DE69332312T2

DE69332312T2 - Cloniertes protein der äusseren membran von leptospira

Info

Publication number: DE69332312T2
Application number: DE69332312T
Authority: DE
Inventors: David R. Blanco; Cheryl I. Champion; David A. Haake; Michael A. Lovett; James N. Miller
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1993-03-31
Publication date: 2003-07-31
Anticipated expiration: 2013-04-01
Also published as: EP0693936A1; AU4100393A; EP0693936A4; ATE224202T1; DE69332312D1; WO1994022475A1; JPH08508980A; CA2158540A1; EP0693936B1; ES2181687T3; AU686561B2

Description

1. Fachgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein antigenes Präparat und spezifisch ein Protein der äußeren Membran von Leptospira (OmpL1), das zum Auslösen einer schützenden Immunantwort bei Tieren eingesetzt wird. Ein solches Protein kann immunologisch als Impfstoff gegen die Leptospirose eingesetzt werden, die durch diesen Organismus verursacht wird. Andererseits kann eine Leptospirose diagnostiziert werden, indem das Vorliegen des Proteins, eines Antikörpers gegen das Protein oder eines Polynucleotids, das das Protein codiert, nachgewiesen wird.

2. Beschreibung des Stands der Technik

Die Leptospirose ist eine weit verbreitete zoonotische Krankheit, die durch pathogene Stämme von Leptospira verursacht wird, welche die meisten Säugerarten infizieren können. Zurzeit gibt es in der Gattung Leptospira sechs pathogene Arten und drei nicht-pathogene Arten. Eine Infektion kommt entweder durch einen direkten Kontakt mit einem infizierten Tier oder durch einen indirekten Kontakt mit verunreinigtem Boden oder Wasser zustande. Beim Nutzvieh kommt es durch die Krankheit aufgrund von Abort, Totgeburt, Infertilität, verringerter Milchproduktion und Tod zu wirtschaftlichen Verlusten.
Die Bemühungen im Kampf gegen die Leptospirose wurden bisher durch die Fähigkeiten der virulenten Leptospiren behindert, sowohl langfristig in der Umgebung als auch als persistierende Infektion überleben zu können als auch von wild lebenden Tieren und Nutztieren freigesetzt werden zu können. Die zurzeit verfügbaren Impfstoffe gegen Leptospira erzeugen nur eine kurzfristige Immunität und bieten keinen Kreuz-Schutz gegen viele der 170 Serovaren von pathogenen Leptospira (Thiermann et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 184 (1984), 722). Diese Impfstoffe bestehen aus inaktivierten ganzen Organismen oder aus Präparaten der äußeren Hülle, die eine Seroreaktivität erzeugen, wie durch eine mikroskopische Agglutination von intakten Organismen gezeigt wurde. Die Natur der schützenden Immunogene in die sen Impfstoffpräparaten konnte noch nicht endgültig geklärt werden, wobei jedoch verschiedene Hinweise nahelegen, dass eine Lipopolysaccharid-artige Substanz (LLS) möglicherweise ein gewisses Ausmaß an Schutz verleiht.
Die Pathogenese der Leptospirose ist sehr ähnlich wie die von anderen, durch Spirochäten verursachten Krankheiten, einschließlich Syphilis (ausgelöst durch Treponema pallidum) und Lyme-Borreliose (ausgelöst durch Borrelia burgdorferi). Sowohl die Syphilis als auch die Lyme-Borreliose sind in der frühen Phase des Krankheitsverlaufs durch eine starke Ausbreitung gekennzeichnet, wobei es auch zu einem Befall des zentralen Nervensystems kommt. Die Leptospira haben diese Fähigkeit mit anderen pathogenen Spirochäten gemeinsam, weshalb bei Leptospirose häufig eine Meningitis auftritt. Eine andere Eigenschaft von Spirochäten-Infektionen ist die Fähigkeit, im Wirt chronisch zu persistieren, wie sich in Fällen von tertiärer Syphilis und chronischer Lyme-Arthritis zeigt.
Die Untersuchungen zum Identifizieren der Proteine der äußeren Membran von Leptospira (OMPs) waren aufgrund der folgenden Probleme bisher noch nicht erfolgreich: 1) Die Techniken, die zum Identifizieren der auf der Oberfläche exponierten Proteine eingesetzt wurden, führten möglicherweise zu einer Beschädigung der brüchigen äußeren Membran von Leptospira, so dass die unter der Oberfläche liegenden Strukturen exponiert wurden; 2) vermeintliche, an der Oberfläche exponierte Proteine, die identifiziert wurden, umfassten eine 35-36-kD-Doppelstruktur, die den Leptospira-Endoflagellen entsprach (Kelson et al., J. Med. Microbiol. 26 (1988), 47), wobei es sich um Strukturen in Spirochäten handelt, die unter der Oberfläche liegen; und 3) die Verwendung von SDS, das die Proteine nicht-selektiv solubilisiert, und zwar unabhängig von ihrer ursprünglichen Lage in der Zelle.
Nunes-Edwards et al. (Infect. Immun. 48 (1985), 492) führten bei Untersuchungen zum Identifizieren von Leptospira-OMPs Radioimmunfällungs- und Zellfraktionierungs-Schemata ein, die auf der Verwendung von SDS beruhten. Die in ihrem Radioimmunfällungs-Verfahren verwendeten Leptospira wurden einer Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation (20 000 · g) unterworfen, anschließend wurden Antikörper zugegeben. Durch solche hohen Zentrifugalkräfte wird die äußere Membran von Leptospira mechanisch aufgerissen. Niikura et al. (Zbl. Bakt. Hyg. A. 266 (1987), 453) führten eine Immunfällung von SDS-solubilisierten Extrakten von virulenten und avirulenten Stämmen von L. interrogans Serovar copenhageni durch, die durch eine Lactoperoxidase katalysierte Oberflächen-Radioiodierung markiert worden waren. Da in beiden Studien eine 35-36-kD-Doppelstruktur ausgefällt wurde, die mit den Leptospira-Endoflagellen übereinstimmte, stellte sich die Frage, ob nicht auch die anderen identifizierten Proteine möglicherweise eher unter der Oberfläche als auf der Oberfläche liegen.
Jost et al. (J. Med. Microbiol. 27, 143) charakterisierten einen monoclonalen Antikörper mit einer Spezifität für ein 35 kD großes, Proteinase-K-sensitives Antigen, das in einem Präparat der äußeren Hülle von Leptospira vorlag. Um jedoch die Bindung des monoclonalen Antikörpers durch Immunelektronenmikroskopie zeigen zu können, musste die äußere Membran von Leptospira aufgeschlossen werden. Doherty et al. (J. Med. Microbiol. 28, 143) clonierten zwei Leptospira-Proteine, die in einem durch SDS erzeugten Präparat der äußeren Membran von L. interrogans vorlagen, wobei sie jedoch keine erhärtenden Beweise dafür hatten, dass diese Proteine Bestandteile der äußeren Membran sind oder dass sie auf der Oberfläche exponiert sind.
Die Misserfolge bei den Forschungsarbeiten zum Identifizieren der OMPs von Leptospira und T. pallidum machten deutlich, wie wichtig es ist, die Brüchigkeit der äußeren Membran der Spirochäten und außerdem die fehlende Selektivität ionischer Detergentien wie Natriumdodecylsulfat (SDS) für die äußere Membran zu berücksichtigen (Cunningham et al., J. Bacteriol. 170 (1988), 5789; Penn et al., J. Gen. Microbiol. 131 (1985), 2349; Stamm et al., Infect. Immun. 55 (1987), 2255). Proteine der äußeren Membran sind von großer Wichtigkeit, da sie in der Pathogenese von Bakterien eine Schlüsselrolle spielen. Die Identifizierung von Proteinen der äußeren Membran, die an der Pathogenese von Leptospira beteiligt sind, ist nicht nur für das Verständnis der Proteine der äußeren Membran von Leptospira und ihrer Beteiligung an der Pathogenese entscheidend, sondern auch für das Verständnis von Proteinen der äußeren Membran anderer Spirochäten und ihrer Rolle in der Pathogenese.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Identifizierung von OmpL1 als ein Hauptprotein der äußeren Membran von Leptospira, das mit pathogenen Stämmen von Leptospira assoziiert ist. Aufgrund der Brüchigkeit der äußeren Membran der Spirochäten und der Tatsache, dass die Proteine der äußeren Membran in kleinen Mengen vorliegen, gab es bis zur vorliegenden Erfindung keine eindeutligen Beschreibungen Membran-überspannender Proteine der äußeren Membran der Spirochäten. Die Erfindung beschreibt ein 31 kD großes Protein der äußeren Membran aus Leptospira und das Gen, das das Protein codiert. Dieses Gen liegt in allen getesteten pathogenen Leptospira-Arten vor, und es fehlt in allen getesteten nichtpathogenen Leptospira-Arten. Die hergeleitete Aminosäuresequenz besitzt eine typische Spaltstefle der Leader-Peptidase-I, was auf ein Ausschleusen außerhalb der inneren Membran hinweist. Das 31-kD-Protein wurde mit OmpL1 bezeichnet, für Protein der äußeren Membran von Leptospira. Dieses immunogene Polypeptid eignet sich zum Auslösen einer Immunantwort gegen pathogene Leptospira und außerdem zum Bereitstellen eines Ziels für die Diagnose von Leptospirose.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die DNA-Sequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz von OmpL1.
Fig. 2 zeigt einen Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen von Nmp1 (einem Porin-Protein der äußeren Membran von Neisseria meningitidis) und von OmpL1.
Fig. 3A zeigt einen Southern-Blot unter Verwendung von ompL1 als Sonde zum Nachweis des Gens in pathogenen und nicht-pathogenen Leptospira (mittlere Stringenz).
Fig. 5B zeigt einen Southern-Blot unter Verwendung von ompL1 als Sonde zum Nachweis des Gens in pathogenen und nicht-pathogenen Leptospira (hohe Stringenz).

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes immunogenes Polypeptid aus einem Protein der äußeren Membran einer pathogenen Leptospira-Art bereit. Außerdem ist eine Polynucleotidsequenz enthalten, die das Polypeptid codiert. Das Protein der äußeren Membran ist ein ursprünglich aus Leptospira alstoni isoliertes 31 kD großes Protein, das mit OmpL1 bezeichnet wurde, wobei es sich um ein Pathogenassoziiertes ausgeschleustes Protein von Leptospira handelt. Dieses immunogene Polypeptid kann in einem Arzneimittel eingesetzt werden, um eine Immunantwort gegen pathogene Leptospira auszulösen.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zum Herstellen des Polypeptidteils eines Proteins der äußeren Membran von Leptospira unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken. Das Gen für das OmpL1-Protein der äußeren Membran von L. alstoni wurde in einen Plasmidvektor cloniert, mit dem sodann E. coli transformiert wurde. Wenn das OmpL1-Gen in E. coli exprimiert wurde, wies das produzierte Polypeptid ein Molekulargewicht von etwa 31 kD auf, wie durch SDS-Polyacrylamid- Gel-Elektrophorese bestimmt wurde. Eine Reaktivität gegenüber dem 31-kD-Protein wurde mit Antiseren gegen pathogene Leptospira-Stämme gezeigt, einschließlich L. interrogans Serovaren icterohaemorrhagiae, pomona und bratislava, L. alstoni Serovaren grippotyphosa und fortbragg, L. santarosai Serovaren bakeri und canalzonae, und L. weilii Serovar celledoni. Hieraus geht hervor, dass OmpL1 nicht nur exprimiert wird, sondern dass es auch unter den pathogenen Leptospira unabhängig von der Art konserviert ist, und deshalb ist dieses Polypeptid ein ausgezeichneter Kandidat für einen Impfstoff und außerdem ein Marker-Antigen für die Diagnose von Leptospirose.
Die Extraktion von Proteinen aus ganzen Zellen von L. alstoni unter Verwendung des nicht-ionischen Detergens Triton X-114 (TX-114) führte zur Solubilisierung verschiedener Proteine, einschließlich eines Proteins mit 31 kD in der Detergensphase (OmpL1). Durch Oberflächen-Immunfällung unter Verwendung eines Antiserums, das gegen ganze L. alstoni hervorgerufen worden war, wurde eine Fraktion erzeugt, die danach einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen wurde, Anschließend wurde die der Elektrophorese unterworfene Fraktion auf eine Sequenzierungsmembran überführt und eine N-terminale Sequenz von 14 Aminosäuren des 31-kD-Proteins bestimmt. Aufgrund der N-terminalen Aminosäuresequenz wurden zwei degenerierte Oligonucleotid-Sonden synthetisiert. Eine genomische DNA-Bank von L. alstoni wurde mit den Oligonucleotiden als Sonden getestet und eine 2,5-kb-Insertion identifiziert, die die codierende Sequenz für das 31-kD-OmpL1 enthielt.
Die Sequenzanalyse zeigte, dass das OmpL1-Strukturgen aus 960 Basen besteht, die ein Protein von 320 Aminosäuren codieren. Wie für Proteine zu erwarten ist, die außerhalb der inneren Membran ausgeschleust werden, beginnt die hergeleitete Aminosäuresequenz mit einem aus 24 Resten bestehenden Signalpeptid. Die OmpL1-Sequenz enthält zehn Bereiche mit einer amphipathischen beta-Faltblatt- Struktur, die mit Transmembransegmenten eines Proteins der äußeren Membran übereinstimmt. Southern-Hybridisierungsstudien zeigten, dass ein deutlicher Zusammenhang besteht zwischen der Pathogenität von Leptospira und dem Vorliegen des OmpL1-Gens. Eine Einzelkopie des OmpU-Gens lag in allen getesteten pathogenen Leptospira-Stämmen vor, während es in allen getesteten nicht-pathogenen Leptospira-Stämmen fehlte.
Die bakteriellen Gene für das Protein der äußeren Membran, OmpL1, können aus einem beliebigen Stamm eines pathogenen Leptospira hergeleitet werden. Vorzugsweise stammt das Protein aus Leptospira alstoni Serovar grippotyphosa. Die Erfindung stellt Polynucleotide bereit, die das Leptospira-Protein OmpL1 codieren. Diese Polynucleotide umfassen DNA- und RNA-Sequenzen, die das Protein codieren. Es ist so zu verstehen, dass hier auch alle Polynucleotide enthalten sind, die das gesamte OmpL1 oder einen Teil davon codieren, so lange sie eine Funktion von OmpL1 zeigen, wie die Fähigkeit, Antikörper zu induzieren oder zu binden. Solche Polynucleotide umfassen sowohl natürlich vorkommende als auch gezielt manipulierte Polynucleotide, z. B. mutagenisierte Polynucleotide.
DNA-Sequenzen der Erfindung können durch verschiedene Verfahren erhalten werden. Z. B. kann die DNA anhand von Hybridisierungsverfahren isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: 1) Hybridisierung von genomischen Banken mit Sonden, wodurch gemeinsame Nucleotidsequenzen nachgewiesen werden können; und 2) Durchmusterung von Ex pressionsbanken anhand von Antikörpern, wodurch gemeinsame Struktureigenschaften nachgewiesen werden können.
Hybridisierungsverfahren eignen sich zum Durchmustern von rekombinanten Clonen, wobei markierte gemischte synthetische Oligonucleotid-Sonden eingesetzt werden, von denen jede in der Lage ist, das Komplement einer spezifischen DNA- Sequenz in der Hybridisierungsprobe zu vervollständigen, die ein heterogenes Gemisch denaturierter doppelsträngiger DNA enthält. Für eine solche Durchmusterung wird die Hybridisierung vorzugsweise entweder an einzelsträngiger DNA oder an denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt. Unter Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen, wodurch eine unspezifische Bindung vermieden wird, kann z. B. ein spezifischer DNA-Clon autoradiographisch sichtbar gemacht werden, und zwar durch die Hybridisierung der Ziel-DNA mit dieser einzelnen Sonde im Gemisch, die ihr vollständiges Komplement darstellt (Wallace et al., Nucleic Acids Research 9 (1981), 879).
Andererseits kann eine Expressionsbank unter Verwendung von Antikörpern gegen OmpL1 indirekt nach OmpL1-Peptiden durchgemustert werden, die mindestens ein Epitop aufweisen. Solche Antikörper können entweder polyclonale oder monocionale Antikörper sein und verwendet werden, um das Expressionsprodukt nachzuweisen, das das Vorliegen der OmpL1-DNA zeigt. Im allgemeinen wird eine Lambda-gt11-Bank konstruiert und immunologisch durchgemustert, wie im Verfahren von Huynh et al. beschrieben (in: DNA Cloning: A Practical Approach, D. M. Glover, Hrsg., 1 (1985), 49).
Die Entwicklung von spezifischen DNA-Sequenzen, die OmpL1 codieren, kann auch folgendermaßen erfolgen: (1) Isolierung einer doppelsträngigen DNA- Sequenz aus der genomischen DNA; und (2) chemische Herstellung einer DNA- Sequenz, welche die erforderlichen Codons für das Polypeptid von Interesse bereitstellt.
DNA-Sequenzen, die OmpL1 codieren, können in vitro durch Übertragung der DNA in eine geeignete Wirtszelle exprimiert werden. "Rekombinante Wirtszellen" oder "Wirtszellen" sind Zellen, in denen ein Vektor vermehrt und seine DNA exprimiert werden kann. Der Begriff umfasst auch jegliche Nachkommen der betreffenden Wirtszelle. Es ist so zu verstehen, dass nicht alle Nachkommen mit der Elternzelle identisch sind, da auch Mutationen vorliegen können, die bei der Replikation auftreten. Solche Nachkommen sind jedoch auch gemeint, wenn die vorstehenden Begriffe verwendet werden.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Wirtszelle" soll nicht nur Prokaryonten umfassen, sondern auch Eukaryonten wie Hefen, filamentöse Pilze und außerdem pflanzliche und tierische Zellen. Der Begriff "Prokaryont" soll alle Bak terien umfassen, die mit dem Gen zur Expression des Proteins der äußeren Membran von Leptospira, OmpL1, transformiert werden können. Prokaryontische Wirte können Gram-negative und auch Gram-positive Bakterien enthalten, wie E. coli, S. typhimurium und Bacillus subtilis.
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das das OmpL1-Protein codiert, kann zum Transformieren eines Wirts verwendet werden, wobei eine beliebige Technik eingesetzt werden kann, die dem Fachmann üblicherweise bekannt ist. Für die Zwecke einer prokaryontischen Transformation ist die Verwendung eines Plasmids besonders bevorzugt, das die OmpL1 codierende Sequenz enthält. Wenn es sich um einen prokaryontischen Wirt wie E. coli handelt, können kompetente Zellen, die in der Lage sind, DNA aufzunehmen, aus Zellen hergestellt werden, die nach der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und anschließend durch das CaCl&sub2;-Verfahren nach Methoden behandelt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Andererseits kann auch MgCl&sub2; oder RbCI verwendet werden. Die Transformation kann auch durchgeführt werden, nachdem ein Protoplast der Wirtszelle hergestellt wurde.
In der vorliegenden Erfindung können die OmpL1-Sequenzen in einen rekombinanten Expressionsvektor eingefügt werden. Der Begriff "rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Plasmid, Virus oder anderes Vehikel, das dem Fachmann bekannt ist und das durch Insertion oder Einbau der genetischen Sequenzen von OmpL1 manipuliert wurde. Solche Expressionsvektoren enthalten eine Promotorsequenz, die die effiziente Transkription der eingebauten genetischen Sequenz im Wirt fördert. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor und außerdem spezifische Gene, die eine phänotypische Selektion der transformierten Zellen möglich machen. Die transformierten prokaryontischen Wirte können anhand von Verfahren gezüchtet werden, die dem Fachmann bekannt sind und die ein optimales Zellwachstum gewährleisten. Für die Expression fremder Gene in Hefe wurden verschiedene Pendelvektoren beschrieben (Heinemann et al., Nature 340 (1989), 205; Rose et al., Gene 60 (1987), 237). Biologisch funktionale DNA-Vektoren sind dem Fachmann bekannt, die zur Expression und Replikation in einem Wirt fähig sind. Solche Vektoren werden zum Einbau der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verwendet.
Verfahren zum Herstellen von fusionierten, funktionell verbundenen Genen und zum Exprimieren dieser Gene in Bakterien sind dem Fachmann bekannt und werden z. B. im US-Patent Nr. 4 366 246 gezeigt. Die dort beschriebenen genetischen Konstrukte und Verfahren können für die Expression des Leptospira-OmpL1 in prokaryontischen Wirten genutzt werden.
Beispiele von Promotoren, die in der Erfindung eingesetzt werden können, sind: recA, trp, lac, tac und der Bakteriophage Lambda pR oder pL. Beispiele von Plasmiden, die in der Erfindung verwendet werden können, sind in Maniatis et al. aufgeführt (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982).
Antikörper, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, sind mit dem OmpL1 -Protein immunreaktiv. Bereitgestellt werden Antikörper, die im Wesentlichen aus gepoolten monodpnalen Antikörpern mit unterschiedlichen epitopischen Spezifitäten bestehen, und außerdem einzelne monodonale Antikörperpräparate. Monodonale Antikörper können aus Antigen enthaltenden Fragmenten des Proteins nach Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495; Current Protocols in Molecular Biology, Ausübel et al., Hrsg., 1989). Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff Antikörper oder Immunglobulin umfasst intakte Moleküle und außerdem Fragmente davon wie Fab und F(ab)&sub2;, die in der Lage sind, eine epitope Determinante auf OmpL1 zu binden.
Kleinere Modifikationen der primären Aminosäuresequenz von OmpL1 können zu Proteinen führen, die im Vergleich zu dem hier beschriebenen Protein OmpL1 eine im Wesentlichen gleichwertige Funktion aufweisen. Solche Modifikationen können gezielt eingeführt werden, z. B. durch ortsspezifische Mutagenese, oder sie können spontan sein. Alle Proteine, die durch diese Modifikationen hergestellt werden, sind hier enthalten, so lange die Funktion von OmpL1 noch vorliegt.
Modifikationen der primären Aminosäuresequenz von OmpL1 umfassen auch konservative Veränderungen. Der hier verwendete Begriff "konservative Veränderung" bezeichnet den Austausch eines Aminosäurerestes gegen einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele von konservativen Veränderungen umfassen die Substitution eines hydrophoben Restes wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin für einen anderen, oder die Substitution eines polaren Restes für einen anderen, wie die Substitution von Arginin für Lysin, Glutaminsäure für Asparaginsäure oder Glutamin für Asparagin und dergleichen. Der Begriff "konservative Veränderung" umfasst außerdem die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer unsubstituierten ursprünglichen Aminosäure, mit der Maßgabe, dass die gegen das substituierte Polypeptid hervorgerufenen Antikörper auch mit dem unsubstituierten Polypeptid reagieren.
Die Isolierung und die Reinigung eines mikrobiell exprimierten Proteins oder von Fragmenten davon, bereitgestellt durch die vorliegende Erfindung, können durch herkömmliche Verfahren, umfassend präparative Chromatographie und immunologische Trennungen erfolgen, die monodonale und polyclonale Antikörper einbeziehen. Die Erfindung betrifft jeden beliebigen Wirt, der gemäß den beschriebenen Verfahren modifiziert wurde oder der durch andere Verfahren modifiziert wurde, die dem Fachmann üblicherweise bekannt sind, wie z. B. durch Übertragung von genetischem Material unter Verwendung eines lysogenen Phagen, und die zu einem Pro karyonten führen, der das Leptospira-Gen für das OmpL1-Protein exprimiert. Prokaryonten, die mit dem Leptospira-Gen, das das OmpL1-Protein codiert, transformiert sind, sind besonders geeignet für die Herstellung von Polypeptiden, die zur Immunisierung eines Tieres verwendet werden können.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Arzneimittel bereit, das zum Auslösen einer Immunantwort gegen pathogene Leptospira in einem Tier eingesetzt werden kann, umfassend eine immunologisch wirksame Menge von OmpL1 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Der hier in der Beschreibung der Erfindung verwendete Begriff "immunologisch wirksame Menge" soll diejenige Menge eines Lepiospira-Antigens bezeichnen, die erforderlich ist, um in einem Tier die Produktion einer Immunantwort gegen Leptospira hervorzurufen. Das erfindungsgemäße Protein der äußeren Membran, OmpL1, ist besonders geeignet, um das Immunsystem eines Tiers so zu sensibilisieren, so dass als Ergebnis eine Immunantwort erzeugt wird, die die Wirkung einer Leptospira-Infektion abschwächt.
Das Protein der äußeren Membran, OmpL1, kann parenteral durch Injektion, schnelle Infusion, nasopharyngeale Absorption, dermale Absorption und oral verabreicht werden. Pharmazeutisch verträgliche Trägerpräparate für die parenterale Verabreichung umfassen sterile oder wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele von nichtwässrigen Lösungsmitteln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Träger für Okklusivverbände können verwendet werden, um die Permeabilität der Haut zu vergrößern und die Antigenabsorption zu steigern. Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung können im allgemeinen eine Liposomenlösung umfassen, welche die flüssige Dosierungsform enthält. Geeignete Formen zum Suspendieren der Liposomen umfassen Emulsionen, Suspensionen, Lösungen, Sirupe und Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, welche nach dem Stand der Technik gebräuchlich sind, wie gereinigtes Wasser.
Neben den inerten Verdünnungsmitteln können solche Zusammensetzungen außerdem Adjuvantien, Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspendiermittel sowie Süßstoffe, Geschmackstoffe und Duftstoffe enthalten.
Ferner können die antigenen Präparate, die das Protein OmpL1 der vorliegenden Erfindung enthalten, ein Adjuvans aufweisen. Adjuvantien sind Substanzen, die eingesetzt werden können, um eine spezifische Immunantwort unspezifisch zu steigern. Normalerweise werden das Adjuvans und das Antigen gemischt, bevor sie an das Immunsystem verabreicht werden, oder sie werden getrennt, jedoch in die gleiche Stelle des Tiers appliziert, das immunisiert wird. Adjuvantien können aufgrund ihrer Zusammensetzung locker in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Diese Gruppen umfassen Öl-Adjuvantien (z. B. komplettes und inkomplettes Freund sches Adjuvans), Mineralsalze (z. B. AlK(SO&sub4;)&sub2;, AlNNa(SO4)&sub2;, AlNH&sub4;(SO&sub4;)&sub2;, Silica, Alaun, Al(OH)&sub3;, Ca&sub3;(PO&sub4;)&sub2;, Kaolin und Kohlenstoff), Polynucleotide (z. B. Poly-IC- und Poly-AU-Säuren) und bestimmte natürliche Substanzen (z. B. Wachs D aus Mycobacterium tuberculosis, außerdem Substanzen, die in Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis und Vertretern der Gattung Brucella vorliegen).
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Auslösen einer Immunantwort gegen pathogene Leptospira in einem Tier bereitgestellt. Wenn ein Schema mit mehreren Immunisierungen verwendet wird, sind viele verschiedene Techniken für den zeitlichen Ablauf der Immunisierungen möglich. So kann das antigene Präparat der Erfindung mehr als einmal verabreicht werden, um die Stärke und die Diversität der Expression der erhaltenen Immunantwort bei dem immunisierten Tier zu steigern. Typischerweise wird bei der Gabe von mehreren Immunisierungen ein Abstand von zwei bis vier Wochen eingehalten. Individuen, bei denen eine Immunantwort gegen Leptospira wünschenswert ist, umfassen Schweine, Rinder und Menschen.
Im allgemeinen variiert die Dosierung des an ein Tier verabreichten OmpL1- Proteins abhängig von Faktoren wie Alter, Zustand, Geschlecht und Schwere der Krankheit, sofern vorhanden, sowie anderen Variablen, die durch einen Fachmann beurteilt werden können. Die antigenen Präparate der Erfindung können entweder als Einzeldosis oder in mehreren Dosierungen verabreicht werden, und sie können von etwa 10 ug bis etwa 1 000 ug des OmpL.1-Antigens von Leptospira pro Dosis variieren, stärker bevorzugt von etwa 50 ug bis etwa 700 ug des OmpL1-Antigens pro Dosis und am stärksten bevorzugt von etwa 50 ug bis etwa 300 ug des OmpL1- Antigens pro Dosis.
Wenn die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung für eine Immuntherapie eingesetzt werden, können sie nicht-markiert sein, oder sie können mit einem therapeutischen Mittel markiert sein. Diese Mittel können entweder direkt oder indirekt mit den erfindungsgemäßen monodonalen Antikörpern gekoppelt sein. Eine indirekte Kopplung erfolgt z. B. unter Verwendung einer Spacereinheit. Diese Spacereinheiten können ihrerseits entweder unlöslich oder löslich sein (Diener et al., Science 231 (1986), 148), und sie können so ausgewählt werden, dass sie die Freisetzung des Arzneistoffs aus dem monodonalen Antikörper an der Zielstelle möglich machen. Beispiele von therapeutischen Mitteln, die für eine Immuntherapie an die monodonalen Antikörper der Erfindung gekoppelt werden können, sind Arzneistoffe, Radioisotope, Lectine und Toxine.
Die markierten oder nicht-markierten monodonalen Antikörper der Erfindung können auch in Kombination mit therapeutischen Mitteln verwendet werden, z. B. den vorstehend beschriebenen Mitteln. Besonders bevorzugt sind therapeutische Kombi nationen, die den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper und Immunmodulatoren sowie andere Modifikatoren der biologischen Antwort umfassen.
Wenn der erfindungsgemäße monodonale Antikörper in Kombination mit verschiedenen therapeutischen Mitteln, z. B. mit den hier beschriebenen Mitteln, verwendet wird, erfolgt die Verabreichung des monoclonalen Antikörpers üblicherweise im Wesentlichen gleichzeitig mit dem therapeutischen Mittel. Der Begriff "im Wesentlichen gleichzeitig" bedeutet, dass der monodonale Antikörper und das therapeutische Mittel, bezogen auf die Zeit, ziemlich nahe beieinander verabreicht werden. Normalerweise ist es bevorzugt, das therapeutische Mittel vor dem monoclonalen Antikörper zu verabreichen. Z. B. kann das therapeutische Mittel einen bis sechs Tage vor dem monoclonalen Antikörper appliziert werden. Die Verabreichung des therapeutischen Mittels kann täglich oder in jedem beliebigen anderen Intervall erfolgen, abhängig von Faktoren, wie z. B. Art der Störung, dem Zustand des Patienten und der Halbwertszeit des Mittels.
Die Dosierungsbereiche für die Verabreichung von erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpern sind so groß, dass sie die gewünschte Wirkung erzeugen, wobei die Symptome beim Ausbruch der Leptospira-Krankheit gebessert werden. Die Dosierung sollte nicht so hoch sein, dass Nebenwirkungen auslöst werden, wie unerwünschte Kreuzreaktionen, anaphylaktische Reaktionen und dergleichen. Im allgemeinen variiert die Dosierung mit dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht des Patienten und der Schwere der Krankheit bei dem Patienten und kann durch einen Fachmann bestimmt werden. Im Fall von Komplikationen kann die Dosierung durch den jeweiligen Arzt angepasst werden. Die Dosierung kann von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 2 000 mg/kg variieren, vorzugsweise von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 500 mg/kg, in einer oder mehreren Dosis-Verabreichungen täglich einen oder mehrere Tage lang. Wenn die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper konjugiert mit therapeutischen Mitteln verabreicht werden, können im allgemeinen niedrigere Dosierungen verwendet werden als bei einer diagnostischen Bildgebung in vivo.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper können parenteral durch Injektion oder durch eine allmähliche Perfusion über eine bestimmte Zeit verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper können intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakavitär oder transdermal verabreicht werden, und zwar alleine oder in Kombination mit Effektorzellen.
Präparate zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele von nicht- wässrigen Lösungsmitteln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, ein schließlich Kochsalzlösung und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, intravenöse Lactat-Ringer-Träger umfassen flüssige und Nährstoff-Füllstoffe, Elektrolyt-Füllstoffe (z. B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren) und dergleichen. Außerdem können Konservierungsstoffe und andere Zusätze vorliegen, wie z. B. antimikrobielle Mittel, Antioxidantien, chelatbildende Mittel und inerte Gase und dergleichen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer mit pathogenen Leptospira assoziierten Störung bei einem Individuum bereit, umfassend das Inkontaktbringen einer Zellkomponente mit einem Reagens, das an die Zellkomponente bindet. Die Zellkomponente kann eine Nucleinsäure sein, wie DNA oder RNA, oder sie kann ein Protein sein. Wenn die Komponente eine Nucleinsäure ist, ist das Reagens eine Nucleinsäure-Sonde oder ein PCR- Primer. Wenn die Zellkomponente ein Protein ist, ist das Reagens eine Antikörper- Sonde. Die Sonden sind nachweisbar markiert, z. B. mit einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer biolumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einem Metall-Chelatbildner oder einem Enzym. Der Fachmann kennt andere geeignete Markierungen für die Bindung an den Antikörper, oder er ist in der Lage, diese anhand herkömmlicher Versuche zu bestimmen.
Für die Zwecke der Erfindung kann ein Antikörper oder eine Nucleinsäure- Sonde, der/die für OmpL1 spezifisch ist, verwendet werden, um das Vorliegen des OmpU-Polypeptids (unter Verwendung des Antikörpers) oder des Polynucleotids (unter Verwendung der Nucleinsäure-Sonde) in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben nachzuweisen. Eine beliebige Probe kann eingesetzt werden, die eine nachweisbare Menge des OmpL1-Antigens oder Polynucleotids enthält. Eine bevorzugte Probe der vorliegenden Erfindung ist Blut, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit oder Gewebe endothelialen Ursprungs.
Wenn die Zellkomponente eine Nucleinsäure ist, kann es erforderlich sein, die Nucleinsäure vor der Bindung an eine Leptospira-spezifische Sonde zu amplifizieren. Vorzugsweise wird hierfür eine Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt, jedoch können auch andere Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren verwendet werden, wie Ligasekettenreaktion (LCR), ligierte aktivierte Transkription (LAT) und Nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA).
Eine weitere Technik, mit der möglicherweise eine größere Empfindlichkeit erreicht werden kann, umfasst die Kopplung von Antikörpern mit Haptenen niedrigen Molekulargewichts. Anschließend können diese Haptene anhand einer zweiten Reaktion spezifisch nachgewiesen werden. Z. B. ist die Verwendung der folgenden Haptene üblich, wie Biotin, das mit Avidin reagiert, oder Dinitrophenyl, Pyridoxal und Fluorescein, die mit spezifischen anti-Hapten-Antikörpern reagieren können.
Andererseits kann das OmpL-1-Polypeptid eingesetzt werden, um Antikörper gegen das OmpL1-Polypeptid in einer Probe nachzuweisen. Das OmpL1 der Erfindung ist besonders für die Verwendung in Immuntests geeignet, wobei es in flüssiger Phase oder gebunden an einen Träger in fester Phase eingesetzt werden kann. Außerdem kann das in diesen Tests verwendete OmpL1 auf verschiedene Art und Weise nachweisbar markiert sein.
Beispiele von Immuntests, bei denen das OmpL1 der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, sind kompetitive und nicht-kompetitive Immuntests in einem direkten oder in einem indirekten Format. Beispiele solcher Immuntests sind der Radioimmuntest (RIA), der Sandwich-Test (immunometrischer Test) und der Western- Blot-Test. Der Nachweis von Antikörpern, die an das erfindungsgemäße OmpL1 binden, kann anhand von Immuntests durchgeführt werden, die in einem Vorwärts-, Rückwärts- oder gleichzeigtigen Modus ablaufen, einschließlich immunhistochemischer Tests auf physiologischen Proben. Die verwendete Konzentration des OmpL1 kann variieren, abhängig davon, welche Art des Immuntests und welche nachweisbare Markierung verwendet werden. Unabhängig von der Art des verwendeten Immuntests kann jedoch die Konzentration des OmpL1, die eingesetzt werden soll, vom Fachmann anhand herkömmlicher Versuche einfach bestimmt werden.
Das erfindungsgemäße OmpL1 kann an viele verschiedene Träger gebunden und verwendet werden, um das Vorliegen eines Antikörpers nachzuweisen, der mit dem Polypeptid spezifisch reagieren kann. Beispiele von bekannten Trägern umfassen Glas-, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Dextran, Nylon, Amylosen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Der Träger kann für die Zwecke der Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein. Der Fachmann kennt noch andere geeignete Träger zur Bindung des OmpL1, oder er ist in der Lage, solche anhand herkömmlicher Versuche zu bestimmen.
Es gibt viele verschiedene Markierungen und Verfahren zur Markierung, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele der Markertypen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen Enzyme, Radioisotope, kolloidale Metalle, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen und biolumineszierende Verbindungen.
Für die Zwecke der Erfindung kann der Antikörper, der an das erfindungsgemäße OmpL1 bindet, in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten und Geweben vorliegen. Eine beliebige Probe kann verwendet werden, die eine nachweisbare Menge von Antikörpern gegen OmpL1 enthält. Normalerweise ist eine Probe eine Flüssigkeit wie Urin, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit, Blut, Serum und dergleichen oder ein Feststoff oder ein halbfester Stoff wie Gewebe, Fäzes und dergleichen.
Die gegen OmpL1 gerichteten erfindungsgemäßen monodonalen Antikörper können auch zum in-vivo-Nachweis eines Antigens eingesetzt werden. Der nachweisbar markierte monodonale Antikörper wird in einer Dosis verabreicht, die diagnostisch wirksam ist. Der Begriff "diagnostisch wirksam" bedeutet, dass die verabreichte Menge eines nachweisbar markierten monodonalen Antikörpers ausreichend groß ist, dass der Nachweis des Leptospira-OmpL1-Antigens möglich ist, für das die monodonalen Antikörper spezifisch sind.
Die Konzentration eines verabreichten, nachweisbar markierten monodonalen Antikörpers sollte ausreichend hoch sein, dass die Bindung an Zellen, Körperflüssigkeit oder Gewebe, die OmpL1 aufweisen, im Vergleich zum Hintergrund nachweisbar ist. Ferner ist es wünschenswert, dass der nachweisbar markierte monodonale Antikörper aus dem Kreislauf rasch ausgeschieden wird, so dass das beste Ziel-zu- Hintergrund-Signalverhältnis erhalten wird.
Als eine Regel gilt, dass die Dosierung eines nachweisbar markierten monodonalen Antikörpers für eine in-vivo-Diagnose variiert, abhängig von Faktoren wie Alter, Geschlecht und Schwere der Krankheit bei dem Individuum. Die Dosierung des monodonalen Antikörpers kann von etwa 0,001 mg/m² bis etwa 500 mg/m², vorzugsweise 0,1 mg/m² bis etwa 200 mg/m², am stärksten bevorzugt von etwa 0,1 mg/m² bis etwa 10 mg/m² reichen. Solche Dosierungen können variieren, z. B. abhängig davon, ob mehrere Injektionen verabreicht werden, und von anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind.
Für eine diagnostische Bildgebung in vivo wird das Radioisotop hauptsächlich danach ausgewählt, welche Art von Nachweisapparatur verfügbar ist. Das gewählte Radioisotop muss eine Zerfallsart aufweisen, die mit einer bestimmten Art von Apparatur nachweisbar ist. Noch ein anderer wichtiger Faktor zur Auswahl eines Radioisotops für eine in-vivo-Diagnose besteht darin, dass die Halbwertszeit des Radioisotops lange genug ist, so dass es zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme durch das Ziel noch nachweisbar ist, dass sie jedoch kurz genug ist, so dass die schädliche Bestrahlung für den Wirt minimiert wird. Idealerweise weist ein Radioisotop, das für eine in-vivo-Bildgebung eingesetzt wird, keine Partikelemission auf, vielmehr produziert es eine große Menge an Photonen im 140-250-Key-bereich, die durch herkömmliche Gamma-Kameras einfach nachgewiesen werden können.
Für eine in-vivo-Diagnose können Radioisotope an ein Immunglobulin direkt gebunden werden, oder sie können indirekt gebunden werden, indem eine intermediäre funktionale Gruppe eingesetzt wird. Intermediäre funktionale Gruppen, die häufig zur Bindung von Radioisotopen, welche als metallische Ionen vorliegen, an Immunglobulin eingesetzt werden, sind die bifunktionalen chelatbildenden Mittel wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sowie ähnliche Moleküle. Typische Beispiele von metallischen Ionen, die an die erfindungsgemäßen monodonalen Antikörper gebunden werden können, sind ¹¹¹In, &sup9;&sup7;Ru, &sup6;&sup7;Ga, &sup6;&sup8;Ga, &sup7;²As, &sup8;&sup9;Zr und ²&sup0;¹Tl.
Die erfindungsgemäßen monodonalen Antikörper können für eine in-vivo- Diagnose auch mit einem paramagnetischen Isotop markiert werden, wie bei dem bildgebenden Magnet-Resonanz-Verfahren (MRI) oder bei der Elektronen-Spin- Resonanz (ESR). Im allgemeinen kann jedes herkömmliche sichtbarmachende bildgebende Diagnose-Verfahren verwendet werden. Üblicherweise werden für bildgebende Verfahren unter Verwendung einer Kamera Gamma- und Positronen emittierende Radioisotope und für MRI paramagnetische Isotope eingesetzt. Elemente, die in solchen Techniken besonders geeignet sind, umfassen ¹&sup5;&sup7;Gd, &sup5;&sup5;Mn, ¹&sup6;²Dy, &sup5;²Cr und &sup5;&sup6;Fe.
Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper können eingesetzt werden, um den Verlauf der Besserung einer mit Leptospira assoziierten Störung zu verfolgen. Somit wäre es möglich, durch ein Messen der Zunahme oder der Abnahme des OmpL1-Polypeptids von Leptospira oder von Antikörpern gegen das OmpL1- Polypeptid, das/die in verschiedenen Körperflüssigkeiten oder Geweben vorliegen, zu bestimmen, ob ein bestimmtes Therapieschema bei der Behandlung der Störung erfolgreich ist.
Die Stoffe, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind idealerweise für die Herstellung eines Kits geeignet. Ein solcher Kit kann ein unterteiltes Trägermittel umfassen, das einen oder mehrere Behälter wie Gläschen, Röhrchen und dergleichen eng nebeneinander aufnehmen kann, wobei jeder der Behälter eines der getrennten Elemente enthält, die in dem Verfahren eingesetzt werden. Z. B. kann einer der Behälter ein OmpL1-Bindungsreagens, z. B. einen Antikörper, umfassen. Ein zweiter Behälter kann dann das OmpL1-Polypeptid enthalten. Die Bestandteile können, wie gewünscht, in flüssiger oder in gefriergetrockneter Form vorliegen. Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, sie jedoch in keiner Weise einschränken. Sie sind zwar für die Verfahren typisch, die verwendet werden können, jedoch ist es auch möglich, andere Verfahren einzusetzen, die dem Fachmann bekannt sind.

Beispiele

Die folgenden Beispiele beschreiben die Identifizierung von OmpL1 als einen wichtigen Kandidaten für ein OMP von Leptospira. Eine umfassende Studie der O- berflächenkomponenten von L. alstoni wird dargestellt, einschließlich einer Extraktion der äußeren Membran von Leptospira mit nicht-ionischen Detergentien, einer Oberflächen-Immunfällung und einer Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie. Das Verfahren wird beschrieben, durch das das OmpL1-Gen cloniert und sequenziert wurde. Se quenzanalyse- und Homologieuntersuchungen sind dargestellt, die weiterhin zeigen, dass das OmpL1 ein OMP ist. Southern-Hybridisierungs- und Immunblot- Untersuchungen machen deutlich, dass das OmpL1 für ein großes Spektrum von pathogenen Leptospira relevant ist, und zwar unabhängig von der Art.

Beispiel 1

Extraktion der äußeren Membran mit dem nicht-ionischen Detergens Triton X-114

Bei der Zusammenstellung der Verfahren, mit denen die Oberflächenkomponenten charakterisiert wurden, wurden die Probleme berücksichtigt, die mit der bekannten Brüchigkeit der äußeren Membran (OM) der Spirochäten zusammenhängen. Das erste Verfahren umfasste die Verwendung des nicht-ionischen Detergens Triton X-114 (TX-114), das die nützliche Eigenschaft besitzt, dass es sich beim Erwärmen in eine hydrophobe und in eine hydrophile Phase auftrennt. Membranproteine sind hydrophob und werden typischerweise in die hydrophobe Phase fraktioniert, während lösliche Nicht-Membran-Proteine in die hydrophile Phase fraktionierten. Verschiedene Hinweise legten nahe, dass 0,1% TX-114 die OM von Leptospira selektiv solubilisiert. Eine Behandlung mit TX-114 reduzierte den Durchmesser von Leptospira, wobei die OM-Struktur nicht mehr zu erkennen war und LLS im Wesentlichen vollständig freigesetzt wurde. Die in TX-114 lösliche Fraktion war frei von periplasmatischen Flagellen; dies wurde durch einen Immunblot bestimmt, der mit einem kreuzreaktiven, für T. pallidum-Endoflagellen spezifischen Antiserum als Sonde getestet wurde. Dieses Ergebnis ist ein erster Beweis für die Epitop-Konservierung zwischen Endoflagellen von T. pallidum und von Leptospira.
Die Extraktion von L. alstoni unter Verwendung von 0,1% TX-114 führte zur Solubilisierung von mehreren Proteinen, deren Molekulargewicht von mehr als 110 kDa bis weniger als 14 kDa reichte. Etwa 16 Proteine wurden in die hydrophobe Detergensphase abgetrennt. Die Proteine der Detergensphase mit 35, 39 und 66 kDa schienen nur beim virulenten Stamm vorzuliegen. Ein Vergleich mit dem abgeschwächten Stamm zeigte, dass hier die Detergensphasen-Proteine mit 31 kDa (OmpL1) und 38 kDa in größeren Mengen exprimiert waren. Der virulente und der abgeschwächte Stamm enthielten ähnliche Mengen der Haupt-Detergensphasen- Proteine mit Molekulargewichten von 41 und 44 kDa. Das Vorliegen von LLS in Leptospira-Proben, die einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen worden waren, wurde anhand Periodat-Silber-Färbung oder Immunblot-Verfahren aufgrund eines charakteristischen Bandenmusters deutlich. Die TX-114-Studien zeigten, dass Leptospira-LLS ausschließlich in die hydrophobe Phase abgetrennt wurde, wodurch bestätigt wird, dass LLS eine hybrophobe Komponente der äußeren Membran ist. Dieses Ergebnis stimmt auch mit der hydrophoben Natur der langkettigen Fettsäurekomponente von LLS überein.

Beispiel 2

Oberflächen-Immunfällung der Komponenten der äußeren Membran

Das zweite Verfahren, das zum Identifizieren von Oberflächenkomponenten von L. alstoni eingesetzt wurde, war eine Oberflächen-Immunfällung unter Verwendung von Antiserum, das gegen den vollständigen Organismus hervorgerufen wurde. Um eine physikalische Manipulation der brüchigen Spirochäten zu vermeiden, wurde eine Modifikation der Oberflächen-Immunfällungstechnik von Hansen et al. (Infect. Immun. 31 (1981), 950-953) verwendet, wobei das Antiserum zu einer Kultur von intakten beweglichen Leptospira in der 10 g-Wachstumsphase zugegeben wurde. Anschließend wurden die ungebunden Antikörper von den agglutinierten Leptospira durch Waschung abgetrennt, indem eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit (2 000 · g) durchgeführt wurde, wodurch ein Aufreißen der äußeren Membran verhindert werden konnte. Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden in dem Hansen- Solubilisierungspuffer solubilisiert und unter Verwendung von Staphylokokken- Protein-A-Sepharose (CL-4B, Sigma) isoliert. In dem Immunblot des immungefällten Materials wurde keine deutliche Menge des 35-36-kDa Endoflagellen-Doppelproteins nachgewiesen, wodurch die Selektivität des Immunfällungsverfahrens zum Identifizieren von Oberflächenkomponenten von Leptospira bestätigt wurde.
Die durch das Oberflächen-Immunfällungsverfahren erhaltenen Ergebnisse bestätigten die Lage der 31-kDa- (OmpL1), 41-kDa- und 44-kDa-Proteine auf der Oberfläche. Das 31-kDa-Protein (OmpL1) lag in der in Kultur abgeschwächten L. alstoni in signifikant größeren Mengen vor als in der virulenten L. alstoni. Das 41- kDa- und das 44-kDa-Protein lagen in den beiden Stämmen in ähnlichen Mengen vor. Die Ergebnisse der Oberflächen-Immunfällung waren ein Beweis dafür, dass LLS-Epitope von L. alstoni auf lebenden Zellen auf der Oberfläche exponiert sind; frühere Radioimmunfällungs-Untersuchungen konzentrierten sich vollständig auf die Oberflächenexposition von Proteinepitopen.

Beispiel 3

Bestimmung des OMP-Gehalts durch Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie

Suspensionen, die etwa 4 · 10&sup8; lebensfähige Spirochäten enthielten (mit einer Beweglichkeit von 100%), wie durch Zählung von 20 Feldern mittels Dunkelfeld- Mikroskopie bestimmt wurde (insgesamt mindestens 200 Organismen), wurden bei 30 000 · g zentrifugiert, wodurch die Organismen sedimentiert wurden. Die Pellets wurden in 2 ml 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer (pH 7,4) suspendiert. Nach 15 Minuten Fixierung wurde 1 ml der Suspension in jedes von zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gefüllt und die Treponemen bei 14000 · g abzentrifugiert. Die Pellets wurden in 50 ul 20% Glycerin in 0,1 M Natriumkakodylat- Puffer (pH 7,4) suspendiert. Diese Behandlungen erfolgten bei Raumtemperatur (22 bis 24ºC). Aus dieser Suspension wurden 2-ul-Portionen auf herkömmliche Balzars- 24ºC). Aus dieser Suspension wurden 2-ul-Portionen auf herkömmliche Balzars- Probenhalter aufgetragen (Balzars Co., Nashua, NH). Die Proben wurden durch Immersion in flüssigem Propan (-190ºC) eingefroren, wobei eine Guillotine-artige Vorrichtung verwendet wurde. Die gefrorenen Proben wurden unter flüssigem Stickstoff in die Probenvorrichtung einer auf -150ºC vorgekühlten Balzars-400K-Gefrierbruch- Apparatur überführt. Die gefrorene Bakteriensuspension wurde bei -120ºC aufgebrochen, wobei ein auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff vorgekühltes Messer verwendet wurde. Die Bruchoberfläche wurde unmittelbar nach 45' mit Platin-Carbon und nach 90' mit Carbon kopiert. Die Kopien wurden mit 3 bis 4% Natriumhypochlorit gespült, um das organische Material auszubleichen, dreimal mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen und auf Formvar beschichtete Gefrierbruch-Netze aufgebracht (Ted Pella Inc., Redding, CA). Die Netze wurden in dem bei 80 kV arbeitenden Elektronenmikroskop JEOL 100 CX II betrachtet. Für jeden untersuchten Organismus wurden mindestens 50 Felder fotografiert und mit einer Endvergrößerung von 100 000 · ausgedruckt; sodann wurden aus diesen Feldern typische gebrochene Zellen für die Bestimmung der intramembranösen Partikeldichte ausgewählt.
Die Partikeldichte der äußeren Membran einer virulenten und einer in Kultur abgeschwächten L. alstoni Serovar grippotyphosa wurde untersucht. Die Ergebnisse waren in zweierlei Hinsicht interessant: 1) Wie andere pathogene Spirochäten hatte dieser Serovar von L. alstoni im Vergleich zu Gram-negativen Enterobakterien einen geringen OMP-Gehalt; und 2) der Vergleich der virulenten und der abgeschwächten L. alstoni zeigte, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Expression des 31- kDa-Proteins (OmpL1) und der Partikeldichte der vollständigen Membran bestand.

Beispiele

Clonierung des 31-kDa-Proteins OmpL1

Die Gewichtung der Hinweise aus den verschiedenen Vorgehensweisen, mit denen die Oberflächenkomponenten von L. alstoni untersucht wurden, führten zu der Folgerung, dass das 31-kDa-Protein der vielversprechendste OMP-Kandidat war. Die Tatsache, dass die Menge des vorliegenden 31-kDa-Proteins nicht mit der Virulenz in Zusammenhang stand, schmälert seine Wichtigkeit nicht, da es sich hierbei um das erste Membran überspannende OMP von Spirochäten handelt, das bisher identifiziert wurde. Die N-terminale Aminosäuresequenz des 31-kDa-Proteins wurde wie folgt erhalten. Unter Verwendung des Oberflächen-Immunfällungsverfahrens wurde eine Probe erzeugt, die sodann einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworten, auf eine Trans Blot PVDF Protein Sequencing Membran (Bio-Rad, Richmond, CA) überführt und in eine UCLA-Mikrosequenzierungsapparatur eingegeben wurde. Hierdurch war es möglich, die 13 bis 14 N-terminalen, aufeinander folgenden Aminosäuren des 31-kDa-Proteins zu bestimmen. Aufgrund der N- terminalen Aminosäuresequenz wurden zwei degenerierte Oligonucleotid-Sonden synthetisiert.
Die genomische DNA von L. alstoni wurde durch das Verfahren von Yelton, D. B., und N. W. Charon, 1948, hergestellt. Die Oligonucleotid-Sonden wurden mit gamma- P-ATP endmarkiert und durch sie wurde durch Southern-Hybridisierung des Lalstoni-Genoms ein 2,5-kb-EcoRI-Fragment unabhängig identifiziert. Ein genomisches EcoRI-Spaltprodukt wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Die durch Restriktionsendonucleasen erzeugten Fragmente in einem Größenbereich von 2,1 bis 2,8 kb, die 10% der Gesamt-DNA von Leptospira darstellten, wurden entfernt und Gel-gereinigt. Diese DNA-Fragmente wurden in den Lambda-Zap-ll-Vektor (Stratagene) ligiert. Die Oligonucleotid-Sonden wurden für eine unabhängige Durchmusterung einer Bank von 4800 Plaques eingesetzt. Die Größe des Leptospira- Genoms beträgt etwa fünf Megabasen (Baril et al., FEMS Microbiol. Lett. 71, 95- 100). Die Bakteriophagen-Lambda-Bank stellte etwa 10% des Gesamtgenoms oder 500 000 Basenpaare dar. Die erwartete Häufigkeit positiver Plaques wäre die Fragmentgröße/Genomfraktion = 2500/500 000 = 0,25%. Aufgrund dieser Berechnung war eine Hybridisierung mit 4800 · 0,25% = 12 Plaques zu erwarten. Beide Oligonucleotid-Sonden hybridisierten mit den gleichen 18 Plaques. Sechs positive Plaques wurden herausgegriffen, erneut plattiert und erneut getestet, um Phagen zu reinigen, die das hybridisierende DNA-Fragment enthielten. Die gereinigten Phagen wurden amplifiziert und durch in-vivo-Ausschneiden und Rezirkularisierung in eine Bluescript SK-Plasmidform überführt. Alle sechs auf diese Weise erhaltenen pBluescript-Plasmide enthielten die gleiche 2,5-kb-Insertion. Eine Restriktionskarte der Insertion wurde konstruiert. Eine Southern-Hybridisierung unter Verwendung der Oligonucleotid-Sonden wurde durchgeführt, wodurch der Hybridisierungsbereich auf ein 122-bp-Fragment in der Nähe der NdeI-Stelle lokalisiert werden konnte.

Beispiel 5

Sequenzanalyse für ompL1

Die Restriktionsfragmente wurden für eine Sequenzierung der doppelsträngigen DNA in pBluescript subcloniert, wobei die Sequenase-Reaktion mit dem T7- Vorwärts- und dem T3-Rückwärts-Primer verwendet wurde. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung des DNA Strider 1.0-Programms analysiert. Ein intaktes offenes Leseraster wurde gefunden, beginnend 770 Basen von der stromaufwärts gelegenen EcoRI-Stelle aus. Das ompL1-Strukturgen besteht aus 960 Basen, die ein Protein von 320 Aminosäuren codieren. Stromaufwärts liegen E. coli-ähnliche 35- (TTGCCG) und 10-(TCCAAT) Promotorregionen vor. Eine E. coli-Konsensus- Ribosomenbindungsstelle (AGGAG) ist sechs Basen stromaufwärts des Initiationscodons vorhanden. Wie für Proteine zu erwarten ist, die außerhalb der inneren Membran ausgeschleust werden sollen, beginnt die hergeleitete Aminosäuresequenz mit einem aus 24 Resten bestehenden Signalpeptid, das in Fig. 1 als schattierte Fläche dargestellt ist. Es liegt eine Spaltstelle der Leader-Peptidase 1 vor, deren Sequenz für prokaryontische ausgeschleuste Proteine insofern typisch ist, als an der Position -1 ein Alanin steht. Außerdem ist zu beachten, dass die Aminosäuresequenz keine Konsensus-Leu-X-Y-Cys-Leader-Peptidase-11-Spaltstelle enthält; dies zeigt, dass das OmpL1 keine Lipoprotein ist. Um zu testen, ob dieses Ausscheidungssignal in E. coli funktioniert, wurde ein SspI-Fragment, das den OmpL1-Leader enthielt, in die SmaI-Stelle des Polylinkers des Expressionsvektors für alkalische Phosphatase pMG cloniert und in 1T41 transformiert, einen E. coli-Stamm mit einer temperatursensitiven Leader-Peptidase-1-Mutation (Inada et al., J. Bacteriol 171 (1989), 585-587). Das resultierende OmpL1-PhoA-Fusionsprotein wurde ins Periplasma ausgeschleust, wodurch blaue Kolonien auf einem Agar entstanden, der das Substrat XP (Brom-Chlor-Indolylphosphat) der alkalischen Phosphatase enthielt. Die Spaltung des OmpL1-PhoA-Fusionsproteins konnte bei der permissiven Temperatur von 32ºC gezeigt werden, nicht jedoch bei der restriktiven Temperatur von 37ºC, wodurch die Sensitivität des OmpL1 gegenüber der Spaltung durch die Leader-Peptidase 1 von E. coli bestätigt wurde. Unmittelbar hinter der Spaltstelle der Leader-Peptidase 1 lag eine Sequenz mit 13 Aminosäuren, die exakt mit den ersten 13 Aminosäuren der aus dem nativen Protein erhaltenen N-terminalen Aminosäuresequenz übereinstimmte. Das aus 296 Aminosäuren bestehende reife Protein weist ein Molekulargewicht von etwa 31 000 Dalton auf, das ähnlich ist wie das in Experimenten festgestellte Molekulargewicht. Der Hydrophobie-Plot zeigt einen N-terminalen Peak von 0,75, der dem Leader-Peptid entspricht. Es gibt keine anderen Bereiche mit einem Hydrophobiewert von mehr als 0,65; dies spricht dafür, dass das ompL1- Gen kein Protein der inneren Membran codiert. Stromabwärts des Terminationsco dons (TAA) liegt eine invertierte Sequenzwiederholung, die als ein rho-unabhängiger Transkriptionsterminator funktionieren könnte, wobei sie sich vom Nucleotid 997 bis zum Nucleotid 1027 erstreckt.
Die OmpL1-Sequenz enthält zehn Bereiche einer amphipathischen β-Faltblatt-Struktur; dies stimmt mit OMP-Transmembransegmenten überein. Aufgrund der Ergebnisse der primären Aminosäuresequenz kann man ein topologisches Modell von OmpL1 vorschlagen, das die strukturellen Regeln erfüllt, die auf der Topologie wohldefinierter Porine von Gram-negativen Bakterien beruhen. Jedes der Transmembransegmente weist eine Länge von zehn Aminosäuren auf, und innerhalb dieser zehn Transmembransegmente gibt es keine Ausnahmen von der Regel der alternierenden hydrophoben Aminosäuren. Die Aminosäuren in den Transmembransegmenten sind in einer gestaffelten Anordnung dargestellt, wobei die hydrophoben, zur Membran schauenden Reste auf der rechten Seite der Anordnung liegen. Einige der Transmembransegmente sind auf dem Beta Moment-Plot als Peaks wiedergegeben, mit dessen Hilfe die Bereiche identifiziert werden können, wo sich hydrophobe und hydrophile Aminosäuren abwechseln, und anhand dessen OMP-Membranüberspannende Sequenzen vorausgesagt werden können (Vogel et al., J. Mol. Biol. 190 (1986), 191-199). Die fünf, an der Oberfläche exponierten Schleifen verschiedener Länge enthalten Segmente mit einer hohen Oberflächen-Wahrscheinlichkeit. Die vier periplasmatischen Schleifen sind insofern typisch für OMPs, als sie kurz sind und Aminosäuren enthalten, wie Prolin (P), Glycin (G), Serin (S) und Asparagin (N), die Promotoren für Umkehrungen sind (Jeanteur et al., Molec. Microbiol. 5 (1991), 2153-2164).
Die 10 carboxyterminalen Aminosäuren von OmpL1 zeigten ein alternierendes Muster von hydrophoben Aminosäuren, das für Gram-negative OMPs charakteristisch ist. Von besonderem Interesse ist die Tatsache, dass an der Position -3 ein Histidin steht. Histidin liegt an dieser Position in dem carboxyterminalen Transmembransegment von Porinen der Klasse 1 (Nmp1) und der Klasse 2 (Nmp2) von Neisseria meningitidis und außerdem des Porins pl von Neisseria gonorrhoeae vor (Jeanteur et al., Molec. Microbiol. 5 (1991), 2153-2164). Unter Verwendung des Programms Gap Alignment (University of Wisconsin, Genetics Computer Group), wobei eine Lücken-Breite von 3,0 eingestellt wurde, zeigte das Ausrichten der gesamten OmpL1-Sequenz mit der von Nmp1, dass 21% der Aminosäuren identisch und weitere 45% ähnlich waren. Ein paarweises Ausrichten von OmpL1 mit verschiedenen anderen Proteinen zeigte, dass das OmpL1 zu Nmp1 homologer war als zu den OMPs von E. coli (wie LamB, OmpF oder PhoE) und dass das OmpL1 zu den OMPs homologer war als zu periplasmatischen Proteinen von E. coli (wie AraF oder beta- Lactamase). Die Bewertung der Ausrichtung mit Lücken von OmpL1 mit diesen Proteinen sind in Klammern angegeben: Nmp1 [113,5], LamB [107,7], PhoE [104,8], teinen sind in Klammern angegeben: Nmp1 [113,5], LamB [107,7], PhoE [104,8], AraF [95,7] und beta-Lactamase [95,5]. Anhand der Werte des paarweisen Ausrichtens wurde die relative Homologie von Porinen festgestellt (Gerbl-Reiger, S., et al., J. Bacteriol. 173 (1991), 2196-2205). Die Ausrichtung mit Lücken von OmpL1 mit Nmp1 zeigte eine Homologie in den Bereichen, die den bekannten Nmp1- Transmembransegmenten entsprachen. Neisseria-Porine zeigen in ihren Transmembransegmenten die größte Sequenzkonservierung (Van der Ley, P., et al., Infect. Immun. 59 (1991), 2963-2971). Die Transmembransegmente (TMSs) #6, #7, # 8, #9, #11 und #16 von Nmp1 ließen sich mit der OmpL1-Sequenz in einem Muster so ausrichten, dass die meisten der alternierenden hydrophoben Reste (*) der Nmp1-Transmembransegmente identisch (I) oder ähnlich (:) zu denen in OmpL1 waren (Fig. 2).

Beispiel 6

Southern-Hybridisierungsstudien

Es gibt einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Pathogenität von Leptospira und dem Vorliegen des ompL1-Gens. Die Southern-Hybridisierungsstudien wurden wie folgt durchgeführt. Das ompL1-Gen hat eine einmalige NdeI-Stelle, zwei Codons hinter der Stelle, an der die Spaltstelle der Leader-Peptide codiert ist. Außerdem liegt eine einmalige PvuI-Stelle in der Nähe des Endes des Strukturgens vor. Das aus 834 Basenpaaren bestehende NdeI-Pvul-Fragment, das 94% des reifen Proteins codiert, wurde durch das Zufallspriming-Verfahren mit α-³²P-dCTP markiert und als Sonde zum Testen der genomischen EcoRI-Spaltprodukte von 11 pathogenen und vier nicht-pathogenen Leptospira-Stämmen verwendet. Fig. 3A zeigt die Ergebnisse nach dem Waschen bei einer mittleren Stringenz in 2 · SSC bei 55ºC. In allen getesteten pathogenen Leptospira-Stämmen lag eine Einzelkopie des Gens vor. In nicht-pathogenen Leptospira-Stämmen dagegen lag das Gen nicht vor. Fig. 3B zeigt die Ergebnisse nach dem Waschen bei einer hohen Stringenz in 0,1 · SSC bei 55ºC. Die am meisten homologen ompL1-Gene wurden in anderen getesteten L. alstoni-Serovaren gefunden.

Beispiel 7

Clonierung des ompL1-Gens in den Expressionsvektor pRCET

Das Plasmid pBluescript, das das ompL1-Gen enthielt, wurde mit NdeI gespalten, sodann mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt, um glatte Enden zu erzeugen, worauf eine Spaltung mit EcoRI folgte. Das resultierende 1600-Basenpaar-DNA- Fragment, das im Wesentlichen das gesamte reife OmpL1-Protein codierte, wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert und in pRSET ligiert (Invitrogen, San Diego, CA), das mit SmaI und EcoRI gespalten worden war. Das resultierende Konstrukt pRSET-ompL1 codiert ein Fusionsprotein, das am Aminoterminus von OmpL1 eine 41-Aminosäuren-His6-Bindungsstelle enthält. Die sechs Histidine machen eine pH- abhängige Affinitätsreinigung des Fusionsproteins auf einer Nickelharz-Säule möglich, wodurch E. coli-Proteine entfernt werden können. Das pRSET-Fusionsprotein steht unter der Kontrolle des T7-Promotors. Nach der Transformation des pRSETompL.1 in E. coli-DHSa wurden in Gegenwart von Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG, Sigma) Milligramm-Mengen des His6-OmpL1-Fusionsproteins produziert. Durch die Zugabe von Rifampicin (Sigma) eine Stunde nach der IPTG-lnduktion wurde die His6-OmpL1-Produktion im Vergleich zu den E. coli-Proteinen gesteigert. Die Masse an E. coli-Wirtsproteinen wurde nach mehreren Zyklen mit Einfrieren und Auftauen in Lysepuffer freigesetzt, während > 90% des unlöslichen Pellets aus dem His6- OmpL1-Fusionsprotein bestand.

Beispiel 8

Immunisierung von Kaninchen mit dem gereinigten OmpL1

Das His6-OmpL1-Fusionsprotein wurde von anderen unlöslichen Stoffen durch SDS-PAGE abgetrennt. Die His6-OmpL1-Bande, die 50 Mikrogramm Protein enthielt, wurde aus dem Acrylamid-Gel ausgeschnitten, getrocknet, zu Pulver zerstoßen, mit komplettem Feundschem Adjuvans gemischt und sowohl subkutan als auch intramuskulär in ein männliches New Zealand White-Kaninchen geimpft. Weiteres His6-OmpL1-Fusionsprotein wurde in 6 M Guanidin solubilisiert und über die Nickelharz-Säule gereinigt sowie in 10 mM Tris, pH 8,0, dialysiert. Die sekundäre Immunisierung erfolgte sechs Wochen nach der primären Immunisierung, wobei etwa 50 Mikrogramm gereinigtes His6-OmpL1-Fusionsprotein in inkomplettem Freundschem Adjuvans verwendet wurden. Dem Kaninchen wurde zwei Wochen nach der sekundären Immunisierung Blut abgenommen. Das Antiserum nach der Boosterung reagierte auf Immunblots von ganzen, durch SDS-PAGE aufgetrennten L. alstoni nur mit dem 31-kDa-Antigen. Die Immunblots mit TX-114 fraktionierten L. alstoni zeigten eine Reaktivität mit dem 31-kDa-OmpL1-Antigen im ganzen Organismus und in der Detergensphase, nicht jedoch in der wässrigen Phase oder im unlöslichen Pellet.

Beispiel 9

Lagebestimmung auf der Oberfläche mit Immunelektronenmikroskopie

Nachdem ein hochspezifisches immunologisches Reagens für Untersuchungen zur Lagebestimmung hergestellt worden war, wurden einleitende immunelektronenmikroskopische Experimente durchgeführt. Eine 20-ul-Suspension von 10&sup7; L. alstoni wurde zu 0,5 ml hitzeinaktiviertem anti-OmpL1-Antiserum oder Vorimmunserum aus dem gleichen Kaninchen zugegeben und eine Stunde unter Mischen inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zugabe von 250 ul 0,75% Glutaraldehyd in 100 mM Kakodylat-Puffer, pH 7,0, 30 Minuten fixiert. Sodann wurden die Bakterien gewaschen, auf Netze für die Elektronenmikroskopie überführt und mit Protein-G- kolloidalem Gold versetzt (Partikel a 10 nm). Eine spezifische Bindung in einem geringen Ausmaß an die äußere Membran von L. alstoni wurde festgestellt. Mit Vorimmunserum lag ein Partikel pro 20 Organismen vor, wohingegen mit anti-OmpL1- Antiserum acht Partikel pro 20 Organismen nachgewiesen wurden. Ein geringes Ausmaß an Bindung war aufgrund der kleinen Menge der Leptospira-OMPs zu erwarten.

Beispiel 10

Expression von OmpL1 mit dem Expressionsvektor pTrc99A

Das His6-Fusionsprotein ist für die Reinigung gut geeignet, es ist jedoch für Immunblotstudien nicht einsetzbar, da möglicherweise eine Hintergrundreaktivität gegenüber den zusätzlichen 41 Aminosäuren auftreten kann, die die His6- Bindungsstelle enthalten. Vorimmunseren aus einem der Kaninchen reagierten mit dem His6-ompL1-Fusionsprotein, nicht jedoch mit dem nativen OmpU. Aus dem pRCET-OmpL1-Vektor wurde durch Gelelektrophorese ein BgIII-HindII-Fragment isoliert und in den Expressionsvektor pTrc99A (Pharmacia) cloniert, bei dem das Leseraster mit einem 10-Nucleotid-NcoI-Linker angepasst worden war. Das in E. coli- DH5α transformierte pTrc99A-ompL1-Konstrukt exprimiert das gesamte reife OmpL1-Protein plus einem Start-Methionin und nur fünf weiteren Aminosäuren, die von dem Vektor stammen. E. coli-DH5α, der den ursprünglichen pTrc99A-Vektor enthielt, diente als negative Kontrolle. Die Bakterienproteine wurden durch SDS- PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose überführt, sodann mit Antiseren aus Kaninchen, die mit verschiedenen pathogenen Leptospira-Stämmen immunisiert worden waren, getestet (die Antiseren wurden von Dr. Arnold Kaufmann zur Verfügung gestellt, Centers for Disease Control, Atlanta). Die Reaktivität gegenüber OmpL1 wurde gezeigt mit Antiseren gegen L. interrogans Serovaren icterohaemorrhagiae, pomona und bratislava, L. alstoni Serovaren grippotyphosa und fortbragg, L. santarosai Serovaren bakeri und canalzonae, und L. weilii Serovar celledoni. Dies zeigt, dass OmpL1 nicht nur exprimiert wird, sondern dass es auch unter den pathogenen Leptospira im Hinblick auf das Antigen konserviert ist, ein Merkmal, das es zu einem exzellenten Kandidaten für einen Impfstoff macht.
Die vorstehende Beschreibung soll den Umfang der Erfindung erläutern, jedoch in keiner Weise einschränken. Dabei kann der Fachmann aufgrund der hier vorliegenden Beschreibung einfach weitere Ausführungsformen planen und herstellen, ohne dass übermäßiges Experimentieren nötig wäre.

Zusammenfassung der Sequenzen

Sequenz ID Nr. 1 ist die Nucleinsäuresequenz von ompL1.
Sequenz ID Nr. 2 ist die hergeleitete Aminosäuresequenz von OmpL1.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Haake, David A.
Blanco, David R.
Champion, Cheryl l.
Lovett, Michael A.
Miller, James N.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Cloniertes Protein der äußeren Membran von Leptospira
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Spensley Hörn Jubas & Lubitz
(B) STRASSE: 1880 Century Park East, Suite 500
(C) STADT: Los Angeles
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 90067
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25
(vi) DERZEITIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US
(B) TAG DER ANMELDUNG: 31. März 1993
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANGABEN ZU ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Wetherell, Jr. Ph. D., John R.
(B) REGRISTIERUNGSNUMMER: 31,678
(C) REFERENZ/DOCKET-NUMMER: PD-2097
(ix) ANGABEN ZU TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (619) 455-5100
(B) TELEFAX: (619) 455-5110
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 963 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vi) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: OMPL1
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..963
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 320 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 2:

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Haake, David A.
Blanco, David R.
Champion, Cheryl I.
Lovett, Michael A.
Miller, James N.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Cloniertes Protein der äußeren Membran von Leptospira
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Spensley Hörn Jubas & Lubitz
(B) STRASSE: 1880 Century Park East, Suite 500
(C) STADT: Los Angeles
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 90067
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25
(vi) DERZEITIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US
(B) TAG DER ANMELDUNG: 31. März 1993
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANGABEN ZU ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Wetherell, Jr. Ph. D., John R.
(B) REGRISTIERUNGSNUMMER:31,678
(C) REFERENZ/DOCKET-NUMMER: PD-2097
(ix) ANGABEN ZU TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (619) 455-5100
(B) TELEFAX: (619) 455-5110
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 963 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vi) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON; OMP L1
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..963
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 320 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 2:

Claims

1. Polynucleotidsequenz, die ein OmpL1-Polypeptid oder einen OmpL1spezifischen Teil eines Polypeptids codiert, das die Eigenschaften des äußeren Membranproteins OmpL1 von Leptospira besitzt, wie die Fähigkeit, einen Antikörper zu induzieren oder zu binden, umfassend:

(a) eine Nucleotidsequenz, wobei das codierte Polypeptid im Wesentlichen die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt;

(b) eine Nucleotidsequenz von (a), wobei das codierte Polypeptid von Leptospira alstoni stammt;

(c) eine Nucleotidsequenz von (b), wobei das codierte Polypeptid von Serovaren von Leptospira alstoni, grippotyphosa oder fortbragg stammt;

(d) eine Nucleotidsequenz von (a), wobei das codierte Polypeptid von Leptospira interrogans stammt;

(e) eine Nucleotidsequenz von (d), wobei das codierte Polypeptid von Serovaren von Leptospira interrogans, icterohaemorrhagias, pomona oder bratislava stammt;

(f) Nucleotide 1-1276 aus Fig. 1;

(g) Nucleotide 159-1118 aus Fig. 1, die das Propolypeptid codieren;

(h) Nucleotide 231-1118 aus Fig. 1, die das reife Protein codieren; oder

(i) eine Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer der Nucleotidsequenzen von (a) bis (h) hybridisiert.

2. Polynucleotidsequenz nach Anspruch 1, die DNA ist.

3. Polynucleotidsequenz nach Anspruch 1, die RNA ist.

4. Rekombinanter Expressionsvektor, der das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.

5. Expressionsvektor nach Anspruch 4, der ein bakterieller Expressionsvektor ist.

6. Expressionsvektor nach Anspruch 4, der ein viraler Expressionsvektor ist.

7. Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei der Vektor ein Plasmid ist.

8. Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 4 bis 7 transformiert ist.

9. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 8, die E. coli ist.

10. Verfahren zur Herstellung des OmpL1-Polypeptids oder eines OmpL1- spezifischen Teils davon, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 8 oder 9;

(b) Exprimieren des Polynucleotids in der Wirtszelle; und

(c) Isolieren des OmpL1-Polypeptids oder eines OmpL1-spezifischen Teils davon.

11. Polypeptid, das durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird, oder das durch das Verfahren nach Anspruch 10 erhältlich ist.

12. Antikörper oder Fragment davon, der/das spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 11 bindet.

13. Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 12, wobei der Antikörper polyclonal oder monoclonal ist.

14. Arzneimittel, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 11 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

15. Arzneimittel, das zum Auslösen einer Immunantwort gegen pathogene Leptospira in einem Tier geeignet ist und eine immunogen wirksame Menge des Polypeptids nach Anspruch 11 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

16. Arzneimittel nach Anspruch 14 oder 15, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger ein Adjuvans enthält.

17. Arzneimittel, umfassend den Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 12 oder 13 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

18. Arzneimittel, das zum Auslösen einer Immunantwort gegen pathogene Leptospira in einem Tier geeignet ist und eine immunogen wirksame Menge des Antikörpers oder Fragments davon nach Anspruch 12 oder 13 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

19. Verfahren zum Nachweis einer pathogenen Leptospira in einer Probe, umfassend das Inkontaktbringen des Polynucleotids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 11 in der Probe mit einem Reagens, das an den für das Pathogen spezifischen Zellbestandteil bindet.

20. Verfahren zum Nachweis des Antikörpers gegen das OmpL1-Polypeptid in einer Probe, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit dem Polypeptid nach Anspruch 11 unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an das Polypeptid erlauben, und das Nachweisen der Bindung des Antikörpers an das OmpL1-Polypeptid.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Probe vom Mensch, Schwein oder Rind stammt.

22. Kit, der für den Nachweis von OmpL1 oder des Antikörpers gegen OmpL1 geeignet ist, wobei der Kit unterteilte Trägermittel umfasst, die einen oder mehrere Behälter eng nebeneinander aufnehmen können, wobei der/die Behälter umfasst/umfassen:

(a) Reagens, das das Polypeptid nach Anspruch 11 binden kann;

(b) Reagens, das das Polynucleotid nach Anspruch 1 binden kann; und/oder

(c) Polypeptid nach Anspruch 13.

23. Verfahren oder Kit nach einem der Ansprüche 19, 21 oder 22, wobei das Reagens eine Sonde ist.

24. Verfahren oder Kit nach Anspruch 23, wobei die Sonde eine Nucleinsäure oder der Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 12 oder 13 ist.

25. Verfahren oder Kit nach Anspruch 24, wobei der Antikörper oder das Fragment davon vom Menschen stammt.

26. Verfahren oder Kit nach einem der Ansprüche 20 oder 23 bis 25, wobei das OmpL1-Polypeptid oder die Sonde nachweisbar markiert ist.

27. Verfahren oder Kit nach Anspruch 26, wobei der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Radioisotop, einer biolumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einer fluoreszierenden Verbindung, einem Metallchelat oder einem Enzym.

28. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend:

(a) den Antikörper nach Anspruch 12 oder 13;

(b) die Polynucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3; und/oder

(c) das Polypeptid nach Anspruch 11.