DE69412146T2

DE69412146T2 - Asymetrische "hammerhead" ribozyme und nukleotidsequenzen zu deren aufbau

Info

Publication number: DE69412146T2
Application number: DE69412146T
Authority: DE
Inventors: Matthias D-69120 Heidelberg Homann; Georg D-69181 Leimen Sczakiel; Martin Gr-711 10 Heraklion-Fortetsa Tabler
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; FOUNDATION FOR RESEARCH AND TE
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; FOUNDATION FOR RESEARCH AND TE
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-14
Publication date: 1999-04-29
Anticipated expiration: 2014-10-15
Also published as: AU5334294A; EP0785998B1; EP0785998A1; DE69412146D1; WO1995010609A1; WO1995010608A1; AU7937894A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen, die zum Aufbau von Target- RNA-spezifischen Hammerhead-Ribozymen eingesetzt werden können. Die Erfindung betrifft auch asymmetrische Hammerhead-Ribozyme, welche die Nukleotidsequenzen enthalten, ebenso wie ein Verfahren zu deren Herstellung. Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung klar werden.
Eine Klasse natürlich vorkommender RNAs, die eine stellenspezifische autokatalytische Spaltung durchmachen, kann eine sogenannte "Hammerhead"-Struktur annehmen (Forster und Symons, Cell 50 (1987), 9-16), womit die Spaltungsstelle bestimmt wird. Die Mehrzahl dieser selbstspaltenden RNAs stammt von Satellit-RNAs von Pflanzenviren. Eine selbstspaltende RNA dieses Typs findet sich auch in einem weiteren Pflanzenpathogen, dem Avocado Sunblotch Viroid (ASBVd) und in einem RNA-Transkript vom Wassermolch (engt. "newt") (rezensiert von Bruenig, Method. Enzymol. 180 (1989), 546-558). Eine selbstkatalysierte Spaltungsreaktion wurde in vitro für das Avocado Sunblotch Viroid (ASBVd) (Hutchins et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 3627-3640), die Satellit- RNAs von Tobacco Ring Spot Virus (sTobRV) (Prody et al., Science 231 (1986), 1577-1580; Buzayan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83 (1986), 8859-8862), von Lucerne Transient Streak Virus (sLTSV) (Forster und Symons, Cell 49 (1987), 211-220) und auch für RNA-Transkripte von wiederholten DNA-Sequenzen vom Wassermolch (Epstein und Gall, Cell 48 (1987), 535- 543) gezeigt.
Unter Verwendung von zwei synthetischen RNA-Oligomeren, die zusammen eine Hammerhead-Struktur bilden können, wurde gezeigt, daß eine Spaltung in trans auftreten kann, d. h. daß ein Molekül die Spaltung des anderen katalysieren kann (Uhlenbeck, Nature 238 (1987), 596-600). Wenn eine Spaltung in trans auftritt, wird die RNA, die gespalten werden kann, als das Substrat (Target-RNA) angesehen, und die RNA, die die Spaltung katalysiert, als "Ribozym" bezeichnet. Ribozyme, die eine Hammerhead-Struktur annehmen, werden als "Hammerhead-Ribozyme" bezeichnet.
Es ist nun möglich, ein geeignetes Ribozym gegen irgendein GUC-Sequenzmotiv, d. h. das spaltbare Motiv, eines gegebenen Substrats (d. h. der Target-RNA) aufzubauen, so daß eine Spaltung an seinem 3'-Ende auftritt (Haseloff und Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591). Gleichermaßen sind GUA, GUU, CUC, AUC und UUC geeignete spaltbare Motive für die Hammerhead-Ribozyme (Koizumi et al., FEBS Lett. 228 (1988), 228-230 und FEBS Lett. 239 (1988), 285-288, und EP-A2 321 201). Das Motiv GUG wurde in einem Fall gespalten (Sheldon und Symons, Nucleic Acids Res. 17 (1989), 5679-5685), während es in anderen nicht gespalten wurde (Koizumi et al., FEBS Lett. 228 (1988), 228-230, und Haseloff und Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591). Im allgemeinen kann irgendeine Trinukleotidsequenz NUH ein spaltbares Motiv sein (N kann A, C, G oder U sein; H kann A, C oder U sein) (Ruffner et al., Biochemistry 29 (1990), 10695-10702). Daher stellen auch die Motive AUA, AUU, CUA, CUU, UUA, UUU spaltbare Motive dar. Es wurde gezeigt, daß auch CAC, UAC und AAC mit niedriger Geschwindigkeit gespalten werden können (Perriman et al., Gene 113 (1992), 157-163).
Die EP-A2 321 201 beschreibt die Ribozyme vom "Hammerhead"-Typ und ihre Verwendung zur Schaffung von RNA-EndoNukleasen, die für eine bestimmte Target-RNA hoch spezifisch sind. Um ein gegebenes Substrat (Target-RNA) an einer bestimmten Stelle zu spalten, kann eine spezifische Ribozym-RNA entworfen werden, die aus drei funktionellen Regionen besteht: die eigentliche katalytische Domäne, und die zwei Regionen, die zur Target-RNA komplementär sind, so daß sich das Ribozym an seinem Substrat in einer sequenzspezifischen Art binden kann, und daß in dieser Weise die katalytische Domäne des Ribozyms gegenüber dem spaltbaren Motiv der Target-RNA angeordnet ist. Die zwei Regionen der Ribozym-RNA, die zur Target-RNA komplementär sind (auch "flankierende Sequenzen" genannt) können in eine Region, die 5' zur katalytischen Domäne angeordnet ist, und eine Region, die 3' dazu angeordnet ist, klassifiziert werden. Die 5' flankierende Region besteht, gemäß dem Numerierungssystem für Hammerhead-RNAs (Hertel et al., Nucleic Acids Res. 20, (1992), 3252) aus Nukleotiden 2.1 bis 2.x (vergleiche Fig. 2), wobei die Numerierung von 3' zu 5' erfolgt und x das am meisten 5' angeordnete Nukleotid ist, das ein Basenpaar mit dem entsprechenden komplementären Nukleotiden 1.1 bis 1.x (von 5' zu 3' numeriert) der Target-RNA bildet. Die doppelsträngige Region, die zwischen den Nukleotiden 1.1 bis 1.x der Target-RNA und 2.1 bis 2.x des Hammerhead-Ribozym-Substrat- Komplexes gebildet wird, wird als "Helix I" bezeichnet. In ähnlicher Weise besteht die 3' flankierende Sequenz des Hammerhead-Enzyms aus Nukleotiden 15.1 bis 15.y (Numerierung von 5' zu 3'), welche mit den komplementären Nukleotiden 16.1 bis 16.y der Target-RNA (Numerierung von 3' zu 5') Basenpaare bilden können. Die letzere doppelsträngige Region bildet eine "Helix III" des Hammerhead-Ribozym-Substrat-Komplexes. Nach dieser Definition ist das spaltbare Motiv der Substrat-RNA aus den drei Nukleotiden 16.2, 16.1, 17 (vergleiche Fig. 2) aufgebaut.
Die EP-A2 321 201 beschreibt das Verfahren zur Herstellung eines Ribozyms. Zu diesem Zweck wird ein DNA-Oligonukleotid gemäß einem spezifischen spaltbaren Motiv und dem Sequenzkontext nächst diesem in der Target-RNA synthetisiert. Nach dem Klonieren dieses DNA-Oligonukleotids downstream eines geeigneten Promotors kann diese synthetische DNA für die in vitro- und in vivo-Synthese der Target-spezifischen Ribozym-RNA eingesetzt werden. Eine Transkription erzeugt ein RNA-Molekül, das die katalytische Ribozymdomäne enthält, flankiert von Sequenzen, die zur Target-RNA komplementär sind, und üblicherweise auch von Vektor-abgeleiteten Sequenzen, die zur Target-RNA nicht komplementär sind. Nach Bildung der sequenzspezifischen Hammerhead-Konformation tritt eine Spaltung am 3'-Ende vom spaltbaren Motiv der Substrat-RNA, z. B. GUC, auf. Da die basenpaarenden komplementären Regionen zwischen dem Substrat und der Ribozym-RNA, d. h. Helix I und Helix III, welche an der katalytischen Reaktion nicht teilnehmen, das sequenzspezifische Binden des Ribozyms an sein Target ermöglichen, beeinflußt deren Länge die Spezifität und Effizienz der Ribozymreaktion.
Die WO92/01786 beschreibt tragbare Ribozym-Kassetten, die in bestimmte Restriktionsenzym-Spaltungsstellen irgendeiner gewünschten DNA-Sequenz eingebaut werden können. Eine Transkription in RNA führt zu katalytischen Antisense-RNAs, welche Hammerhead-RNAs mit großen Helices 1 und 3 sind. Solche katalytischen Antisense-RNAs wurden auch anderswo beschrieben (Tabler und Tsagris, Gene 108, (1991), 175-183).
Die im Stand der Technik bekannten Hammerhead-Ribozyme enthalten zwei Domänen, welche sequenzspezifisch für die Target-RNA sind (Helix I und III) und welche jeweils eine Länge von 5 Nukleotiden aufweisen und durch die katalytische Domäne getrennt sind. Beide Domänen müssen für jeden Sequenzkontext eines bestimmten spaltbaren Motivs in einer Target-RNA spezifisch synthetisiert werden, oder Ribozyme müssen durch Einfügen bestimmter DNA-Kassetten in cDNA, die die Target-RNA codiert, erzeugt werden. Letztere Technik weist den Nachteil auf, daß der Ribozymaufbau auf die Verfügbarkeit bestimmter Restriktions-Erkennungssequenzen limitiert ist.
Unabhängig von ihrer Art des Aufbaus können im Stand der Technik bekannte Ribozyme geringe Bindungsgeschwindigkeiten an ihre korrespondierende Target-RNA und/oder eine geringe katalytische Aktivität, basierend auf thermodynamisch oder kinetisch ungünstigen Eigenschaften, aufweisen.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Aufgabe ist es daher, ein neues System zur Verfügung zu stellen, das den Target-RNA-spezifischen Aufbau von Hammerhead-Ribozymen mit hoher katalytischer Aktivität erlaubt.
Die Lösung des obigen technischen Problems wird durch das Bereitstellen von Nukleotidsequenzen erzielt, die einen Teil eines Hammerhead-Ribozyms bilden oder bilden können. Weiters wird dies durch Bereitstellen der anderen in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen erzielt.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleotidsequenz, welche die folgende allgemeine Formel umfaßt, die in 3'-5'-Richtung gemäß der Antisense-Polarität der Ribozym- RNA angegeben ist,
3'-[N]&sub1;&sub1;-[N]Lo-[N]&sub1;&sub0;[N]&sub9;&submin;&sub3;-[N]-5'
worin N ein beliebiges Nukleotid bedeutet und gleich oder unterschiedlich sein kann, [N] kein Nukleotid, Nukleotid 2.1 oder Nukleotide 2.x bis 2.1, befähigt zur Bildung einer Helix I in einem Hammerhead-Ribozym/Target-Komplex, bedeutet, [N]&sub9;&submin;&sub3; Nukleotide 3 bis 9 eines Hammerhead-Ribozyms bedeutet, [N]&sub1;&sub0; Nukleotide 10.1 bis 10.n bedeutet und [N]&sub1;&sub1; kein Nukleotid, Nukleotid 11.m bedeutet oder mindestens ein Teil der Nukleotide 11.m bis 11.1 umfaßt, x eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis 8 ist, m eine ganze Zahl ist, n eine ganze Zahl ist und die Länge von Helix II bedeutet, worin, wenn [N]&sub1;&sub1; mindestens ein Teil der Nukleotide 11.m bis 11.1 umfaßt, n und m gleich oder unterschiedlich sein können, Lo eine ganze Zahl ist und [N]Lo irgendeine Sequenz bedeutet, die befähigt ist, ein Loop 2 eines Hammerhead- Ribozyms zu bilden.
Die Begriffe "Nukleotide 2.x bis 2.1 ", "Nukleotid 2.1 ", "Nukleotide 10.1 bis 10.n", "Nukleotide 11.m bis 11.1", "Nukleotid 11.m", "Helix I", "Helix II", "Nukleotide 3 bis 9" und "Loop 2" entsprechen der Nomenklatur und dem Numerierungssystem für Hammerhead- Ribozyme (Hertel et al., siehe oben).
Der Begriff "Nukleotidsequenz" bezieht sich entweder auf eine RNA-Sequenz, die in einer Ribozym-RNA enthalten ist, oder auf eine DNA-Sequenz, die in einer längeren DNA- Sequenz enthalten ist, oder auf heterooligomere Sequenzen.
Der Begriff" befähigt zur Bildung einer Helix I in einem Hammerhead- Ribozym/Target-Komplex " bezieht sich auf die Region der Ribozymsequenz, die die katalytische Domäne bei der 5'-Seite flankiert (5' flankierende Region) und die komplementär zu jener Region der Target-RNA ist, die 3' vom spaltbaren Motiv der Target-RNA angeordnet ist, so daß sie eine doppelsträngige RNA-Helix bilden kann, wobei diese Helix die Helix I ist. Wenn die Helix I-bildende Region in einer DNA-Sequenz enthalten ist, wird sie auch "Helix I Box" genannt.
Der Begriff "befähigt zur Bildung zumindest eines Teils der Helix II eines Hammerhead-Ribozyms" bezieht sich auf die intramolekulare doppelsträngige Region, die in der katalytischen Domäne einer Ribozym-RNA gefunden wird. Die ganzen Zahlen n und m beginnen mit 2. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die ganze Zahl n im Bereich von 3 bis 50.
Der Begriff "irgendeine Sequenz, befähigt zur Bildung von Loop 2 eines Hammerhead-Ribozyms" bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, die die zwei Sequenzen 10.1 bis 10.n mit 11.m bis 11.1 verbinden, welche Helix II eines Hammerhead-Ribozyms bilden. Beispiele einer solchen Sequenz sind in den Fig. 1-5, 7-14, 16 und 17, insbesondere in Fig. 9 und 17, gezeigt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Region 3'-[N]&sub1;&sub1;-[N]Lo-[N]&sub1;&sub0;-5' mindestens eine Erkennungssequenz für ein oder mehrere Restriktionsenzyme und/oder eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, die mit der Sequenz, welche 3' von [N]&sub1;&sub1; folgt, überlappt (vgl. Fig. 9 und 17).
Der Begriff "Erkennungssequenz für ein oder mehrere Restriktionsenzyme" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die durch eine oder mehrere Arten einer Restriktions- EndoNuklease spaltbar ist, wenn sie in einem doppelsträngigen DNA-Molekül vorhanden ist. Beispiele einer solchen Erkennungssequenz sind in den Fig. 1-5, 7-14, 16 und 17 gezeigt.
Spezifische Beispiele der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung sind in der folgenden Tabelle I aufgelistet: Tabelle I
Fußnoten:
a: Dieses Plasmid kann als zwei [N]-Motive enthaltend angesehen werden. Gegenüber der Target-RNA, die aus Plasmid pBS29-CX erhalten wird, enthält es kein passendes [N]-Motiv, sondern enthält ein [N]-Motiv AAA, das für irgendeine passende RNA geeignet ist.
b: Das Motiv N2.1 N2.2 N2.3 kann irgendeine der 64 Kombinationen annehmen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die die oben definierte Nukleotidsequenz und eine zweite Nukleotidsequenz umfaßt, welche mindestens die Nukleotide 12 bis 14 ("Teil der katalytischen Domäne") eines Hammerhead- Ribozyms enthält und mindestens ein Teil der Helix III-bildenden Region ("Helix LIIbildender Teil") eines Hammerhead-Ribozyms/Target-Komplexes, beginnend mit den Nukleotiden 15.1 bis 15.y, worin y eine ganze Zahl ist.
Die Begriffe "Nukleotide 12 bis 14" und "Helix III" entsprechen der Nomenklatur und dem Numerierungssystem für Hammerhead-Ribozyme (Hertel et al., siehe oben).
Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, welche im wesentlichen aus DNA und/oder RNA zusammengesetzt ist.
Der Begriff "zweite Nukleotidsequenz" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz wie oben definiert, die 3' von der oben definierten Nukleotidsequenz verbunden ist.
Der Begriff "mindestens ein Teil der Helix III-bildenden Region eines Hammerhead- Ribozym/Target-Komplexes enthaltend" bezieht sich auf die Region der Ribozymsequenz, die die katalytische Domäne an der 3'-Seite (3'-flankierende Region) flankiert, beginnend mit Nukleotid 15.1 der Ribozym-RNA, welches zum Nukleotid 16.1 in der Target-RNA komplementär ist, welches selbst das mittlere Nukleotid des spaltbaren Motivs ist, das aus den drei Nukleotiden 16.2, 16.1 und 17 besteht, so daß es eine doppelsträngige RNA-Helix bilden kann, wobei diese Helix die Helix III ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Nukleotidsequenz und die zweite Nukleotidsequenz über eine oder die Erkennungssequenzen, die in 3'-[N]&sub1;&sub1;-[N]Lo-[N]&sub1;&sub0; 5' enthalten sind, oder über eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym verknüpft, die mit einer Sequenz, welche 3' von [N]&sub1;&sub1; folgt, überlappt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die RNA eine dritte Nukleotidsequenz, welche benachbart zur Helix III-bildenden Region der zweiten Nukleotidsequenz ist, mindestens 3 Nukleotide, die befähigt sind, eine intramolekulare Helix III eines Hammerhead-Ribozyms auszubilden, welche direkt an Nukleotid 17 eines Hammerhead-Ribozyms anschließt, und eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu [N] ist, enthält.
Der Begriff "Nukleotid 17" entspricht der Nomenklatur und dem Numerierungssystem für Hammerhead-Ribozyme (Hertel et al., siehe oben).
Der Begriff "dritte Nukleotidsequenz, benachbart zur Helix III-bildenden Region der zweiten Nukleotidsequenz" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, welche 3' von der oben definierten zweiten Nukleotidsequenz angeordnet ist, und sie kann entweder direkt oder unter Zwischenschaltung einer nicht verwandten Sequenz verknüpft sein.
Der Begriff "mindestens 3 Nukleotide enthaltend, die zur Bildung einer intramolekularen Helix III eines Hammerhead-Ribozyms befähigt sind", bezieht sich auf Nukleotide, welche den Nukleotiden 16.3, 16.2, 16.1 in der Target-RNA entsprechen.
Der Begriff "Nukleotidsequenz, welche komplementär zu [N] ist" bezieht sich auf Nukleotide, die den Nukleotiden 1.1 und folgenden Nukleotiden in der Target-RNA entsprechen würden und welche zu der oben definierten Sequenz [N] komplementär sind.
Ein spezifisches Beispiel einer solchen RNA ist in Fig. 14 gezeigt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym, welches die oben definierte RNA oder Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die Helix I-bildende Region kleiner ist als die die Helix III-bildende Region.
Der Begriff "die Helix I-bildende Region ist kleiner als die die Helix III-bildende Region" bezieht sich auf eine unterschiedliche Anzahl an Nukleotiden der Ribozymsequenz, die zur Target-RNA komplementär sind und die eine Helix I und eine Helix III bilden können, wobei die Anzahl an Nukleotiden im Helix I-bildenden Teil, entsprechend den Nukleotiden 2.1 bis 2.x in der allgemeinen Formel, kleiner ist als die Anzahl der Nukleotide der Helix IIIbildenden Region, entsprechend den Nukleotiden 15.1 bis 15.y in Hammerhead-Ribozymen. Die ganze Zahl x liegt vorzugsweise im Bereich von 2 bis 8. Angesichts der unterschiedlichen Länge der zwei flankierenden Sequenzen wird diese Art von Ribozymen "asymmetrische Hammerhead-Ribozyme" genannt.
Asymmetrische Hammerhead-Ribozyme mit einer sehr kurzen Helix I (vgl. Fig. 4 und S) weisen mindestens drei Hauptvorteile auf:
(i) Fig. 6 und Beispiel 1 zeigen, daß eine Ribozym-RNA, die einen Helix I-bildenden Teil von nur drei oder fünf Nukleotiden aufweist, zumindest gleich wirksam beim Spalten der Target-RNA ist gegenüber einer Kontrolle, die eine erweiterte Helix III mit mehr als 100 Nukleotiden aufweist, welche etwa gleich aktiv beim Spalten der Target-RNA ist wie ein Ribozym mit einer Helix I mit zwei Nukleotiden.
(ii) Bei einem solchen asymmetrischen Ribozym mit nur einem extrem kurzen Helix Ibildenden Teil aus wenigen Nukleotiden wird die Spezifität für die Target-RNA fast ausschließlich durch den die Helix III-bildenden Teil des Ribozyms gesteuert. Das Freisetzen von Bindungsenergie durch die Helix I-Bildung ist extrem gering und kann gegenüber der Energiefreisetzung durch die Helix III-Bildung vernachlässigt werden. Ein solches asymmetrisches Ribozym kann daher als modifizierte Antisense-RNA angesehen werden, entsprechend der Helix III-bildenden Region, welche an ihrem 5'-Ende eine katalytische Domäne und eine sehr kurze Helix I-bildende Region trägt. Ein solches asymmetrisches Hammerhead-Ribozym, welches einer modifizierten Antisense-RNA ähnelt, ist über Techniken zugänglich, die zum Bestimmen der 3'-terminalen Ausdehnung in Antisense-RNAs zum Optimieren des Bindens von Antisense-RNA an ihrem Target entwickelt wurden (Rittner et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 1381-1387).
(iii) Da die Target-Spezifität eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms vorwiegend aus seiner Helix III-bildenden Region hervorgeht, gestattet dies drittens unterschiedliche und einfachere Strategien zur Herstellung von targetspezifischen Ribozymen. Beim konventionellen Ribozymaufbau müssen zwei Target-sequenzspezifische Domänen zur Verfügung gestellt werden: jene des Helix I- und jene des Helix III-bildenden Teils. Angesichts der nur 64 vorstellbaren Kombinationen eines Motivs mit drei Nukleotiden, ist es möglich, den Helix I-bildenden Teil - der später auch als "Helix I Box" bezeichnet wird - und einen Teil oder die gesamte Region der katalytischen Domäne aus einem Set von 64 vorgefertigten DNA-Molekülen, die in einem Vektor enthalten sein können, zu liefern. Ein Set von 64 vorgefertigten Vektoren, wie z. B. die pUR-("pIMBB")-Serie (Fig. 10) oder pFORTH-Serie (Fig. 17) kann universell eingesetzt werden, um alle vorstellbaren asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme ohne die Notwendigkeit, die Sequenz von Helix I und einen Großteil der katalytischen Domäne spezifisch zu synthetisieren, herzustellen. Nur spezifische, der Helix III-bildenden Region entsprechende Teile müssen zur Verfügung gestellt werden. Wenn die universellen DNAs einmal hergestellt sind, werden die der Helix III-bildenden Region entsprechenden Sequenzen einfach angefügt, wodurch ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym hergestellt wird. Solche universell anwendbaren Strategien zum Herstellen asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme sind in den Fig. 7-13, 16 und 17 erläutert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das asymmetrische Hammerhead-Ribozym, die Nukleinsäure oder die Nukleotidsequenz mindestens ein chemisch modifiziertes Nukleotid.
Der Begriff "chemisch modifiziertes Nukleotid" bezieht sich auf Nukleotide, die sich in ihrer chemischen Struktur von konventionellen Ribonukleotiden unterscheiden. Die chemische Modifizierung kann in der Ribose-Komponente, zum Beispiel 2'-O-Methyl-, 2'- Amino- oder 2'-Fluororibose, oder in der internukleotidischen Phosphatgruppe, welche zum Beispiel zu einem Phosphorthioat, Phosphoramidat, Methylphosphonat, Phosphotriester, insbesondere Alkylester, modifiziert sein kann, auftreten. Modifikationen können auch in irgendeiner der vier Basen oder in Änderungen in der Stereochemie (α-Nukleotid- Phosphodiester) oder durch Anfügen verschiedener 5'-terminaler Gruppen, wie zum Beispiel Psoralen und Derivate, Phenadrolin und Derivate, Ellipicitin und Derivate, EDTA, 5'-p(N-2- Chlorethyl-N-methylamino)benzylamid, Acridin und Derivate, auftreten. Auch Oligonukleotide, die aus gemischten Ribo- und Desoxyribonukleotiden bestehen, werden als modifiziert angesehen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein RNA- Konstrukt, das mindestens zwei asymmetrische Hammerhead-Ribozyme, wie oben definiert, umfaßt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Helix I- und die Helix III-bildenden Regionen der asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme des RNA-Konstrukts gleich oder unterschiedlich sein.
Ein spezifisches Beispiel eines solchen RNA-Konstrukts ist in Fig. 14 gezeigt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine DNA- Sequenz, die die Nukleotidsequenz enthält, welche nach einer Transkription zu RNA dem asymmetrischen Hammerhead-Ribozym oder RNA-Konstrukt, wie oben definiert, entspricht.
Der Begriff "nach Transkription" bezieht sich auf die enzymatische Konvertierung von DNA-Sequenzen in RNA-Sequenzen durch eine geeignete RNA-Polymerase.
Spezifische Beispiele einer solchen DNA-Sequenz sind in den Fig. 4, 8, 9, 12-14, 16 und 17 gezeigt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen DNA- und/oder RNA-Vektor, welcher die Nukleotidsequenz, die Nukleinsäure, das asymmetrische Hammerhead-Ribozym, das RNA-Konstrukt oder die DNA-Sequenz, wie oben definiert, umfaßt.
Der Begriff "Vektor" bezieht sich auf ein DNA- und/oder RNA-Replikon, das für die Amplifizierung einer fremden Nukleotidsequenz eingesetzt werden kann. Im Zusammenhang mit asymmetrischen Hammerhead-Ribozymen sind insbesondere DNA- oder RNA-Vektoren nützlich, welche die Expression des Hammerhead-Ribozyms gestatten. Zum Beispiel DNA- Vektoren, die die Nukleotidsequenz enthalten, die für ein asymmetrisches Hammerhead- Ribozym codiert, downstream von einem geeigneten Promotor, so daß eine Transkription von dem Promotor das funktionale und katalytisch aktive asymmetrische Hammerhead-Ribozym erzeugt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Wirtsorganismus, der mindestens eine der oben definierten Nukleotidsequenzen und/oder Nukleinsäuren oder zumindest einen oben definierten Vektor und/oder eine DNA-Sequenz umfaßt, welche nach Transkription vorzugsweise zu einem katalytisch aktiven asymmetrischen Ribozym oder RNA-Konstrukt, wie oben definiert, führt.
Der Begriff "Wirtsorganismus" bezieht sich auf ein Virus, ein Bakterium, einen Pilz, eine Pflanze oder ein Säugetier.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirtsorganismus, der ein episomales Replikationssystem trägt, das die Nukleotidsequenz, die eine asymmetrische Hammerhead-RNA codiert, amplifizieren kann. Der Begriff "episomales Replikationssystem" bezieht sich auf ein Replikationssystem, welches vom Genomsystem des Wirten unabhängig ist; eine Plasmid-DNA oder ein Virus sind episomale Replikationssysteme.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen gentechnologisch behandelten Wirtsorganismus, der mindestens eine oben definierte DNA-Sequenz in seinem Genom enthält. Der Begriff "Genom" bezieht sich auf das gesamte genetische Material, das an die nächste Generation vererbbar ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Organismen, die die Eigenschaft vererben, ein funktionelles, katalytisch aktives Hammerhead-Ribozym zu synthetisieren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Nukleotidsequenzen, der Nukleinsäuren, der asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme, der RNA-Konstrukte, der DNA-Sequenzen oder der Vektoren, wie oben definiert, welches das Züchten des oben definierten Wirtsorganismus unter geeigneten Bedingungen und die Isolierung der gewünschten Produkte von der Kultur (Zellen und/oder Kulturmedium) gemäß bekannten Verfahren umfaßt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der oben definierten asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme oder RNA- Konstrukte.
Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die Schritte des Erzeugens eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms oder einer DNA, die ein asymmetrisches Hammerhead-Enzym codiert, durch
(i) das Selektieren eines spaltbaren Motivs in der Target-RNA,
(ii) das Selektieren eines geeigneten Vektors und/oder einer DNA-Kassette, welche eine Helix I Box liefert, die zu dem selektierten spaltbaren Motiv und einem Teil der katalytischen Domäne eines Hammerhead-Ribozyms paßt, wie durch die allgemeine Formel 3'-[N]&sub1;&sub1;-[N]Lo- [N]&sub1;&sub0;-[N]&sub9;&submin;&sub3;-[N]-5' definiert, und
(iii) das Anfügen der zweiten Sequenz, die dem Helix III-bildenden Teil und dem restlichen Teil der katalytischen Domäne eines Hammerhead-Ribozyms entspricht.
Die angefügte zweite Sequenz der vorliegenden Erfindung, die dem Helix III- bildenden Teil und einem Teil der katalytischen Domäne eines Hammerhead-Ribozyms entspricht, kann entweder chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden oder durch geeignete Restriktions-EndoNukleasen aus cDNA, die die Target-RNA codiert, herausgeschnitten werden.
Spezifische Beispiele des Verfahrens sind in den Fig. 8, 9, 12, 13, 16 und 17 gezeigt.
Ein zweites Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die Schritte des Einführens der katalytischen Domäne in der Helix I-bildenden Sequenz in DNA durch einen einzigen · PCR-Schritt, in welchem ein DNA-Nukleotid die Sequenz zumindest eines Teils der katalytischen Domäne und der Helix I-bildenden Region liefert.
Ein drittes Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt den Schritt der chemischen Synthese zumindest eines Teils der asymmetrischen Ribozyme.
Ein viertes Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft die Herstellung multipler Ribozyme durch Zufügen einer kurzen Sense-Sequenz, die eine intramolekulare Helix III- und Helix I-bildende Region ausbildet, einschließlich eines spaltbaren Motivs. Ein solches Verfahren ist in Fig. 14 beschrieben.
Die oben definierten Nukleotidsequenzen, Nukleinsäuren und asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme können entweder chemisch und/oder enzymatisch unter Verwendung bekannter Verfahren synthetisiert werden.
Die Transkription der DNA-Sequenzen, die die asymmetrischen Ribozyme der vorliegenden Erfindung codieren, führt zu Ribozymen, die zum Inaktivieren einer bestimmten Target-RNA befähigt sind. Deshalb haben entweder die DNA-Sequenzen, die die asymmetrischen Ribozyme oder RNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung codieren, oder die asymmetrischen Ribozyme selbst weitgehende therapeutische und biologische Anwendungen. Zum Beispiel können sie für die Suppression irgendwelcher unerwünschten endogenen Gene verwendet werden. Sie können auch zur Suppression von Genen von Pathogenen oder pathogener RNA, die normalerweise nicht in einer Zelle vorhanden ist, eingesetzt werden. Asymmetrische Hammerhead-Ribozyme sind für die Behandlung viraler Infektionen beim Menschen, bei Tieren und Pflanzen durch Inaktivieren einer Target-RNA, die im Lebenszyklus des Virus erzeugt wird, nützlich. Daher können die asymmetrischen Ribozyme der vorliegenden Erfindung als Präventivmittel oder für die Behandlung von Infektionen mit Retroviren, wie z. B. dem menschlichen Immunschwächevirus (HIV), und positive-sense-RNA-Viren, wie z. B. Infektionen mit Togaviren, Coronaviren, Picornaviren, Caliviviren, und auch für Infektionen mit negative-sense-RNA-Viren, wie z. B. Paramyxoviren (z. B. Sendaivirus), Rhabdoviren, den Influenzaviren, den Bunyaviren oder Arenaviren, eingesetzt werden.
Auch die viralen mRNAs von DNA-Viren können durch die asymmetrischen Ribozyme der vorliegenden Erfindung inaktiviert werden, so daß sie für die Behandlung viraler Infektionen mit Pocken-, Irido-, Herpes- (z. B. Herpes simplex virus (HSV)), Adeno-, Papova-, (z. B. Hepatitis B Virus (HBV)) und/oder Reoviren eingesetzt werden können. Die asymmetrischen Ribozyme und die entsprechenden codierenden DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können auch für die Inaktivierung oder Suppression von Target- RNAs in prokaryotischen Zellen, wie z. B. Bakterien, oder eukaryotischen Zellen, wie z. B. Protozoen und Hefe, in Pflanzen und Tieren, wie z. B. parasitischen Tieren, z. B. Plasmodium fasparum, und Säugetieren, wie z. B. Menschen, eingesetzt werden. Bei der Behandlung von Menschen können die asymmetrischen Ribozyme oder RNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung oder die entsprechenden codierenden DNA-Sequenzen an einen Patienten, der sie benötigt, verabreicht werden.
In Pflanzen können asymmetrische Ribozyme für die Suppression irgendwelcher unerwünschten Gene eingesetzt werden, z. B. bestimmte Gene, die während der Fruchtreifung oder während Streß, verursacht durch Hitzeschock, Pathogene, Trockenheit, Salz oder andere Mittel, induziert werden. Asymmetrische Ribozyme sind nützlich als schützende Mittel gegen Pilz-, virale oder Insektenpathogene in transgenen Pflanzen oder anderen transformierten Organismen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Zusammensetzung, die ein asymmetrisches Ribozym, ein RNA-Konstrukt oder eine entsprechende codierende DNA- Sequenz der vorliegenden Erfindung oder den oben definierten Vektor enthält. Die vorliegende Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zum Entfernen einer Target-RNA in einer Pflanze, einem Tier oder einem menschlichen Patienten, welches das Behandeln der Pflanze, des Tiers oder des menschlichen Patienten mit einer DNA-Sequenz, die das asymmetrische Ribozym oder das RNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung codiert, oder mit einem asymmetrischen Ribozym der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutisch, veterinärmedizinisch oder landwirtschaftlich verträglichen Träger und/oder Exzipienten, umfaßt. Durch Verwendung solcher Zusammensetzungen können die asymmetrischen Ribozyme oder die entsprechenden codierenden DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung durch parenterale oder andere Verabreichungsmittel geliefert werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist die das asymmetrische Ribozym oder das RNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung codierende DNA-Sequenz in einem Vehikel enthalten, wie z. B. in einem Trägervirus oder einem defekten interferierenden Teilchen, durch welches sie zu einem bestimmten Target-Gewebe oder einer Zelle in das Genom transportiert wird, von dem sie aufgenommen werden kann oder in dem sie vorübergehend exprimiert werden kann. Ein Trägervirus, das hierfür eingesetzt werden kann, ist beispielsweise ein rekombinantes Retrovirus oder ein rekombinantes Vacciniavirus.
Im Fall von Pflanzen können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auf Ti-Plasmid basierende Vektoren oder Vektorsysteme oder entsprechend transformierte Agrobakterien enthalten, die zum Steuern des Transfers der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung in ein gewünschtes Target-Gewebe oder eine Target-Zelle der zu behandelnden Pflanze befähigt sind. Alternativ dazu können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Expressionsvektoren enthalten, die für direkte Gen-Transfertechniken in Pflanzenzellen oder Gewebe, wie z. B. Elektroporation oder Teilchenbeschleunigung, geeignet sind. Die Expression des Ribozyms in einem solchen Pflanzen-Target-Gewebe oder einer Targetzelle kann wiederum entweder vorübergehend oder permanent sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft also auch Zusammensetzungen zum Eliminieren der eine Krankheit verursachenden Fähigkeit eines infektiösen Mittels, wie z. B. eines Viroids, Virus, Bakterium, Protozoen und Fungus.
Die Figuren zeigen:

Fig. 1

Den Hammerhead-Komplex, der zwischen der Target-RNA, welche HIV-1-RNA ist, und der Ribozym-RNA 2as-Rz12, die beschrieben wurde (Homann et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 2809-2814), ausgebildet ist. Das spaltbare Motiv GUA in der HIV-1-RNA ist unterstrichen und die katalytische Domäne ist in Kleinbuchstaben angegeben. Die Zahlen beziehen sich auf Nukleotidnummern der RNA 2s, die ebenfalls in Hertel et al., siehe oben, beschrieben wurde. Das A-Nukleotid des spaltbaren Motivs entspricht der Position 506 und die komplementären Regionen zwischen Substrat- und Ribozym-RNA liegen in einem Bereich von 227 bis 633, was zu einem doppelsträngigen Bereich von 278 Nukleotiden 5' vom spaltbaren Motiv und 128 Nukleotiden 3' (downstream) davon führt.
Für Details, wie dieses Beispiel eines Ribozym-Substrat-Komplexes in der Hammerhead-Konformation dem Numerierungssystem von Hammerhead-RNAs gemäß der Konvention (Hertel et al., siehe oben) entspricht, siehe Fig. 2.

Fig. 2

Der gleiche Hammerhead-Ribozym-Substratkomplex wie in Fig. 1 ist dargelegt. Das spaltbare Motiv GUA der Target-RNA (Nukleotide 16.2, 16.1, 17) ist unterstrichen und die katalytische Domäne (in einem Bereich von Nukleotid 3 bis 14) ist in Kleinbuchstaben angegeben; diese Nukleotide treten nicht durch Basenpaarung mit der Target-RNA in Wechselwirkung. Es soll jedoch betont werden, daß der Begriff "katalytische Domäne" nicht ganz präzis ist, da auch die Nukleotide 15.1 und 15.2 für die katalytische Aktivität wesentlich sind; in dieser Anmeldung sind die Nukleotide 15.1 und 15.2 nicht in dem umfaßt, was als "katalytische Domäne" bezeichnet wird.
Helix I ist von den zwei komplementären Sequenzen von Target-RNA bzw. Ribozym- RNA gebildet, im Bereich von den Nukleotiden 1.1 bis 1.x (5' zu 3') und 2.1 bis 2.x (3' zu 5'), wobei x in diesem Beispiel 128 ist.
Helix III ist von den zwei komplementären Sequenzen von Target-RNA bzw. Ribozym-RNA gebildet, im Bereich von den Nukleotiden 16.1 bis 16.y (3' zu 5') und 15.1 bis 15.y (5' zu 3'), wobei y in diesem Beispiel 278 ist. Helix II ist intramolekular in der katalytischen Domäne von den Nukleotiden 10.1 bis 10.4 (5' zu 3') und den komplementären Nukleotiden 11.4 bis 11.1 (3' zu 5') gebildet.
Die Helix II-bildenden Nukleotide sind durch die vier Nukleotide L2.1 bis L2.4, die eine Haarnadelschleife bilden, verbunden.
In diesem speziellen Beispiel sind zwei Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme in der katalytischen Domäne enthalten: eine für StuI AGG,ICCT (Nukleotide 9 bis L2.1) und XhoI C/TCGAG-Nukleotide 10.4 bis 11.4.

Fig. 3

DNA-Sequenz von pBS29-Rz12 und die DNA-Oligodesoxynukleotide, die zum Herstellen eines DNA-Konstrukts verwendet werden, das für ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym codiert. In Panel (A) ist die relevante Sequenz von Plasmid pBS29- Rz12 detailliert dargestellt. Nur ein DNA-Strang ist angegeben. Es ist der Strang, der komplementäre Polarität gegenüber der Ribozymsequenz 2as-Rz12 und gleiche Polarität wie die HIV-1-Target-RNA aufweist. Die HIV-1-spezifische Sequenz ist zwischen den SacI- und HindIII-Stellen enthalten, die mit einer Box versehen sind. Das erste G-Nukleotid der SacI- Erkennungssequenz GAGCT/C entspricht dem Nukleotid, das komplementär zum Nukleotid 15.y oder 15.278 in Fig. 2 und Fig. 5 ist. Das letze T-Nukleotid der HindIII- Erkennungssequenz A/AGCTT entspricht dem Nukleotid 2.x oder 2.128. Die Sequenz, die zur katalytischen Domäne komplementär ist, ist in Kleinbuchstaben angegeben und mit einer Box versehen, wobei das erste T-Nukleotid dem Nukleotid entspricht, das zum Nukleotid 14 von Fig. 2 komplementär ist, und das letzte G-Nukleotid ist zum Nukleotid 3 von Fig. 2 komplementär. Die Sequenz des T7-Promotors ist im Detail dargestellt (siehe Box) und die Richtung der Transkription ist angegeben, während die Position und die Richtung des T3- Promotors schematisch angegeben ist.
Die unterstrichenen Sequenzen stellen Regionen dar, wo die DNA-Oligonukleotide mit der pBS29-Rz12-DNA binden können (vgl. die Beschreibung von Beispiel 1). Der "T7 Primer" paßt genau auf die T7-Promotor-Region. Die Region, die durch zumindest eine der DNA-Oligos Rz12/0 - Rz12/13 abgedeckt ist, ist ebenfalls unterstrichen.
Das Plasmid pBS29-CX, welches zur Herstellung markierter HIV-1-Target-RNA eingesetzt wurde, enthält anstelle der katalytischen Domäne (Sequenz in der Box) einen zusätzlichen A-Rest.
(B) zeigt die Sequenzen der DNA-Oligonukleotide, die für die in Beispiel 1 beschriebenen PCR-Experimente verwendet wurden. Die Region in den DNA- Oligonukleotiden, die mit pBS29-Rz12 binden kann, ist unterstrichen und die HindIII- Erkennungssequenz, die in der 5'-Region jedes der DNA-Oligonukleotide enthalten ist, ist kursiv angegeben.
(C) gibt ein detaillierteres Beispiel an, wie das Oligonukleotid Rz12/5 mit der pBS29- Rz12-DNA bindet, welche hier als Doppelstrang angegeben ist.

Fig. 4

DNA-Sequenz der Plasmide pBS-Rz12/0, pBS-Rz12/1, pBS-Rz12/2, pBS-Rz12/3, pBS-Rz12/3H, pBS-Rz12/5, pBS-Rz12/8, pBS-Rz12/13, die asymmetrische Hammerhead- Ribozyme codieren.
Die relevante Sequenz der Plasmide, welche durch PCR, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurden, sind angegeben. Die DNA-Sequenz, die der katalytischen Domäne entspricht, ist in Kleinbuchstaben angegeben. Die HindIII- und SacI-Stellen, die zum Klonieren in pT3T7lac (Boehringer Mannheim) eingesetzt werden, sind mit einer Box versehen, ebenso wie der T3-Promotor, von dem aus die entsprechenden asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme transkribiert werden. Die Sequenzen, die aus den in den PCR- Reaktionen verwendeten DNA-Oligonukleotiden stammen, sind unterstrichen (vgl. auch Fig. 3A, B und C). Die Sequenz, die nicht detailliert dargestellt, sondern als -//- angegeben ist, kann aus der Fig. 3A abgeleitet werden.

Fig. 5

Ribozym-Substrat-Komplex, der zwischen der HIV-1-Target-RNA und den asymmetrischen Hammerhead-Ribozymen 2as-Rz12/0, 2as-Rz12/1, 2as-Rz12/2, 2as- Rz12/3H, 2as-Rz12/5, 2as-Rz12/8, 2as-Rz12/13, 2as-Rz12/88 ausgebildet ist.
Nach Transkription von EcoRI-linearisierten Plasmiden pBS-Rz12/0, pBS-Rz12/1, pBS-Rz12/2, pBS-Rz12/3H, pBS-Rz12/5, pBS-Rz12/8, pBS-Rz12/13, pBS-Rz12/88 mit T3- RNA-Polymerase werden die folgenden asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme 2as- Rz12/0, 2as-Rz12/1, 2as-Rz12/2, 2as-Rz12/3H, 2as-Rz12/5, 2as-Rz12/8, 2as-Rz12/13 bzw. 2as-Rz12/88 synthetisiert. Wenn ein Hammerhead-Komplex mit der HIV-1-Target-RNA gebildet wird, werden die angegebenen Strukturen erhalten. Die der katalytischen Domäne entsprechende Sequenz ist in Kleinbuchstaben angegeben. Helix III bleibt die gleiche wie in den Fig. 1 und 2 und besteht aus 283 Nukleotiden. Helix 1 ist mit einer Box versehen.
Helix I entspricht [N] der allgemeinen Formel 3'-[N]&sub1;&sub1;-[N]Lo-[N]&sub1;&sub0;-[N]&sub9;&submin;&sub3;-[N]-5', wobei x der Länge von Helix I entspricht. In diesen Beispielen ist ix, 0, 1, 2, 3, 5, 8, 13 für 2as-Rz12/0, 2as- Rz12/1, 2as-Rz12/2, 2as-Rz12/3, 2as-Rz12/5, 2as-Rz12/8 bzw. 2as-Rz12/13. Der Größenunterschied zwischen Helix I und Helix III spiegelt sich im Begriff "asymmetrisches Hammerhead-Ribozym" wider.

Fig. 6

Ribozym-Assay der asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme 2as-Rz12/0, 2as- Rz12/1, 2as-Rz12/2, 2as-Rz12/3, 2as-Rz12/5.
HindIII-linearisiertes Plasmid pBS29-CX wurde für die Synthese radioaktiv markierter HIV-1-Target-RNA eingesetzt. Etwa 30 fmol der radioaktiv markierten Target-RNA wurden in 20 mM MgCl&sub2;, 50 mM Tris/HCl bei pH 8,0 für 60 Minuten bei 37ºC inkubiert, entweder allein (Bahn 1), oder in Kombination mit einem 10-fachen molaren Überschuß der asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme 2as-Rz12/0 (Bahn 2), 2as-Rz12/1 (Bahn 3), 2as- Rz12/2 (Bahn 4), 2as-Rz12/3 (Bahn 5), 2as-Rz12/5 (Bahn 6) oder mit der ursprünglichen Ribozym-RNA 2as-Rz12 (Bahn 7). Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 5%-igen Polyacrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthielt, getrennt und durch Autoradiographie visualisiert. Die Position der 5'- und 3'-Spaltungsprodukte ist angegeben. Man kann erkennen, daß asymmetrische Hammerhead-Ribozyme, die eine Helix I von 3 bis 5 Basen aufweisen (2as-Rz12/3 oder 2as-Rz12/5), sehr viel wirksamer bei der Spaltung der Target-RNA sind als das konventionelle Hammerhead-Ribozym 2as-Rz12. Auch das asymmetrische Hammerhead- Ribozym 2as-Rz12/2 zeigt eine beachtliche Spaltungsaktivität, vergleichbar mit der von 2as- Rz12/5. Asymmetrische Hammerhead-Ribozyme, in welchen die Helix I fehlt (2as-Rz12/0) oder nur aus einem Nukleotid besteht (2as-Rz12/1), weisen keine oder nur eine sehr beschränkte Spaltungsaktivität auf.
Die den gespaltenen (5'- und 3'-Spaltungsprodukt) und den ungeschnittenen Materialien in den Bahnen 5-7 entsprechenden Positionen wurden aus dem Gel herausgeschnitten und die darin enthaltene Radioaktivität wurde in counts per minute wie folgt bestimmt:
Ein Umsatz von 67% nach einer Stunde entspricht einer Halbwertszeit der Target- RNA von etwa 35 Minuten, wenn sie mit irgendeinem der asymmetrischen Hammerhead- Ribozyme 2as-Rz12/3 oder 2as-Rz12/5 inkubiert wird, während ein Umsatz von etwa 22%, der mit dem konventionellen Hammerhead-Ribozym 2as-Rz12 erhalten wurde, einer Halbwertszeit von etwa 160 Minuten entspricht. Aus diesen Daten kann man darauf schließen, daß die asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme verglichen mit konventionellen Hammerhead-Ribozymen mit langer Helix I etwa 5-mal effektiver in der katalytischen Aktivität sind. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die Verzögerung, die zur Bildung des doppelsträngigen Komplexes erforderlich ist, welche für die Ribozymspaltung wesentlich ist, in diesem Experiment nicht berücksichtigt wurde, ist zu erwarten, daß der eigentliche Unterschied in den Spaltungsgeschwindigkeiten viel höher ist.

Fig. 7

Sequenz des HIV-1-cDNA-Inserts von pAR6 und DNA-Oligonukleotiden, die für die PCR-Amplifikation verwendet werden, um ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym zu erzeugen. Teil A zeigt das cDNA-564-Basenpaar-cDNA-Insert zwischen den Nukleotiden 5819-6382 des Human T-cell Lymphotropic-Virus Typ III. Der angegebene Strang entspricht dem Sense-Strang, d. h. die RNA, auf die mit einem asymmetrischen Hammerhead-Ribozym gezielt werden kann, weist die gleiche Polarität auf. Die SaII- und KpnI-Sequenzen sind mit einer Box versehen, ebenso wie die GUC-Sequenz, die als spaltbares Motiv selektiert wurde. Die unterstrichenen Sequenzen entsprechen den Bindungsstellen für DNA-Oligonukleotide pAR6 und XHOW, die in der in Beispiel 2 beschriebenen PCR-Reaktion verwendet werden. Die unterstrichene Sequenz GCCTTA, die fett angegeben ist, ist in Fig. 14 erwähnt. Teil B zeigt die Sequenz dieser zwei DNA-Oligonukleotide und ein drittes DNA-Oligonukleotid XHOM, welchem ein G-Rest fehlt, verglichen mit XHOW, und welches in einem weiteren PCR-Experiment eingesetzt wurde, um ein katalytisch inaktives asymmetrisches Hammerhead-Ribozym αY195inac zu erzeugen. Die unterstrichenen Teile können mit pAR6- DNA binden, die zwei Restriktions-Erkennungssequenzen für EcoRI G/AATTC und XhoI C/TCGAG sind kursiv angegeben. Sequenzen, die der katalytischen Domäne von asymmetrischen Hammerhead-Ribozymen entsprechen, sind in Kleinbuchstaben angegeben. Teil C zeigt die zwei DNA-Oligonukleotide, die an pAR6-DNA gebunden sind, wobei nur zur Klarheit das XHOW-DNA-Oligonukleotid in der Konformation der RNA eines Hammerhead- Ribozyms angegeben ist.
Die Sequenz des amplifizierten PCR-Produkts ist in Teil D angegeben.

Fig. 8

Herstellung des asymmetrisches Hammerhead-Ribozyms αY-Rz195 durch Rekombinieren einer mittels PCR hergestellten DNA mit einer Plasmid-DNA, die die geeignete Helix I Box aufweist.
Teil A gibt die Sequenz des DNA-Oligonucleotids UCU an, wobei die HindIII- Sequenz A/AGCTT kursiv angegeben ist.
Teil B zeigt die Bindungsstelle an Plasmid pBS-Rz12/0, welches eine AAA Helix I Box aufweist. Das UCU DNA-Oligonukleotid ist in der Region der Helix I Box nicht komplementär.
Teil C zeigt das Plasmid, das nach dem Re-Klonieren des PCR-Produkts, welches unter Verwendung des UCU DNA-Oligonukleotids erhalten wurde, und des T7-"Primer" - DNA-Oligonukleotids in pT3T7lac erhalten wurde. Das resultierende Plasmid pBS-UCU weist eine TCT Helix I Box auf.
Teil D zeigt das Plasmid pBS-UCU nach Spaltung mit EcoRI und XhoI und Teil E zeigt das in Fig. 7D angegebene PCR-Produkt, gespalten mit EcoRI und XhoI. Eine Ligierung der zwei DNAs führte zu pαY-Rz195, angegeben in Teil F, wobei die aus dem PCR-Produkt abgeleitete Region unterstrichen ist.
Teil G zeigt den asymmetrischen Hammerhead-Komplex, der zwischen αY-Rz195- RNA und der HIV-1-Target-RNA ausgebildet ist, welcher eine Helix I mit nur drei Nukleotiden aufweist.
Teil H zeigt schematisch, welche Regionen des asymmetrischen Hammerhead- Ribozyms aus der mittels PCR hergestellten DNA abgeleitet sind und welche durch den pBS- UCU-Vektor geliefert wurden.
Die Regionen, die im pBS-UCU-Vektor enthalten sind, sind auch in Teil I angegeben, welcher auch die Nukleotidnummern gemäß der Konvention angibt (Hertel et al., siehe oben). Diese Sequenz, welche selbst kein funktionelles Hammerhead-Ribozym ist, ist ein spezifisches Beispiel der allgemeinen Formel 3'-[N]&sub1;&sub1;-[N]Lo-[N]&sub1;&sub0;-[N]&sub9;&submin;&sub3;-[N]-5', die im Text und im Anspruch 1 angegeben ist.
In diesem spezifischen Beispiel entspricht [N]5'UCU(TCT), welches die Helix I in einem Hammerhead-Ribozym/Target-Komplex (oder die Helix I Box im Fall von DNA, vgl. Fig. 8C) darstellt, [N]&sub9;&submin;&sub3; entspricht 5' CUGAUGA, welches die Nukleotide 3 bis 9 eines Hammerhead-Ribozyms darstellt, [N]&sub1;&sub0; entspricht 5' GGCC, welches die Nukleotide 10.1 bis 10.4 darstellt (entsprechend 10. n, wobei n 4 ist), [N]&sub1;&sub1; entspricht G oder Nukleotid 11.4 (entsprechend 11.m, wobei m 4 ist) und [N]Lo entspricht 5' UCGA, welches die Nukleotide L2.1, L2.2, L2.3, L2.4 darstellt, welche zum Bilden von Loop 2 eines Hammerhead- Ribozyms befähigt sind.
Die Restriktions-Erkennungssequenz, die für die Rekombination mit dem PCR- Produkt eingesetzt wird, ist XhoI (CITCGAG) (Nukleotide 10.4 bis 11.4). Auch eine zweite Restriktions-Erkennungssequenz ist vorhanden: StuI (AGG/CCT) (Nukleotide 9 bis L2.1). Im Prinzip ist es auch vorstellbar, daß die Rekombination über die letzere Restriktionsstelle abläuft, so daß es möglich ist, daß [N]&sub1;&sub1; oder sogar [N]Lo in einem Vektor mit einer Helix I Box fehlen.

Fig. 9

Eine zweite Strategie zur Herstellung asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme durch Rekombinieren einer mittels PCR hergestellten DNA mit einer Plasmid-DNA, welche die geeignete Helix I Box aufweist.
Teil A zeigt die Teile des asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms, die durch PCR geliefert werden müssen, und die Teile, die aus einer bestimmten Vektor-DNA stammen, welche aus einem vorgefertigten Set von 64 Vektoren gewählt ist, der jeder eine unterschiedliche Helix I Box mit drei Nukleotiden enthält. Verglichen mit der ersten, in Fig. 8 dargelegten Strategie hat sich die Sequenz der katalytischen Domäne in der Position der Nukleotide 10.2 und 11.2 geändert (in Großbuchstaben angegeben). Weiters wurde der Teil der Sequenz entsprechend der katalytischen Domäne, der in dem Vektor enthalten ist, erweitert, so daß eine Rekombination über die Nukleotide 11.1 und 12 abläuft.
Teil B zeigt die Sequenz eines solchen Vektors. Sie enthält zwei Restriktionsstellen A und B, wobei jeweils A und B auch ein Set von Stellen sein können und B auch entbehrlich ist. Die Helix I Box besteht aus drei Nukleotiden, welche irgendeine der 64 möglichen Kombinationen sein kann, und sie enthält eine AccI-Erkennungsstelle GT/CGAC, wobei der CGAC-Teil den Nukleotiden 12, 11.1, 11.2, 11.3 entspricht.
Das PCR-Produkt, das für die Rekombination in eine DNA, die ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym (Teil C) codiert, erforderlich ist, enthält eine terminale SfuI-Stelle (TT/GCAA), wobei der TT/GA-Teil den Nukleotiden 14, 13, 12, 11.1 entspricht. Der SfuI- Stelle folgen zwei oder mehr nicht verwandte Nukleotide N und N', was die Spaltbarkeit durch SfuI erleichtert oder unterstützt. Nach Spaltung der DNAs mit einer Restriktions- EndoNuklease, die in jeder Region A spaltet, und mit SfuI bzw. AccI (Teil D), werden die zwei DNA rekombiniert (Teil E), was zu einer zerstörten AccI- und SfuI-Stelle führt. Die RNA, die vom upstream-Promotor aus transkribiert ist, liefert ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym, das in Teil F angegeben ist.

Fig. 10

Die pUR-Serie von Vektoren, die für die Strategie zur Herstellung von in Fig. 9 beschriebenen asymmetrischen Hammerhead-Ribozymen verwendbar sind.
Teil A zeigt den universellen Vektor pUR zur Erzeugung von Ribozymen. Er enthält die Sequenz der katalytischen Domäne von Hammerhead-Ribozymen, wie in Fig. 9 dargelegt, eingefügt in die SalI-(AccI-) und SphI-Stellen des Plasmids pT3T7lac (Boehringer Mannheim, Deutschland). Die Helix I Box ist durch NNN und N'N'N' angegeben, welche irgendeine der 64 möglichen Kombinationen sein kann. Zum Beispiel wäre in pUR-AAA die Sequenz N!N'N' AAA, welche für den Aufbau eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms geeignet wäre, das eine Helix I bestehend aus der Sequenz AAA erfordert. Das Set von Plasmiden wurde durch Einfügen einer synthetischen DNA-Kassette (Teil B) in das mit SalI und SphI gespaltene pT3T7lac erhalten. Die Kassette bestand aus zwei DNA- Oligonukleotiden Pat3A und Pat3B, welche in Teil C gezeigt sind.

Fig. 11

Herstellung eines Vektors mit einer Helix I Box mit 4 Nukleotiden durch Einfügen einer synthetischen DNA-Kassette.
Teil A zeigt schematisch die Polylinker-Region des Plasmids pBluescript II KS (Stratagene) mit der XhoI- und PstI-Stelle im Detail. Die zwei DNA-Oligonukleotide HB1 und HB2 wurden phosphoryliert, einem Annealing unterzogen und in das mit XhoI und PstI geschnittene Plasmid eingefügt (Teil B). Teil C zeigt den endgültigen Vektor pAGUG mit der AGTG Helix I Box. Auch Vektoren mit längeren Helix I Boxen konnten so aufgebaut werden.

Fig. 12

Herstellung eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms durch Einfügen einer cDNA-Kassette in eine EcoRI-Stelle.
Teil A zeigt den Hammerhead-Komplex eines asymmetrischen Hammerhead- Ribozyms mit einer Target-Sequenz, die die Sequenz GAAUUC enthält, welche auf Ebene der cDNA einer EcoRI-Restriktions-Erkennungssequenz entspricht.
Teil B zeigt die cDNA, die die Target-RNA codiert, und Teil C zeigt, wie eine synthetische DNA-Kassette in eine mit EcoRI gespaltene cDNA eingefügt werden kann, wodurch eine DNA hergestellt wird, die für ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym codiert. Die mit N und N' dargestellten Nukleotidsequenzen können irgendeine andere nützliche Sequenz, wie z. B. zusätzliche Restriktions-Erkennungssequenzen und/oder eine Promotor-Region, enthalten.

Fig. 13

Herstellung eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms durch Einfügen einer cDNA in einen vorgefertigten Vektor, der eine Helix I Box enthält.
Teil A zeigt eine Vektor-DNA, bestehend aus einer oder mehreren Restriktions- Erkennungssequenzen A, einer ApoI-Restriktions-Erkennungssequenz und der katalytischen Domäne einer Hammerhead-RNA (in Kleinbuchstaben), gefolgt von einer Helix I Box und optionalen Restriktionsstellen B und einem optionalen Promotor.
Teil B symbolisiert eine cDNA mit Restriktions-Erkennungssequenzen für irgendeine Restriktionsstelle A, welche auch im Vektor in Teil A und EcoRI vorhanden ist. Nach Verdauung der cDNA und des Vektors, der die passende Helix I Box aufweist, mit dem Restriktionsenzym A und EcoRI bzw. ApoI, wird das cDNA-Fragment in den Vektor ligiert (Teil C), wodurch eine DNA hergestellt wird, die ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym codiert (Teil D). Das asymmetrische Hammerhead-Ribozym ist gegen das UUC-Motiv gerichtet, das Teil der EcoRI- Restriktions-Erkennungssequenz ist (Teil E).

Fig. 14

Herstellung eines doppelten Ribozyms, das eine intramolekulare selbstspaltende Stelle enthält.
Teil A zeigt den asymmetrischen Hammerhead-Komplex, der zwischen der RNA αY- Rz195 (vgl. Fig. 7 und 8) mit seiner Target-RNA ausgebildet ist. Die Nukleotide 15.4 bis 15.9 und die Nukleotide 15.58 bis 15.63 sind unterstrichen. Diese Sequenzen sind komplementär.
Teil B zeigt die intramolekulare Wechselwirkung zwischen diesen zwei Hexanukleotid-Sequenzen.
Teil C zeigt die Position der Nukleotide 15.58 bis 15.63 im Plasmid pαY-Rz195. Die Sequenz, die der katalytischen Domäne entspricht, ist in Kleinbuchstaben angegeben. Die Bindungsstellen für die zwei DNA-Oligonukleotide DRZ und XHOW (siehe D) sind unterstrichen. Plasmid pαY-Rz195 enthält eine HindIII-Restriktions-Erkennungssequenz (in einer Box), die zwischen dem T3-Promotor und der Helix I Box angeordnet ist. Diese HindIII-Stelle wurde durch Verdauung mit HindIII zerstört, gefolgt von einer Behandlung mit Nuklease S1 und Re-Ligierung, was Plasmid pαY-Rz195-H lieferte (Teil D). Dieses Plasmid wurde als Template für eine PCR-Reaktion verwendet, die mit den zwei DNA- Oligonukleotiden DRZ und XHOW, die angegeben sind, durchgeführt wurde. DRZ enthält eine Restriktions-Erkennungssequenz für EcoRI und HindIII. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit EcoRI und XhoI gespalten und in pαY-Rz195-H wiedereingeführt, so daß ein Plasmid pαY-Rz63 erhalten wurde (Teil E). Dieses Plasmid codiert die RNA αY-Rz63, die den intramolekularen asymmetrischen Hammerhead-Komplex bilden kann, der in Teil F angegeben ist. Die Nukleotide 15.58 bis 15.63 können nun als Nukleotide 16.9 bis 16.4 einer intramolekularen Hammerhead-RNA angesehen werden.
Nach Einfügen des EcoRI-HindIII-Fragments von Plasmid pBS-Rz12/3 (Fig. 4) in die EcoRI- und HindIII-Stelle von pαY-Rz63 wird eine DNA hergestellt, die ein doppeltes Ribozym codiert. Das RNA-Transkript dieser DNA ist in Teil G gezeigt. Die RNA besteht aus zwei Domänen, der αY-Rz63-Domäne (unten), welche am 5'-Ende angeordnet ist und durch die Sequenz AAGCUU (in einer Box) verbunden ist, welche die Restriktions- Erkennungssequenz für HindIII darstellt, zur 3'-terminalen Domäne, die der 2as-Rz123-RNA ähnelt. Da die 5'-terminale Domäne die intramolekulare Konformation eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms annehmen kann, erfolgt eine Spaltung an der angegebenen Stelle, wodurch zwei RNA freigesetzt werden, die in Teil H gezeigt sind. Das 3'-terminale C- Nukleotid der αY-Rz63-Domäne trägt 2', 3'-Cyclophosphat. Beide RNAs spalten unabhängig ihre HIV-1-Target-RNA an unterschiedlichen Stellen.

Fig. 15

Schematische Pläne der HIV-1-Target-Sequenz und der katalytischen Antisense- RNAs.
Der obere Teil zeigt funktionale Elemente des HIV-1-Genoms und der durchgezogene Balken unten Details der Region zwischen Nukleotiden 222-633, welche der Sense-RNA 2s entsprechen, die als Target-RNA eingesetzt wurde. Funktionale Elemente in dieser Region sind ebenfalls angegeben. Die Antisense-RNA 2as ist komplementär zur RNA 2s. Die katalytische Anitsense-RNA 2as-Rz12 enthält eine eingebaute katalytische Domäne von 22 Nukleotiden, welche die Spaltung der Target-RNA zwischen den Nukleotiden 505 und 506 bewirkt. Der Balken unten zeigt die katalytischen Antisense-RNAs mit verkürzten Helices I.

Fig. 16

Strategie zur vereinfachten Herstellung asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme.
Das linke Panel zeigt die Konvertierung des Plasmids pBS-Rz12/0, das - wenn es vom T3-Promotor aus transkribiert wurde - die katalytische Domäne eines Hammerhead-Ribozyms codiert, dem eine AAA-Sequenz vorangeht, die eine Helix I in einem asymmetrischen Hammerhead-Ribozym bilden könnte. Unter Verwendung des DNA-Oligonukleotids UCU und des T7-Sequenzierprimers d(TAATACGACTCACTATAGGG) wurde ein DNA- Fragment mittels PCR amplifiziert und re-kloniert, was zu einem Plasmid pBS-UCU mit einer modifizierten Helix I Box führte. Das resultierende T3-RNA-Transkript konnte mit einer Target-RNA mit einem spaltbaren Motiv, dem eine AGA-Sequenz folgt, paaren. In ähnlicher Weise können alle vorstellbaren Helix I Boxen mit drei Nukleotiden eingeführt werden. Das rechte Panel zeigt die Konvertierung des Plasmids pRC-SR6, das HIV-1-cDNA-Sequenzen enthält (Nukleotidnummern beziehen sich auf die Sequenz von Ratner et al., Nature 313 (1985), 277-284; jene in Klammern auf das SR6-RNA-Transkript), zu einem Ribozym- Konstrukt. Die GTC-Sequenz, die der selektierten Target-Stelle entspricht, ist mit einer Box versehen. Zwei "nested" DNA-Oligonukleotide AR6B und XHOW wurden für die PCR- Amplifizierung eingesetzt. Letzeres ist nur zur Klarheit in der Konformation einer Hammerhead-Struktur angegeben. Die amplifizierte DNA wurde über die neu eingeführten EcoRI- und XhoI-Stellen in das Plasmid pBS-UCU kloniert, das die passende Helix I Box liefert, was zu Plasmid pαY195 führte. Das verbundene Kontroll-Plasmid pαY195inac wurde ähnlich hergestellt, wobei anstelle von XHOW ein DNA-Oligo ohne den G-Rest, der die AAA-Sequenz am 3'-Ende der katalytischen Domäne fortsetzt, eingesetzt wurde. Nach Transkription mit T3-RNA-Polymerase wird die asymmetrische Ribozym-RNA αY195 (oder αY195inac) hergestellt, die unten in ihrer Hammerhead-Konformation zusammen mit der Target-RNA SR6 gezeigt ist. Dieser Hammerhead-Komplex bildet eine Helix I mit drei Nukleotiden und eine Helix III, die aus 195 Nukleotiden besteht. Daher erfordert der Aufbau asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme nur eine PCR-Amplifizierung, gefolgt von einem Subklonieren in den passenden Vektor, der die katalytische Domäne samt der targetspezifischen Helix I-bildenden Region liefert.

Fig. 17

Eine dritte Strategie zur Herstellung asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme durch Rekombinieren einer mittels PCR hergestellten DNA mit einer Plasmid-DNA mit der geeigneten Helix I Box.
Teil A zeigt die Teile des asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms, die durch PCR und durch ein Set vorgefertiger Vektoren, die eine Helix I Box enthalten, geliefert werden müssen. Verglichen zu der ersten, in Fig. 8 dargelegten Strategie wurde die Sequenz der katalytischen Domäne in der Position der Nukleotide L2.2 und L2.3 (diese Änderungen haben keine besondere Bedeutung) und bei Position L2.4 (C anstelle von G) geändert. Als Ergebnis wird eine neue EagI-Stelle (C/GGCCG) geschaffen, die in Großbuchstaben angegeben ist und die Nukleotide L2.4, 11.4-11.1 und 12 umfaßt.
Teil B zeigt die Sequenz eines solchen Vektors (pFORTH-Serie). Sie enthält zwei Restriktionsstellen A und B, wobei A und B jeweils auch ein Set von Stellen sein können und B auch entbehrlich ist. Die Helix I Box besteht aus drei Nukleotiden, welche irgendeine der 64 möglichen Kombinationen sein kann.
Das PCR-Produkt, das für eine Rekombination in eine DNA erforderlich ist, die ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym (Teil C) codiert, enthält eine terminale EagI-Stelle (C/GGCCG), die auch den Nukleotiden L2.4, 11.4-11.1 und 12 entspricht.
Nach Spaltung der DNAs mit EagI und einer Restriktions-Endonuklease, die in jeder Region A (Teil D) spaltet, werden die zwei DNA rekombiniert (Teil E), was zu einer regenerierten EagI-Stelle führt. Die RNA, die vom upstream-Promotor aus transkribiert wurde, liefert ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym, das in Teil F angegeben ist.

Fig. 18

Spaltungsanalyse eines Sets von katalytischen Antisense-RNAs, die von 2as abgeleitet sind.
(A) Radioaktiv markierte Target-RNA 2s wurde für 5 Minuten bei 37ºC allein (Bahn 1) oder mit den Ribozym-RNAs, die am Kopf jeder Bahn angegeben sind, inkubiert und auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt. Bahn M enthält radioaktiv markierte HinfI-Fragmente von Plasmid pBR322. Die Position der Substrat-RNA (S) und die Position der 5'- und 3'-Spaltungsprodukte sind angegeben.
(B) Gleiche Reaktion wie in (A), außer daß für 60 Minuten inkubiert wurde. Die in Bahn 11 analysierten RNAs wurden für 5 Minuten bei 60ºC vorgewärmt, gefolgt vom Kühlen in Eis und einer normalen Inkubation bei 37ºC für 60 Minuten.

Fig. 19

Analyse der Ribozym-Reaktionen auf einem nativen Polyacrylamidgel.
Die Ribozym-Reaktion wurde unter Bedingungen ausgeführt, wie sie in der Legende zu Fig. 18B beschrieben sind, und die Reaktionsprodukte wurden auf einem nativen Polyacrylamidgel getrennt. Die Position der Substrat-RNA ist angegeben (S). Substrat-RNA, die Ribozym-RNA bindet, bildet einen Komplex, der nicht in das Gel migriert (C). Ribozym- RNAs, die in den Bahnen 4-8 analysiert wurden, setzen das 3'-Spaltungsprodukt frei (3'). Bahn M enthält radioaktiv markierte HinfI-Fragmente von Plasmid pBR322.

Fig. 20

Replikation von HIV-I in Gegenwart asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme und Kontroll-RNAs.
Alle RNAs (160 ng) wurden durch Co-Transfektion in menschlichen SW480-Zellen mit infektiöser proviraler HIV-1-DNA (pNL4-3, 40 ng) getestet. CAT-RNA diente als 100%- Replikations-Kontrolle. Die Balken stellen Durchschnitte aus 24 Messungen dar (16 im Fall von αY-Rz195 und αY-Rz195inac); die Durchschnittswerte in % Replikation sind mit Zahlen nahe den Balken angegeben und die Standardabweichungen der Mittelwerte sind im Diagramm angegeben. Schwarze Balken stellen katalytisch inaktive RNAs und punktierte Balken katalytisch aktive RNAs dar.

Fig. 21

Spaltung von RNA SR6 durch das asymmetrische Hammerhead-Ribozym αY-Rz195.
Radioaktiv markierte Substrat-RNA SR6 wurde für unterschiedliche Reaktionszeiten, wie am Kopf jeder Bahn (in Stunden) angegeben, mit dem asymmetrischen Hammerhead- Ribozym αY-Rz195 inkubiert und auf einem Polyacrylamid/Harnstoffgel analysiert und durch Autoradiographie visualisiert. Die Position des Substrats (S) und der 5'- und 3'- Spaltungsprodukte sind angegeben.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung:
Mehr Information über die hierin angewendeten Verfahren findet sich in Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbour, zweite Auflage, 1989.

Beispiel 1: Herstellung asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme

Das Plasmid pBS29-Rz12 codiert für das HIV-1-spezifische Ribozym 2as-Rz12, das in den Fig. 1, 2 und 15 angegeben ist. Die relevante Sequenz von Plasmid pBS29-Rz12 ist in Fig. 3 gezeigt und auch die DNA-Sequenz, die die katalytische Domäne codiert, ist angegeben, ebenso wie die Position von T3- und T7-Promotoren und die Position der SacI- und HindIII-Restriktions-Stellen.
Um asymmetrische Ribozyme herzustellen, die eine nur kurze Helix I bilden können, wurde die DNA von Plasmid pBS29-Rz12 verschiedenen Polymerase Chain Reactions (PCR) unterzogen.
Anfänglich wurden zwei Reaktionen jeweils in einem Reaktionsvolumen von 100 ul durchgeführt, das enthielt:
20 mM Tris pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 25 mM KCl, 0,05% Tween 20,
Rinderserumalbumin (Molekularbiologie-Reinheit) 0,1 mg/ml, eine Mischung von dATP, dCPT, dGTP, dTTP, jeweils 0,1 mM, 100 pg Plasmid-DNA von pBS29-Rz12, 20 pmol des Oligodesoxynukleotids ("T7-Primer") d(TAATACGACTCACTATAGGG) und 20 pmol entweder des Oligonukleotids Rz12/5 d(AAAAGCTTGTCCTGATGAG) bzw. Rz12/3 d(GCAAGCTTAGTCCTGATGAG), und 5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Minotech, Heraklion/Kreta, Griechenland).
Die Reaktion wurde in einem DNA-Thermocycler (Perkin Eimer Cetus) gemäß dem folgenden Reaktionsschema durchgeführt:
7 Minuten bei 94ºC, vier Zyklen bestehend aus 30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 15ºC, 2 Minuten bei 72ºC. Darauf folgten 30 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 45ºC, 2 Minuten bei 72ºC, bevor die Reaktionsmischungen für endgültige 7 Minuten bei 72ºC inkubiert wurden.
Die PCR-Produkte wurden mit SacI und HindIII gespalten und in den Vektor pT3T7lac (Boehringer Mannheim) an den gleichen Stellen ligiert.
Die resultierenden Plasmide wurden pBS-Rz12/3 bzw. pBS-Rz12/5 genannt. Ihre relevante Sequenz wurde durch Didesoxysequenzieren bestätigt. Die Sequenzen der DNA sind in Fig. 4 gezeigt, und die RNA-Transkripte, die durch T3-RNA-Polymerase aus pBS- Rz12/3 und pBS-Rz12/5 erhalten wurden, sind in 5 dargelegt, wobei die Konformation der resultierenden asymmetrischen Hammerhead-Ribozym-RNAs angegeben ist. Das Plasmid pBS-Rz12/3 wurde mit HindIII verdaut und mit Nuklease 51 behandelt, um die vorstehenden Enden zu trimmen. Eine Re-Ligierung erzeugte Plasmid pBS-Rz12/3H.
Fünf weitere PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, unter Verwendung der gleichen Reaktionsbedingungen, außer 100 pg pBS-Rz12/3 anstelle von pBS29-Rz12 und anstelle von Rz12/5 oder Rz12/3 die DNA-Oligonukleotide Rz12/0: d(CCAAGCITAAAACTGATGAG) oder Rz12/1: d(CCAAGCTTAAACCTGATGAG) oder Rz12/2: d(CCAAGCTTAATCCTGATGAG) oder Rz12/8: d(GGAAGCTTATTTGTCCTGATGAGG) bzw. Rz12/13:
d(GGAAGCTTAGTATTTGTCCTGATGAGG). Die resultierenden PCR-Produkte wurden auch mit SacI und HindIII gespalten und in pT3T7lac kloniert, was zu den Plasmiden pBS-Rz12/0, pBS-Rz12/1, pBS-Rz12/2, pBS-Rz12/8 bzw. pBS-Rz12/13 führte. Die relevante Sequenz wurde durch Sequenzieren bestätigt. Für die Herstellung von Plasmid pBS-Rz12/88 wurden zwei DNA-Oligonukleotide SX1: d(CAAGGCTGTTTCGGCC) und SX2:
d(TCGAGGCCGAAACAGCCTTGAGCT) am 5'-Ende mit Hilfe von T4-Kinase phosphoryliert, jeweils einem Annealing aneinander unterzogen und in Plasmid pBS-Rz12/8 ligiert, das mit SacI und XhoI gespalten worden war. Der korrekte Aufbau wurde durch Sequenzieren bestätigt.
Die relevanten Sequenzen der DNAs sind in Fig. 4 gezeigt und die resultierenden RNA-Transkripte, die durch T3-RNA-Polymerase aus allen diesen Plasmiden erhalten wurden, sind in Fig. 5 dargestellt, wobei die Konformation der resultierenden asymmetrischen Hammerhead-Ribozym-RNAs angegeben ist.
Ein Ribozym-Assay ist in den Fig. 18 und 19 angegeben, und die Spaltungsgeschwindigkeiten einiger Konstrukte sind in Tabelle II zusammengefaßt:
a Die Standardabweichung war 10% oder weniger.

Beispiel 2: Herstellung eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms mit Hilfe von PCR

Um ein zweites auf HIV-1 gerichtetes asymmetrisches Hammerhead-Ribozym herzustellen, wurde das Plasmid pAR6 (Sczakiel et al., J. Virol 66 (1992), 5576-5581) selektiert (Fig. 7A). Eine bestimmte GUC-Sequenz wurde als spaltbares Motiv selektiert (Fig. 7A und 16), welcher in diesem Fall ein downstream-AGA-Motiv in der Target-RNA folgt. Ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym, das dieses Motiv spalten kann, benötigt eine UCU-Sequenz, die mit der Target-RNA eine Helix I bilden kann. Um die katalytische Domäne einzuführen, wurde eine PCR-Reaktion durchgeführt, unter Anwendung der gleichen experimentellen Bedingungen wie in Experiment 1, aber DNA von pAR6 und die zwei DNA- Oligonukleotide AR6B und XHOW. Deren Sequenz ist in Fig. 7B und Fig. 7C, ebenso wie in Fig. 16 angegeben, die ihre Bindungsstellen an pAR6-DNA zeigen. Das PCR-Produkt (Fig. 7D und 16) enthält weder die vollständige Sequenz der katalytischen Domäne eines Hammerhead-Ribozyms noch seine Helix I-Region.
Das Plasmid pBS-Rz12/0 codiert nicht ein katalytisch aktives asymmetrisches Hammerhead-Ribozym, da es mit seiner Target-RNA keine Helix I bilden kann (vgl. Fig. 5). Es kann jedoch als Basis für den Aufbau eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms verwendet werden, das eine Helix I mit drei Nukleotiden, bestehend aus AAA für die Nukleotide 2.3, 2.2, 2.1, bildet, da diese Nukleotide der Sequenz der katalytischen Domäne benachbart sind (vgl. Fig. 4). Die Technik für einen solchen Aufbau ist im Detail unten beschrieben (siehe auch Fig. 8, 9).
Das Plasmid pBS-Rz12/0 kann auch zur Herstellung einer anderen der weiteren 63 vorstellbaren Dreinukleotid-Sequenzen, die sich von AAA unterscheiden, eingesetzt werden. Diese Nukleotid-Sequenz, die die Nukleotide 2.3, 2.2, 2.1 eines Hammerhead-Ribozyms darstellt, wird im folgenden "Helix I Box" genannt. In Fig. 8A-C ist die Konvertierung einer AAA-Box in eine TCT-Box beschrieben. Zu diesem Zweck wurde das DNA-Oligonukleotid UCU synthetisiert (Fig. 8A) mit der Sequenz: d(GCAAGCTTATCTCTGATGAGG). Dieses DNA-Oligonukleotid wurde zusammen mit Plasmid-DNA von pBS-Rz12/0 und dem T7- Primer-DNA-Oligonukleotid (vgl. Experiment 1) in einer analogen PCR-Reaktion, wie in Beispiel 1 dargelegt, verwendet. Das PCR-Produkt wurde mit SacI und HindIII gespalten und in pT3T7lac kloniert, was zum Plasmid pBS-UCU (Fig. 8C) führte, welches eines Helix I Box: TCT aufweist. Die korrekte Manipulation wurde durch Sequenzieren bestätigt.
Ähnlich wie die AAA-Box von pBS-Rz12/0 in eine TCT-Box konvertiert wurde, wurde sie in 5 alternative Helix I Boxen konvertiert und kann in irgendeine der vorstellbaren Dreinukleotid-Sequenzen konvertiert werden.
Das aktuell gewünschte asymmetrische Hammerhead-Ribozym wurde dann durch Rekombinieren von pBS-UCU mit dem PCR-Fragment, das mit pAR6 und den DNA-Oligos AR6B und XHOW erhalten wurde, aufgebaut. Beide DNAs wurden jeweils mit EcoRI und XhoI (Fig. 8D, E) gespalten und das EcoRI-XhoI-Fragment des PCR-Produkts wurde in pBS-UCU, das mit EcoRI und XhoI geschnitten wurde, eingefügt, was zu Plasmid pαY- Rz195 führte (Fig. 8F). Nach Transkription mit T3-RNA-Polymerase wurde die RNA αY- Rz195 synthetisiert. Die RNA kann mit ihrer Target-RNA das asymmetrische Hammerhead- Ribozym mit einer Helix I-Region mit drei Nukleotiden bilden (Fig. 8G).
Fig. 8H stellt schematisch den Ursprung der für den Aufbau von pαY-Rz195 verwendeten DNAs dar. Das PCR-Produkt liefert die Helix III-bildende Region und ein Teil der Helix II, umfassend die Nukleotide 12, 13, 14 (vergleiche Fig. 2) und die Loop 2- Nukleotide. Der andere Teil kommt von dem nicht verwandten Plasmid pBS-UCU, welches die gesamte Helix I-Region liefert, die Nukleotide 3-9 der katalytischen Domäne, samt den Nukleotiden 10.1 bis 10.4, welche die 5'-Hälfte von Helix II und die Loop 2-Nukleotide bilden. Eine Rekombination der zwei DNAs trat über die XhoI-Stelle CITCGAG auf, welche in beiden DNAs vorhanden ist. Fig. 8I zeigt die Nukleotidnummern des relevanten Teils für den Ribozymaufbau, der im pBS-UCU-Vektor vorhanden ist und der allgemeinen Formel von Anspruch 1 entspricht.
Parallel zum Plasmid pαY-Rz195 wurde ein zweites Plasmid pαY-Rz195inac mit dem DNA-Oligonukleotid XHOM, das sich von XHOW in einem Nukleotid unterscheidet, aufgebaut. Dem resultierenden asymmetrischen Hammerhead-Ribozym fehlt das Nukleotid 12 der katalytischen Domäne (ein G-Nukleotid) und es ist deshalb völlig inaktiv. Ein Ribozym-Assay von αY195 ist in Fig. 21 angegeben.

Beispiel 3: Herstellung eines Sets von Plasmidvektoren mit einer Helix I Box mit drei Nukleotiden.

Im Prinzip kann jede gewünschte Helix I Box mit drei Nukleotiden durch Manipulieren von Plasmid pBS-12/0 oder verwandter Plasmide erzeugt werden, die dann mit einem PCR-Produkt kombiniert werden, das den komplementierenden Teil der katalytischen Domäne eines Hammerhead-Ribozyms samt der Helix III-bildenden Region liefert, wie in Beispiel 2 und Fig. 8 beschrieben. Um die PCR-Amplifikation wirtschaftlicher zu gestalten, wäre es wünschenswert, die Sequenz zu kürzen, die mit der katalytischen Domäne eines Hammerhead-Ribozyms überlappt, und einen größeren Teil der Sequenz der katalytischen Domäne in den Vektor einzuschließen. Die Strategie dafür ist in Fig. 9 und in Fig. 17 dargelegt. Der Vektor in Fig. 9 liefert Nukleotide 2.3, 2.2, 2.1, welche der Helix I Box entsprechen, und die Nukleotide 3 bis 12 der katalytischen Domäne (Fig. 9A). Das PCR- Produkt liefert die Nukleotide 11.1, 12, 13, 14 der katalytischen Domäne und die Helix IIIbildenden Nukleotide 15.1 bis 15.y. Eine Rekombination tritt über die Nukleotide 11.1 und 12 auf. Diese allgemeine Strategie wird durch Erzeugen von Vektoren, wie in Fig. 9B angegeben, erzielt. Das Plasmid besteht aus zwei Restriktionsstellen A und B, wobei A und B irgendeine vernünftige Restriktionsstelle sein kann, jede Stelle A und B auch aus mehreren Restriktions-Erkennungssequenzen (Polylinker-Regionen) bestehen kann und zumindest B auch entbehrlich ist. Die Sequenz, die den Teil der katalytischen Domäne eines Hammerhead- Ribozyms codiert, wie in Fig. 9A angegeben, ist zwischen einer AccI-Stelle der Sequenz GT/CGAC und der Helix I Box enthalten. Upstream der Helix I Box befindet sich ein geeigneter Promotor (Fig. 9B). Das PCR-Produkt (Fig. 9C) sollte eine Restriktionsstelle A und eine terminale SfuI-Stelle enthalten. Durch Rekombinieren des mit Restriktionsenzym A und AccI (Vektor) und Restriktionsenzym A und SfuI (PCR-Produkt) (Fig. 9D) gespaltenen DNA-Fragments wird die rekombinante DNA (Fig. 9E) erzeugt, aus welcher das asymmetrische Hammerhead-Ribozym, wie in Fig. 9F angegeben, synthetisiert werden kann.
Fig. 10 zeigt ein spezifisches Beispiel eines solchen Vektor-Plasmids (pIMBB- Serie), das für eine einfache Herstellung asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme verwendet werden kann.
Es basiert auf dem Plasmid pT3T7lac, das die Sequenz zwischen den AccI und SphI- Stellen, wie angegeben, enthält. Zum Aufbau von Plasmiden der pIMBB-Serie wurden die zwei DNA-Oligonukleotide Pat3a und Pat3b synthetisiert (Fig. 10C). Beide DNA- Oligonukleotide enthalten eine zufällige Sequenz aus drei Nukleotiden. Durch Einfügen der einem Annealing unterzogenen und phosphorylierten DNA-Oligonukleotide in pT3T7lac wird ein Set von 64 verschiedenen Plasmiden erhalten. Das Sequenzieren individueller Plasmid- Klone identifiziert eine bestimmte Helix I Box. Spezifische Boxen können durch Synthetisieren eines spezifischen Paares an DNA-Oligonukleotiden hergestellt werden.
Basierend auf der allgemeinen, in Fig. 10 gezeigten Sequenz wurden die folgenden Plasmide hergestellt und für den Ribozymaufbau mit unterschiedlichen Substraten eingesetzt: pIMBB-GCT/AGC, pIMBB-GTT/AAC, pIMBB-AGG/TCC, wobei GCT, GTT und AGG die entsprechenden Helix I Boxen darstellen.
Eine ähnliche Strategie, wie in Fig. 9 dargelegt, ist in Fig. 17 angegeben und beschrieben.
Hier ist die Klonierungsstelle, die für das Einfügen des PCR-Fragments in einen der Vektoren der pFORTH-Serie verwendet wird, EagI, welches während des Klonierens regeneriert wird. Ähnliche Vektorsysteme sind vorstellbar.
Auch die gesamte katalytische Domäne samt der Helix I-bildenden Region kann durch ein DNA-Oligonukleotid geliefert werden, das für die PCR-Amplifizierung eingesetzt wird.

Beispiel 4: Herstellung eines Plasmidvektors mit einer Helix I Box mit vier Nukleotiden.

Um einen Vektor mit einer Helix I Box herzustellen, die länger als drei Nukleotide und geeignet für die PCR-Strategie ist, um asymmetrische Hammerhead-Ribozyme zu erzeugen, wie in den Fig. 8 und 9 dargelegt, kann eine spezifische DNA-Kassette eingefügt werden. Die Fig. 11 zeigt das Einfügen einer synthetischen DNA-Kassette, die aus den einem Annealing unterzogenen und phosphorylierten DNA-Oligonukleotiden HB1 und HB2 besteht, in das Plasmid-pBluescript II KS (Stratagene), um eine Helix I Box mit vier Nukleotiden herzustellen, die aus Nukleotiden AGTG besteht. Die korrekten Sequenzmanipulationen im resultierenden Plasmid pAGUG wurden durch Sequenzieren bestätigt.

Beispiel 5. Herstellen von asymmetrischen Hammerhead-Ribozymen durch Einfügen einer synthetischen cDNA-Kassette in Restriktions-Erkennungsstellen.

Einige Restriktions-Erkennungssequenzen enthalten ein spaltbares Motiv und können zum Einfügen von synthetischen DNA-Kassetten verwendet werden, um eine DNA zu erzeugen, die ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym codiert. Insbesondere nützlich sind jene Restriktions-Erkennungssequenzen, in welchen das potentielle Nukleotid 17 des spaltbaren Motivs der Target-RNA Teil der Restriktions-Erkennungssequenz, aber nicht Teil der vorstehenden Enden ist, die nach Verdauung mit dem Restriktionsenzym erzeugt werden. Zum Beispiel enthält EcoRI (G/AATTC) das UUC-Motiv, ApoI (R/AATT) enthält entweder ein UUC- oder UUU-Motiv, Psp1406I(AA/CGTT) enthält ein GUU-Motiv, Aatl (GACGT/C) und SnaBI(TAC/GTC) enthalten ein GUC-Motiv, HindIII (A/AGCTT) enthält ein CUU-Motiv, Ecl126II (GAC/CTC) und SacI (GAGCT/C) enthalten ein CUC-Motiv, SspI (ATA/TAT) enthält ein AUA-Motiv und EcoRV (GAT/ATC) enthält ein AUC-Motiv. Auf irgendeine RNA-Sequenz, die eine dieser Restriktions-Erkennungssequenzen enthält, kann durch ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym gezielt werden, wie für die EcoRI- Restriktions-Erkennungssequenz in Fig. 12A gezeigt ist. Die entsprechende doppelsträngige cDNA, die diese Target-RNA codiert, ist in Fig. 12B gezeigt. Nach Verdauung mit EcoRI kann die im mittleren Teil von Fig. 12C gezeigte synthetische DNA-Kassette eingefügt werden, wodurch eine DNA erzeugt wird, die ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym codiert. Die mit N und N' dargestellten Nukleotidsequenzen können andere nützliche Sequenzen, wie z. B. Restriktions-Erkennungssequenzen und/oder Promotorsequenzen, enthalten. Ähnliche Strategien können für jede der oben erwähnten und weiters geeigneten Restriktions-Erkennungssequenzen entwickelt werden. Dieses Verfahren der Herstellung eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms erfordert nicht den Einsatz einer PCR- Reaktion.
Das Verfahren kann modifiziert werden, wie in Fig. 13 angegeben. Hier wird die Sequenz, die der synthetischen DNA-Kassette entspricht, durch einen DNA-Vektor der pApo- Serie geliefert, bestehend aus einem oder mehreren Restriktions-Erkennungsstellen A, gefolgt von einer Restriktions-Erkennungssequenz für ApoI, wobei die Sequenz die katalytische Domäne und eine Helix I Box (64 Kombinationen möglich) codiert, gegebenenfalls gefolgt von einem oder mehreren Restriktions-Erkennungsstellen B und einem optionalen Promotor (Fig. 13A). Die cDNA, die die Target-RNA codiert und eine Restriktions- Erkennungssequenz für EcoRI enthält (Fig. 13B) und irgendeine der Restriktions- Erkennungssequenzen, die im Vektor von Fig. 13A vorhanden sind, ist für die Konvertierung in eine DNA geeignet, die ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym codiert, das gegen ein in der EcoRI-Restriktions-Erkennungssequenz enthaltenes WC-Motiv gerichtet ist. Zu diesem Zweck wird die cDNA mit EcoRI und einem geeigneten Restriktionsenzym A verdaut. Der Vektor wird mit ApoI und dem geeigneten Restriktionsenzym A verdaut, und beide Fragmente werden ligiert (Fig. 13 C), was zu der rekombinanten DNA (Fig. 13D) führt, die das in Fig. 13E gezeigte asymmetrische Hammerhead-Ribozym codiert. Auch dieses Verfahren erfordert keinen PCR-Schritt.

Beispiel 6: Herstellung von vielfachen asymmetrischen Hammerhead-Ribozymen.

Wie oben erwähnt, sind asymmetrische Hammerhead-Ribozyme durch die Kürze der Helix I-bildenden Region charakterisiert. Daher ist es auch möglich, eine "Sense-Box" bei der 3'-terminalen Region der asymmetrischen Hammerhead-Ribozym-RNA zu konstruieren, um die Bildung eines intramolekularen Hammerhead-Komplexes zu gestatten. In der αY-Rz195- RNA gibt es eine Hexanukleotidsequenz, entsprechend den Nukleotiden 15.58 bis 15.63 gemäß dem konventionellen Numerierungssystem für Hammerhead-Ribozyme (Hertel et al., siehe oben) (Fig. 14A und Fig. 7A), welche komplementär zu den Nukleotiden 15.4 bis 15.9 (Fig. 14A) ist. Im Prinzip könnten diese zwei Sequenzen wechselwirken und eine in Fig. 14B angegebene sekundäre Struktur bilden. Die RNA αY-Rz195 wird durch das Plasmid pαY-Rz195 (Fig. 14C und Fig. 8F) codiert. Durch Konvertieren dieser DNA in eine DNA, die für ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym codiert, das sich intramolekular selbst spalten kann, ist es möglich, ein zweites asymmetrisches Hammerhead- Ribozym downstream der Spaltungsstelle anzufügen, um ein "Tandern"-Ribozym zu erzeugen. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pαY-Rz195 zuerst mit HindIII gespalten, gefolgt von einer Behandlung mit Nuklease 51 und Re-Ligation, wodurch seine HindIll- Restriktions-Erkennungssequenz zerstört wird. Das resultierende Plasmid pαY-Rz195-H ist in Fig. 14D angegeben. Aus diesem Plasmid wurde ein DNA-Fragment durch PCR amplifiziert, unter Verwendung der zwei DNA-Oligonukleotide DRZ (Fig. 14D) und XHOW (Fig. 14D und 7B) unter den gleichen experimentellen Bedingungen wie in Beispiel 1. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit EcoRI und XhoI gespalten und in die gleichen Stellen von Plasmid pαY-Rz195-H re-kloniert. Das resultierende rekombinante PIasmid pαY-Rz63 ist in Fig. 14E angegeben. Das DNA-Oligonukleotid DRZ führte neuerlich eine HindllI-Restriktions-Erkennungssequenz (Fig. 14D und E) ein. Das resultierende RNA-Transkript αY-Rz63 kann einen intramolekularen Hammerhead-Komplex (Fig. 14F) bilden, der selbst ein asymmetrisches Hammerhead-Ribozym ist.
Das Plasmid pαY-Rz63 weist zwei Restriktions-Erkennungssequenzen auf EcoRI und HindIII, welche das Einfügen einer "downstream"-Ribozymsequenz gestatten. Dies könnte zum Beispiel das EcoRI-HindIII-Fragment von Plasmid pαY-Rz195 (Fig. 14C) sein. Das resultierende RNA-Transkript würde zwei asymmetrische Hammerhead-Ribozymmoleküle enthalten, die die in Fig. 14A gezeigte Target-RNA spalten könnten. Diese RNAs sind physikalisch während der Transkription verbunden, aber können sich selbst aufgrund der Bildung der intramolekularen Hammerhead-Konformation freisetzen.
Die zweite RNA kann jedoch überhaupt nicht verwandt sein. Zum Beispiel wurde das EcoRI-HindIII-Fragment von Plasmid pBS-Rz12/3 (Fig. 4, die EcoRI-Stelle ist dort nicht im Detail dargestellt, aber sie ist direkt der SacI-Stelle benachbart) in Plasmid pαY-Rz63 kloniert. Das resultierende RNA-Transkript (Fig. 14G) besteht aus zwei Domänen, wobei die 5'-angeordnete Sequenz αY-Rz63 entspricht und, über eine AAGCW-Sequenz verbunden, die HindIII-Restriktions-Erkennungssequenz darstellt, und wobei die 3'- angeordnete Sequenz 2as-Rz123 (Fig. 5) entspricht. Da die αY-Rz63-Domäne einen intramolekularen Komplex eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms bilden kann, werden zwei in Fig. 15H gezeigte RNAs freigesetzt.
Im Prinzip kann eine unbegrenzte Anzahl asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme zu Vielfach-Ribozymsequenzen zusammengefügt werden, die sich nach Transkription selbst ausschneiden. Dies ist insbesondere wichtig, wenn auf eine Target-RNA, zum Beispiel eine virale RNA, durch ein Ribozym gleichzeitig an verschieden Stellen gezielt werden soll. Dies kann einfach durch Bereitstellen eines einzigen RNA-Transkripts erzielt werden, das sich selbst in die individuellen asymmetrischen Hammerhead-Ribozyme ausschneidet. Es wird betont, daß es nicht erforderlich ist, eine Nukleotidsequenz im die Helix III-bildenden Teil zu finden, die eine bestimmte Sense-Polarität aufweist, wie im Fall für αY-Rz195. Eine solche "Sense-Box", welche eine intramolekulare Helix III- und Helix I-Region, umfassend das spaltbare Motiv, liefern kann, kann vollkommen künstlich konstruiert werden.

Beispiel 7: Bestimmung der Spaltungsgeschwindigkeiten für asymmetrische Hammerhead-Ribozyme.

Radioaktiv markierte Substrat-RNA wurde durch Transkription mit T7-RNA- Polymerase von HindIII-linearisiertem Plasmid pBS29-CX erhalten, wie durch Homann et al., Nucleic Acids Res., 21 (1993), 2809-2814, beschrieben, oder von NotI-linearisiertem Plasmid pRC-SR6, beschrieben von Homann et al., J. Mol. Biol., 223 (1993), 7-15, welches die für eine Transkription geeignete relevante Sequenz von pAR6 enthält.
Zur Herstellung von Ribozym-RNA, wurden die Plasmide pBS29-Rz12 und pBS- Rz12/88 mit SacI linearisiert, gefolgt vom Trimmen mit T4-DNA-Polymerase, alle anderen Ribozym-codierenden Plasmide mit EcoRI. Alle Ribozyme wurden mit T3-RNA-Polymerase synthetisiert, wie von Homann et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 2809-2814 beschrieben.
Es wurde herausgefunden, daß die Assozüerungsgeschwindigkeitskonstanten aller Ribozym-RNAs, außer Transkript 2as-Rz12/88, an ihr Target im gleichen Bereich lagen wie die von 2as-Rz12, die früher durch Homann et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 2809-2814, mit 1,5 · 10&sup5; M&supmin;¹s&supmin;¹ bestimmt wurde.
Alle Ribozym-Assays wurden unter Bedingungen für einen einzigen Umsatz durchgeführt. Ribozym-RNAs wurden in einer Endkonzentration von etwa 200 nM eingesetzt und mit einer radioaktiv markierten Substrat-RNA gemischt (Endkonzentration etwa 2 nM), in einem Reaktionsvolumen von 5 ul, enthaltend 20 mM MgCl&sub2; und 50 mM Tris/HCl pH 8,0. Unter diesen Reaktionsbedingungen wird die Substrat-RNA schnell mit Ribozym-RNA assoziiert, bei ähnlichen Geschwindigkeiten für alle Konstrukte. Zum Beispiel war, bei kass 1,5 · 10 M&supmin;¹s&supmin;¹ und 200 nM der die Geschwindigkeit limitierenden RNA-Konzentration, die Halbwertszeit für die Assoziierung in der Größenordnung einer halben Minute. Die Reaktion wurde durch Zufügen von EDTA auf eine Endkonzentration von 25 mM, gefolgt von einer Zugabe von 1 ug tRNA und Ethanol-Fällung, gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 5% Polyacrylamidgel, das 8M Harnstoff enthielt, wie durch Tsagris et al., EMBO J., (1987) 8, 2173-2183 beschrieben, getrennt. Zur Trennung auf einem nativen Gel wurde der Harnstoffweggelassen und Proben wurden aufgebracht, ohne sie in Formamid zu lösen oder ohne vorhergehendes Kochen. Nach Trocknen der Gele wurden die RNAs durch Autoradiographie visualisiert.
Fig. 18 zeigt die Ergebnisse des Spaltungs-Assays, der mit dem Set 5'-gekürzter, von 2as-Rz12 abgeleiteter RNAs durchgeführt wurde. Wenn die Helix I-bildende Region der katalytischen RNA drei Nukleotide lang oder länger war, konnte eine einheitliche Spaltungseffizienz bei jeder Reaktionszeit detektiert werden. Zum Beispiel ist die RNA 2as- Rz12/3, die eine Helix I mit nur drei Nukleotiden (vgl. Fig. 5) bilden kann, gleich aktiv wie 2as-Rz12, die eine Helix I mit 128 Basenpaaren bildet (vergl. Fig. 18A, B, Bahnen 5 und 9). Auch alle anderen RNAs mit Helices I mit 5-13 Nukleotiden in der Länge wiesen die gleiche Spaltungseffizienz auf (für Geschwindigkeitskonstanten siehe Tabelle II; vgl. auch Fig. 18A, B, Bahnen 6-8). Das Ribozym 2as-Rz12/2, das eine Helix I-bildende Region mit zwei Basen (Fig. 5) aufweist, lieferte einige Spaltungsprodukte, die nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten detektierbar wurden (Fig. 18B, Bahn 4), die Spaltungsgeschwindigkeit war jedoch 15-fach vermindert (Tabelle II). Spuren gespaltener Substrat-RNA konnten sogar in den ursprünglichen Autoradiographen für Ribozym 2as-Rz12/1 (Fig. 5) und nach längeren Reaktionszeiten detektiert werden. Das Ribozym 2as-Rz12/0 (Fig. 5), dem eine passende Helix I-bildende Region völlig fehlt, erzeugte keine spezifischen Spaltungsprodukte.
Wenn das Ribozym 2as-Rz12/88 (welches flankierende Regionen von 8 Nukleotiden auf jeder Seite aufweist, Fig. 5) unter den gleichen Reaktionsbedingungen getestet wurde, wie die 5'-terminal gekürzten, von 2as-Rz abgeleiteten RNAs, erzeugte es keine spezifische Spaltung (Fig. 18A, B, Bahn 10). Um sicherzustellen, daß die Reaktionstemperatur unter der Schmelztemperatur für Duplex-RNA war, wurde die Reaktion bei 20ºC wiederholt, aber es wurde wiederum keine Spaltung beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wenn jedoch die Mischung der Substrat-RNA und der Ribozym-RNA 2as-Rz12/88 für 5 Minuten bei 60ºC erwärmt wurde, gefolgt von einem raschen Kühlen in Eis und anschließender Inkubation bei 37ºC für 60 Minuten, wurde klar, daß dieses Ribozym das Substrat ebenso wie die anderen 2as-Rz12- Derivate spalten kann (Fig. 18B, Bahn 11). Dies zeigt, daß das Ribozym 2as-Rz12/88 (mit einem "8 plus 8-Design") ohne vorhergehende Wärmebehandlung nicht ordentlich mit seiner Target-RNA 2as assoziieren kann.
Wenn die Reaktionsprodukte einer Ribozymreaktion auf einem nativen Polyacrylamidgel getrennt wurden (Fig. 19), wurde beobachtet, daß asymmetrische katalytische RNAs das 3'-terminale Spaltungsprodukt freisetzten, während die parentale katalytische Antisense-RNA 2as-Rz12 an die gespaltene Substrat-RNA gebunden blieb. Weiters wurde bestätigt, daß die Substrat-RNA mit der 2as-Rz12/88-RNA keinen Komplex bilden konnte.

Beispiel 8: Inhibierung einer HIV-1-Replikation durch asymmetrische Hammerhead- Ribozyme

Für Messungen der Wirkungen asymmetrischer Hammerhead-Ribozyme auf die HIV- 1-Replikation wurden in vitro synthetisierte RNAs in Mengen von 160 ng pro Vertiefung bzw. infektiöse provirale HIV-1-DNA pNL4-3 40 ng mittels Co-Transfektion in SW480- Zellen eingeführt, die halb-konfluent in Platten mit 48 Vertiefungen gezüchtet wurden, durch Calcium-Copräzipitation, wie im wesentlichen durch Rittner et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 1381-1387 beschrieben. Einen Tag nach der Transfektion wurden 1 · 10&sup5; MT-4- Zellen zugefügt und das Endvolumen wurde auf 1 ml mit RMPI 1640-Medium eingestellt. Eine Virus-Replikation wurde 5 Tage nach der Transfektion mit Verdünnungen zellfreier Kulturüberstände durch einen kommerziellen HIV-1-Antigen-ELISA (Organon, Holland) gemessen. Die Daten des Inhibierungs-Assays sind in Fig. 20 zusammengefaßt.

Claims

1. Nukleotidsequenz, umfassend die folgende allgemeine Formel

3' - [N]&sub1;&sub1; - [N]Lo - [N]&sub1;&sub0; - [N]&sub9;&submin;&sub3; - [N] - 5'

worin N ein beliebiges Nukleotid bedeutet und gleich oder unterschiedlich sein kann, [N] kein Nukleotid, Nukleotid 2.1 oder Nukleotide 2.x bis 2.1, befähigt zur Bildung einer Helix I in einem Hammerhead-Ribozym/Target-Komplex bedeutet, [N]&sub9;&submin;&sub3; Nukleotide 3 bis 9 eines Hammerhead-Ribozyms bedeutet, [N]&sub1;&sub0; Nukleotide 10.1 bis 10.n bedeutet und [N]&sub1;&sub1; kein Nukleotid, Nukleotid 11.m bedeutet oder mindestens ein Teil der Nukleotide 11.m bis 11.1 umfaßt, x eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis 8 ist, m eine ganze Zahl ist, n eine ganze Zahl ist und die Länge von Helix II bedeutet, worin, wenn [N]&sub1;&sub1; mindestens ein Teil der Nukleotide 11.m bis 11.1 umfaßt, n und m gleich oder unterschiedlich sein können, Lo eine ganze Zahl ist und [N]Lo irgendeine Sequenz bedeutet, die befähigt ist, einen Loop 2 eines Hammerhead- Ribozyms zu bilden, wobei die Nukleotid-Sequenz keine Helix III-bildende Region eines Hammerhead-Ribozym/Target-Komplexes enthält.

2. Nukleotidsequenz nach Anspruch 1, worin die Region 3'-[N]&sub1;&sub1;-[N]Lo-[N]&sub1;&sub0;-5' mindestens eine Erkennungssequenz für ein oder mehrere Restriktionsenzyme enthält und/oder eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, die mit der Sequenz, welche 3' von [N]&sub1;&sub1; folgt, überlappt.

3. Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 oder 2, worin n im Bereich von 3 bis 50 liegt.

4. Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin · 3 ist und/oder n 4 ist und/oder m im Bereich von 2 bis 4 liegt.

5. Nukleinsäure, umfassend die Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und eine zweite Nukleotidsequenz, welche mindestens die Nukleotide 12 bis 14 eines Hammerhead-Ribozyms enthält und mindestens ein Teil der Helix III-bildenden Region eines Hammerhead-Ribozyms/Target-Komplexes, beginnend mit den Nukleotiden 15.1 bis 15.y, worin y eine ganze Zahl ist und die Anzahl der Nukleotide im Helix I-bildenden Teil, entsprechend den Nukleotiden 2.1 bis 2.x, kleiner ist als die Anzahl der Nukleotide der Helix IIIbildenden Region, entsprechend den Nukleotiden 15.1 bis 15.y.

6. Nukleinsäure nach Anspruch 5, worin die Nukleotidsequenz und die zweite Nukleotidsequenz verknüpft sind über eine der Erkennungssequenzen, die in der Sequenz 3'-[N]&sub1;&sub1;-[N]Lo-[N]&sub1;&sub0;-5' enthalten ist, oder über eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, die mit einer Sequenz, welche 3' von [N]&sub1;&sub1; folgt, überlappt.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 5 oder 6, welche weiterhin eine dritte Nukleotidsequenz umfaßt, welche benachbart zur Helix III-bildenden Region der zweiten Nukleotidsequenz ist, mindestens 3 Nukleotide, die befähigt sind, eine intramolekulare Helix III eines Hammerhead-Ribozyms auszubilden, welche direkt an Nukleotid 17 eines Hammerhead-Ribozyms anschließt, und eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu [N] ist, enthält.

8. Asymmetrisches Hammerhead-Ribozym, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7 oder die Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

9. Asymmetrisches Hammerhead-Ribozym nach Anspruch 8, worin x im Bereich von 2 bis 8 liegt.

10. Asymmetrisches Hammerhead-Ribozym, worin die Helix I-bildende Region kleiner ist als die Helix III-bildende Region.

11. Asymmetrisches Hammerhead-Ribozym nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin mindestens ein Nukleotid chemisch modifiziert ist.

12. Asymmetrisches Hammerhead-Ribozym nach einem der Ansprüche 8 bis 11, welches chemisch synthetisiert ist.

13. RNA-Konstrukt, umfassend mindestens zwei asymmetrische Hammerhead- Ribozyme nach einem der Ansprüche 8 bis 12.

14. RNA-Konstrukt nach Anspruch 13, worin die Helix I- und Helix III-bildenden Regionen des asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms gleich oder unterschiedlich sein können.

15. DNA-Sequenz, welche nach einer Transkription einem asymmetrischen Hammerhead-Ribozym nach einem der Ansprüche 8 bis 12 oder dem RNA- Konstrukt nach Anspruch 13 oder 14 entspricht.

16. Vektor, umfassend die Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7, das asymmetrische Hammerhead-Ribozym nach einem der Ansprüche 8 bis 12, das RNA- Konstrukt nach Anspruch 13 oder 14 oder die DNA-Sequenz nach Anspruch 15.

17. Wirtsorganismus, enthaltend die Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7, das asymmetrische Hammerhead-Ribozym nach einem der Ansprüche 8 bis 12, das RNA-Konstrukt nach Anspruch 13 oder 14, die DNA-Sequenz nach Anspruch 15 oder den Vektor nach Anspruch 16.

18. Verfahren zur Herstellung der Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7, des asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms nach einem der Ansprüche 8 bis 12, des RNA-Konstruktes nach Anspruch 13 oder 14, der DNA-Sequenz nach Anspruch 15 oder des Vektors nach Anspruch 16, welches die Züchtung des Wirtsorganismus nach Anspruch 17 unter geeigneten Bedingungen und die Isolierung des gewünschten Produktes von der Kultur umfaßt.

19. Verfahren zur Herstellung eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms nach einem der Ansprüche 8 bis 12, des RNA-Konstruktes nach Anspruch 13 oder 14 oder der DNA, welche das asymmetrische Hammerhead-Ribozym oder das RNA-Konstrukt kodiert, umfassend

(i) das Selektieren eines spaltbaren Motives in der Target-RNA,

(ii) das Selektieren des geeigneten Vektors und/oder der DNA-Kassette, welche die Helix I Box liefert, die zu dem selektierten spaltbaren Motiv und einem Teil der katalytischen Domäne eines Hammerhead-Ribozyms paßt, wie durch die allgemeine Formel 3' - [N]&sub1;&sub1; - [N]Lo - [N]&sub1;&sub0; - [N]&sub9;&submin;&sub3; - [N] - 5' definiert, und

(iii) das Anfügen der zweiten Sequenz, die dem Helix III-bildenden Teil und den restlichen Teilen der katalytischen Domäne eines Hammerhead- Ribozyms entspricht.

20. Verfahren zur Herstellung eines asymmetrischen Hammerhead-Ribozyms nach einem der Ansprüche 8 bis 12, des RNA-Konstruktes nach Anspruch 13 oder 14 oder der DNA, welche das asymmetrische Hammerhead-Ribozym oder das RNA-Konstrukt kodiert, umfassend das Einführen der katalytischen Domäne und der Helix I-bildenden Sequenz in DNA durch einen einzigen PCR-Schritt, in dem ein DNA-Oligonukleotid die Sequenz von mindestens einem Teil der katalytischen Domäne und der Helix I-bildenden Region liefert, oder den Schritt der chemischen Synthese von mindestens einem Teil des asymmetrischen Ribozymes, oder das Erzeugen von multiplen Ribozymen durch Hinzufügen einer kurzen sense-Sequenz, welche eine intramolekulare Helix III- und Helix I-bildende Region ausbildet, einschließlich eines spaltbaren Motivs.

21. Zusammensetzung, enthaltend das asymmetrische Hammerhead-Ribozym nach einem der Ansprüche 8 bis 12, das RNA-Konstrukt nach Anspruch 13 oder 14, die DNA-Sequenz nach Anspruch 15, welche das asymmetrische Hammerhead-Ribozym oder das RNA-Konstrukt kodiert, oder den Vektor nach Anspruch 16, der das asymmetrische Hammerhead-Ribozym, das RNA- Konstrukt oder die DNA-Sequenz enthält, gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutisch, veterinärmedizinisch oder landwirtschaftlich verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.