oder indirekter Modelle konzipiert sein, wobei beim indirekten Modell ein oder mehrere Nebenbindungspartner zum Einsatz kommen.
Die vorstehenden Angaben stellen keine Beschränkung dar, und der Fachmann kann leicht andere Arten von Tests konzipieren, die nicht unbedingt unter die beschriebenen Modelle fallen.
Dennoch ist die Erfindung nicht auf diese Anwendung beschränkt. Sie betrifft ganz allgemein alle Arten von Dosierungen, bei denen spezifische Bindungspartner und mindestens ein Tracer aus einem wasserlöslichen leitfähigen Polymer beteiligt sein können.
Bei den dosierten Analyten kann es sich nicht nur um Antigene oder Antikörper, sondern um jeden beliebigen Stoff handeln, auf den sich das Prinzip der durchgeführten erfindungsgemäßen Dosierungen und Nachweistests anwenden läßt.
Unter "Einfangreagenz" versteht man ein Reagenz, das einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten darstellt und entweder den letzteren immobilisieren kann (heterogener Test) oder auch Bindungsstellen anbieten kann, um die der Analyt mit dem erfindungsgemäßen Indikatorreagenz in Konkurrenz treten kann (Konkurrenztest).
Unter "spezifischer Hauptbindungspartner" versteht man einen spezifischen Bindungspartner gemäß der vorstehenden Definition, der an der Hauptreaktion des Nachweis- oder Dosierungstests beteiligt ist. Anders ausgedrückt ist sein Komplementärpartner entweder der Analyt oder das Einfangreagenz (im Falle eines Konkurrenztests).
Unter "spezifischer Nebenbindungspartner" versteht man einen spezifischen Bindungspartner, der an einer Nebenreaktion des Nachweis- oder Dosierungstests (indirekter Test oder heterogener Test) beteiligt ist und dessen Komplementärpartner beispielsweise der spezifische Hauptbindungspartner oder auch das Einfangreagenz, deren Komplex mit dem Analyten oder der Tracer selbst ist, für den Fall, daß der letztere an ein oder mehrere dieser weiteren Reagenzien gebunden ist.
Bei den erfindungsgemäßen Reagenzien kann es sich bei den leitfähigen Polymeren um Homopolymere oder Copolymere handeln, die durch Kondensation substituierter Derivate von Monomeren gebildet wurden, die aus der Gruppe bestehend aus Anilin, Pyrrol, Thiophen, Acetylen, Phenylen, Naphthalin, Carbazol, Pyren, Pyrenylen Vinylen, Azulen, Isothianaphthen, Phenylen Vinylen und Thiophenol ausgewählt sind.
Vorzugsweise erfolgt die Bildung des leitfähigen Polymers aus Monomeren, die durch eine oder mehrere Gruppierungen, ausgewählt aus den Gruppierungen Carboxyl, Sulfonyl, Phenol, Thiol, Alkohol, Aldehyd, Amin, Nitril, Amid, Keton, Nitro und Halogen, substituiert sind.
Jede Substitutionsgruppierung kann entweder direkt am Monomer oder über eine Kohlenwasserstoffkette oder einen Ring indirekt an diesem befestigt sein.
Als wasserlösliche leitfähige Polymere sind Poly(anilin-2-carbonsäure), Poly(anilin-2-sulfonsäure), Poly(thiophen-3-carbonsäure) und Poly(thiophen-3- carboxaldehyd) bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Indikatorreagenzien können in Trockenform oder in in einem wäßrigen Medium gelöster Form vorliegen.
Die erfindungsgemäßen Indikatorreagenzien können auf einem Feststoffträger angeordnet sein und in einer interessanten Ausführungsform in Form eines Films vorliegen.
Bei dem von den erfindungsgemäßen Indikatorreagenzien gesendeten Signal kann es sich um ein optisches durch das Auge nachweisbares oder quantitativ bestimmbares Signal oder um ein durch ein Instrument nachweisbares oder quantitativ bestimmbares Signal handeln.
Das zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung des Signals verwendete Instrument kann zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Reflexion, Beugung, Brechung oder Absorption von ultraviolettem, sichtbarem oder Infrarot-Licht geeignet sein.
Vorzugsweise sind der spezifische Bindungspartner, an den der Tracer des Indikatorreagenz gebunden sein kann, und dessen Komplementärpartner aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Haptenen und Antikörpern, Enzymen und Substraten, sowie Rezeptoren und Liganden ausgewählt.
Der Tracer kann an diesen spezifischen Bindungspartner mittels einer kovalenten Bindung oder durch passive Adsorption gebunden werden.
Der spezifische Bindungspartner eines erfindungsgemäßen Indikatorreagenz kann je nach Fall ein spezifischer Haupt- oder Nebenbindungspartner sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Tracers aus einem wasserlöslichen leitfähigen Polymer, wobei dieser Tracer an einen spezifischen Bindungspartner gebunden werden und in einem erfindungsgemäßen Indikatorreagenz enthalten sein kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Kits zum Nachweis und zur Dosierung eines Analyten in einer zu prüfenden Probe, die mindestens ein erfindungsgemäßes Indikatorreagenz enthalten. Sie können außerdem ein Einfangreagenz enthalten. Dieses kann gegebenenfalls an einer Feststoffphase befestigt sein.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthalten diese Kits weiterhin mindestens einen spezifischen Nebenbindungspartner.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer zu prüfenden Probe, das die folgenden Schritte umfaßt:
a) man gibt in die Probe mindestens ein erfindungsgemäßes Indikatorreagenz;
b) man läßt das Indikatorreagenz an den Komplementärpartner des spezifischen Bindungspartners anbinden, den es enthält;
c) man trennt gegebenenfalls die freien und gebundenen Fraktionen des Indikatorreagenz voneinander;
d) man weist das Indikatorreagenz und somit das Vorliegen des Analyten in der Probe nach.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Nachweisverfahren weiterhin den folgenden Schritt:
e) man gibt in die 2u prüfende Probe ein gegebenenfalls an einer Feststoffphase befestigtes Einfangreagenz.
Gegebenenfalls umfaßt es auch noch den folgenden Schritt:
f) man gibt in die zu prüfende Probe, falls der Analyt nicht der Komplementärpartner des spezifischen Bindungspartners des Indikatorreagenz ist, mindestens einen spezifischen Hauptbindungspartner.
Weiterhin kann das Verfahren noch den folgenden Schritt umfassen:
g) man gibt in die zu prüfende Probe mindestens einen spezifischen Nebenbindungspartner.
Es versteht sich von selbst, daß die Schritte a, e, f und g gleichzeitig oder nacheinander erfolgen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Dosierung eines Analyten einer zu prüfenden Probe, bei dem man den Analyten nach einem der oben beschriebenen Verfahren nachweist,
h) das Signal mißt und
i) eine Korrelation zwischen dieser Messung und der in der Probe vorliegenden Menge an Analyt herstellt.
Zum besseren Verständnis der Erfindung sei auf die nachfolgend beschriebenen und in den Abbildungen erläuterten Ausführungsbeispiele verwiesen. Es zeigen:
- Abb. 1 eine bei der konkurrierenden Dosierung menschlichen Serumalbumins (hSA) unter Verwendung von kolloidalem Polyanilin (Abkürzung PA) als Tracer in einem Reagenz aus dem Stande der Technik erhaltene Dosis-Wirkung-Kurve;
- Abb. 2 eine bei der konkurrierenden Dosierung menschliches Serumalbumins (hSA) unter Verwendung von wasserlöslicher Poly(anilin-2-carbonsäure) (Abkürzung PA-COOH) als Tracer in einem erfindungsgemäßen Indikatorreagenz erhaltene Dosis-Wirkung-Kurve, und zwar bei Konzentrationen an Indikatorreagenz und Antiserum, die denen vergleichbar sind, die bei der in Abb. 1 gezeigten Kurve verwendet wurden;
- Abb. 3 bei der konkurrierenden Dosierung menschliches Apotransferrins (hTRF) bei verschiedenen Konzentrationen an Antiserum unter Verwendung von wasserlöslicher Poly(thiophen-3- carbonsäure) (Abkürzung PT-COOH) als Tracer in einem erfindungsgemäßen Indikatorreagenz erhaltene Dosis-Wirkung-Kurven;
- Abb. 4 bei der Dosierung eines Überschusses an Antikörpern des menschlichen C-Reaktivproteins (h-CRP) unter Verwendung entweder von wasserlöslichem Poly(thiophen-3-carboxaldehyd) (Abkürzung PT-CHO) als Tracer in einem erfindungsgemäßen Indikatorreagenz oder von nicht markiertem Antiserum (Kontrolle) erhaltene Dosis- Wirkung-Kurven;
- Abb. 5 die bei der Dosierung eines Überschusses an Antikörpern des h-CRP unter Verwendung von wasserlöslicher Poly(anilin-2- sulfonsäure) (Abkürzung PA-SO&sub3;) als Tracer in einem erfindungsgemäßen Indikatorreagenz erhaltene Dosis-Wirkung-Kurve;
- Abb. 6 bis 9 die jeweilige Wirkung des pH- Werts auf die elektronischen Absorptionsspektren von PA-SO&sub3;, PA-COOH, PT-COOH und PT-CHO in wäßriger Lösung, und
- Abb. 10 den Vergleich der elektronischen Absorptionsspektren von kolloidalem PA und wasserlöslichem PA-SO&sub2; in wäßriger Lösung beim gleichen pH-Wert.

Beispiele

1) Herstellung von wasserlöslichen leitfähigen Polymeren:

Die Synthesen wurden ausgehend von den folgenden substituierten Monomeren:
1) Anilin-2-sulfonsäure
2) Anilin-2-carbonsäure
3) Thiophen-3-carbonsäure
4) Thiophen-3-carboxaldehyd
in einem wäßrigen Medium mit 8,4 ml 37%iger HCl pro 100 ml H&sub2;O in Gegenwart eines Oxidationsmittels (Ammoniumpersulfat) durchgeführt.
Die verschiedenen Monomere wurden mit Ammoniumpersulfat bei Raumtemperatur über einen je nach der Geschwindigkeit des Auftretens des Polymers verschieden langen Zeitraum, und zwar
- 48 Stunden für PA-SO&sub3;;
- 24 Stunden für PA-COOH;
- 3 ¹/&sub2; Stunden für PT-COOH;
- 4 ¹/&sub2; Stunden für PT-CHO
umgesetzt.
Diese Synthesebedingungen sind lediglich beispielhaft und nicht als Beschränkung aufzufassen.
Nach Beendigung der Synthese wurden die Lösungen mit laufendem entionisiertem Wasser dialysiert.
Mit Ausnahme der Thiophen-3-carbonsäure, die in heißem Wasser gelöst wurde, wurden die Monomere bei Raumtemperatur stehengelassen.
Die Absorptionsspektren der verschiedenen Polymere bei verschiedenen pH-Werten sind in den weiter unten besprochenen Abb. 6 bis 9 aufgeführt.
Zum Vergleich wurde ebenfalls Polyanilin in kolloidaler Lösung (Abkürzung PA) synthetisiert. Man löste Polyvinylalkohol (10 Gramm; PVA) in 200 ml siedendem Wasser. Zum Ausgleich des verdampfenden Wassers wurde kontinuierlich Wasser zugegeben. Die noch heiße Lösung wurde filtriert und nach dem Erkalten durch Zugabe von 16,8 ml 12 N HCl angesäuert. Die Hälfte wurde in ein sauberes Gefäß überführt und bei 4ºC mit einem Magnetrührer gerührt.
In die Lösung wurden 0,25 ml Anilin eingespritzt, und dann ließ man abkühlen.
0,658 g Ammoniumpersulfat, gelöst in 5 ml Wasser, wurde zugegeben, und die Polymerisation wurde 48 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Die Lösung wurde eingehend mit entionisiertem Wasser dialysiert, und das Kolloid wurde durch mehrfaches Zentrifugieren gewaschen.

2) Chromatographie

Man füllt Säulen (2 · 40 cm) mit Sephacryl S- 1000 und äquilibriert sie mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8,0. Aliquote Teile der wäßrigen PA-SO&sub3;-, PA-COOH-, PT-COOH- und PT-CHO-Lösung sowie der kolloidalen PA- Lösung (im letzteren Fall enthält der Puffer außerdem 0,5% V/V Tween 20) werden auf die Säulen gegeben und mit Äquilibrierungspuffer als Laufmittel chromatographiert. Es werden jeweils die dem ersten Peak entsprechenden polymerhaltigen Fraktionen gesammelt und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Die verschiedenen wasserlöslichen Polymere bleiben nach ihrer Synthese mindestens 24 Stunden stabil. Zumindest nach chromatographischer Reinigung beträgt ihre Stabilität mehrere Wochen. Ihr Molekulargewicht liegt nach der Chromatographie zwischen 50 und 100 kDa.
Daß die wäßrigen Lösungen der wasserlöslichen Polymere in einer echten Lösung vorliegen, wurde durch folgende Kriterien nachgewiesen: es wird keine Bodensatzbildung nach 2-stündigem Zentrifugieren bei 45.000 g beobachtet, und die Untersuchung der Photonenemission durch Lichtbeugung unter einem veränderlichen Winkel ist statistisch mit dem Untergrundrauschen vergleichbar.

3) Kupplungen

Die verschiedenen synthetisierten wasserlöslichen leitfähigen Polymere werden als Tracer in Indikatorreagenzien für Nachweis- oder Dosierungstests eingesetzt. Diese Tracer müssen zuvor an einen spezifischen Bindungspartner gebunden worden sein. In den nachstehend angegebenen Beispielen sind diese spezifischen Bindungspartner Proteine, insbesondere Antigene oder Antikörper.
Es wurden also nach der chromatographischen Reinigung Kupplungen entweder mittels kovalenter Bindung oder passiver Adsorption gemäß den verschiedenen Protokollen in Abhängigkeit von der Struktur des verwendeten Polymers durchgeführt.
Bei PA-COOH und PT-COOH wurde als Kupplungsmittel ein Carbodiimid verwendet.
Die Kupplung von PT-CHO mit Proteinen erfolgt über die Bildung von Aldimin.
Die Kupplung von PA-SO&sub3; mit Proteinen erfolgt mittels passiver Adsorption.

a) Kovalente Kupplung von menschlichem Serumalbumin (hSA) mit Polyanilin in kolloidaler Lösung (PA)

40 ml des chromatographisch gereinigten Polymers wurden mit 20 ml 25%igem (V/V) Glutaraldehyd gemischt und 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Anschließend wird die Mischung erneut chromatographisch gereinigt, wobei die dem Polymerpeak entsprechenden Fraktionen gesammelt werden.
Die Lösung wurde mit 10 mg hSA pro ml versetzt, und die Mischung wurde 48 Stunden bei 4ºC inkubiert. Man fügte Ethanolamin bis zum Erreichen einer 1-molaren Lösung zu und inkubierte die Mischung erneut 48 Stunden bei 4ºC und reinigte sie dann erneut chromatographisch.

b) Kovalente Kupplung von hSA mit Poly(anilin-2- carbonsäure) (PA-COOH) in wäßriger Lösung

30 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid werden zu 30 mg in 25 ml Wasser gelöstem hSA gegeben. Die Proteinlösung wurde tropfenweise unter Rühren mit einem Magnetrührer mit 30 ml chromatographisch gereinigter Poly(anilin-2- carbonsäure)-Lösung (4,4 AE/ml bei 325 nm und pH 6,85) versetzt, wobei der pH-Wert mit 0,1 N HCl auf 5,5 eingestellt und gehalten wurde.
Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden erneut 10 mg des Carbodiimidderivats zugegeben, und die Mischung wurde 18 Stunden im Dunkeln unter Rühren mit einem Magnetrührer stehengelassen. Die Lösung wurde durch Dialyse mit Aquacid III auf 25 ml konzentriert und dann mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,0 auf 30 ml verdünnt und mit 6 M NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.

c) Kovalente Kupplung von hTRF mit Poly(thiophen-3- carbonsäure) (PT-COOH) in wäßriger Lösung

Es wurde analog dem unter b) beschriebenen Protokoll gearbeitet.

d) Kovalente Kupplung des Antikörpers Anti-hCRP mit Poly(thiophen-3-carboxaldehyd) (PT-CHO) in wäßriger Lösung

1 ml gepufferte Lösung der IgG-Fraktion von Kaninchen-Antiserum wurde mit 0,3 ml chromatographisch gereinigtem Polymer gemischt, und die Mischung wurde 48 Stunden bei 4ºC inkubiert und dann ohne weitere Behandlung verwendet.

e) Passive Kupplung des Antikörpers Anti-hCRP mit Poly(anilin-2-sulfonsäure) (PA-SO&sub3;) in wäßriger Lösung

Ziegen-Anti-hCRP-Antiserum wurde mit der gleichen Menge an chromatographisch gereinigtem Polymer gemischt, und die Mischung wurde 48 Stunden bei 9ºC inkubiert und dann ohne weitere Behandlung verwendet.

4) Dosierungen

4.1. Konkurrierende Immundosierungen (mit Überschuß an Antigen)

Bei solchen Dosierungen tritt der zu dosierende Analyt mit einer bestimmten Menge an mit dem Tracer markiertem Analyt um eine bestimmte Menge von Bindungsstellen eines Antikörpers in Konkurrenz.

4.1.a) Konkurrierende Dosierung von hSA unter Verwendung von Polyanilin in kolloidaler Lösung als Tracer (PA)

Das Vorliegen von hSA an PA-Teilchen wurde durch Untersuchung des elektronischen Absorptionsspektrums nachgewiesen, wobei ein Peak bei 280 mm auf das Vorliegen des Proteins im Kupplungsprodukt schließen läßt.
Das durch Kupplung entstandene PA-hSA-Reagenz wurde zur Titrierung von Antiserum verwendet, das mit 35 mM Imidazolpuffer pH 7,0, der 150 mM NaCl und 40 g/l Polyethylenglycol 6000 enthielt, verdünnt worden war. Für die Dosierung wurde eine Antikörperverdünnung gewählt, die ein Signal ergibt, das zwischen der Hälfte und einem Drittel desjenigen liegt, das bei einer für die verwendete Tracermenge sättigenden Antikörperverdünnung hervorgerufen wird.
Diese Dosierung wurde mittels eines automatischen Analysators des Typs Cobas Mira durchgeführt, für den zuvor ein Programm geschrieben wurde. Dieses Programm sieht vor, 30 ul Tracer und 30 u Probe (mit 0,15 M NaCl verdünntes hSA) mit 300 ul der Antikörperverdünnung zu mischen. Nach einer Inkubation von 10 Minuten bei 37ºC wurde der bei 340 nm abgelesene optische Dichteunterschied zwischen dem Zeitpunkt des Endes der Inkubation und dem Zeitpunkt des Mischens der Reagenzien und der Probe berechnet, wobei die Meßdaten der optischen Dichte am Ende der Inkubation direkt aufgezeichnet wurden, ohne daß eine Trennung der freien von den gebundenen Fraktionen des Reaktionsmediums stattgefunden hätte.
Die erzielten Ergebnisse sind in Abb. 1 aufgeführt.
In dieser Abbildung ist auf der Abszisse der Logarithmus der Konzentration des Analyten (hSA) in ug/ml und auf der Ordinate der Prozentanteil B/Bo aufgetragen, wobei
- Bo die Höchstmenge an Reagenz (an den Tracer gebundenes hSA) ist, die sich am Antikörper (AntihSA) anbinden kann, wenn das Medium keinen Analyten (PA) enthält, und
- B die Menge an Reagenz bedeutet, die an die von dem in der Probe vorliegenden Analyten nicht besetzten Stellen des Antikörpers gebunden werden kann.
Der optische Dichteunterschied wird auf herkömmliche Weise in % B/Bo umgerechnet.

4.1.b) Konkurrierende Dosierung von hSA unter Verwendung von wasserlöslicher Poly(anilin-2- carbonsäure) (PA-COOH) als Tracer

Man verfährt nach dem gleichen Versuchsprotokoll wie für die kolloidale Polyanilinlösung.
Die erzielten Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt, deren Koordinaten die gleiche Bedeutung besitzen wie in Abb. 1.
Es ist zu erkennen, daß bei der gleichen Antikörperverdünnung und bei ähnlichen Tracerkonzentrationen wie den unter a) verwendeten eine etwa um das Zehnfache höhere Empfindlichkeit beobachtet wird.

4.1.c) Konkurrierende Dosierung von hTRF unter Verwendung von wasserlöslicher Poly(thiophen- 3-carbonsäure) (PT-COOH) als Tracer

Man verfährt nach dem gleichen Versuchsprotokoll wie unter a) und b). Als Antikörper wird Anti-hTRF verwendet.
Die mit verschiedenen Antiserumverdünnungen erzielten Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt (gleiche Koordinaten wie in Abb. 1 und 2).
Es ist zu erkennen, daß sich bei gleichbleibender spezifischer Aktivität des Reagenzes mit zunehmender Verdünnung des Antiserums eine stetig zunehmende Empfindlichkeit erzielen läßt.
Unter spezifischer Aktivität versteht man das Verhältnis der Menge an Tracer zur Menge an spezifischen Bindungspartnern im Reagenz.

4.2 Immundosierungen mit einem Überschuß an Antikörper

Diese Art von Dosierung besteht in der Inkubation des Analyten in einem hohen Überschuß an Antikörper mit anschließender Aufzeichnung der bei der Bildung des Immunkomplexes erhaltenen optischen Dichte und Korrektur im Vergleich mit der Kontrolle.
Die in den nachstehenden Beispielen angegebenen Dosierungen wurden auf einem automatischen Analysator des Typs Cobas Mira durchgeführt. Das Programm sieht eine Verdünnung der zu dosierenden Probe (menschliches Serum) von 1 : 4 (V/V) in 150 mM NaCl und das Mischen von 30 ul dieser Verdünnung mit 120 ul von 35 mM MES-Puffer pH 6,5, der 150 mM NaCl und 40 g/l Polyethylenglycol 6000 enthält, und 3 ul Reagenz (Antikörper im Falle der Kontrolldosierung und an den Tracer gekuppelter Antikörper in den übrigen Fällen) vor. Nach einer 10-minütigen Inkubation wird der optische Dichteunterschied zwischen dem Ende der Inkubation und dem Zeitpunkt des Mischens berechnet.

4.2.a) Konkurrierende Dosierung von hCRP unter Verwendung von wasserlöslichem Poly(thiophen- 3-carboxaldehyd) (PT-CHO) als Tracer

Sowohl bei der Dosierung mit Tracer (PT-CHO) als auch bei der Kontrolldosierung (Kontrolle ohne Tracer) wurde die optische Dichte bei 340 nm aufgezeichnet.
Die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt, in der auf der Ordinate der optische Dichteunterschied zwischen der Probe und der Kontrolle bei 340 nm und auf der Abszisse die Konzentration des Analyten in ug/ml aufgetragen ist.
In dieser Abbildung sind die mit dem erfindungsgemäßen Reagenz an PT-CHO als Tracer erzielten Ergebnisse durch Dreiecke dargestellt, während die Quadrate die mit der Kontrolle (Antikörper allein) erzielten Ergebnisse bedeuten.
Es ist zu erkennen, daß man bei Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenz ein lineares Dosis- Wirkung-Verhältnis sowie eine gegenüber der Kontrolle deutliche Verstärkung des Signals erhält.

4.2.b) Dosierung von h-CRP unter Verwendung von wasserlöslichem Poly(anilin-2-sulfonsäure) (PA-SO&sub3;) als Tracer

In diesem Fall wurde die optische Dichte bei 405 nm aufgezeichnet.
Die Ergebnisse sind in Abb. 5 dargestellt, in der auf der Ordinate der optische Dichteunterschied zwischen der Probe und der Kontrolle bei 405 nm und auf der Abszisse die Konzentration des Analyten in ug/ml aufgetragen ist.
Es ist zu erkennen, daß man in diesem Fall trotz Verwendung eines nicht gereinigten Antiserums ebenfalls ein lineares Dosis-Wirkung-Verhältnis erhält.

5) Spektralanalyse

Der Einfluß des pH-Werts auf das Spektrum der vier synthetisierten wasserlöslichen leitfähigen Polymere ist jeweils in den Abb. 6 bis 9 dargestellt.
Bei allen Schaubildern dieser Abbildungen und dem der Abb. 10 ist die in nm ausgedrückte Wellenlänge auf der Abszisse und die optische Dichte auf der Ordinate aufgetragen.
Die chromatographisch gereinigten Polymerlösungen wurden je nach Polymer auf 1 : 10 bis 1 : 100 (V/V) verdünnt.
Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 3 M HCl oder 6 M NaOH variiert. Das Endvolumen jedes Präparats wurde mit Wasser auf 10,1 ml eingestellt, und die Spektren wurden im Vergleich mit der Luft aufgenommen.
Es ist zu erkennen, daß durch Variieren des pH-Werts, wodurch der Protonierungsgrad und somit die Oxidationsstufe der Polymere verändert wird, deutliche Änderungen in ihren elektronischen Absorptionsspektren hervorgerufen werden.
Die überlagerten Spektren sind durch folgende Maxima gekennzeichnet:
- von 275 nm (4,5 eV) bis 350 nm (3,5 eV) und 410 nm (3,02 eV) für PA-SO&sub3; (Abb. 6);
- bei 210 nm (5,76 eV), 225 nm (5,38 eV), 275 nm (4,50 eV) und 320 nm (3,87 eV) für PA-COOH (Abb. 7);
- bei 245 nm (5,06 eV) und 310 nm (3,99 eV) für PT- COOH (Abb. 8);
- bei 220 nm (5,63 eV), 240 nm (5,16 eV) und 275 nm (4,50 eV) für PT-CHO (Abb. 9).
Als Folge der Änderungen des pH-Werts der Lösungen besitzen die Spektren von PA-SO&sub3;, PA-COOH und PT-CHO zwei isosbestische Punkte, was darauf schließen läßt, daß sich bei demselben Polymer zwei verschiedene Redoxformen bilden können.
In Abb. 10 ist der Vergleich der Absorptionsspektren von kolloidalem Polyanilin (punktierte Linie) und von Poly(anilin-2-sulfonsäure) (durchgehende Linie) beim gleichen pH-Wert dargestellt.
In beiden Fällen ist die Hochenergiebande (4,5 eV bei PA-SO&sub3; und 3,85 eV bei PA) auf den Übergang π-π* zurückzuführen, während die schwächere Energiebande (3,02 eV bei PA-SO&sub3; und 1,98 eV bei PA) der Absorption des Polaron (Radikalinn) zuzuschreiben ist. Im Falle von PA-SO&sub3; beobachtet man eine hypsochrome Verschiebung der zwei Banden gegenüber dem Spektrum von PA. Diese Verschiebung, die genau den Literaturangaben entspricht, erklärt sich aus den verschiedenen Konformationen des substituierten Polymers im Vergleich zu dem nicht substituierten Polymer. Das PA liegt in planarer Konformation vor, während bei Anwesenheit eines Substituenten an den Ringen des PA-SO&sub3; eine sterische Wechselwirkung induziert wird, die zu einer nicht planaren Konformation führt. Hierdurch wird die tatsächliche Länge der konjugierten Doppelbindungen zwischen den Monomeren verringert, wodurch sich eine Blauverschiebung der elektronischen Absorptionsbanden ergibt.

5) Interpretation

Das durch das Indikatorreagenz als Folge der Bindung an die komplementären spezifischen Bindungspartner hervorgerufene Signal entsteht nicht allein durch die durch Vergrößerung der gebildeten Komplexe hervorgerufene Trübung. Es ist wahrscheinlich, daß auch durch direkte Umwandlung durch das Polymer der in der mikroskopischen Umgebung, die die Bindungstasche umgibt, hervorgerufenen leichten Änderungen der elektrischen Ladungen ein optisches Signal erzeugt wird (beispielsweise bei der Fixierung eines Antigens an einem Antikörper im Falle eines immunologischen Dosierungstests).
Hiermit läßt sich erklären, warum man im Gegensatz zu dem bei Verwendung von Polymeren in kolloidaler Form beobachteten Sachverhalt ein besseres Lichtmeßsignal bekommen kann, obwohl die Größe der Komplexe (beispielsweise Immunkomplexe) nicht wesentlich erhöht ist.
Es wurde somit gezeigt, daß wasserlösliche leitfähige Polymere mit Erfolg bei Dosierungen mit einem Überschuß an Antikörper oder einem Überschuß an Antigen (Konkurrenztests) eingesetzt werden können und daß hierbei ein zu der Dosis des geprüften Analyten proportionales optisches ablesbares Signal erzeugt wird, und zwar mit einer sehr guten Empfindlichkeit, ohne daß die freien Fraktionen von den gebundenen Fraktionen getrennt werden müßten.
Dadurch, daß sich an den Ringen oder Ketten Substituenten befinden, eröffnet sich die Möglichkeit, die wasserlöslichen leitfähigen Polymere mit zahlreichen Molekülen gegebenenfalls kovalent zu kuppeln.
Außerdem lassen sich die wasserlöslichen leitfähigen Polymere bei physiologischem pH einsetzen, wodurch sich zahlreiche Anwendungen in der Biochemie ergeben.
Durch Einsatz dieser wasserlöslichen leitfähigen Polymere in den erfindungsgemäßen Reagenzien wird eine homogene Analysetechnik bereitgestellt, mit der sich ein Signal direkt messen und in bestimmten Fällen ebenfalls ein lineares Dosis- Wirkung-Verhältnis erzielen läßt.
Aufgrund der hohen Homogenität, die man in wäßrigen Lösungen erzielen kann, besitzen die wasserlöslichen leitfähigen Polymere bestimmte Vorteile gegenüber den gleichen Polymeren in kolloidaler Lösung, insbesondere vom Standpunkt der Verarbeitbarkeit aus.
Dies ist von wesentlicher Bedeutung für die Konzipierung von Produkten in Form von Filmen oder auch als biochemische Sensoren.
Die oben angegebenen Versuchsergebnisse beziehen sich alle auf Dosierungen.
Dennoch lassen sich die erfindungsgemäßen Indikatorreagenzien in Nachweistests, wie z. B. Schwangerschaftstests, einsetzen.

Claims

1. Indikatorreagenz zum Nachweis oder zur Dosierung eines Analyten in einer zu prüfenden Probe, enthaltend einen an einen spezifischen Bindungspartner gebundenen Tracer, der bei Bindung des spezifischen Bindungspartners an einen Komplementärpartner ein Signal senden kann, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Tracer um ein wasserlösliches leitfähiges Polymer handelt.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem leitfähigen Polymer um ein Homo- oder Copolymer handelt, das durch Kondensation substituierter Derivate von Monomeren gebildet wurde, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Anilin, Pyrrol, Thiophen, Acetylen, Phenylen, Naphthalin, Carbazol, Pyren, Pyrenylen Vinylen, Azulen, Isothianaphthen, Phenylen Vinylen und Thiophenol.

3. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung des leitfähigen Polymers aus Monomeren erfolgt, die durch eine oder mehrere Gruppierungen, ausgewählt aus den Gruppierungen Carboxyl, Sulfonyl, Phenol, Thiol, Alkohol, Aldehyd, Amin, Nitril, Amid, Keton, Nitro und Halogen, substituiert sind.

4. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Substitutionsgruppierungen direkt an das Monomer gebunden ist bzw. sind.

5. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Substitutionsgruppierungen indirekt an das Monomer gebunden ist bzw. sind.

6. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche leitfähige Polymer Poly(anilin-2-carbonsäure) ist.

7. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche leitfähige Polymer Poly(anilin-2-sulfonsäure) ist.

8. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche leitfähige Polymer Poly(thiophen-3-carbonsäure) ist.

9. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche leitfähige Polymer Poly(thiophen-3-carboxaldehyd) ist.

10. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in Trockenform vorliegt.

11. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einem Feststoffträger angeordnet ist.

12. Reagenz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines Films vorliegt.

13. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem wäßrigen Medium gelöst vorliegt.

14. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Signal um ein optisches durch das Auge nachweisbares oder quantitativ bestimmbares Signal handelt.

15. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Signal um ein optisches durch ein Instrument nachweisbares oder quantitativ bestimmbares Signal handelt.

16. Reagenz nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Instrument zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Reflexion, Beugung, Brechung oder Absorption von ultraviolettem, sichtbarem oder Infrarot-Licht geeignet ist.

17. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Bindungspartner und dessen Komplementärpartner aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Haptenen und Antikörpern, Enzymen und Substraten, sowie Rezeptoren und Liganden ausgewählt sind.

18. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Tracer an den spezifischen Bindungspartner über eine kovalente Bindung gebunden ist.

19. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Tracer an den spezifischen Bindungspartner mittels passiver Adsorption gebunden ist.

20. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Tracer an einen spezifischen Hauptbindungspartner gebunden ist.

21. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Tracer an einen spezifischen Nebenbindungspartner gebunden ist.

22. Verwendung eines löslichen leitfähigen Polymers als Tracer, der an einen spezifischen Bindungspartner anbindbar ist und in einem Indikatorreagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 21 enthalten sein kann.

23. Kit zum Nachweis oder zur Dosierung eines Analyten in einer zu prüfenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Indikatorreagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 21 enthält.

24. Kit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem ein Einfangreagenz enthält.

25. Kit nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Einfangreagenz an einer Feststoffphase befestigt ist.

26. Kit nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin mindestens einen spezifischen Nebenbindungspartner enthält.

27. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer zu prüfenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

a) man gibt in die Probe mindestens ein Indikatorreagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 21;

b) man läßt das Indikatorreagenz an den Komplementärpartner des spezifischen Bindungspartners anbinden, den es enthält;

c) man trennt gegebenenfalls die freien und gebundenen Fraktionen des Indikatorreagenz voneinander;

d) man weist das Indikatorreagenz und somit das Vorliegen des Analyten in der Probe nach.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin folgenden Schritt umfaßt:

e) man gibt in die zu prüfende Probe ein gegebenenfalls an einer Feststoffphase befestigtes Einfangreagenz.

29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin folgenden Schritt umfaßt:

f) man gibt in die zu prüfende Probe, falls der Analyt nicht der Komplementärpartner des spezifischen Bindungspartners des Indikatorreagenz ist, mindestens einen spezifischen Hauptbindungspartner.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin folgenden Schritt umfaßt:

g) man gibt in die zu prüfende Probe mindestens einen spezifischen Nebenbindungspartner.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte a, e, f und g gleichzeitig oder nacheinander erfolgen.

32. Verfahren zur Dosierung eines Analyten in einer zu prüfenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte eines Nachweisverfahrens nach einem der Ansprüche 27 bis 31 und folgende Schritte umfaßt:

h) man mißt das von dem Indikatorreagenz gesendete Signal und

i) stellt eine Korrelation zwischen dieser Messung und der in der Probe vorliegenden Menge an Analyt her.